專利名稱：TGF-β在質(zhì)體中的表達(dá)的制作方法
TGF-Z 在質(zhì)體中的表達(dá)
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-"(TGF-")的表達(dá)。本發(fā)明涉及TGF-"在植物中的表達(dá)。特別地本發(fā)明涉及TGF-〃在植物葉綠體中的表達(dá)。TGF-/ 3是依照本發(fā)明表達(dá)的優(yōu)選TGF-々。本發(fā)明還提供適合用于在植物中表達(dá)TGF-"的嵌合核酸序列，以及通過(guò)此類方法產(chǎn)生的TGF-^和此類TGF-"的用途。
TGF-"是具有多樣性生物活性的細(xì)胞因子家族。迄今已鑒定了TGF-"家族的五個(gè)成員，同種型TGF-y l、 TGF-戶2、 TGF-^3、 TGF-^4和TGF-^5。這些TGF-》共享結(jié)構(gòu)相似性(例如共同的半胱氨酸結(jié)基序)以及共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
TGF-"具有可用于許多不同治療環(huán)境的生物活性。因此TGF-yff家族成員的藥學(xué)應(yīng)用受到很多關(guān)注。
迄今，最大的藥學(xué)關(guān)注顯示于TGF-/ 1、 TGF-"2和TGF-"3。這些同種型均發(fā)現(xiàn)于人類，已知它們?cè)趧?chuàng)傷愈合應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。
TGF-々1在預(yù)防和/或治療硬皮病、血管發(fā)生病癥、腎病、骨質(zhì)疏松癥、骨病、腎小球腎炎和腎病中具有用途。
TGF-々2可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸瘤、卵巢瘤、老年性黃斑退化癥、眼外傷、骨質(zhì)疏松癥、視網(wǎng)膜病、潰瘍、癌、口力空炎癥和》更皮病。
TGF-々3可用于治療纖維化病癥、硬皮病、血管發(fā)生病癥、再狹窄、粘附、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨誘導(dǎo)、體外受精、口腔粘膜炎、腎病，預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，增強(qiáng)周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元再連接，預(yù)防、減少或抑制眼科手術(shù)(例如LASIK或PRK手術(shù))的并發(fā)癥。
目前用于產(chǎn)生TGF-風(fēng)特別是用于治療用途)的方法依賴于通過(guò)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞或適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)染的細(xì)菌的培養(yǎng)物表達(dá)這些蛋白質(zhì)(以它們的活性形式或前蛋白形式)。雖然此類方法有效產(chǎn)生TGF--,但是它們通常產(chǎn)生的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?，此類蛋白的制備中涉及的成本高?br> 根據(jù)以上內(nèi)容，應(yīng)理解存在開(kāi)發(fā)不具有這些缺點(diǎn)的產(chǎn)生TGF--的新方法的非常明確的需求。
本發(fā)明某些實(shí)施方案的目標(biāo)是克服或消除現(xiàn)有技術(shù)的至少一些缺點(diǎn)。本發(fā)明某些實(shí)施方案的目標(biāo)是提供可用于以低于現(xiàn)有技術(shù)的方法的成本制備TGF-A的方法和/或手段。本發(fā)明某些實(shí)施方案的目標(biāo)是提供可用于以比現(xiàn)有技術(shù)的方法能制備的量大的量制備TGF-^的方法和/或手段。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供在植物中表達(dá)TGF-A的方法，所述方法包括
(a) 向植物細(xì)胞引入包含以下的嵌合核酸序列
(1) 能夠調(diào)節(jié)(2)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的第一核酸序列
(2) 編碼TGF-々并被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的第二核酸序列；和
(3) 編碼在所述植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)的第三核酸序列；和
(b) 培養(yǎng)所述;f直物細(xì)胞以產(chǎn)生所述TGF-〃。在本發(fā)明的第二方面，提供包含以下的嵌合核酸序列
(1) 能夠調(diào)節(jié)(2)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的第一核酸序列
(2) 編碼TGF-y9并被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的第二核酸序列；和
(3) 編碼在植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)的第三核酸序列。
本發(fā)明的方法和核酸特別適合用于在植物細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)TGF-々。特別地，所述嵌合核酸可以是適合用于轉(zhuǎn)化葉綠體基因組的核酸。合適的嵌合核酸可適合在植物葉綠體中表達(dá)，并可優(yōu)選地被適應(yīng)以此方式表達(dá)。本說(shuō)明書(shū)全文描述了可將核酸(嵌合核酸整體或組成所述嵌合核酸的第一、第二或第三核酸)被適應(yīng)以在植物細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)的優(yōu)選手段。
蛋白質(zhì)在葉綠體中的表達(dá)，特別是葉綠體轉(zhuǎn)化，提供了相對(duì)于在植物細(xì)胞中的其他地方表達(dá)的許多優(yōu)點(diǎn)。在葉綠體中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的區(qū)室化降低了對(duì)它們?cè)谄渲斜磉_(dá)的細(xì)胞的潛在毒性。葉綠體基因組以高拷貝數(shù)量存在，并可因此用于實(shí)現(xiàn)高表達(dá)水平。同源重組允許精確插入感興趣的核酸，和它們的產(chǎn)物的持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。廣泛的植 物中都可觀察到此類表達(dá)。最后，許多農(nóng)作物植物中的母體遺傳表明， 花粉中轉(zhuǎn)基因的不希望的傳播的風(fēng)險(xiǎn)被大大降低。
本發(fā)明的第 一 和第二方面中所指類型的"第 一核酸序列"是能夠調(diào) 節(jié)第二核酸序列(如其他地方所定義)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的 核酸序列。能夠調(diào)節(jié)第二核酸序列的翻譯的本發(fā)明的第 一核酸序列將 優(yōu)選地包含啟動(dòng)子位點(diǎn)?？刹⑷氡景l(fā)明的第一核酸序列的合適啟動(dòng)子 位點(diǎn)的詳情參見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)的其他地方。能夠調(diào)節(jié)第二核酸序列轉(zhuǎn)錄的
本發(fā)明的第 一核酸序列將優(yōu)選地包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)?？刹⑷氡?發(fā)明的第一核酸序列的合適RBS的詳情參見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)的其他地方。通 常優(yōu)選的是，本發(fā)明的第 一 核酸序列是能夠調(diào)節(jié)第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄 和翻譯兩者的核酸序列。因此，優(yōu)選的第一核酸序列可包含合適的啟 動(dòng)子和合適的RBS兩者?？捎糜诖祟惤M合的第一核酸序列的優(yōu)選的啟 動(dòng)子和RBS參見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)的其他地方。優(yōu)選的第一核酸序列可被適應(yīng) 以調(diào)節(jié)在植物細(xì)胞葉綠體中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
本發(fā)明的"第二核酸序列"是編碼待表達(dá)的TGF-y9并被適應(yīng)以在植 物細(xì)胞中表達(dá)的序列。所述第二核酸序列的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄可被如上所 述的適當(dāng)?shù)牡谝缓怂嵝蛄姓{(diào)節(jié)。應(yīng)理解，合適的第二核酸序列可編碼 期望在植物細(xì)胞中表達(dá)的任何TGF-々。例如，優(yōu)選的第二核酸可編碼 TGF-戶l、 TGF--2或TGF-y93，其中TGF-"3可以是更加優(yōu)選的?？墒?用 一種或多種不同的適應(yīng)策略以使本發(fā)明的第二核酸被適應(yīng)以在植物 細(xì)胞中表達(dá)。合適的適應(yīng)策略的實(shí)例參見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)的其他地方。優(yōu)選 的第二核酸序列可適應(yīng)它們?cè)谥参锛?xì)胞的葉綠體中的表達(dá)。
本發(fā)明的"第三核酸序列，，是編碼可用于終止所述第二核酸的翻譯 的終止區(qū)的序列。所述終止區(qū)是在植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)。優(yōu) 選地，合適的終止區(qū)是在植物細(xì)胞的葉綠體中具有功能的終止區(qū)。可 依照本發(fā)明使用合適的第三核酸序列(包括適合用于植物細(xì)胞和葉綠 體的序列)的實(shí)例參見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)的其他地方。
所述第一和/或第二和/或第三核酸序列可優(yōu)選地彼此遺傳融合，從 而產(chǎn)生包含所述不同核酸序列的單個(gè)嵌合核酸分子。優(yōu)選地本發(fā)明的嵌合核酸序列是DNA序列。因此，應(yīng)理解，優(yōu) 選的第 一和/或第二和/或第三核酸序列是DNA序列。
從其最廣泛的解釋而言，術(shù)語(yǔ)"被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)"可用 來(lái)包括可在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)以實(shí)現(xiàn)需要的活性或表達(dá)的任何核 酸?？刹捎酶鞣N策略以促進(jìn)嵌合核酸在葉綠體中的表達(dá)。幾個(gè)此類合 適的策略在本說(shuō)明書(shū)的其他地方中進(jìn)一步詳細(xì)討論，并且這些特定策 略可代表將核酸被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)選手段。
