專利名稱：非復制型副粘病毒科病毒載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種非復制型副粘病毒科病毒載體。
背景技術：
仙臺病毒載體(SeV載體)為細胞質型病毒載體(表達的整個過程在 細胞質內完成的載體)，所以，體內使用也不用擔心攜帶基因整合到宿主染 色體產(chǎn)生遺傳毒性。另外還具有數(shù)項優(yōu)越的性能，如體外和體內均可獲得 高效率基因導入和表達的效率，以及體外可長期持續(xù)表達。所以，在基因 治療、基因疫苗或抗體生產(chǎn)及機能解析的應用上，SeV作為基因導入載體 有望得到更廣泛地應用(非專利文獻l、 2)。
然而，利用仙臺病毒載體表達外源基因時，病毒結構蛋白(尤其是轉 錄復制所需的RNP構成蛋白NP、 P、 L蛋白)也隨著攜帶的外源基因一起 表達，所以活體應用有可能招致免疫原性。于是，近年來開發(fā)了各種類型 的基因缺失型SeV載體。例如，有的是將病毒RNP構成蛋白以外的M、 F、 HN蛋白質別單獨或多數(shù)缺失的類型(專利文獻l 、 2 )。這些基因缺失型 SeV載體雖然降低了免疫原性，但預計仍有殘余。
SeV載體的RNP構成蛋白NP、 P、 L是仙臺病毒基因組的轉錄復制所 需要的蛋白質，在SeV載體中本來就是不可缺少的蛋白質。然而，即使在 基因組中去除這些蛋白基因，如果通過表達質粒等由外部提供這些缺失的 蛋白基因，理論上說重建、擴增這些蛋白病毒載體粒子是可能的。而且， 重建的缺失NP、 P、 L的SeV載體一旦感染到靶細胞，可利用進入到粒子 內的NP、 P及L蛋白轉錄基因組上的外源基因的mRNA,使其表達外源基 因。由于這種缺失NP、 P、 L的SeV載體在基因組上缺失了 NP、 P、 L基 因，所以不能復制RNP，從而演變?yōu)榉菑椭菩蚐eV載體。
如果在基因組上去除NP、 P、 L中的任一項，便不能復制RNP (或極 少復制)，可得到非復制型SeV載體。過去有報告稱，為制備非復制型SeV 載體，構建了單獨缺失NP蛋白基因的載體和單獨缺失P蛋白基因的載體(非專利文獻3、 4)。然而，考慮到L蛋白是RNA聚合酶活性主體，不是從基 因組中單獨缺失P基因或NP基因，而是通過缺失L基因或包括L基因在 內的多個基因，能夠使非復制型載體的特征更加明顯。此外，缺失包括L 基因在內的多個基因，有望可以最大限度地減少病毒蛋白的影響。所以， 從降低免疫原性的觀點考慮，優(yōu)選缺失包含L基因在內的多個基因，如所 有的NP、 P、 L基因。另外，L基因約占基因組長的一半左右，所以缺失L 基因，便可在基因組中插入更長的目的基因，并且基因組越短，轉錄效率 越高，越可獲得更高效率的目的基因的表達量。所以，缺失L基因的SeV 載體極為有用。然而，就包含SeV載體的副粘病毒科病毒載體而言，目前 還沒有報告表明缺失L基因的載體的制備。
專利文獻1WO00/70070
專利文獻2WO2003/025570
非專利文獻1Bitzer M等人，J Gene Med. 5(7):543-553 (2003)非專利文獻2Griesenbach U等人，Curr Opin Mol Ther.7(4):346-352. (2005)
非專利文獻3Molecular Therapy Volume 13, Supplement 1， May 2006， 第S185頁
非專利文南足4NSV2006 (13th International Conference Negative Strand Viruses 2006， Salamance, Spain, June 17-22nd, 2006)概要集
發(fā)明的內容 發(fā)明要解決的問題
鑒于以上情況，本發(fā)明所要解決的問題為制備低免疫原性的非復制型 副粘病毒科病毒載體。
解決問題的手段
為解決上述課題，本發(fā)明者們進行了不懈的努力，成功地制備了從基 因組RNA中全部缺失RNP構成蛋白NP、 P、 L蛋白基因的非復制型SeV 載體，并確認到攜帶GFP等標記基因的NP/P/L缺失型SeV載體可提高生 產(chǎn)效率(le7 CIU/ml以上)和外源基因導入及表達的高效率(為獲得高表 達量，需要高MOI感染)。本發(fā)明的載體通過缺失L基因或NP、 P、 L基因中的多個基因，可以減少宿主細胞內表達的來源于病毒的蛋白量，降低體 內給藥的免疫原性。本發(fā)明的載體尤其在基因治療領域極為有用。即，本
發(fā)明涉及缺失L基因的副粘病毒科病毒載體，更具體地說提供如下所述的
發(fā)明
(1 )一種病毒載體，其含有復合體，所述復合體包含下述(a )和(b ): (a )源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA,其被修飾為不表
達從結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P、 L蛋白質中選擇
的、至少包含L蛋白質在內的一種或多種蛋白質； (b ) NP蛋白質、P蛋白質及L蛋白質。
(2) —種病毒載體，其含有復合體，所述復合體包含下述(a )和(b ):
(a )源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA，其被修飾為不表 達從結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選 擇的多種蛋白質；
(b ) NP蛋白質、P蛋白質及L蛋白質。
(3) 上述(1 )和(2 )所述的載體，其中源自副粘病毒科病毒的(-) 鏈單鏈RNA被修飾為不表達NP、 P及L蛋白質。
(4 )上述(1 ) - ( 3 )中任一項所述的載體，其中源自副粘病毒科 病毒的(-)鏈單鏈RNA至少表達一種副粘病毒科病毒包膜蛋白質。
(5 )上述(4 )所述的載體，其中源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單 鏈RNA被修飾為表達M、 F、 HN蛋白質，而不表達NP、 P及L蛋白質。
(6 )上述(1 ) - ( 5 )中任一項所述的載體，其中(-)鏈單鏈RNA 源自仙臺病毒。
(7 )上述(1 ) - ( 6 )中任一項所述的載體，其中(-)鏈單鏈RNA 還攜帶外源基因。
(8 ) —種DNA，其編碼上述(1 ) - (7)中任一項所述載體所包含 的(—)鏈單鏈RNA或其互補鏈。
(9)一種上述(1)所述載體的制備方法，包含下述(a)和(b) 的步驟
(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補 鏈的DNA導入到能表達NP、 P及L蛋白質的細胞的步驟，該(-)鏈 單鏈RNA被修飾為不表達從結合副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選擇的、且至少包括L蛋白質在內的一種和多 種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(10) —種上述(2 )所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b ) 的步驟
(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補 鏈的DNA導入到能表達NP、 P及L蛋白質的細胞中的步驟，該(-) 鏈單鏈RNA被修飾為不表達從NP、 P及L蛋白質中選擇的多種蛋白 質5和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(11) 上述(9 )或(1 0 )所述的制備方法，其中能表達NP、 P 及L蛋白質的細胞還能表達具有促進病毒粒子形成和釋放功能的蛋白質。
(12) 上述(11)所述的方法，其中具有促進病毒粒子形成和釋 放功能的蛋白質為C蛋白質。
(13) —種上述(1 )所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b ) 的步驟
(a )將插入了編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或 其互補鏈的DNA的載體、NP蛋白質表達載體、P蛋白質表達載體及L 蛋白質表達載體導入到能表達這些載體的細胞中的步驟，該(-)鏈單 鏈RNA被修飾為不表達從結合源自副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA 的NP、 P及L蛋白質中選擇的、至少包括L蛋白質在內的l種或多種 蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(14) 一種上述(2 )所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b ) 的步驟
(a )將插入了編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或 編碼其互補鏈的DNA的載體、NP蛋白質表達載體、P蛋白質表達載 體及L蛋白質表達載體導入細胞的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修飾 為不表達從NP、 P及L蛋白質中選擇的多種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(15) —種上述(1 )所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b )的步驟
(a )將包含源自副粘病毒的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-)鏈 單鏈RNA的蛋白質的復合體導入到能表達NP、 P、 L蛋白質及包膜蛋 白質的細胞內的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表達從結合源 自副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選擇的、 至少包含L蛋白質在內的l種或多種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(16) —種上述(2 )所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b ) 的步驟