本發(fā)明的核酸可并入合適的質(zhì)粒，例如葉綠體靶向質(zhì)粒。 一般可 優(yōu)選的是，要在葉綠體中表達(dá)的核酸具有質(zhì)體靶向DNA區(qū)域的側(cè)翼， 所述質(zhì)體靶向DNA區(qū)域允許將所述嵌合核酸分子插入葉綠體基因組。 合適的質(zhì)粒代表用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選試劑。
要表達(dá)的TGF-"可以是得自任何動(dòng)物、人或非人的任何TGF-P， 但是優(yōu)選地所述TGF-y 是人TGF-/ 。
本發(fā)明的方法或核酸可用于表達(dá)任何TGF-〃 (例如TGF-"1、 TGF-^2、 TGF-A3、 TGF-"4或TGF-/ 5的任何一個(gè))。優(yōu)選所述TGF-" 選自由TGF-"1、 TGF-"2和TGF-"3組成的組。更優(yōu)選地，所述TGF-/ 是TGF-"3。特別優(yōu)選地，所述TGF-A是人TGF-^3。
應(yīng)理解，由本發(fā)明的核酸序列編碼的TGF-"將優(yōu)選地包含TGF-yS 的活性片段。所編碼的TGF-"可合適地僅包含所述活性片段(即未與潛 在相關(guān)肽結(jié)合)。合適的核酸可編碼所選TGF-"活性片段的全部或部 分。作為參考，TGF-^1、 TGF-^2和TGF-^3的活性片段的氨基酸序列 分別在

圖11中顯示為序列ID No. 1至3。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的或根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)的TGF-P可包 含TGF-"前蛋白。此類前蛋白可展示出使它們適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存或在商業(yè) 使用前加工的穩(wěn)定性。本發(fā)明人認(rèn)為由于蛋白的穩(wěn)定性，前蛋白同型 二聚體(75kDa)的純化可比活性區(qū)同型二聚體(24kDa)的純化更容易。 活性蛋白的包嚢作用可將蛋白半衰期增加40倍，并且設(shè)計(jì)的切割位點(diǎn) 在其作用的治療位點(diǎn)釋放所述蛋白。所述前蛋白可于純化后在體外切 割，以提供活性區(qū)，例如用作治療劑。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的或根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)的TGF-"可包含全長(zhǎng)TGF-"，優(yōu)選具有序列ID No. 6、 7或8的任何一個(gè)編碼的氨基
酸序列的全長(zhǎng)TGF-yg。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的TGF-P可包含TGF-々的變體形式。 本發(fā)明的方法和核酸可使用得自在植物葉綠體中表達(dá)的基因的啟
動(dòng)子。優(yōu)選地合適的啟動(dòng)子得自光合基因。
組質(zhì)體啟動(dòng)子(其包含表達(dá)光合作用相關(guān)基因、遺傳系統(tǒng)基因和被質(zhì) 體編碼的質(zhì)體(PEP) RNA聚合酶或核編碼的質(zhì)體(NEP) RNA聚合酶識(shí) 別的任何其他基因的啟動(dòng)子)、藻類啟動(dòng)子、細(xì)菌啟動(dòng)子或噬菌體(phage) 啟動(dòng)子，例如質(zhì)體psbA啟動(dòng)子、質(zhì)體16S rrn啟動(dòng)子、衣藻 (Chlamydomonas) psbA啟動(dòng)子、纟田菌trc啟動(dòng)子和嗟菌體(bacteriophage) T7啟動(dòng)子。在此組中，16srrn啟動(dòng)子代表優(yōu)選的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng) 子可得自煙草(Nicotiana tabacum)或優(yōu)選地得自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)。事實(shí)上，甘藍(lán)型油菜16srrn啟動(dòng)子代表用于本發(fā)明的方法或 核酸的特別優(yōu)選的啟動(dòng)子。
用于本發(fā)明的方法或核酸的合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)可選自 由任何質(zhì)體RBS (例如rbcLRBS或psbARBS)、或細(xì)菌或嗟菌體RBS (例如T7gl0 RBS)組成的組。在此組中，T7gl0 RBS可以是優(yōu)選的RBS。 用于本發(fā)明的方法的其他合適的RBS包括得自煙草的那些，例如煙草 psbARBS。
可用于本發(fā)明的方法或核酸的合適的終止子可選自由質(zhì)體終止子 (包括psbA終止子、rbcL終止子、rpsl8終止子(來(lái)自核糖體蛋白S18) 和psbC終止子)或細(xì)菌終止子或噬菌體終止子組成的組。psbC終止子 代表此組中有利的終止子。合適的終止子可得自大麥(Hordeum vulgare),或優(yōu)選地得自甘藍(lán)型油菜。甘藍(lán)型油菜psbC終止子是依據(jù) 本發(fā)明使用的特別優(yōu)選的終止子。
如上所示，葉綠體表達(dá)可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的TGF-々在眾多植物中 的表達(dá)。本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的方法和核酸(并且特別是用于葉綠體表 達(dá)的那些)可用于單子葉植物或雙子葉植物?？梢勒毡景l(fā)明的方法和核 酸使用的雙子葉植物的優(yōu)選實(shí)例是煙草。 一般而言，本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的方法和核酸可與眾多植物(包括陸生植物和藻類)連同使用。合
適的植物包括但不限于，甘藍(lán)、花椰菜、小球藻(Chlorella)、衣藻、大 麥、胡蘿卜、萵苣、苔蘚、玉米、油菜、胡椒、馬鈴薯、水稻、大豆、 向日葵、西紅柿、小麥。本發(fā)明的方法或核酸可利用根據(jù)它們要在其 中表達(dá)的所選植物選4奪的適當(dāng)?shù)陌蚁蛐蛄泻蛦?dòng)子。例如，合適的本 發(fā)明的核酸或方法可利用適合用于藻類或苔蘚的靶向序列和啟動(dòng)子。
如上所示，本發(fā)明人認(rèn)為T(mén)GF-"在葉綠體中的表達(dá)，并且特別是 是由于葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化而發(fā)生的此類表達(dá)，提供了在本發(fā)明環(huán)境 下的許多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人已鑒定了可用于產(chǎn)生編碼TGF-"并被適應(yīng)以 在葉綠體中表達(dá)的核酸的許多策略。
本發(fā)明的TGF-/ 的表達(dá)可通過(guò)使用適合葉綠體表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序 列(位于本說(shuō)明書(shū)的其他地方所稱的"第 一核酸序列"，其可包含啟動(dòng)子 和核糖體結(jié)合位點(diǎn))實(shí)現(xiàn)，并且優(yōu)選地可利用優(yōu)先或甚至特異性進(jìn)行葉 綠體表達(dá)的第 一核酸序列。
同樣地，本發(fā)明的方法和核酸可利用適合在葉綠體中表達(dá)的終止 區(qū)(位于本說(shuō)明書(shū)的其他地方所稱的"第三核酸序列，，)。此類第三核酸序 列可甚至更優(yōu)選地是葉綠體表達(dá)優(yōu)先或特異性的。
特別地，用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酸適應(yīng)可參考編碼待表達(dá)的 TGF-P的序列(本文所述的"第二核酸序列")進(jìn)行。本發(fā)明人已鑒定了可 用于將此類第二核酸序列凈皮適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且更特別地 在葉綠體中表達(dá)的許多手段。使用這些手段中的一種或多種產(chǎn)生合適 的第二核酸序列可以是本發(fā)明描述的任何方法或核酸序列的優(yōu)選實(shí)施 方案。
可將此類第二核酸序列被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中或更特別地在葉綠 體表達(dá)的一個(gè)優(yōu)選方法是，置換編碼待表達(dá)的TGF-y9的天然DNA中 發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可優(yōu)選置換編碼天然DNA中存在的 氨基酸半胱氨酸的一個(gè)或多個(gè)密碼子。TGF-y9包含許多半胱氨酸殘基， 并且這些殘基是TGF-々蛋白的特征。但是，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸在葉綠體基 因產(chǎn)物中的量低于其他氨基酸，并且在光合葉綠體基因產(chǎn)物中的量顯著更低。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果置換編碼TGF-"的天然DNA(例如，在TGF-/ 3 活性片段的情況下，序列IDNo.4的DNA)中存在的一個(gè)(或多個(gè))UGC 密碼子，則編碼TGF-"的DNA可一皮適應(yīng)以在才直物細(xì)胞的葉綠體中表 達(dá)。UGC密碼子編碼氨基酸半胱氨酸，并且此類情況下的優(yōu)選置換一 般是用可選的半胱氨酸編碼密碼子UGU。優(yōu)選地天然DNA序列中存 在的至少兩個(gè)UGC密碼子可被置換，更優(yōu)選地至少三個(gè)UGC密碼子 可被置換，并且最優(yōu)選地四個(gè)UGC密碼子可被置換。本發(fā)明人認(rèn)為， 天然DNA中存在的五個(gè)或甚至六個(gè)UGC密碼子可被置換，并且仍允 許產(chǎn)生所需的TGF--，但是優(yōu)選在合適的核酸中至少一個(gè)和更優(yōu)選地 兩個(gè)UGC密碼子被保留。
本發(fā)明人已鑒定了可成為可選的或另外的置換對(duì)象的許多其他密 碼子。
例如，亮氨酸編碼密碼子CUG可有益地成為產(chǎn)生適應(yīng)在植物細(xì)胞 中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉綠體中)表達(dá)的核酸的置換對(duì)象。可優(yōu) 選置換至少一個(gè)CUG密碼子以產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的方法或核酸序 列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選置換編碼待表達(dá)的TGF-y 的天然 DNA中存在的所有CUG密碼子。例如，在編碼人TGF-^3的天然DNA 的情況下，可優(yōu)選置換存在的全部七個(gè)CUG密碼子。待使用的優(yōu)選置 換密碼子可以是可選的亮氨酸編碼密碼子UUA。