(a )將包含源自副粘病毒的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-)鏈 單鏈RNA的蛋白質的復合體導入到表達NP、 P、 L蛋白質及包膜蛋白 質的細胞中的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表達從結合源自 副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA蛋白質的NP、 P及L蛋白質中選擇
的多種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(17) —種制備用于在靶細胞中表達外源基因的載體的方法，包含 下述(a )和(b )的步驟
(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補 鏈的DNA導入到能表達NP、 P及L蛋白質的細胞中的步驟，該(-) 鏈單鏈RNA被修飾為攜帶外源基因，且不表達從NP、 P及L蛋白質 中選擇的、至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(18) —種制備用于在靶細胞中表達外源基因的載體的方法，包含 下述(a )和(b )的步驟
(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補 鏈的DNA導入到能表達NP、 P及L蛋白質的細胞中的步驟，該(-) 鏈單鏈RNA被修飾為攜帶外源基因，且不表達從NP、 P及L蛋白質 中選擇的多種蛋白質；和
(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
(19) 在靶細胞中表達外源基因的方法，包含下述(a)和(b) 的步驟(a )制備(7 )所述載體的步驟；和
(b)將(7)所述載體導入靶細胞的步驟。
發(fā)明的實施方案
本發(fā)明提供一種利用副粘病毒科病毒的新的非復制型載體。 本發(fā)明所述的副粘病毒是指屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae )的病毒， 或其衍生物。副粘病毒科是一組以非分節(jié)的負鏈RNA為其基因組的病毒之 一，包4舌副粘病毒亞一+(Pammyxovirinae)(包4舌呼p及道病毒屬(Respirovirus)(也 稱為副粘病毒屬(Paramyxovirus)、肥4，炎病毒屬(Rubulavirus)和麻滲病毒屬 (Morbilli virus))以及月申病毒亞-牛(Pneumovirinae)(包4舌肺病毒屬(Pneumovims) 和間質性肺病毒屬(Metapneumovirus))。副粘病毒-牛病毒所包含的病毒具體 有仙臺病毒(Sendai virus)、新;成疫病毒(Newcastle disease virus)、月思A袈炎病毒 (Mumps virus)、麻滲病毒(Measles virus)、呼吸道合月包病毒(RS病毒) (Respiratory syncytial virus)、 牛痘病毒(rinderpest virus)、痘熱病毒(distemper vims)、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒1，2，3型等等。更具體地說，包 括仙臺病毒(SeV)、人副流感病毒(HPIV-1)、人副流感病毒-3 (HPIV-3)、豬瘟 熱病毒(phocine distemper virus) (PDV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海月豕麻滲病毒 (dolphin molbillivims) (DMV)、 小反芻動物痘病毒(peste-des-petits-ruminants vims) (PDPR)、麻滲病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、 Hendra病毒(Hendra)、 Nipah 病毒(Nipah)、人副流感病毒-2 (HPIV-2)、猴副流感病毒5 (SV5)、人副流感 病毒4a (HPIV_4a)、人副流感病毒4b (HPIV4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、及 新城疫病毒(NDV)等。本發(fā)明的病毒優(yōu)選屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病 毒屬、腮腺炎病毒屬和麻滲病毒屬)的病毒或其衍生物，更優(yōu)選屬于呼吸道 病毒屬(genus Respirovirus )(也稱副粘病毒屬(Paramyxovirus)的病毒或 其衍生物。衍生物包含以不破壞病毒基因導入能力的方式改變了病毒基因 的病毒以及化學修飾的病毒等。本發(fā)明適用的呼吸道病毒屬的病毒包括人 副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型 (BPIV-3)、仙臺病毒(Sendai virus,也稱鼠副流感病毒1型)、麻滲病毒、猴 副流感病毒(SV5 )及猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本發(fā)明中的副粘病 毒最優(yōu)選仙臺病毒。
副粘病毒一般包含包膜內部的RNA和蛋白質構成的復合體(核糖核蛋白體；RNP)。 RNP中所含的RNA是副粘病毒的基因組(-)鏈(負鏈)單 鏈RNA。該單鏈RNA與NP、 P及L蛋白質結合，形成RNP。該RNP中所 含的RNA成為病毒基因組轉錄及復制的模板(Lamb， R.A.和D. Kolakofsky， 1996, Paramyxoviridae : The viruses and their replication, pp. 1177-1204. 《Fields Virology》,3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe和P. M. Howley等人 (ed.), Raven Press, New York, N. Y.)。
副粘病毒的"NP、 P、 M、 F、 HN及L基因，，分別指核殼、磷(phospho)、 基質(matrix)、融合(fbsion)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶及編碼大(large)蛋白質的基 因。核殼(NP)蛋白結合于基因組RNA，是基因組RNA產(chǎn)生模板活性不 可缺少的蛋白質。NP基因一般也表示為"N基因"。磷(P)蛋白質是RNA 聚合酶的小亞單位磷酸化蛋白質?；|(M)蛋白質具有從內側維持病毒粒 子結構的機能。融合(F)蛋白質是關系到滲入宿主細胞的膜融合蛋白質， 血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白質是關系到宿主細胞結合的蛋白質。大(L) 蛋白質是RNA聚合酶的大亞單位。上述各種基因各自持有轉錄調節(jié)單位， 由各基因轉錄單獨的mRNA和蛋白質。除P蛋白質以外，從P基因還翻譯 出(C)非結構蛋白質和(V)蛋白質，(C)非結構蛋白質利用不同的ORF 翻譯而成，(V)蛋白質通過讀取P蛋白質mRNA過程中的RNA編輯而成。 屬于副粘病毒亞科的各種病毒中的各基因從3'起一般表示如下
呼吸道病毒 NP/C/VMFHN畫L
腮腺炎病毒 NP/V M FHN(SH) L
麻滲病毒 NP/C/V MFH-L
例如，仙臺病毒的每個基因的堿基序列的數(shù)據(jù)庫登錄號分別為N基 因為M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P基因為M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M基因為D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F基因為D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046， X00152, X02131, HN基因為 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56B1， L基因為D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886?？梢粤信e的其他病毒編碼的病毒基因有N基因為CDV, AF014953;DMV, X75961; HPIV-1， D01070; HPIV-2， M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV， AF064091; PDPR， X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV， X00087; SV5, M81442;及Tupaia， AF079780, P基因為CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3， X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b， M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV， X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 及Tupaia, ART79780, C基因為CDV， AF014953; DMV， Z47758; HPIV-l. M74081; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV， AB005796;及 Tupaia, AF079780， M基因為CDV， M12669; DMV Z30087; HPIV-l, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3， D00130; HPIV-4a， D10241; HPIV-4b， D10242; Mumps， D86171; MV， ABO12948; NDV，細89819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;及SV5, M32248， F基因為CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1， M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3， X05303, HPIV-4a， D49821; HPIV-4b， D49822; Mumps， D86169; MV， AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV， M21514; SeV, D17334;及SV5， AB021962， HN( H和G )基因為CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3， ABO12132; HPIV-4A: M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps， X99040; MV, K01711; NDV， AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV， AF132934; SeV， U06433;及 SV-5， S76876,L基因為CDV,AF014953;DMV,AJ608288;HPIV-1，AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3， AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698;及SV-5, D13868。 但是，已知每種基因有多種不同的毒抹，除上述序列以外，還存在著其他 序列的基因。
本發(fā)明的非復制型載體(以下稱"本發(fā)明的載體，，)中(-)鏈單鏈RNA 被修飾為不表達結合(-)鏈單鏈RNA的蛋白質的一部分或全部，從而喪失 自我復制能力。本發(fā)明所述結合(-)鏈單鏈RNA的蛋白質是指能直接及/ 或間接結合該(-)鏈單鏈RNA，與該(-)鏈單鏈RNA構成復合體的蛋白 質。本發(fā)明的復合體包括這樣的復合體，其包含源自副粘病毒的(-)鏈單 鏈RNA及結合該(-)鏈單鏈RNA的源自副粘病毒的蛋白質(NP、 P、及 L蛋白質)。本發(fā)明中所述"源自副粘病毒"意為副粘病毒的組分(包括蛋白質、RNA)保留原有狀態(tài)，或處于被部分修飾的狀態(tài)。例如，通過修飾副
粘病毒的蛋白質或RNA而制備的蛋白質或RNA是"源自副粘病毒"的蛋白 質或RNA。本發(fā)明載體只要具有上述特征，則種類不限。例如，本發(fā)明的 載體可以是具有包膜蛋白質(F、 HN、 M蛋白質)等、采取病毒粒子結構 的病毒載體，也可以是沒有病毒包膜的RNP本身的RNP載體。
副粘病毒科病毒中的NP、 P、 L蛋白質結合(-)鏈單鏈RNA，在基因 組RNA復制及蛋白質表達中發(fā)揮著不可缺少的作用(以下有時將NP、 P、 L蛋白質也稱為"基因組RNA結合蛋白質")。NP蛋白質非常牢固地結合基 因組RNA,是賦予基因組RNA模板活性的蛋白質?；蚪MRNA只有在與 NP蛋白質結合的狀態(tài)下才具有RNA合成的模板活性，在不結合于NP蛋白 質的狀態(tài)下，則完全沒有模板活性。P蛋白質作為RNA聚合酶的小亞單位， L蛋白質作為RNA聚合酶的大亞單位，結合基因組RNA。所以，在副粘病 毒科病毒中，NP、 P、 L蛋白質缺一不可，否則不會產(chǎn)生基因組RNA復制。
本發(fā)明的載體的第 一個實施方案的特征是含有這樣的復合體，其包含 (a )源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA,其被修飾為不表達從結合 副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選擇的、至少包 含L蛋白質在內的一種以上的蛋白質；和(b ) NP、 P及L蛋白質。本發(fā) 明的載體是一種含有復合體(RNP )的病毒粒子，所述復合體包含被修飾的 (-)鏈單鏈RNA (基因組RNA)和NP、 P、 L蛋白質。在第一個實施方案 中，本發(fā)明的載體所包含的(-)鏈單鏈RNA被修飾為至少不表達L蛋白 質。本發(fā)明的載體感染宿主后，在本發(fā)明載體所包含的NP、 P、 L蛋白質的 作用下，從基因組RNA所編碼的基因中表達蛋白質。然而，包含L蛋白質 在內的基因組結合蛋白基因由于未被編碼到本發(fā)明載體的基因組RNA中而 不表達，所以，不能形成自我復制病毒粒子(包含基因組RNA和NP、 P、 L蛋白質的粒子)。即，本發(fā)明的載體為非復制型病毒載體。將攜帶外源基 因的本發(fā)明的載體感染宿主時，外源基因在宿主細胞內進行表達，但不會 從本發(fā)明載體產(chǎn)生具有自我復制能力的病毒粒子。
所以從沒有自我復制能力這一點，可以說本發(fā)明載體具有很高的安全 性。如果只是使其缺失自我復制能力，可將破壞NP、 P、 L蛋白質機能的突 變導入基因組RNA中的NP、 P、 L基因，即可達到目的。但是，本發(fā)明載 體的意義不在于將突變導入基因來表達缺失功能的蛋白質，而是去除蛋白質表達本身。即，從降低免疫原性這一點看，本發(fā)明載體是比單純非復制 型載體更為安全性的載體。從這一觀點來說，本發(fā)明載體中包含的基因組
RNA可以只缺失L基因，優(yōu)選缺失L基因及NP或P基因，最優(yōu)選缺失所 有的NP、 P、 L基因。-
在RNA結合蛋白質基因中尤其是L基因在基因組上缺失，從這一點看， 本發(fā)明載體的優(yōu)點如下。由于L基因約占基因組RNA長度的一半，所以， 本發(fā)明載體的基因組RNA缺失L基因后可大幅度縮短基因組的長度。因此， 第一個優(yōu)點為，與缺失其它基因比，本發(fā)明載體能攜帶更長的外源基因。 第二個優(yōu)點為，基因組變短后，可期待提高轉錄效率、增加表達量。尤其 是用非復制型病毒載體表達外源基因時，不能期待通過病毒載體的自我復 制來增加外源基因表達量，因此，為確保蛋白質的高表達量，高轉錄效率 尤為重要。
本發(fā)明載體的第二個實施方案的特征為包含這樣的復合體，其包含 (a )源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA,其被修飾為不表達從結合 副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的蛋白質中選擇的多種蛋白質；和(b ) NP、 P及L蛋白質。作為第二個實施方案的病毒載體基因組RNA的范例之 一，可以列舉的是修飾為編碼L基因但不編碼NP和P基因的基因組RNA， 但并不限于此，修飾為不表達2種或3種基因組RNA結合蛋白質的基因組 RNA均包括在內。缺失多種基因比只缺失NP或P中任一基因更能降低來 源于病毒的蛋白量。此外，由于基因組RNA的長度進一步縮短，可攜帶更 長的外源基因。
如上所述，本發(fā)明載體的基因組RNA缺失基因組RNA結合蛋白質基 因的一部分或全部。在第一個實施方案中，基因組RNA至少缺失L基因， 優(yōu)選缺失L基因和NP基因或L基因和P基因，最優(yōu)選NP、 P、 L基因全部 缺失；在第二個實施方案中，缺失多種基因組RNA結合蛋白質基因。另一 方面，基因組RNA所編碼的基因可以保持病毒來源的原有基因序列，也可 導入其它突變。例如，本領域技術人員可采用已知方法將不破壞各蛋白質 機能的輕微突變導入到基因組RNA上的各基因中。例如，利用PCR法及 盒式突變法等導入位點特異性突變，用化學試劑及隨機核苷酸等導入隨機
25%甲酰胺、較嚴格的條件為50%曱酰胺、4xSSC、 50mM Hepes pH7.0、10xdenhardts溶液、20昭/ml變性鮭精DNA的雜交溶液中，42。C下預雜交過 夜后，42。C下過夜雜交。之后在"lxSSC、 0.1%SDS、 37。C，，左右的洗滌液及 溫度條件下清洗，較嚴格條件為"0.5xSSC、 0.1%SDS、 42°C"，更嚴格條件 為"0.2xSSC、 0.1%SDS、 65。C，'。 一般情況下，利用這種雜交技術單離的多 核苦酸編碼的多肽與上述(-)鏈RNA編碼的多肽在氨基酸序列上具有高的同 源性。所謂高同源性是指至少40%以上，優(yōu)選60%以上，更優(yōu)選80%以上， 更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選至少95 %以上，最優(yōu)選至少97%以上(例如，98-99 % )的序列的同源性。關于氨基酸序列的同一性，例如可以根據(jù)Karlin和 Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA卯:5873-5877, 1993)來確定。用根據(jù)這種算法開發(fā)的 BLASTX (Altschul等.J. Mol. Biol.215:403-410， 1990)解析氨基酸序列時， 參數(shù)可為例如分數(shù)(score) = 50、字長(wordlength) = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各程序的默認參數(shù)。這些具體的解析方法是眾所周 ^口的(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