另外或可選地，纈氨酸編碼密碼子GUG可有益地成為產(chǎn)生適應(yīng) 在植物細(xì)胞中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉綠體中)表達(dá)的核酸的置換 對(duì)象。可優(yōu)選置換至少一個(gè)GUG密碼子以產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的方 法或核酸序列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選置換編碼待表達(dá)的TGF-" 的天然DNA中存在的所有GUG密碼子。例如，在編碼人TGF-"3的 天然DNA的情況下，可優(yōu)選置換否則將會(huì)存在的全部六個(gè)GUG密碼 子。待使用的優(yōu)選置換密碼子可以是可選的纈氨酸編碼密碼子GUU 或GUA。
可選地或另外地，可有益地置換脯氨酸編碼密碼子CCC以產(chǎn)生適 應(yīng)在植物細(xì)胞中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉綠體中)表達(dá)的核酸?？蓛?yōu)選置換至少一個(gè)CCC密碼子以產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的方法或核酸
序列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選置換編碼待表達(dá)的TGF-"的天然 DNA中否則存在的所有CCC密碼子。例如，在編碼人TGF-"3的天然 DNA的情況下，可優(yōu)選置換否則將會(huì)存在的全部四個(gè)CCC密碼子。 待使用的優(yōu)選置換密碼子可以是可選的脯氨酸編碼密碼子CCU。
進(jìn)一步可選或另外地，可有益地置換酪氨酸編碼密碼子UAC以產(chǎn) 生適應(yīng)在植物細(xì)胞中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉綠體中)表達(dá)的核 酸。可優(yōu)選置換至少一個(gè)UAC密碼子以產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的方法或 核酸序列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選置換編碼待表達(dá)的TGF-P的 天然DNA中存在的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)UAC密碼子。例如， 在編碼人TGF-"3的天然DNA的情況下，特別優(yōu)選置換否則將會(huì)存在 的六個(gè)UAC密碼子中的五個(gè)。待使用的優(yōu)選置換密碼子可以是可選的 酪氨酸編碼密碼子UAU。
針對(duì)上述適應(yīng)更進(jìn)一步可選地或另外地，可優(yōu)選置換天冬酰胺編 碼密碼子AAC以產(chǎn)生適應(yīng)在植物細(xì)胞中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉 綠體中)表達(dá)的核酸。可優(yōu)選置換至少一個(gè)AAC密碼子以產(chǎn)生適合用 于本發(fā)明的方法或核酸序列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選置換編碼 待表達(dá)的TGF-"的天然DNA中存在的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè) AAC密碼子。例如，在編碼人TGF-/J3的天然DNA的情況下，可特 別優(yōu)選置換否則將會(huì)存在的六個(gè)AAC密碼子中的五個(gè)。待使用的優(yōu)選 置換密碼子可以是可選的天冬酰胺編碼密碼子AAU。
另外地或可選地，針對(duì)上述那些適應(yīng)可用于產(chǎn)生適應(yīng)在植物細(xì)胞 中(并且特別地在植物細(xì)胞的葉綠體中)表達(dá)的核酸的另一個(gè)適應(yīng)是置 換天冬氨酸編碼密碼子GAC?？蓛?yōu)選置換至少一個(gè)GAC密碼子以產(chǎn) 生適合用于本發(fā)明的方法或核酸序列的第二核酸序列。例如，可優(yōu)選 置換編碼待表達(dá)的TGF-々的天然DNA中存在的所有GAC密碼子。例 如，在編碼人TGF-"3的天然DNA的情況下，可特別優(yōu)選地置換否則 將會(huì)存在的全部四個(gè)GAC密碼子。待使用的優(yōu)選置換密碼子可以是可 選的天冬氨酸編碼密碼子GAU。
出于本7>開(kāi)的目的，天然DNA應(yīng)視為是編碼依照本發(fā)明表達(dá)或編碼的TGF-"的天然存在的DNA。例如，在人TGF-y51 (其活性片段 的氨基酸序列如序列ID No. 1所示)的情況下，天然DNA將是編碼此 蛋白的天然存在的人基因組DNA(其全長(zhǎng)DNA序列如序列ID No. 6所 示)。在人TGF--2 (其活性片段的氨基酸序列如序列ID No. 2所示)的 情況下，天然DNA將是編碼此蛋白的天然存在的人基因組DNA(其全 長(zhǎng)DNA序列如序列ID No. 7所示)。在人TGF-"3 (其活性片段的氨基 酸序列如序列ID No. 3所示)的優(yōu)選情況下，天然DNA將是編碼此蛋 白的天然存在的人基因組DNA(例如，如序列IDNo. 4所示的編碼活 性片段的DNA，或如序列IDNo. 8所示的全長(zhǎng)DNA序列)。
編碼TGF-"(在此情況下，TGF-"3的活性片,爻)并^皮適應(yīng)以在植物 細(xì)胞中并且更特別地在葉綠體中表達(dá)的特別優(yōu)選的核酸序列的實(shí)例如 序列IDNo. 5所示。事實(shí)上，此核酸序列如此優(yōu)選，以至于在本發(fā)明 的進(jìn)一 步方面，提供包含如序列ID No. 5所示的核酸序列的核酸序列。 如序列IDNo. 5所示的核酸序列同時(shí)代表用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的 第二核酸序列，和用于本發(fā)明的核酸的優(yōu)選的第二核酸序列。
本發(fā)明人認(rèn)為，與如序列IDNo. 5所示的序列共享至少1.75 %密 碼子同 一性的核酸序列可用于本發(fā)明的方法和核酸，條件是此核酸序 列仍編碼待表達(dá)的TGF-A。更優(yōu)選地，合適的核酸可與序列ID No. 5 共享至少22°/。密碼子同一性，甚至更優(yōu)選地至少50%密碼子同一性， 進(jìn)一步更優(yōu)選地至少75%密碼子同一性，和最優(yōu)選地至少99.1%密碼 子同一性。
應(yīng)理解，前述段落中描述的核酸序列，例如序列IDNo.5核酸序 列(或與序列IDNo. 5共享指定程度同一性，例如至少22%密碼子同一 性的序列)，可包含合適的"第二核酸序列"以依照本發(fā)明的任何或所有 方法或核酸〗吏用。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上文所述類型的修飾對(duì)于增加可在植物細(xì)胞中表達(dá) 的TGF-々的總量(包括在葉綠體中的表達(dá))非常有效。例如，如下文實(shí) 驗(yàn)結(jié)果部分進(jìn)一步解釋的，用包含編碼TGF-^3的天然DNA的核酸轉(zhuǎn) 化的植物可產(chǎn)生產(chǎn)量為總蛋白的約1%的TGF-々3。相比之下，使用被 適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列(例如序列ID No. 5核酸序列)能夠產(chǎn)生TGF--3的產(chǎn)量比使用天然序列產(chǎn)生的那些高10倍(產(chǎn)生產(chǎn)量為 總蛋白的約10%的TGF-"3)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用所選的此類型的第 二核酸序列(例如序列ID No. 5)與天然序列相比能夠顯著增加TGF-P 產(chǎn)量，即使共同使用相同的第 一和第三核酸序列時(shí)也是如此。
應(yīng)理解，TGF-A產(chǎn)量的這些增加代表超過(guò)否則不利用本發(fā)明的方 法和核酸可實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)量的顯著和驚人的提高。利用本發(fā)明的方法和核 酸產(chǎn)生的TGF-"的量允許以先前不可能的方式在植物中經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)地產(chǎn) 生TGF-A (例如TGF-々3)。
本發(fā)明人進(jìn)一步鑒定了可任選地有利地用于本發(fā)明的方法的許多 新技術(shù)和條件。這些技術(shù)和條件在回收依照本發(fā)明表達(dá)的TGF-p和/ 或折疊或再折疊此TGF-卩以產(chǎn)生活性TGF-p方面提供了顯著的益處。
TGF-卩的步驟。
在植物中表達(dá)的重組蛋白典型地表達(dá)為可溶蛋白。 一般認(rèn)為這是 由于使用現(xiàn)有技術(shù)所述的方法可實(shí)現(xiàn)的蛋白表達(dá)的相對(duì)低水平。產(chǎn)生 的可溶蛋白往往包含生物活性形式和生物非活性形式的混合物，而非 活性形式代表總蛋白的更大比例。
發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明的方法和核酸實(shí)現(xiàn)的高水平表達(dá)產(chǎn)生高產(chǎn)量的重 組TGF-P蛋白，但是產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的不溶性聚集，而沒(méi)有可檢測(cè)的 以產(chǎn)生生物活性的正確折疊形式表達(dá)的蛋白。不希望受任何假設(shè)約束， 本發(fā)明人認(rèn)為這些聚集體的產(chǎn)生是由于植物細(xì)胞(并且特別是葉綠體) 內(nèi)建立的重組蛋白的高濃度，并且是因?yàn)楸磉_(dá)的TGF-P蛋白的疏水性。 以此方式產(chǎn)生TGF-(3的不溶性聚集體具有優(yōu)點(diǎn)(因?yàn)楦菀讖姆駝t形 成污染物的可溶性植物細(xì)胞組分中分離不溶性重組蛋白)，并且TGF-P 的此不溶性形式自身代表有用的產(chǎn)物(因?yàn)殡S后可使用現(xiàn)有技術(shù)將其 溶解并折疊為其活性形式)。但是，為了產(chǎn)生TGF-P的正確折疊的生物 活性形式并改善純度和產(chǎn)量，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了特別適合溶解和折疊/ 再折疊使用本發(fā)明的方法和核酸表達(dá)的TGF-(3的新技術(shù)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)純化使用本發(fā)明的方法或核酸表達(dá)的TGF-P的有利 步驟包括裂解葉綠體提取物(其中TGF-P已表達(dá)于葉綠體內(nèi))，并勻漿和超聲所得的混合物以幫助溶解TGF-(3。裂解可使用包含10mM HEPES、 5mMEDTA、 2%重量/重量Triton X-IOO、 0.1MDTT的pH 8.0
的緩沖液實(shí)現(xiàn)。
可有利地"洗滌"使用本發(fā)明的方法或核酸表達(dá)的TGF-p以除去污 染物，例如葉綠素或其它植物蛋白質(zhì)。合適的洗滌緩沖液可包含0.05M Tris堿和0.01MEDTA， pH 8.0。洗滌可容易地通過(guò)一系列離心和重懸 步驟(優(yōu)選地在洗滌緩沖液中的兩個(gè)或多個(gè)循環(huán)的離心和重懸)進(jìn)行。 離心可在8000 x g下執(zhí)行30分鐘。
然后可溶解在此洗滌后獲得的TGF-P產(chǎn)物，優(yōu)選地使用溶解重組 TGF-(3而不溶解植物蛋白質(zhì)或糖類(例如淀粉)的溶劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 具有此活性的合適的緩沖液可包含尿素，并且此緩沖液的優(yōu)選實(shí)例包 含0.05MTris堿、0.1M DTT、 6M尿素，pH 8.0。此溶解可在室溫實(shí) 現(xiàn)(優(yōu)選地伴隨攪拌以幫助溶解)，并可通過(guò)將溶解溶液的pH調(diào)節(jié)至 9.5左右來(lái)輔助。能夠優(yōu)先溶解重組TGF-p而不溶解植物細(xì)胞組分(例 如植物蛋白質(zhì)或糖類)的溶劑的所述使用未在現(xiàn)有技術(shù)中提出，并且由 于其賦予的顯著優(yōu)點(diǎn)，代表可用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選步驟。
當(dāng)使用本發(fā)明的方法或核酸表達(dá)的TGF-p已被溶解時(shí)(例如以上 文所述方式)，然后其可使用透析過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行濃縮。合適的技術(shù)可利 用5kDaTFF (正切流動(dòng)過(guò)濾)膜和包含0.05MTris石威、0.01MDTT、 3 M 尿素的pH9.5的透析過(guò)濾緩沖液。可使用此透析過(guò)濾將所述溶液濃縮 約15倍。
依照本發(fā)明方法的任何實(shí)施方案產(chǎn)生的TGF-(3可使用其中CHES (2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸)或其功能類似物存在下發(fā)生折疊的技術(shù)進(jìn)行 折疊或再折疊，以便產(chǎn)生活性TGF-P。以此方式的TGF-P的折疊或再 折疊是特別有利的，并且包括此進(jìn)一步的步驟的方法代表本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案。優(yōu)選地，CHES可在約100mM至l.OM的濃度下、更優(yōu) 選地在約0.7M濃度下使用。包括在折疊使用本發(fā)明的方法或核酸表 達(dá)的TGF-p中使用CHES的任選步驟可組合使用CHES (或其功能類 似物)與低分子量巰基/二硫化物氧化還原系統(tǒng)。利用可有利地用于本 發(fā)明的方法的CHES的折疊或再折疊方法的進(jìn)一步詳情參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB2007/000814，并且此文件的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文，特 別是在它們涉及折疊TGF-p以產(chǎn)生生物活性分子的方法的范圍內(nèi)。
依照本發(fā)明的方法表達(dá)的TGF-(3可被疏水相互作用色譜捕獲。作 為例子，丁基-瓊脂糖4快流速分離介質(zhì)可用于執(zhí)行此捕獲?？蓪? TGF-P (優(yōu)選地以上述方式再折疊成活性形式)的溶液加入用洗滌緩沖 液和平衡緩沖液平4軒的丁基-瓊脂糖4快流速柱。合適的平衡緩沖液可 包含0.02M乙酸鈉、1M硫酸銨、10%(體積:體積)乙酸，pH 3.3。在洗 脫結(jié)合的TGF-"之前，可根據(jù)需要洗滌所述柱。洗脫可利用合適的洗 脫緩沖液，例如包含0.02M乙酸鈉、10%(體積:體積)乙酸、30°/。(體積 體積)乙醇的pH3.3的緩沖液。
所述TGF-p可進(jìn)一步通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜純化。作為例子，SP-瓊脂糖介質(zhì)可用于從TGF-P單體和植物相關(guān)的雜質(zhì)中進(jìn)一步純化 TGF-p 二聚體。為了確保TGF-卩二聚體與陽(yáng)離子交換色譜介質(zhì)的結(jié)合， 可需要降低來(lái)自捕獲純化步驟的洗脫液(優(yōu)選地來(lái)自上文所述的丁基-瓊脂糖洗脫液)的電導(dǎo)率，并且這最好通過(guò)將所述洗脫液用合適的緩沖 液(例如含有2.72g/L三水合乙酸鈉、100mL/L冰乙酸、300mL/L乙醇 的pH 3.9-4.1的緩沖液)稀釋實(shí)現(xiàn)。然后將此條件的上樣加入SP-瓊脂 糖柱并用合適的緩沖液平衡。所述緩沖液可包含2.72g/L三水合乙酸 鈉、100mL/L冰乙酸、300mL/L乙醇、2.92g/L氯化鈉，pH 3.9-4.1。 在洗脫結(jié)合的TGF-"之前，可根據(jù)需要洗滌所述柱。TGF-(3從所述柱 的洗脫可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH或通過(guò)升高流動(dòng)相的電導(dǎo)率實(shí)現(xiàn)。作 為例子，合適的洗脫緩沖液可由2.72g/L三水合乙酸鈉、100mL/L冰 乙酸、300mL/L乙醇、29.22g/L氯化鈉，pH 3.9-4.l組成。含有TGF-^ 二聚體的SP瓊脂糖洗脫液組分應(yīng)根據(jù)純度匯集。因?yàn)闅埩舻柠}可造 成TGF-p蛋白的聚集，所以應(yīng)將SP-瓊脂糖洗脫液的緩沖液交換成合 適的最終制劑，實(shí)例緩沖液可包含1.2mL/L乙酸、200mL/L乙醇，pH 4.0± 0.1。
超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)，所述現(xiàn)有技術(shù)曾建議從植物中純化重組人 蛋白或用于總體上純化TGF-P。因此技術(shù)人員應(yīng)理解，這些任選步驟特別地，使用純化重組蛋白的這些新方法允許產(chǎn)生高度純化的TGF-p， 例如TGF-P3,而無(wú)需鹽沉淀和色譜方法(現(xiàn)有技術(shù)建議的方法，但是 由于存在殘留的鹽，可導(dǎo)致以此方式純化的蛋白質(zhì)的不期望的聚集)。
技術(shù)人員應(yīng)容易理解，本發(fā)明的核酸可通過(guò)任何合適的途徑引入 植物細(xì)胞(如本發(fā)明的方法所要求)。適合以此方式引入核酸的許多^支 術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知，包括但不限于基因槍轉(zhuǎn)染。合適的實(shí)驗(yàn) 方案進(jìn)一步描述于實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分。
本發(fā)明的核酸可進(jìn)一步并入合適的表達(dá)盒或載體。此類表達(dá)盒或 載體的實(shí)例對(duì)蛋白質(zhì)的植物表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員為公知。包括本發(fā)明 的嵌合核酸序列的合適的表達(dá)盒的實(shí)例如實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分所示。
用于表達(dá)如下產(chǎn)物的核酸序列，即所述產(chǎn)物可幫助鑒定所述嵌合核酸 序列成功并入其中的植物細(xì)胞。可用于此方式的合適的進(jìn)一步核酸序 列的實(shí)例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，并包括產(chǎn)生賦予對(duì)可用于選擇 的物質(zhì)的抗性的產(chǎn)物(例如抗生素)的核酸，或產(chǎn)生可用作選擇基礎(chǔ)的 可4全測(cè)產(chǎn)物(例如發(fā)色酶產(chǎn)物)的標(biāo)志物。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明^是供用本發(fā)明第二方面(和此說(shuō)明書(shū)描述 的其任何實(shí)施方案)的核酸轉(zhuǎn)化的植物。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二方面(和此說(shuō)明書(shū)描 述的其任何實(shí)施方案)的核酸的植物種子。
除了本說(shuō)明書(shū)的其他地方描述的方法和核酸之外，本發(fā)明還提供 由本發(fā)明的方法表達(dá)的TGF-々。技術(shù)人員應(yīng)理解，存在可識(shí)別此TGF-" 的植物來(lái)源的許多區(qū)別特征。例如，在TGF-々前蛋白的情況下，動(dòng)物 細(xì)胞表達(dá)的TGF-"或由于植物細(xì)胞的核轉(zhuǎn)化表達(dá)的TGF-〃中發(fā)現(xiàn)的糖 基化將從葉綠體中表達(dá)的前蛋白缺失。這可用于鑒定依照本發(fā)明產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)或前蛋白。
技術(shù)人員應(yīng)理解，可適應(yīng)本說(shuō)明書(shū)中描述的方法和核酸，特別是 通過(guò)適應(yīng)第二核酸序列，以用于表達(dá)除TGF-"同種型自身以外的 TGF-〃超家族成員。因此本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供其中所述第二核酸序列編碼除TGF-"以外的TGF-"超家族成員的方法和核酸。
現(xiàn)在將參考下列實(shí)驗(yàn)結(jié)果和附圖1至12進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中 圖1示意性地顯示了實(shí)施本發(fā)明的方法的煙草葉綠體轉(zhuǎn)化中包括 的步驟。1 ，分離靶TGF-(3基因的cDNA并克隆至大腸桿菌(￡. co/z〕特 異性載體；2，將靶cDNA克隆至表達(dá)盒；3，將完整的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移至 葉綠體耙向質(zhì)粒；4，純化質(zhì)粒l&液并用于葉組織的粒子轟擊；5，在 抗生素選擇條件下從葉組織再生植物；和6，葉組織再生的三個(gè)循環(huán) 產(chǎn)生同型異源(homoplastic)植物。
圖2以示意形式說(shuō)明了適合本發(fā)明使用的TGF-(33表達(dá)構(gòu)建體。 圖3說(shuō)明了產(chǎn)生用于本發(fā)明的核酸的合成基因構(gòu)建。在圖的左側(cè)， 核酸片段以逐步的方式合并以產(chǎn)生合成的TGF-P3基因。圖的右側(cè)顯 示DNA凝膠電泳，顯現(xiàn)了左圖顯示的步驟產(chǎn)生的不同產(chǎn)物的大小。
圖4比較了合成(上部序列)和天然(下部序列)TGF-p3活性區(qū)的 DNA的編碼序列。