已知在P基因中導入突變，可降低副粘病毒載體的細胞毒性。本發(fā)明 載體的基因組RNA編碼P基因時，也可在基因組上的RNA基因中導入該 突變。舉例來說，這種突變具體有SeVP蛋白質的第511位的Leu (L511 ) 置換為其它氨基酸，或者是其它(-)鏈RNA病毒P蛋白質的同源位點的置換。 氨基酸突變也可以是置換為所需的其它氨基酸，優(yōu)選置換為側鏈的化學性 質不同的氨基酸。例如，氨基酸可分類為堿性氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、 組氨酸)、酸性氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酸)、非帶電極性氨基酸(如甘氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基 酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、 色氨酸)、|3分支氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)及芳香族氨基酸(如 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等組群，某種氨基酸可以置換為該氨 基酸所屬組群以外的氨基酸。具體的說，堿性氨基酸可以置換為酸性或中 性氨基酸，極性氨基酸可以置換為非極性氨基酸，分子量大于20種天然氨 基酸平均分子量的氨基酸可以置換為小于其平均分子量的氨基酸，反之， 小于平均分子量的氨基酸可以置換為比其大的氨基酸，但不限于此。具體 來說，例如L511置換為Phe (L511F)等。編碼包膜蛋白基因的一部分或全部。由于被修飾為既不表達基因組RNA結
合蛋白質基因，也不表達包膜蛋白質基因，所以，可進一步改善體內給藥
載體時的免疫原性?；蚪MRNA所編碼的包膜蛋白基因(M、 F、 HN基因) 可以是野生型，也可導入溫度敏感性突變。包膜蛋白的溫度敏感性突變詳 述于WO2003/025570。
本發(fā)明載體中包含的基因組RNA中至少缺失L基因，或者缺失多種基 因組RNA結合蛋白基因，在NP、 P、及L蛋白質存在的情況下，可以使該 基因組RNA (正鏈或負鏈)進行轉錄，由此制備本發(fā)明的RNP?？梢栽?BHK-21或LLC-MK2細胞等中完成RNP的形成。只要不是由病毒載體提供， 可通過各種方法提供NP、 P、 L蛋白質。例如，可以通過將編碼各基因的表 達載體導入到細胞來供給蛋白質(參照實施例)。各基因還可整合到宿主細 胞的染色體中。為形成RNP而表達的NP、 P、 L基因不需要與載體基因組 所編碼的NP、 P、 L基因完全同一。即，這些基因編碼的蛋白質的氨基酸序 列即使不與RNP基因組編碼的蛋白質氨基酸序列完全一致，只要與基因組 RNA結合，并在細胞內具有基因組轉錄復制活性，也可導入突變或用其它 病毒的同源基因代替。
在細胞內重建載體時，如果NP、 P及L蛋白質在細胞內表達，則這些 蛋白質被整合到病毒載體中，可生產(chǎn)攜帶感染性的病毒載體。這樣的載體 一旦感染細胞，即使可以通過細胞內RNP由基因組RNA表達蛋白，但由 于其本身沒有L基因，所以不能再次生產(chǎn)具有與原來相同的復制能力的病 毒。尤其在基因治療等中，這種載體對需要盡量減輕載體影響的對象疾患 或應用領域非常有用。
重建本發(fā)明病毒載體通?？墒褂孟率鲋苽浞椒?a )將編碼源自副粘 病毒的(-)鏈單鏈RNA(其被修飾為不表達從副粘病毒的NP、 P及L蛋白 質中選擇的、包含L蛋白質在內的一種或多種蛋白質)或其互補鏈的載體 DNA導入到表達結合該(-)鏈單鏈RNA的、源自副粘病毒的蛋白質的細 胞(輔助細胞)并使其表達；(b )培養(yǎng)該細胞，并從其培養(yǎng)上清回收病毒 粒子。在上述(a )步驟中，也可以采用"編碼修飾為不表達從NP、 P、 L 蛋白質中選擇的多種蛋白質的、源于副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或 其互補鏈的DNA"。表達載體DNA時，通過共表達NP、 L、及P蛋白質而 形成RNP,從而構建本發(fā)明的病毒。在輔助細胞內表達的載體CDNA編碼本發(fā)明載體中包含的(-)鏈單鏈
RNA (負鏈)或其互補鏈(正鏈)。例如，將編碼(-)鏈單鏈RNA或其互 補鏈的DNA連結到T7啟動子的下游，通過T7 RNA聚合酶轉錄為RNA。 載體cDNA也可克隆到質粒中，使其可以在大腸桿菌C&c/zeWc/n'a co/Z)中擴 增。在細胞內轉錄的鏈，可以是病毒的正鏈或負鏈，但為了提高重建效率， 優(yōu)選使得正鏈轉錄。例如，本發(fā)明實施例載體cDNA設計為正鏈轉錄(序 列號3 )。
輔助細胞使用表達NP、 L及P蛋白質的細胞。輔助細胞并不限定于表 達病毒載體中缺失蛋白質(NP、 L、 P)的細胞，也可以是表達與該病毒載 體缺失的基因所編碼的基因組RNA結合蛋白質不同的基因組RNA結合蛋 白質的細胞。例如，只要基因組RNA可以復制、轉錄，也可使用其它副粘 病毒的基因組RNA結合蛋白質。
只要不通過病毒載體，這些基因可以利用各種方法在輔助細胞內表達。 例如，可以將表達缺失L基因或包含L基因在內的多個基因的重組仙臺病 毒載體基因組的質粒，與NP、 P/C及L蛋白質的表達載體一起轉染到宿主 細胞，重建病毒載體。例如，可以使用L基因整合到染色體的宿主細胞進 行重建。由病毒基因組以外供給的這些蛋白質群組的氨基酸序列即使和病 毒原有序列不完全一致，只要在核酸導入中的活性與天然型相同或超過天 然型，則可以導入突變，或用其它病毒的同源基因代替。
輔助細胞還可以是具有促進病毒粒子形成和釋放功能的蛋白質。例如， 可以是表達C蛋白質的細胞。若采用C蛋白質，為了提高本發(fā)明病毒載體 的生產(chǎn)效率，優(yōu)選在輔助細胞中對C蛋白質進行表達。仙臺病毒的C蛋白 質有4種，即C，、 C、 Yl、 Y2，它們在同一個讀碼框上分別通過不同的起 始密碼子翻譯。對于重建本發(fā)明的病毒載體時在輔助細胞中表達的C蛋白 質，只要上述4種蛋白質中的任何一種或多種蛋白進行表達即可。作為用 于重建本發(fā)明病毒載體的細胞，優(yōu)選C，、 C、 Yl、 Y2的4種蛋白全部表達 的輔助細胞。本發(fā)明的病毒載體從基因組RNA中去除了 P基因時，也會去 除與P基因讀碼框不同的C基因。基因組RNA上缺失C基因時，可以將編 碼C基因的表達載體導入到輔助細胞，使C基因在輔助細胞內表達。不過， 作為在輔助細胞中表達C蛋白質的方法，已知C蛋白質的持續(xù)表達細胞抹 中載體基因組的復制受到抑制(Kato A等人，J Virol. 78， 7443-54 (2004)),可能難以提供持續(xù)表達，具體可參照后述的實施例。
如果形成RNP或病毒，將該RNP或病毒再次導入到上述輔助細胞進 行培養(yǎng)，可以擴增本發(fā)明的載體。這個過程包含如下步驟，(a )將包含源 自副粘病毒的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-)鏈單鏈RNA的蛋白質的復合 體導入到表達包膜蛋白質的細胞的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表 達從結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P、 L蛋白質中選擇的、 至少包括L蛋白質在內的一種以上的蛋白質；和(b )培養(yǎng)該細胞，并從 其培養(yǎng)上清回收病毒粒子?；蛘甙缦虏襟E，(a )將包含源自副粘病毒 的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-)鏈單鏈RNA的蛋白質的復合體導入到 NP、 P、 L蛋白質及包膜蛋白質的表達細胞，該(-)鏈單鏈RNA被修飾為 不表達從結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選 擇的多種蛋白質；和(b )培養(yǎng)該細胞，并從其培養(yǎng)上清回收病毒粒子。
為了將RNP導入到細胞，例如，可以與脂轉染胺(lipofectamine)、聚陽 離子脂質體(polycationicliposome)等形成復合體，然后導入到細胞。具體可 以使用各種轉染試劑。例如，DOTMA (Boehringer)、 Superfect (QIAGEN #301305 )、 DOTAP、 DOPE、 DOSPER ( Boehringer #1811169 )、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)等等。為了防止在內體中降解，還可加入氯喹(Calos， M，P.， 1983, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015 )
包膜蛋白除病毒包膜蛋白外，例如可以使用嵌合蛋白等，其細胞外區(qū) 域攜帶能夠粘附于特定細胞的源自粘附因子、配體、受體等的多肽、細胞 內區(qū)域攜帶源自病毒包膜的多肽。由此能夠制備以特定組織為靶標的載體。 例如，為了降低免疫原性或提高RNA轉錄效率及復制效率，本發(fā)明的病毒 載體中所含的病毒基因可以是修飾后的病毒基因。
本發(fā)明的載體在(-)鏈單鏈RNA中可包含編碼外源基因的RNA。外 源基因可使用期望在靶細胞中表達的所需基因。例如，以基因治療等為目 的時，可將對象疾患的治療用基因插入到該病毒載體基因中。向病毒載體 基因導入外源基因時，例如，導入仙臺病毒載體基因中時，有必要考慮在 轉錄起始(S)序列和轉錄終止(E)序列之間等插入序列，使基因組的總堿基數(shù) 為6的倍數(shù)(Journal of Virology, Vol.67， No.8, 1993, p.4822-4830 )。外源基因 可插到病毒各基因的前面或后面(參照實施例)。為避免妨礙前后基因的表 達，在外源基因前面或后面適當插入E-I-S序列(轉錄起始序列-插入序歹寸-轉錄終止序列)或其部分。對于插入的外源基因的表達量，可通過附加在 外源基因上游的轉錄起始序列的種類來調節(jié)，也可通過基因插入位置及基 因前后的堿基序列進行調節(jié)。例如，仙臺病毒中的插入位置越靠近(-)鏈
RNA的3'端(從野生型病毒基因組的基因排布上說，為越靠近NP基因)，
所插入的基因的表達量越高。為提高外源基因的表達效率，優(yōu)選將外源基
因插入負鏈基因組的上游區(qū)域(負鏈3'側)。反之，插入位置越靠近負鏈RNA
的5'端(從野生型病毒基因組的基因排布上說，為越靠近L基因)，所插入
基因的表達量越低。為了控制外源基因低表達，例如，將外源基因插到負
鏈的最靠近5'側，即野生型病毒基因組的L基因下游(負鏈中L基因的5'
鄰接部位)或L基因的上游(負鏈中L基因的3'鄰接部位)。另外，也可將
一個或多個基因組啟動子與外源基因一起插入。本發(fā)明中的基因組啟動子
沒有特別限制，例如采用RNA聚合酶I啟動子。將細胞內表達RNA聚合
酶I的細胞作為生產(chǎn)細胞時，不需要由外源載體供給RNA聚合酶I ,可節(jié)