圖5顯示了如圖4所示的合成和天然DNA序列的比對(duì)。 圖6顯示了由如圖4和5所示的合成和天然DNA序列編碼的 TGF-卩3的氨基酸序列的比對(duì)。
圖7示意性地說(shuō)明了適合用于本發(fā)明的葉綠體靶向質(zhì)粒。"LTR" 表示左靶向區(qū)，"RTR"表示右靶向區(qū)。"aadA"表示氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn) 移酶， 一種可使用的抗生素抗性標(biāo)記。
圖8說(shuō)明了煙草葉片制備物中產(chǎn)生的TGF-P3的檢測(cè)。該圖顯示 了其中蛋白質(zhì)已使用考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)染色的SDS-PAGE凝 膠。比較了得自野生型煙草植物(所述凝膠的泳道1)、得自 16Srrn-T7-TGF-P3活性區(qū)-psbC煙草植物(即其中編碼TGF-P的核酸序 列不被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的植物，結(jié)果顯示于所述凝膠的泳道 2),和得自16Srrn-T7-TGF-P3合成活性區(qū)-psbC煙草植物(其中編碼 TGF-p的核酸序列被適應(yīng)以在才直物細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示于泳道3)的 總蛋白制備物的產(chǎn)量。結(jié)果分析表明，在此實(shí)例中，TGF-P3在含有天 然未適應(yīng)序列的植物中代表總蛋白的約1 %，而在含有合成的適應(yīng)序列 的植物中代表總蛋白的約10%。圖9也說(shuō)明了煙草葉片制備物中產(chǎn)生的TGF-P3的4全測(cè)，但是在 此情況下，該圖顯示了其中TGF-(33已使用抗TGF-P3抗體標(biāo)記的蛋白 質(zhì)印跡(免疫印跡)。泳道1和2比較了得自16Srrn-T7-TGF-P3活性區(qū) -psbC煙草植物(顯示于泳道1),和得自16Srrn-T7-TGF-P3合成活性區(qū) -psbC煙草植物(顯示于泳道2)的總蛋白制備物的產(chǎn)量。這些與泳道3 、 4和5(分別為l.Ofig、 .05嗎和0.25嗎)中的TGF-卩3"標(biāo)準(zhǔn)品"進(jìn)行了比 較。結(jié)果分析表明，在此實(shí)例中，來(lái)自含有合成的適應(yīng)序列的植物的 20昭蛋白樣品含有約2|igTGF-|33 (即總蛋白含量的約10%)。
圖IO說(shuō)明了通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中描述的方法表達(dá)的TGF-P3具有不溶 性蛋白的形式。圖的左側(cè)顯示了其中蛋白質(zhì)已使用考馬斯藍(lán)染色的 SDS-PAGE凝膠，而右側(cè)顯示了其中TGF-(33已使用抗TGF-|33抗體標(biāo) 記的蛋白質(zhì)印跡。在兩種情況下，泳道1和2是TGF-(33"標(biāo)準(zhǔn)品"(分 別為l.Omg和O.lmg)，而泳道3顯示了從植物16Srrn-T7-TGF-卩3合成 活性區(qū)-psbC煙草植物中收集的可溶性蛋白，泳道4顯示了從 16Srrn-T7-TGF-|33合成活性區(qū)-psbC煙草植物中收集的不溶性蛋白。
圖11顯示了使用Biorad RC/DC測(cè)定研究植物表達(dá)的物質(zhì)的回收 所獲得的結(jié)果，所述植物含有被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酸。
圖12顯示了丁基-瓊脂糖色鐠，說(shuō)明了丁基-瓊脂糖捕獲后逐步洗 脫得到的TGF-P3產(chǎn)量。
本公開(kāi)依據(jù)的某些氨基酸和核酸序列也顯示于實(shí)驗(yàn)結(jié)果后面的序 列信息部分。如上所述，相關(guān)序列也顯示于附圖中。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 引言
下面描述了用來(lái)通過(guò)遺傳修飾所述植物的葉綠體基因組，允許來(lái) 自煙草(iWco^"a to6acwm)植物的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩3 (TGF-"3)蛋白的表 達(dá)的實(shí)驗(yàn)方案。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomic)(質(zhì)體修飾的基因組)植物所需 的步驟的綜述顯示于圖1。
2. 結(jié)果2.1表達(dá)盒構(gòu)建體的設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)了含有處于質(zhì)體特異性高表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)的控制下的DNA編碼 區(qū)的許多表達(dá)盒(參見(jiàn)圖2)。
通常使用來(lái)自不同物種的調(diào)節(jié)區(qū)進(jìn)行基因表達(dá)。這些元件具有足 夠的相似性以允許在非天然物種中正常行使功能，但是又具有足以避 免同源重組至原質(zhì)體系(plastome)的非靶標(biāo)部分的堿基序列差異。
顯示于圖2的表達(dá)盒含有甘藍(lán)型油菜16Srrn啟動(dòng)子和甘藍(lán)型油菜 戸6C3，終止區(qū)，二者均是質(zhì)體特異性的。來(lái)自T7噬菌體基因10的 RBS也并入此表達(dá)盒。將r( F-"3浮遂且編碼區(qū)整合至此盒。還合成 了設(shè)計(jì)用于在煙草葉綠體中優(yōu)化表達(dá)的合成TGF-^3法'/4^基因(即依 照本發(fā)明的第二核酸序列)，并將其整合至此表達(dá)盒。
選擇16Srrn啟動(dòng)子是因?yàn)槠淇僧a(chǎn)生強(qiáng)基因表達(dá)。噬菌體T7基因 10前導(dǎo)序列是廣泛用于細(xì)菌的高翻譯水平的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并已成 功用于質(zhì)體表達(dá)。
所有構(gòu)建體都還含有處于質(zhì)體特異性調(diào)節(jié)區(qū)控制下的標(biāo)記基因氨 基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(aadA)。 aadA基因賦予對(duì)抗生素壯觀霉素和鏈霉 素的抗性。
2.2合成TGF-)ff3活性區(qū)基因的構(gòu)建
設(shè)計(jì)已優(yōu)化為進(jìn)行煙草葉綠體基因表達(dá)的合成rGF-yW法^^基
因。從在逐步方法中連接在一起的單鏈寡核苷酸合成該基因(參見(jiàn)圖3)。
由于內(nèi)部發(fā)夾形成或引物整體性，第一引物對(duì)不能形成引物二聚 體，所以以更高花費(fèi)訂購(gòu)更大的引物對(duì)以允許構(gòu)建快速繼續(xù)。在兩個(gè) 185bp引物"八聚體"的連接示于步驟4，未能得到最終的350bp產(chǎn)物。 認(rèn)為這是由于3'單鏈重疊序列與總DNA鏈長(zhǎng)相比太短造成的。將在 步驟2中已經(jīng)創(chuàng)建的其他引物"二聚體"連接至180bp構(gòu)建體以創(chuàng)建具 有更大重疊序列的225bpDNA構(gòu)建體。此方法成功克服了所述問(wèn)題， 通過(guò)PCR擴(kuò)增最終的350bp合成TGF-戶3基因。
所述合成序列顯示與天然DNA序列具有70%堿基同一性，優(yōu)化 序列中的GC含量從56%降低至33%。合成rGF-"3活遂^和天然法# ^"的DNA編碼序列顯示于圖4。合成和天然序列的DNA 比對(duì)顯示于圖5。所述合成和天然序列翻譯的氨基酸序列是同一的， 并顯示于圖6。
2.3質(zhì)體靶向載體的構(gòu)建
將上文提及的四個(gè)表達(dá)盒全部克隆至葉綠體耙向質(zhì)粒以準(zhǔn)備轟擊 (參見(jiàn)圖7A)。所述葉綠體靶向載體含有與煙草質(zhì)體基因組 (52377-59319、 59320-63864)同源的DNA區(qū)，以允許所述把構(gòu)建體通 過(guò)質(zhì)體中的同源復(fù)制整合。圖7B中的箭頭突出顯示了煙草質(zhì)體基因 組(原質(zhì)體系)中DNA整合的位置。
所述靶基因構(gòu)建體與選擇劑表達(dá)盒一起存在于所述載體中，以促 進(jìn)所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的穩(wěn)定性。aadA (氨基糖苦腺噤呤轉(zhuǎn)移酶)解毒壯 觀霉素和鏈霉素抗生素，是本發(fā)明使用的優(yōu)選選擇劑。
與質(zhì)體基因組同源的兩個(gè)DNA區(qū)位于兩個(gè)表達(dá)盒側(cè)翼。這些區(qū) 指導(dǎo)與質(zhì)體基因組的特異性區(qū)域的同源重組。所述側(cè)翼區(qū)稱為"左靶向
區(qū)"和"右耙向區(qū)"(LTR & RTR)。
所用的側(cè)翼區(qū)將所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體插入非?；钴S的rbcL基因的 下游，該基因產(chǎn)生光合作用必需的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶 (rubsico)的大亞基。
2.4轉(zhuǎn)基因盒在大腸桿菌的表達(dá)
由于植物質(zhì)體的原核起源，葉綠體表達(dá)盒通常在細(xì)菌例如大腸桿 菌C^c/^n'c/n'fl co//)中具有功能。在大腸桿菌中鑒定每個(gè)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體 的TGF-"3蛋白表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自大腸桿菌的總蛋白樣品通過(guò) SDS-PAGE分離，并使用TGF-々3蛋白特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分 析。
因?yàn)楸磉_(dá)元件在細(xì)菌和質(zhì)體中均起作用，所以這些研究對(duì)于檢查 有功能的表達(dá)盒非常有用。
進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，并使用TGF-"3活性區(qū)抗體檢查表達(dá)水平。 2.5煙草植物的轉(zhuǎn)化
通過(guò)粒子轟擊轉(zhuǎn)化威斯康辛38 (Wisconsin 38， w38)煙草葉片，然 后通過(guò)陽(yáng)性抗生素選擇分離克隆。在具有抗生素的MS培養(yǎng)基上生芽和生根，然后將植物最終移到土壤。
2.6植物的DNA表征
通過(guò)PCR和DNA印跡分析表征假定的轉(zhuǎn)化體的植物的DNA,以 確認(rèn)特異性TGF-^3基因和aadA標(biāo)記基因(用于抗生素選擇)的整合。 DNA印跡分析確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的正確整合，并且還確認(rèn)代表穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的 植物中的同型異源性。