省其供給成本。由此，可與T7系同樣實現(xiàn)基因的高表達效率。為便于外源
基因的插入，可在插入部位設計克隆位點?？寺∥稽c可作為例如限制酶的
識別序列?？蓪⑼庠椿蚱尾迦刖幋a基因組的載體DNA的該限制酶部位。
克隆位點也可作為有多個限制酶識別序列的所謂多克隆位點。這樣，本發(fā) 明的載體可以攜帶外源基因。
攜帶外源基因的重組仙臺病毒載體，例如可依Kato, A等人，1997, EMBO J. 16: 578-587及Yu， D.等人,1997， Genes Cells 2: 457-466的記載，采 用如下方法構建。
首先，制備包含所需外源基因的cDNA堿基序列的DNA試液。所述 DNA試液優(yōu)選在至少25ng/(il的濃度下可以通過電泳確認為單一質粒。下 面以利用Notl位點將外源基因插入編碼病毒基因組的DNA為例進行說明。 如果目的cDNA堿基序列包含Notl識別位點，則優(yōu)選采用位點特異性突變 插入法等，修飾堿基序列而除去該Notl識別位點，但維持所編碼的氨基酸 序列不變。采用PCR方法，從所述DNA試液中擴增回收所需基因片段。 作為包含NotI限制性酶切位點序列、轉錄終止序列(E )、插入序列(I ) 和轉錄起始序列(S )以及部分目的基因序列的引物對，設計正向合成DNA 序列(有義鏈)和反向合成DNA序列(反義鏈)，使擴增片段的兩個末端都 帶有NotI位點，并在其一個末端添加仙臺病毒轉錄終止序列(E )、插入序列(I )和轉錄起始序列(S ) ( E I S序歹'J )的拷貝。
例如，正向合成DNA序列中，為保證用NotI切斷，在其5'-側選擇2 個或更多個任意核苷酸(優(yōu)選4個堿基，但不包括源自Notl識別位點的GCG 和GCC等序列；更優(yōu)選ACTT ),在其3'-側添加Notl識別位點gcggccgc， 再在其3'-側添加任意9個堿基或9加6的倍數(shù)個堿基作為間隔序列，再在 其3'-側附加所需cDNA的ORF的約25個堿基的相應序歹ij(從起始密碼子 ATG開始，含其在內)。為了使最后一個堿基以G或者C結束，優(yōu)選從所需 cDNA選擇約25個堿基，以此作為正向合成寡DNA的3'-末端。
反向合成DNA序列中，從5'-端選擇2個或更多個任意核芬酸(優(yōu)選 4個堿基，但不包含源自Notl識別位點的GCG、 GCC等序列，更優(yōu)選 ACTT )，在其3'-側添加Notl識別位點gcggccgc,再在其3'-側添加用于調節(jié) 長度的插入片段寡DNA。設計這些寡DNA的長度時，其堿基數(shù)應使仙臺 病毒基因組的堿基總數(shù)為6的倍數(shù)(所謂"6位規(guī)則(rule of six )"; Kolakofski， D.等人，J. Virol. 72:891-899, 1998)。進而，在插入片段的3'-側添加仙臺病 毒的S序列的互補鏈序列，優(yōu)選5'-CTTTCACCCT-3'(序列號8 ); I序列， 更優(yōu)選5'-AAG-3'; E序列的互補鏈序列，更優(yōu)選5'-TTTTTCTTACTACGG-3' (序列號9 ),再在其3'-側添加所需cDNA序列從終止密碼子起倒數(shù)約25 個堿基的互補鏈，并選擇其長度使得最后一個堿基為G或C，以此作為反 向合成寡DNA的3'-末端。
PCR可采用ExTaq聚合酶(寶酒造)的常規(guī)方法。優(yōu)選使用Vent聚合 酶(NEB),擴增的所需片段用Notl消化后，插入質粒載體pBluescript的 Notl位點。用測序儀確認所得PCR產(chǎn)物的堿基序列，選出正確序列的質粒。 用Notl從該質粒切割插入片段，克隆到包含缺失包膜基因的基因組cDNA 的質粒的Notl位點。不經(jīng)過質粒載體pBluescript的介導，直接插入Notl位 點，便可得到重組仙臺病毒cDNA。
可將本發(fā)明的病毒載體cDNA在試管內或細胞內轉錄，使其與另行表 達的L、 P、 NP蛋白質相結合，重建RNP,生成包含該RNP的病毒載體。 從編碼修飾為不表達部分病毒來源蛋白的(-)鏈單鏈RNA或其互補鏈的病 毒載體cDNA中重建病毒粒子，可參考已知方法予以實施(W097/16539號; W097/16538號；Durbin, A.P.等人，1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. 等人，1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M丄等人，1994,EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F.等人，1995， EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D.等人， 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A.等人,1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.D,和Barrett, T., 1997， J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A.和Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404 )。特別是改良后的方 法更能有效地發(fā)揮作用(WO2005/071092)。對于本發(fā)明的病毒載體cDNA 所缺失的基因，可另行將該缺失的基因導入宿主細胞并使其表達。如果利 用本發(fā)明的病毒載體cDNA或被其它表達載體編碼的基因構建RNP,表達 包膜蛋白、重建病毒粒子，則可維持該病毒粒子的感染性。
另外，將RNP復合體本身作為RNA載體導入細胞時，也可利用上述 方法，與脂轉染胺及聚陽離子脂質體一起形成復合體，導入細胞。
將病毒載體cDNA導入細胞的方法有，(i)制備可被目的細胞攝入的 DNA沉淀的方法；(ii)制備復合體的方法，所述復合體適于被目的細胞攝入， 且包含具有較低細胞毒性的正電特性的DNA; (iii)利用電脈沖在目的細胞膜 上瞬時開孔的方法，孔的大小僅足以使DNA分子通過。
方法(ii)可以4吏用各種轉染試劑，例如DOTMA ( Boehringer )、 Superfect (QIAGEN #301305 )、 DOTAP、 DOPE、 DOSPER ( Boehringer #1811169 )、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)等。方法(i)可以用磷酸鈣進行轉染，用這 種方法導入細胞的DNA被吞噬體攝入，但已知細胞核中能夠攝入足量的 DNA (Graham, R L.和Van Der Eb, J., 1973， Virology 52: 456; Wigler, M.和 Silverstein, S.， 1977, Cell 11: 223)。 Chen和Okayama研究了導入技術的最佳 條件，他們的報告稱(l)細胞和共沉淀物的溫育條件為2~4% C02， 35°C, l5 ~ Mhr; (2)環(huán)狀DNA比線性DNA活性更高；(3)當沉淀混合液中的DNA 濃度為20 ~ 30|ig/ml時，可形成最佳沉淀(Chen, C.和Okayama， H., 1987， Mol. Cell. Biol. 7: 2745)。方法(ii)適于瞬時轉染。已知更早的方法是按所需的DNA 濃度比配制DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885 M.W. 5x 105)混合液進行轉染。由 于大多數(shù)復合體在內體中降解，可以加入氯喹來提高轉染效力(Calos,M.P., 1983,Proc.Natl.Acad. Sci. USA80:3015)。方法(iii)被稱為電穿孔方法，由于 沒有細胞選擇性，它比方法(i)和(ii)應用更廣。據(jù)稱在最佳的脈沖電流持續(xù) 時間、脈沖形式、電場強度(電極間的差、電壓)、緩沖液的導電率、DNA 濃度和細胞密度的條件下，效率較好。在上述三種方法中，方法(ii)操作簡單，并且能用大量的細胞檢測多個樣品。適用于本發(fā)明的轉染試劑有Lipofectamine 2000 ( Invitrogen )、 Superfect Transfection Ragent ( QIAGEN, Cat No. 301305 )、 DOSPER Liposomal Transfection Reagent ( Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169 )?；厥盏牟《镜牡味瓤赏ㄟ^測定CIU ( Cell-Infected Unit:細胞感染單位) 或紅細胞凝集活性(HA)來確定(WO00/70070; Kato, A.等人，1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda， Y" Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999 )。關于攜帶GFP (綠色焚光蛋白)等標記基 因的載體，可以將所述標記作為指標，直接計數(shù)受感染的細胞來定量滴度(例 如，GFP-CIU)。如此測定的滴度可與CIU進行等同處理(WO 00/70070)。回收的病毒載體可以純化至基本純。純化方法可利用過濾、離心分離 和柱純化等公認的純化分離方法或上述方法的組合方法。"基本純，，是指病毒 載體在其樣品中占主要成分。 一般來說，當樣品中所含的全部蛋白(作為承 運體和穩(wěn)定劑加入的蛋白除外)中，源自病毒載體的蛋白比例為10%以上， 優(yōu)選20 %以上，更優(yōu)選50 %以上，更優(yōu)選70 %以上，更優(yōu)選80 %以上， 進一步優(yōu)選90%以上時，可以確認為基本純的病毒載體。副粘病毒的具體 純化方法包括，例如，采用纖維素硫酸酯或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(特公昭 JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)以及吸附于含有硫酸 巖藻糖的多糖及/或其分解產(chǎn)物上的方法(WO 97/32010)。