2.7蛋白質(zhì)表征
收獲來(lái)自同型異源植物的葉組織并通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡 分析進(jìn)行分析。通過(guò)SDS-PAGE鑒定來(lái)自'16Srm-T7-TGF-p3活性區(qū) -psbC，和'16Srrn-T7-TGF-々3合成活性區(qū)-psbC，構(gòu)建體的TGF-"3活性 區(qū)蛋白的表達(dá)；蛋白表達(dá)分別定量為總植物蛋白的約1%和約10%(參 見(jiàn)圖8)。在掃描的凝膠上使用BioRad Quantity One軟件分析進(jìn)行數(shù)字 化定量。此結(jié)果說(shuō)明使用本發(fā)明的方法和核酸可實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)量有很大增 加，其中編碼TGF-P的核酸序列被適應(yīng)以由才直物表達(dá)。
用TGF-A3抗體的蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)感興趣的蛋白條帶是 TGF-"3活性區(qū)蛋白(參見(jiàn)圖9)，而TGF-"3標(biāo)準(zhǔn)品的定量確認(rèn)上文提 及的蛋白表達(dá)水平是正確的。
來(lái)自'16Srrn-T7-TGF-y93合成活性區(qū)-psbC，植物的葉片的蛋白以可 溶性蛋白制備物或不溶性蛋白制備物制備，并通過(guò)SDS-PAGE和蛋白 質(zhì)印跡進(jìn)行分析(參見(jiàn)圖10)。結(jié)果表明合成TGF-"3活性區(qū)表達(dá)為不 溶性蛋白產(chǎn)物。
3.方法
3.1合成rGF-;^澤遂厭基因的構(gòu)建
Shimada等人(1991)已經(jīng)分析了已知編碼光合蛋白質(zhì)的所有二十 九個(gè)葉綠體基因的編碼區(qū)，并制成了密碼子使用表。將所述密碼子使 用表導(dǎo)入Vector NTI suite軟件(Informax)，并將天然TOP-々3法'/4足氨 基酸序列回翻成DNA編碼區(qū)序列。在存在大量單一密碼子類型的地 方，包括第二或第三最常用的密碼子以降低tRNA代謝負(fù)荷和/或減少 重復(fù)序列。得到的DNA序列代表在煙草葉綠體中表達(dá)的優(yōu)化的合成使用逐步構(gòu)建過(guò)程從單鏈寡核苦酸組裝350bp合成rGF-/^ ;SVi 且DNA編碼區(qū)(參見(jiàn)圖3A)。使用寡核苷酸重疊序列、Klenow酶指導(dǎo) 的DNA堿基補(bǔ)平(fill-in)、 Vent-聚合酶介導(dǎo)的單鏈(ss) DNA產(chǎn)生和雙 鏈(ds)DNAPCR擴(kuò)增技術(shù)以促進(jìn)所述合成構(gòu)建體的組裝。圖3B顯示 了代表所述合成基因的構(gòu)建進(jìn)程的瓊脂糖凝膠?？梢栽谒瞿z上看 到約35、 60、 100、 180、 225和350bp的dsDNA分子，其代表逐步組 裝的基因片段。將最終的350bp構(gòu)建體加A尾，克隆至pGEM-T載體 (Invitrogen)并測(cè)序以確認(rèn)序列完整性。
3.2煙草的質(zhì)體轉(zhuǎn)化
3.2.1準(zhǔn)備葉片
威斯康辛38 (W38)煙草從種子開(kāi)始在含蔗糖的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 約5周。在此階段，生長(zhǎng)容器中存在具有約4-6個(gè)中等大小葉片的植 物。將這些葉片從葉組織的基部切下，離軸側(cè)向上放置于RMOP平板 的中央。蓋上平板、密封并置于生長(zhǎng)拒中，直至需要用于DNA轟擊。
3.2.2包被DNA的微載體的制備
金粒(直徑l.Opm, BioRad)通過(guò)渦旋在乙醇中洗滌。將這些微載體
離心并除去上清液，然后加入雙蒸水(3.(1.1120)并短暫地再次渦旋。將
此金溶液的等分試樣轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。將靶向質(zhì)粒DNA加入所述 微載體懸浮液等分試樣中并短暫渦旋。在混合的同時(shí)立即向此金制備 物中加入2.5M CaCl2，然后快速加入O.l M亞精胺。將所述孩丈載體制 備物渦旋并離心。除去上清液，用EtOH通過(guò)渦旋洗滌微載體。再次 離心所述微載體并除去上清液。通過(guò)短暫渦旋將微載體重懸于EtOH。 將無(wú)菌巨栽體盤(pán)置于金屬支撐的平板，將微載體制備物的等分試樣吸 至每個(gè)巨載體的中心。蒸發(fā)所述微載體溶液以在所述巨載體表面留下 小的圓形沉淀物。此時(shí)即準(zhǔn)備好巨載體用于轟擊實(shí)驗(yàn)。 3.2.3粒子轟擊
煙草葉片的粒子轟擊使用Bio-Rad基因槍儀器在層流凈化罩中進(jìn) 行。儀器的設(shè)置、真空的產(chǎn)生和氣體釋放步驟根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行。 將葉組織置于區(qū)室的下部，并除去平板的蓋。將含有DNA載體的微 載體加速進(jìn)入植物組織。使用1100 psi破裂盤(pán)，并采用停止屏和植物轟擊后，將有煙草葉片的平板 重新蓋上，密封，并在生長(zhǎng)拒中于23°C培養(yǎng)約48小時(shí)，12小時(shí)光/ 暗周期。光強(qiáng)為約150pEi。 3.2.4轟擊后的葉片選擇
轟擊48小時(shí)后，將葉組織切成約2mm2片并置于選擇培養(yǎng)基上。 此選擇培養(yǎng)基是含500嗎/ml壯觀霉素的RMOP或含500|ig/ml壯觀霉 素加250ng/ml鏈霉素的RMOP。組織平板在23。C下溫育，12小時(shí)光 /暗周期，光強(qiáng)約150nEi。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在4-8周再生為植物苗，并轉(zhuǎn)移至 含有加250^ig/ml壯觀霉素的MS培養(yǎng)基的生長(zhǎng)容器以生長(zhǎng)和生根。使 用PCR篩選轉(zhuǎn)基因的假定轉(zhuǎn)化體，然后通過(guò)DNA印跡分析表征它們 的DNA。
3.3 DNA表征
DNA分析通過(guò)首先收獲植物葉片和在液氮中研磨進(jìn)行。DNA使 用Eppendorf植物DNA制備(plantDNAprep)，試劑盒制備。DNA樣品 通過(guò)限制酶消化切割，并通過(guò)凝膠電泳按進(jìn)行大小分離。將DNA轉(zhuǎn) 移至尼龍膜，然后與32P-dCTP標(biāo)記的DNA探針雜交以鑒定TGF--3 基因、標(biāo)記基因和天然葉綠體基因。探針雜交鑒定整合的基因，而限 制消化模式允許確認(rèn)DNA整合圖語(yǔ)。
3.4蛋白表征
3.4.1 SDS畫(huà)PAGE分析
對(duì)于總細(xì)胞蛋白制備，將葉組織在液氮中研磨成粉末，并按1:5 比率(w/v)加入lx樣品緩沖液中。將樣品置于沸水浴中5分鐘，然后 離心。收集上清液并用于SDS-PAGE分析。對(duì)于可溶性蛋白制備，將 研磨的冷凍葉組織在提取緩沖液中渦旋和溫育，然后離心除去固體。 分離上清液并定量其蛋白含量。將可溶性蛋白樣品加入2x樣品緩沖液 并置于沸水浴中5分鐘。離心樣品并收集上清液用于SDS-PAGE分析。 對(duì)于不溶性蛋白制備，將可溶性蛋白提取物剩余的沉淀在提取緩沖液 中重懸并洗滌3次，每次洗滌后離心。然后將剩余的沉淀重懸于lx 樣品緩沖液、置于沸水浴中5分鐘、然后離心并收集上清液用于 SDS-PAGE分析。使用10-20°/。Tris-HCl丙烯酰胺凝膠電泳按大小分離蛋白質(zhì)，并通過(guò)考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)蛋白條帶。
3.4.2蛋白質(zhì)印跡分析
蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上按大小分離，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。 封閉膜，用TGF-P3抗體探測(cè)，然后洗滌。TGF--3蛋白通過(guò)堿性磷酸 酶連接的抗體的BCIP染色來(lái)顯現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果II
4表達(dá)的TGF-/ 3的回收
使用下文第一次描述的技術(shù)回收使用上文所述技術(shù)在植物葉綠體 中表達(dá)的TGF-"3。此技術(shù)產(chǎn)生比現(xiàn)有技術(shù)中描述的回收或純化技術(shù)更 高產(chǎn)量的TGF-P和具有更高純度的TGF-卩。
將葉綠體提取物在裂解緩沖液(包含10mMHEPES、 5mM EDTA、 2%重量/重量Triton X-100、 O.IMDTT, pH8.0)中1:1稀釋。勻漿并超 聲此混合物以幫助溶解。然后將得到的溶液在8000 x g下離心30分鐘。
將上文離心產(chǎn)生的沉淀^吏用洗滌緩沖液(包含0.05M Tris堿、 0.01MEDTA， pH8.0)重懸至原始體積，然后進(jìn)4亍下一輪的離心，8000 xg, 30分鐘。
洗滌此輪離心產(chǎn)生的沉淀，然后重懸于溶解緩沖液(包含0.05M Tris堿、O.IMDTT、 6M尿素，pH 8.0)以產(chǎn)生十倍稀釋(即一體積沉淀 物質(zhì)加至九體積所述溶解緩沖液)。所得溶液在室溫下攪拌60分鐘以 溶解重懸的物質(zhì)。攪拌60分鐘后，將溶解的溶液的pH調(diào)節(jié)至9.5, 并在室溫下繼續(xù)攪拌另外60分鐘。
然后將調(diào)節(jié)pH的溶液在8000 x g下離心30分鐘，在此期間使用 透析過(guò)濾方法(4吏用5kDaTFF (正切流動(dòng)過(guò)濾)膜)以將所述稀釋劑交換 為透析過(guò)濾緩沖液(0.05MTris堿、O.OIMDTT、 3M尿素，pH9.5)，并 將由此產(chǎn)生的溶液濃縮15倍。然后使用下文描述的條件對(duì)此濃縮的溶 液(保留物)進(jìn)行再折疊。
5回收的TGF-)93的分才斤
使用BioradRC/DC測(cè)定確認(rèn)要再折疊的溶液中TGF-戶3的存在。 結(jié)果顯示于圖11。圖ll顯示了使用12。/。Bis-Tris還原凝膠得到的結(jié)果，其中蛋白質(zhì)已使用考馬斯藍(lán)標(biāo)記。泳道(從左至右讀為l-10)上樣如下 泳道1 =標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品 泳道2-TGF-,標(biāo)準(zhǔn)品 泳道3=裂解的材料 泳道4=裂解的材料的上清液 泳道5 =洗滌上清液 泳道6=溶解的上清液 泳道7=溶解的上清液 泳道8 =溶解的上清液 泳道9=空白 泳道10 =溶解的上清液
這些結(jié)果證實(shí)可從裂解的葉綠體材料獲得使用本發(fā)明的方法表達(dá) 的TGF-"3，并且在再折疊之前，使用上文列出的回收方案，可在溶解 的上清液中濃縮此材料。
6表達(dá)的TGF-/ 3的再折疊
將上文所述的材料用再折疊緩沖液(包含0.7MCHES、 1MNaCl、 0.002M還原型谷胱甘肽、0.0004M氧化型谷胱甘肽、0.25mg/mL依照 本發(fā)明表達(dá)的TGF-"3單體，均在pH9.5)稀釋，然后將此再折疊混合 物在攪拌下于10。C保持3天以允許發(fā)生再折疊。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在2-(環(huán) 己基氨基)乙磺酸(CHES)存在的情況下執(zhí)行的此再折疊過(guò)程產(chǎn)生特別 高產(chǎn)量的正確折疊的TGF-P3。因此在存在CHES的情況下折疊(或再 折疊)依照本發(fā)明表達(dá)的TGF-p代表特別有用和有利的本發(fā)明的實(shí)施 方案。
7再折疊的依照本發(fā)明表達(dá)的TGF-/ 3的捕獲
按上文的描述產(chǎn)生的再折疊的TGF-"3在裝有膜(MWCO為5 kDa) 的預(yù)調(diào)節(jié)的UF系統(tǒng)中濃縮五倍。使用水乙酸將所述再折疊濃縮液的 pH從pH2.5逐步調(diào)節(jié)至2.8。然后使用稀釋緩沖液(0.02M乙酸鈉、2M 硫酸銨、1M鹽酸精氨酸、8.33。/q(w/w)乙酸)按1:1比值稀釋酸化的濃 縮液并通過(guò)0.22jim濾器過(guò)濾。將此"調(diào)節(jié)的上樣"加至丁基-瓊脂糖4 快流速分離介質(zhì)，以通過(guò)疏水相互作用色譜捕獲再折疊的TGF-(33。所述丁基-瓊脂糖4快流速柱用洗滌緩沖液/平衡緩沖液(包含0.02M乙酸 鈉、1M硫酸銨、10%(體積:體積)乙酸，pH3.3)平衡。在逐步洗脫結(jié)合 的TGF-^3之前，用四倍柱體積(CV)的此平衡緩沖液洗滌所述柱。逐 步洗脫使用洗脫緩沖液(包含0.02M乙酸鈉、10%(體積:體積)乙酸、 30%(體積:體積)乙醇，pH 3.3)進(jìn)行，并匯集以此方式產(chǎn)生的TGF-yS3 洗脫液。
對(duì)匯集的洗脫液中產(chǎn)生的純化TGF-"3的分析顯示于圖12，其說(shuō) 明了使用本發(fā)明的方法在植物中表達(dá)的TGF-々3可使用本文描述的方 法純化以產(chǎn)生再折疊的TGF-》3 。應(yīng)理解，這些方法也可用于除TGF-卩3 以外的生物活性TGF-p的回收、再折疊和捕獲?？蛇x地或另外地，使 用上文所述的方法產(chǎn)生的生物活性TGF-(33的純化可使用下列步驟進(jìn) 行。
8依照本發(fā)明表達(dá)的TGF-/B的純化
在可選的純化過(guò)程中，將丁基-瓊脂糖捕獲純化步驟的洗脫液的 pH調(diào)節(jié)至4.0(士0.1)，并用包含2.72g/L三水合乙酸鈉、100mL/L水乙 酸和300mL/L乙醇，pH 3.9-4.1的緩沖液稀釋至電導(dǎo)率達(dá)到要求的規(guī)》 格<7.0 mS/cm。然后將所述調(diào)節(jié)的丁基洗脫液通過(guò)0.22pm濾器過(guò)濾， 然后將其加載至用洗滌緩沖液和平衡緩沖液(包含2.72g/L三水合乙 酸鈉、100mL/L冰乙酸、300mL/L乙醇和2.92g/L氯化鈉，pH3.9-4.1) 平衡的SP-瓊脂糖柱。然后用3倍柱體積的洗滌緩沖液和平衡緩沖液 洗滌所述柱。將超過(guò)十五倍柱體積的0%至50%線性梯度的洗脫緩沖 液(2.72g/L三水合乙酸鈉、100mL/L水乙酸、300mL/L乙醇、29.22g/L 氯化鈉，pH3.9-4.1)應(yīng)用至所述柱。然后用50%至100%逐步梯度的洗 脫緩沖液、接著2-3倍柱體積的1 M氯化鈉洗滌所述柱。通過(guò)RP-HPLC 根據(jù)純度匯集含有TGF-"3二聚體的SP瓊脂糖洗脫液組分。使用預(yù)調(diào) 節(jié)的UF/DF系統(tǒng)(MWCO為5 kDa)濃縮匯集的SP-瓊脂糖洗脫液至 TGF-^3濃度為12mg/mL (通過(guò)A278nm)。然后將濃縮的TGF-^溶液交 換緩沖液為超過(guò)6倍置換體積(diavolumes)的制劑緩沖液(1.2mL/L乙 酸、200mL/L乙醇，pH4.0士0.1)。然后用制劑緩沖液將所述透析過(guò)濾 的TGF-^溶液稀釋至TGF-A濃度為10 ± 2mg/mL(通過(guò)A278nm)。序列信息
TGF-/H活性片段的氨基酸序列(序列ID No. 1)
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDIjGWKWIHEPKGYHAMFCiLGPCPYIWSLDT QYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
TGF-p 2活性片段的氨基酸序列(序列ID No.2)
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPIjYIDFKRDIjGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYIjWSSDT
qhsrvls:lynt工npeasaspccvsqd:lepijTIIiYyigktpkieq:lsnm工vksckcs TGF-P3活性片段的氨基酸序列(序列ID No. 3)
ALDTNYCFRNiLEENCCVRPLYIDFRQDiLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYIiRSADT THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS
編碼TGF-P 3活性片段的天然DNA序列(序列ID No.4)
cccaaagtggagcagctctccaacatggtggtgaagtcttgtaaAtgtagctga
編碼TGF-p 3活性片段的本發(fā)明的第二核酸序列(序列ID No. 5)
CCTAAAGTTGAACAATTGTCTAACATGGTAGTTAAAAGTTGTAAATGTTCTTAA
編碼全長(zhǎng)TGF-p 1的DNA(序列ID No. 6)，顯示信號(hào)肽(用斜體顯示)、 前肽(用粗體顯示)以及活性片段(用正常文本顯示)
60 stgccgec ct ccgrggctg^g gc;fcg^tgct^ ctgctgrctac cgcfcgrctgtg" gctactggtgr
ctgacgcctgr gccggccggrc cgcggrgacta tccacctgca agactatcga catggagctg gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc的ccagatcc tgtcc站gct gcggctcgcc 3gc0occcga gocaggggga ggtgccgocc ggcccgctgc ccgaggccgt gotogccetg tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag gccg站tact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tgga幼cocs c站cga幼tc tatgac;aagt tcaagcag的taeacacagc atatatatgt tcttcaacao atcagagotc cgagaagcgg tacctgaaoe cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga tecctcagck sccg^ctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggott七cgccttagc gcccactgct cctgtgac的cagggataac acactgcaag tggacatcasL cgggttcsact accggccgcc gaggtgacct ggcaaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc a七ggccaacc cgctggsgag ggcccagcat ctgc站agct cccggcsccg cc:gagccctg gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gct'gtacatt gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg ctggagccgc tgcccsthgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga
120 180 240 300 360 420 480 540 柳 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1173編碼全長(zhǎng)TGF-P 2的DNA(序列ID No. 7)，顯示信號(hào)肽(用斜體顯示)、 前肽(用粗體顯示)以及活性片段(用正常文本顯示)
60
120
ctgtctacct gcagcacact cgratatgrgac cagttcstgc grcaagaggat cgragrgcgatc
cgcgggcsga gaggaagtcc 33ggcgeigcc 站ggaggttt
gatgt站ctg
ggtgatcsga ctgct站tgt
cgtgctttgg ctttacattg aatgccaact agggtcctga tcccaagatt cagctttcta
tcctgagc站 ggagggcggc
stgctgttca 站ctag祖gc
tsLttgccctc
atgcggccta atttcaagag tctgtgctgg gcttatataa
atatgsttgt
gctgaagctc gatttceatc
ca^tgccgccc
gttcagagtc
tgaatggctt
aagatttgca gtccsctagg ctacagactt
tt^ctttaga ggatctaggg agcatgcccg taccataaat aaccattctc aaagtcttgc
sccsgtcccc
ttcttciccct tttgacgtct tttcgtttgc ctcsagtcca>
ggtattgatg 站站站站csi
aatgtgcagg tggaaatgga tatttatgga ccagaagcat tactscattg aaatgcagct
gcgacgaaga ccgaagccst cagcaatgga
aagattt站c
gc3cctcc3c gtggg站gsc
sitwttgctg tacacgaacc gttcsgscsc ctgcttctcc
tcctgagccc gctccaggsg
cccgcccact gaaga這tgct agccagagtg atctcc站cc gctctccttc gggatttaaa
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180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1242
編碼全長(zhǎng)TGF-P 3的DNA(序列ID No. 8)，顯示信號(hào)肽(用斜體顯示)、 前肽(用粗體顯示)以及活性片段(用正常文本顯示)
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權(quán)利要求