本發(fā)明的載體為L蛋白質等不表達的非復制型載體，整體來說可大幅 度降低病毒源蛋白質的表達，是具有很高安全性的載體。尤其在用于基因 治療時，載體的免疫原性越高，越限制載體的反復給藥，而本發(fā)明的載體 為低免疫原性，可期待擴大病毒載體基因治療的應用范圍。本發(fā)明的載體可以根據(jù)需要制備成組合物。在制備包含載體的組合物 時，可根據(jù)需要將該載體與藥學上可接受的承運體或賦形劑組合使用。"藥 學上可接受的承運體或賦形劑"是指可以與本發(fā)明載體一起給藥，不明顯抑 制該載體的基因導入活性的材料。例如，可以用生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽 水(PBS)等適當稀釋該載體，制成組合物。包含載體的組合物可以含有去離 子水和5%葡萄糖水溶液等承運體或賦形劑。除此以外，還可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑和殺生物劑等。另外，可以添加防腐劑或其 它添加劑。包含本發(fā)明載體的組合物可以用作試劑或藥物。如果使用疾患治療用基因作為外源基因來制備載體，可給藥該載體， 進行基因治療。本發(fā)明的病毒載體用于基因治療時，無論使用直接給藥、 間接(回體(exvivo))給藥的任一基因表達方法，都可以表達有望獲得治療 效果的外源基因或患者體內供給不足的內在基因等。對外源基因沒有特別 限制，除編碼蛋白質的核酸外，例如，也可以是反義鏈或核酶等不編碼蛋 白質的核酸。如果使用編碼感染相關的細菌或病毒抗原的基因作為外源基因，可給 藥到動物，誘導該動物體內的免疫，即用作疫苗。用作疫苗時，本發(fā)明的載體可適用于腫瘤、感染及其它的一般疾患。例如，在治療腫瘤時，本發(fā)明的載體可用于腫瘤細胞或DC細胞等抗原提示 細胞(APC),以使具有療效的基因進行表達。這樣的基因有癌抗原Muc-l 或Muc-l樣粘蛋白串聯(lián)重復肽鏈(美國專利第5，744，144號)、黑素瘤gp100 抗原等。這些基因治療可廣泛應用到乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、 肺癌等。還可以與細胞因子類組合，提高佐劑效果。例如，i)IL-2和單鏈 IL-12的組合(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999 ); ii) IL-2 和干擾素-Y (美國專利第5，798，100號)；iii)單獨使用的粒細胞集落刺激因 子(GM-CSF); iv)以腦腫瘤為治療對象的GM-CSF和IL-4的組合(J. Neurosurgery 90 (6)， 1115-1124(1999))等。在感染的治療上，用于流感治療的有例如強毒抹H5N1型包膜；用于 日本腦炎治療的有例如包膜嵌合體(Vaccine, vol. 17, No. 15-16， 1869-1882(1999) );用于艾滋病治療的有例如HIV gag或SIV gag蛋白質(J. Immunology(2000) vol. 164, 4968-4978 ); 口服HIV包膜蛋白的免疫接種治療，包封在聚 乳酸-甘醇共聚物后給藥(Kaneko， H.等人，Virology 267: 8-16 (2000));用于 霍亂治療的有霍亂毒素B亞單位(CTB ) (Arakawa T,等人，Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、 Arakawa T，等人，Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292-7 );用于狂犬病治療的有狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell DL 等人，1998, Nature Medicine 4(8):949-52 );用于宮頸癌治療的有人類乳頭瘤 病毒6型的衣殼蛋白L1 ( J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000))等。載體的給藥量視疾病、患者的體重、年齡、性別、癥狀、給藥目的、給藥組合物的形態(tài)、給藥方法和導入基因類型等而異，如果是本領域技術 人員，可以適當決定。給藥途徑可以適當選擇，例如經(jīng)皮、鼻腔內、經(jīng)支 氣管、肌肉內、腹腔內、靜脈內、關節(jié)內、脊髓腔內及皮下給藥，但不限 于此。鼻腔內給藥為優(yōu)選給藥途徑之一。也可局部給藥或全身給藥。給藥載體優(yōu)選約105 ClU/ml-約10" ClU/ml的范圍內的給藥量，更優(yōu)選約107 CIU/ml-約109 ClU/ml ，最優(yōu)選約1 x 108 CIU/ml-約5 x 108 ClU/ml，并在藥學 上可接受的承運體中給藥。對人的一次給藥量優(yōu)選2xl05 CIU 2xl010 CIU，給藥次數(shù)可為一次給藥，或者視其臨床上可容許副作用的范圍而多次 給藥。1日給藥次數(shù)也可依此調整。如果是使用本發(fā)明載體制備的蛋白質制 劑，蛋白質的給藥量例如可在10ng/kg-100jig/kg的范圍內，優(yōu)選 100ng/kg-50(ig/kg,更優(yōu)選l|ig/kg-5(ig/kg。對人類以外的動物給藥時，例如 可根據(jù)目的動物與人的體重比或給藥靶部位的容積比(例如平均值)換算 劑量給藥。含有本發(fā)明載體的組合物的給藥對象為包括人、猴、小鼠、大 鼠、兔、綿羊、牛和狗等所有的哺乳動物。


圖1pMiniSeV/M/F/HN和pMiniSeV/GFP/M/F/HN的構建過程。圖2pCI-4C/P(-)的構建過程。圖3SeV的C蛋白質對MiniSeV/GFP/M/F/HN生產(chǎn)效率的影響。(A) 向導入了 pCAGGS-NP (Z)、 pCAGGS-P (Z)/4C(-)、 pCAGGS-L (TDK)和pCI 對照或pCI-4C/P(-)的BHK-21細胞中，感染MiniSeV/GFP/M/F/HN后，第4 天生產(chǎn)細胞的GFP熒光照片。(B )將(A)的第4天培養(yǎng)上清感染LLC-MK2 細胞后，第3天的GFP焚光照片。圖4(A)感染后第1 ~7天的MiniSeV/GFP/M/F/HN生產(chǎn)效率的 GFP照片。(B )第1 ~ 7天回收的培養(yǎng)上清的MiniSeV/GFP/M/F/HN滴度的 曲線圖。圖5MiniSeV/GFP/M/F/HN的體外的GFP表達的焚光照片。圖6pMiniSeVsp/GFP和pMiniSeVsp/荄光素酶的構建過程。圖7pMiniSeVDp/GFP和pMiniSeVDp/螢光素酶的構建過程。圖8基因組啟動子對MiniSeV載體表達量的影響。圖9MiniSeVSP/GFP的GFP表達的焚光照片。 實施例下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。 〔材料和方法〕 1 構建質粒1.1 pMiniSeV/M/F/HN (也可表記為pSeV/ANP/AP/AL ) 首先，以 pSeV(+18)為模板，采用引物為 M/Not I-F(5，-aagtggcggccgcacggcgcaatggcagatatc、 33mer (序歹'J號1 ))和HN/Sac II-R(5，-ggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattattaagactcggccttgcataatttag 、 70mer (序列號2 ))的PCR方法，得到Not I-M/F/HN-Sac II片段(圖1 )。然 后，將該片段用Notl和SacII處理、純化后，作為插入片段插到同樣用Not I和Sac II處理并去除包括SeV的NP/P/M/F/HN/L序列在內的片段的pSeV (+18)載體中，得到pMiniSeV/M/F/HN (序列號3 )。將pSeV/GFP/AF進行Not I處理J對GFP-EIS/Not I片段(序列號4 ) 進行分離、純化后，插到同樣經(jīng)Not I處理的pMiniSeV/M/F/HN載體中，得 到pMiniSeV/GFP/M/F/HN (圖1 )。攜帶其它目的基因(GOI)時，也參照 了 GFP-EIS/Not I片段的序列。用PCR擴增GOI-EIS/Not I片段，經(jīng)Not I 處理、純化后，插入到同樣用Notl處理的pMiniSeV/M/F/HN載體中，得到 pMiniSeV/GOI/M/F/HN。1.3 pCI-4C/P(-)首先，以pSeV(+18)為模板，采用引物為EcoR I-4C/P(-)-F ( 5，-acttgaattcacggcttcggctacacttaccgcctggatcaagatgccttcattc、 55mer(序歹'J號5 )) 和EcoR I-4C/P(-)-R( 5，- cgaggcggccgcttactcttgcactatgtg、 30mer(序歹'J號6 )) 的PCR方法，得到EcoRI-4C/P(-)-EcoRI片段(序列號7 )(圖3 )。然后， 將該片段用EcoRI處理并純化后，作為插入序列，插到同樣經(jīng)EcoRI處理、 純化的pCI-neo載體中，得到了 pCI-4C/P(-)。2MiniSeV/GFP/M/F/HN(也表記為SeV/GFP/ANP/AP/AL)的重建2.1 準備1)細胞前一天~ 8e5 BHK-21細胞/孔(6孔板)2) 20 %FBS/opti-MEM [目錄號31985-070,批號1183337, Invitrogen公 司](P&S無添加)
3) opti-MEM (原液) 2.2 準備轉染液 l)DNA溶液(每孔)
opti-MEM (無添力。原液) 300 |il
pCAGGS-NP (Z), 1嗎/ pi 0.5
pCAGGS畫P (Z)/4C(國)，1 (ig/ pi 0.5 pi
pCAGGS-L (TDK), 1嗎/ pi 2.0 |al
pCAGGS-T7， 1昭 1 1.0 |il
pMiniSeV/GFP/M/F應cDNA, 1嗎/ 5 pi 2) LipofectAMINE 2000試劑[目錄號11668-019,批號1188609 Invitrogen公司]溶液(每孔)
opti-MEM (無添加原液) 300 pi