1. 在植物中表達(dá)TGF-β的方法，所述方法包括(a)向植物細(xì)胞引入包含以下的嵌合核酸序列(1)第一核酸序列，其能夠調(diào)節(jié)(2)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄(2)第二核酸序列，其編碼TGF-β并被適應(yīng)以在所述植物細(xì)胞中表達(dá)；和(3)第三核酸序列，其編碼在所述植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)；和(b)培養(yǎng)所述植物細(xì)胞以產(chǎn)生所述TGF-β。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述核酸序列適合在植物細(xì)胞 的葉綠體中表達(dá)。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸序列被適應(yīng)以在植物 細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)。
4. 如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-々是人
5. 如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-"是 TGF-y93。
6. 如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-々包含選 自由序列ID No. 1;序列ID No. 2;和序列ID No. 3組成的組的TGF-" 活性片段。
7. 如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-々包含全 長(zhǎng)TGF-々蛋白。
8. 如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-P包含TGF-y5前蛋白。
9. 如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包含 與編碼所述TGF-A的天然DNA相比至少一個(gè)UGC密碼子置換。
10. 如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-^的天然DNA相比至少一個(gè)CUG密碼子置換。
11. 如權(quán)利要求1至IO任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-々的天然DNA相比至少一個(gè)UAC密碼子置換。
12. 如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-"的天然DNA相比至少一個(gè)GUG密碼子置換。
13. 如權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-々的天然DNA相比至少一個(gè)CCC密碼子置換。
14. 如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-"的天然DNA相比至少一個(gè)AAC密碼子置換。
15. 如權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸包 含與編碼所述TGF-"的天然DNA相比至少一個(gè)GAC密碼子置換。
16. 如權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序 列包含選自由以下組成的組的質(zhì)體啟動(dòng)子表達(dá)光合作用相關(guān)基因的 啟動(dòng)子；表達(dá)遺傳系統(tǒng)基因的啟動(dòng)子；表達(dá)被質(zhì)體編碼的質(zhì)體(PEP) RNA聚合酶或核編碼的質(zhì)體(NEP) RNA聚合酶識(shí)別的基因的啟動(dòng)子； 質(zhì)體psbA啟動(dòng)子；和質(zhì)體16Srm啟動(dòng)子。
17. 如權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序列包含藻類啟動(dòng)子，例如衣藻(Chlamydomonas)psbA啟動(dòng)子。
18. 如權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序列包含細(xì)菌啟動(dòng)子，例如細(xì)菌trc啟動(dòng)子。
19. 如權(quán)利要求1至18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序列包含噬菌體啟動(dòng)子，例如噬菌體T7啟動(dòng)子。
20. 如權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序列包含16srrn啟動(dòng)子。
21. 如權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一核酸序列包含選自由以下組成的組的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS):i) 質(zhì)體RBS，例如rbcL RBS或psbARBS;ii) 細(xì)菌RBS;和iii) 噬菌體RBS，例如T7glORBS。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一核酸序列包含T7gl0核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
23. 如權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第三核酸序列包含選自由以下組成的組的終止子i) 質(zhì)體終止子，例如pSbA終止子、rbcL終止子、rpsl8終止子或psbC終止子；ii) 細(xì)菌終止子；和iii) 噬菌體終止子。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第三核酸序列包含psbC終止子。
25. 如權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合核酸序列還包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。
26. 如權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二核酸序列包含序列ID No. 5,或與序列ID No. 5具有至少22%密碼子同一性的序列。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第二核酸序列包含序列ID No. 5。
28. 如權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)所述的方法，其還包括將所述TGF-P溶解于能夠優(yōu)先溶解重組TGF-P而非植物細(xì)胞組分的溶劑。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述溶劑包含尿素。
30. 如權(quán)利要求1至29任一項(xiàng)所述的方法，其還包括透析過(guò)濾以濃縮所述TGF-P的溶液。
31. 如權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在CHES(2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸)或其功能類似物存在下折疊所述TGF-(3,以便產(chǎn)生活性TGF-卩。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述CHES以約lOOmM至l.OM的濃度使用。
33. 如權(quán)利要求1至32任一項(xiàng)所述的方法，其還包括將如此表達(dá)的TGF-々用于制備藥物。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述藥物用于預(yù)防瘢痕形成或纖維化。
35. 由權(quán)利要求1至34任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的TGF--。
36. 如權(quán)利要求35所述的TGF-〃，其中所述TGF-戶是TGF-"3。
37. 如權(quán)利要求35或權(quán)利要求36所述的TGF-"，其中所述TGF-〃包含選自由序列ID No. 1;序列ID No. 2;和序列ID No. 3組成的組的TGF-々活性片段。
38. 如權(quán)利要求35或權(quán)利要求36所述的TGF-A,其中所述TGF-"包含TGF-A前蛋白。
39. 嵌合核酸序列，其包含(1) 第 一核酸序列，其能夠調(diào)節(jié)(2)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄(2) 第二核酸序列，其編碼TGF-〃并被適應(yīng)以在植物細(xì)胞中表達(dá)；和(3) 第三核酸序列，其編碼在植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)。
40. 如權(quán)利要求39所述的核酸，其包含適合在植物細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)的核酸序列。
41. 如權(quán)利要求40所述的核酸序列，其包含被適應(yīng)以在植物細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)的核酸序列。
42. 如權(quán)利要求39至41任一項(xiàng)所述的核酸序列，其包含在權(quán)利要求3至權(quán)利要求27的任一項(xiàng)中描述的核酸。
43. 用權(quán)利要求39至權(quán)利要求42任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)化的植物。
44. 植物種子，其包含權(quán)利要求39至權(quán)利要求42任一項(xiàng)所述的核酸。
45. 藥物，其包含依照權(quán)利要求1至34的任何一項(xiàng)產(chǎn)生的TGF-卩。
全文摘要
提供了在植物中表達(dá)TGF-β的方法。嵌合核酸序列，其包含(1)能夠調(diào)節(jié)(2)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的第一核酸序列，(2)編碼TGF-β并被適應(yīng)以在所述植物細(xì)胞中表達(dá)的第二核酸序列；和(3)編碼在所述植物細(xì)胞中具有功能的終止區(qū)的第三核酸序列，其被引入植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞生長(zhǎng)以產(chǎn)生TGF-β。所述核酸序列可優(yōu)選地被適應(yīng)以在植物葉綠體中表達(dá)。優(yōu)選所述TGF-β是TGF-β3，無(wú)論是全長(zhǎng)還是以活性片段的形式。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101535484SQ200780034586
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2007年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日
發(fā)明者修·杰勒德·蒂弗蒂, 尼古拉斯·奧克萊斯頓, 沙倫·奧凱恩, 菲爾·梅勒斯, 阿尼爾·戴, 馬丁·吉司貝, 馬克·威廉·詹姆斯·弗格森 申請(qǐng)人:瑞諾弗有限責(zé)任公司