LipofectAMINE2000 18 jid
3) 準備好LipofectAMINE 2000試劑溶液2)， 5分鐘后與l)的DNA溶 液混合，室溫下力t置20-30分鐘。
2.3 用opti-MEM (原液)洗滌一次，添力。0.6 ml/孑L的20% FBS/opti-MEM,然后，將0.5 ml/孔的上述轉染液加到細胞中。
2.4 在37。C下培養(yǎng)6小時后，添加1.2 ml/孔的10%FBS/G-MEM。第 二天，用VP-SFM洗滌一次后，加入2.5 pg/ml胰蛋白酶/VP-SFM進行培養(yǎng)。 以后每天更換培養(yǎng)液?；厥盏?-6天的上清(P0病毒溶液)，感染到生產(chǎn)細 胞(P0-P1的病毒傳代)中，進行病毒生產(chǎn)。生產(chǎn)細胞使用了前一天導入了 pCAGGS-NP(Z)、 pCAGGS-P(Z)/4C (-)、 pCAGGS-L (TDK)、 pCI-4C/P(-)的 BHK-21細胞。
3pMiniSeVSP/GFP和pMiniSeVsp/螢光素酶的構建 構建了在GFP基因或螢光素酶基因的上游添加一個啟動子的 pMiniSeVSp/GFP和pMiniSeVsp/螢光素酶。 SP:單-啟動子的cDNA序列
5'-accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatcc accctgaggagcaggttccagaccct, (96 nt)(序歹'J號20 )如圖6-A所示，以市場銷售的GFP質粒為模板，采用引物為Not I-GFP-N (5，一 agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg， 50 mer(序歹'J號10 )) 和GFP-Sac II-C (5，陽
caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg， 65 mer (序 列號11))的PCR方法，得到Not I-GFP-Sac II片#殳。然后，將該片段用 Not I和Sac II處理、純化后，作為GFP插入片段，插到同樣用Not I和Sac II處理并去除了包括SeV的NP、 P、 L、 M、 F、 HN序列在內的片^a的 pSeV(TDK)載體中，得到pMiniSeVSP/GFP (序列號12)。
另 一 方面，如圖6-B所示，采用引物為Not I-螢光素酶N (5 ，-atccatcgcggccgcagatcttcacgatggaagacgccaaaaacataaag, 50mer (序歹'J號13)) 和螢光素酶Sac II-C
(5 ， - acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc, 66mer (序列號14 ))的PCR方法，在螢光素酶的兩側添加Not I和Sac II 限制酶位點，用其替換pMiniSeVSP/GFP的Not I-GFP-Sac II序列，得到 pMiniSeVsp/荄光素酶(序列號15)。
4pMiniSeVDP/GFP和pMiniSeVop/安光素酶的構建
構建了在GFP基因或螢光素酶基因的上游添加2個啟動子的 pMiniSeVDP/GFP和pMiniSeV。p/螢光素酶。
DP:雙-啟動子的cDNA序列
Eicc3犯c3ag3g^幼犯catgtetgggatatgt3atg犯gttat3C3ggattttegtgtc犯敏3Tcc3c cctgaggagcaggttccagaccct
/肌3肌acatgtatgggatatgt肌tga3gtt3t3C3ggattttegggtc犯3gtatcc3Ccctg3gg3gc3ggttcc agaccct, (GP5 8A (96 nt) + GPd 12(84 nt))(序列號:21)
如圖7-A所示，以pMiniSeVSP/GFP為模板，分別采用224N (5，-ataccgcatcaggcgccattcg， 22 mer (序歹'J號16))和(GP58A-GPdl2)R (5，-gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg， 57 mer(序歹'j號17 )) 為引物進行PCR得到片段，及采用(GP58A-GPdl2)F (5，-ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer(序歹寸號18 ))牙口 GFP—Sac II匿C (序 列號11 )作為引物進行PCR得到片段，并分別進行純化。以這些片段為 模板，進而采用引物為224N和GFP-Sac II-C的PCR方法，得到片段。將 這個片段用KasI和SacII處理、純化后，作為插入片段，插到同樣經(jīng)KasI和Sac II處理并去除包括單啟動子(Single-promoter)序列在內的 pMiniSeVSP/GFP載體中，得到了 pMiniSeVDP/GFP (序列號19)。
如圖7-B所示，采用引物為Not I-螢光素酶-N和螢光素酶-Sac II-C的 PCR方法，在螢光素酶的兩側添加Not I和Sac II限制酶位點，用其替換 pMiniSeVDP/GFP的Not I-GFP-Sac II序列，得到了 pMiniSeVDp/螢光素酶。
5 MiniSeV 載體(MiniSeVSP/GFP， MiniSeVSP/螢光素酶， MiniSeVDP/GFP, MiniSeVDp/螢光素酶)的重建及生產(chǎn)
5.1 準備
1) 細胞前一天~ 8e5 BHK-21細胞/孔(6孔板)
2) 20 % FBS/opti-MEM [目錄號31985-070，批號1183337, Invitrogen公 司](P&S無添加)
3) opti-MEM (原液)
5.2 準備轉染液
1) DNA溶液(每孔)
opti-MEM (無添加原液) 300 pi
pCAGGS-NP (Z), 1嗎/ ^il 0.5 pi
pCAGGS-P (Z)/4C(-), 1嗎/ pi 0.5 ^
pCAGGS-L (TDK), 1嗎/ pi 2.0 pil
pCAGGS-M (Z), 1 jig/ pi 1.0 ^
pCAGGS-F5R， 1 jig/ ^ 1.0 |al
pCAGGS-HN(Z), 1嗎/ ^ 1.0 pi
pCAGGS-T7, 1 (ig/>l 1.0 pi
MiniSeV載體cDNA， 1嗎/ (il 5 pi
2) LipofectAMINE 2000試劑[目錄號11668-019，批號1188609， Invitrogen社]溶液(每孑L )
叩ti-MEM (無添加原液) 300 jil
LipofectAMINE2000 21 (il
3) 準備好2)的LipofectAMINE 2000試劑液5分鐘后，與l)的DNA溶 液混合，在室溫下放置20-30分鐘。
5.3 用opti-MEM (原液)洗滌 一 次，添力。0.6 ml/孑L的20 % FBS/opti-MEM后，將0.5 ml/孔的上述轉染液加入細胞中。5.4 上述細胞在37。C下培養(yǎng)6小時后，添加了 1.2 ml/孔的 10%FBS/G-MEM。第二天，用VP-SFM洗滌一次后，加入2.5嗎/ml胰蛋白 酶/VP-SFM進行培養(yǎng)。以后每天更換培養(yǎng)基?；厥盏?-6天的上清(P0病 毒溶液)，感染到生產(chǎn)細胞(P0-P1的病毒傳代)中，進行病毒生產(chǎn)。生產(chǎn) 細胞使用的是病毒感染的前一天導入了 pCAGGS-NP (Z)、 pCAGGS-P (Z)/4C (-)、pCAGGS-L (TDK)、 pCI畫4C/P(-) 、 pCAGGS-M(Z) 、 pCAGGS-F5R、 pCAGGS-HN(Z)的BHK-21細胞。
〔實施例1 〕SeV的C蛋白質對MiniSeV/GFP/M/F/HN生產(chǎn)效率的
影響
使用Lipofectamine 2000試劑，將pCAGGS陽NP (Z) 、 pCAGGS-P (Z)/4C(-)、 pCAGGS-L (TDK)和pCI對照或pCI-4C/P(-)導入到前一天用2e5 細胞/孔(12-孔膠原包被平板，IWAKI)接種的BHK-21細胞中。第二天將 MiniSeV/GFP/M/F/HN作為病毒種進行感染后，用含有胰蛋白酶(最終濃度 2.5嗎/ml)的VP-SFM培養(yǎng)液進行病毒生產(chǎn)。感染后第4天拍攝了生產(chǎn)細胞 的GFP熒光照片。回收第4天的培養(yǎng)上清，并感染到新鮮的LLC-MK2細 胞(24-孔平板)中，3天后拍攝了 GFP焚光照片。
與導入不表達C蛋白質的對照質粒[pCI-neo]的條件相比，在導入C蛋 白質表達質粒[pCI-4C/P(-)]的條件下，獲得了更高的病毒生產(chǎn)效率(圖3 )。 很顯然，為得到高生產(chǎn)效率有必要表達適量的C蛋白。
〔實施例2 〕MiniSeV/GFP/M/F/HN的生產(chǎn)
用Lipofectamine 2000試劑，將pCAGGS-NP (Z)、 P(Z)/4C(-)、 L(TDK) 和pCI-4C/P(-)導入到前一天用8e5細胞/孔(6-孔膠原包被平板，IWAKI)接種 的BHK-21細胞中。第二天將MiniSeV/GFP/M/F/HN作為病毒種進行感染后， 用含有胰蛋白酶(最終濃度2.5嗎/ml)的VP-SFM培養(yǎng)液進行病毒生產(chǎn)。感染 后第1~7天，每天拍攝GFP熒光照片，回收培養(yǎng)上清，更換培養(yǎng)液。對第 1 ~ 7天回收的培養(yǎng)上清進行CIU測定。
如圖4所示，從第3-6天的培養(yǎng)上清回收了 le7 GFP-CIU/ml以上滴度 很高的MiniSeV/GFP/M/F/HN。
〔實施例3 〕MiniSeV/GFP/M/F/HN的體外表達將MiniSeV/GFP/M/F/麗以MOI=100、 10、 1感染到當天用3e5細胞/ 孔(12-孑L膠原包被平板，IWAKI)接種的HeLa細胞中。并將 MiniSeV/GFP/M/F/HN以MOI=l和SeVagp55/dF以MOI=5進行共感染。拍 攝了感染后第l、 2天的GFP照片。
如圖5所示，MiniSeV/GFP/M/F/HN單獨用MOI-l感染時，只觀察到 微弱的GFP表達，用MOI=100感染時，確認到了接近于Helper-SeV (SeVagp55/AF)共感染(相當于復制型SeV )水平的GFP表達。
〔實施例4 〕基因組啟動子對MiniSeV載體表達量的影響 將MiniSeVsp/螢光素酶和MiniSeVDp/螢光素酶單獨感染(n=3 )或分別 與Helper-SeV(MOI10)共感染(『3)到前一天用2e5細胞/孔(12-孔膠原包尋皮 平板，IWAKI)接種的LLC-MK2細胞中。感染后的第2天，回收單獨感染孔 的細胞，測定了螢光素酶活性。用抗縈光素酶抗體將與Helper-SeV共感染 的孔進行免疫染色，計數(shù)了每孔的螢光素酶陽性細胞數(shù)。用螢光素酶活性 的平均值除螢光素酶陽性細胞數(shù)的平均值，可算出每個細胞的螢光素酶活 性。如圖8所示，與具有雙啟動子(Double-promoter)的MiniSeVDp/螢光素酶 相比，具有單啟動子(Single-promoter)的MiniSeVsp/螢光素酶載體每個細胞 的蛋白表達量(螢光素酶活性)約高1.5倍。
〔實施例5 〕 MiniSeVSp/GFP的GFP表達 將MiniSeVSp/GFP單獨感染或與Helper-SeV (MOI10)共感染到前一天 用2e5細胞/孔(12-孔膠原包被平板，IWAKI)接種的LLC-MK2纟田胞中，第2 天觀察GFP萸光，并進行了拍照。如圖9所示，與Helper-SeV共感染相比， 雖然MiniSeV載體單獨感染的GFP表達較弱，但單獨感染時也能觀察到明 顯的GFP表達細胞。
產(chǎn)業(yè)實用性
本發(fā)明者們開發(fā)的非復制型SeV載體具有高導入效率和低免疫原性， 所以可期待應用于抗體制作、蛋白機能解析、基因治療、基因疫苗等廣泛領域。
權利要求
1.一種載體，其含有復合體，所述復合體包含下述(a)和(b)(a)源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA，其被修飾為不表達從結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、P及L蛋白質中選擇的、至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和(b)NP蛋白質、P蛋白質及L蛋白質。
2. —種載體，其含有復合體，所述復合體包含下述(a )和(b ):(a )源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA,其被修飾為不表達從 結合副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白質中選擇的多種 蛋白質；和(b ) NP蛋白質、P蛋白質及L蛋白質。
3. 權利要求1和2所述的載體，其中源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單 鏈RNA被修飾為不表達NP、 P及L蛋白質。
4. 權利要求1 - 3中任一項所述的載體，其中源自副粘病毒科病毒的 (-)鏈單鏈RNA至少表達一種副粘病毒科病毒包膜蛋白質。
5. 權利要求4所述的載體，其中源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈 RNA被修飾為表達M、 F和HN蛋白質，而不表達NP、 P和L蛋白質。
6. 權利要求1-5中任一項所述的載體，其中(-)鏈單鏈RNA源自仙 臺病毒。
7. 權利要求l-6中任一項所述的載體，其中(-)鏈單鏈RNA還攜帶外源基因。
8. —種DNA，其編碼權利要求l-7中任一項所述載體中包含的(-) 鏈單鏈RNA或其互補鏈。
9. 一種權利要求1所述載體的制備方法，包含以下(a )、 ( b )步驟 (a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補鏈的DNA導入能夠表達NP、 P及L蛋白質的細胞的步驟，其中該(-)鏈單鏈 RNA被修飾為不表達從結合副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA的NP、 P 及L蛋白質中選擇的、且至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和 (b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
10. —種權利要求2所述載體的制備方法，包含以下(a )和(b )步驟(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補鏈的 DNA導入到能夠表達NP、 P、 L蛋白質的細胞中的步驟，該(-)鏈單鏈 RNA被修飾為不表達從NP、 P及L蛋白質中選擇的多種蛋白質；和(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
11. 權利要求9和IO所述的制備方法，其中能夠表達NP、 P、 L蛋白 質的細胞還能夠表達具有促進病毒粒子形成和釋放功能的蛋白質。
12. 權利要求11所述的方法，其中具有促進病毒粒子形成和釋放功能 的蛋白質為C蛋白質。
13. —種權利要求1所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b )步驟(a )將插入了編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互 補鏈的DNA的載體、NP蛋白質表達載體、P蛋白質表達載體及L蛋白質 表達載體導入到能表達這些載體的細胞中的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修 飾為不表達從結合副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA的NP、 P及L蛋白 質中選擇的、至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
14. 一種權利要求2所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b )步驟(a )將插入了編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互 補鏈的DNA的載體、NP蛋白質表達載體、P蛋白質表達載體及L蛋白質 表達載體導入到細胞的步驟，該(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表達從NP、 P及L蛋白質中選擇的多種蛋白質；和(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
15. —種權利要求1所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b )步驟(a )將包含源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-) 鏈單鏈RNA的蛋白質的復合物導入到表達NP、 P、 L蛋白質和包膜蛋白質 的細胞內的步驟，該源自副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表達 從結合該(-)鏈單鏈RNA的NP、 P、 L蛋白質中選擇的、至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和(b )培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
16. —種權利要求2所述載體的制備方法，包含下述(a )和(b )步驟(a )將包含源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA和結合該(-) 鏈單鏈RNA的蛋白質的復合物導入到表達NP、 P、 L蛋白質和包膜蛋白質 的細胞內的步驟，該源自副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA被修飾為不表達 從結合(-)鏈單鏈RNA的NP、 P、 L蛋白質中選擇的多種蛋白質；和(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
17. —種制備用于在靶細胞中表達外源基因的載體的方法，包含以下 (a )和(b )步驟(a )將編碼源自副粘病毒科病毒的(-)鏈單鏈RNA或其互補鏈的 DNA導入到能表達NP、 P、 L蛋白質的細胞內的步驟，該源自副粘病毒科 病毒(_)鏈單鏈RNA攜帶外源基因，并被修飾為不表達從NP、 P、 L蛋白 質中選擇的、至少包括L蛋白質在內的一種或多種蛋白質；和(b )培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
18. —種制備用于在靶細胞中表達外源基因的載體的方法，包含以下 (a )和(b )步驟(a )將編碼源自副粘病毒科病毒(-)鏈單鏈RNA或其互補鏈的DNA 導入到能表達NP、 P、 L蛋白質的細胞內的步驟，該源于副粘病毒科病毒(-) 鏈單鏈RNA攜帶外源基因，并被修飾為不表達從NP、 P、 L蛋白質中選擇 的多種蛋白質；和(b)培養(yǎng)所述細胞，并從該培養(yǎng)上清回收病毒粒子的步驟。
19. 一種在靶細胞中表達外源基因的方法，包含以下(a )、 ( b )步驟 (a)制備權利要求7所述載體的步驟；和(b )將權利要求7所述載體導入靶細胞的步驟。
全文摘要
本發(fā)明者們成功地制備了從基因組RNA中全部去除RNP構成蛋白的NP、P、L蛋白質基因的非復制型SeV載體，并確認到攜帶GFP等標記基因的NP/P/L缺失型SeV載體可以提高生產(chǎn)效率和外源基因導入及表達的效率(為獲得高表達量，需要高MOI感染)。本發(fā)明的載體通過去除L基因或NP、P、L基因等多個基因，可減少宿主細胞內的來源于病毒的蛋白表達量，降低體內給藥的免疫原性。
文檔編號C12N5/10GK101517079SQ20078003411
公開日2009年8月26日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權日2006年7月13日
發(fā)明者井上誠, 軍 游, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社