專利名稱：：用于產(chǎn)生4-羥基-l-異亮氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，并具體涉及新的雙加氧酶和制備4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法。
背景技術(shù)：
：4-羥基-L-異亮氨酸是能夠從胡盧巴(fenugreek)種子(豆科胡盧巴(7Hgcwe〃"/oewMm-graecww丄./egww/waae))4是取禾口纟屯^f匕的一種氨基酉交。4-羥基-L-異亮氨酸顯示引起強烈興趣的促胰島素活性，因為它的刺激作用明顯依賴于介質(zhì)中的血漿葡萄糖濃度，正如在離體灌注的(isolatedperfUsed)大鼠胰臟和人胰島中所證明的(Sauvaire,Y.等，Diabetes,47:206-210,(1998》。對于磺酰脲未確認(rèn)這種葡萄糖依賴性(Drucker,D.J.，Diabetes47:159-169,(1998))，磺酰脲是目前用于治療II型糖尿病[或非胰島素依賴性糖尿病(NIDD或NIDDM)(non-insulin-dependentdiabetes(NIDD)mellitus(NIDDM))]的唯一促胰島素藥物，因此低血糖仍是磺酰脲治療的一個普遍的、不理想的副作用(Jackson,J.和Bessler,R.Drugs,22:211—245;295-320，(1981);Jennings,A.等，DiabetesCare:12:203-208,(1989))。葡萄糖耐受的改善也是已知的(Am.J.Physiol.Endocrinol.:Vol.287,E463-E471,2004)。已經(jīng)報道了這種葡糖代謝增強活性，和它用于藥物和保健食品的潛在應(yīng)用(特開平6-157302,US2007-000463A1)。僅存在于植物中的4-幾基-L-異亮氨酸，由于它的特殊似l夷島素作用，可能被認(rèn)為是新的促分泌素，對于治療II型糖尿病具有潛在的重要性，所述II型糖尿病是一種特征在于與不同程度胰島素抗性相關(guān)的缺陷性胰島素分泌的疾病(Broca，C.等,Am.J.Physiol.277(Endocrinol.Metab.40):E617畫E623，(1999》。一種通過利用胡盧巴^是取物中的雙加氧酶活性將4^、抗壞血酸、2-酮戊二酸(2-oxyglutaricacid)和氧依賴性異亮氨酸氧化的方法，作為制備4-羥基-L-異亮氨酸的方法已有報道(Phytochemistry,Vol.44,No.4,pp.563-566,1997)。然而，這種方法作為制備4-羥基-L-異亮氨酸的方法并不令人滿意，因為在20mM及以上的異亮氨酸濃度，所述酶的活性受到底物的抑制，該酶尚未得到鑒定，該酶源自植物提取物并且不易大量獲得，并且該酶不穩(wěn)定。已經(jīng)公開了一種有效的光學(xué)純(opticallypure)pS^R，4S)"4-羥基異亮氨酸的八步合成，其總產(chǎn)率為39%。這種合成的關(guān)鍵步驟涉及用白地霉(GeoWc/7wwcaw/Wwm)將乙基2-曱基乙酰乙酸生物轉(zhuǎn)化為乙基(2S,3S)-2-曱基—3-羥基—丁酸酯和不對稱Strecker合成(Wang,Q.等,Eur.J.Org.Chem.,834-839(2002))。還公開了(2S,3R，4S)-4-羥基異亮氨酸的一種完全控制立體化學(xué)(totalcontrolofstereochemistry)的簡短六步化學(xué)酶促合成，最后的步驟是通過使用商業(yè)上可以獲得的固定在EupergitC(E-PAC)上的青霉素酰化酶G(penicillinacylaseG)水解N-苯乙酰內(nèi)酯衍生物的酶促溶解(Rolland-Fulcrand,V.等，J.Org,Chem.，873-877(2004))。但在目前，尚未報道對任何L-異亮氨酸雙加氧酶的克隆和通過使用L-異亮氨酸雙加氧酶直接酶促羥化L-異亮氨酸來產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。至于由微生物產(chǎn)生異亮氨酸類似物，已報道了通過芽孢桿菌屬(Sfl"〃w)細(xì)菌產(chǎn)生2-氨基-3-酮-4-曱基戊酸(AMKP)(BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271(1977))。然而，沒有關(guān)于源自微生物的異亮氨酸輕化酶的報道。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供通過使用源自微生物的酶來產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸(用于表示包括它的游離形式和鹽形式兩者，并且可稱作"4HIL",下同)的方法，該方法能夠以大量制備4-羥基異亮氨酸。本發(fā)明的目的包括提供具有從異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的酶活性的微生物，和基于使用源自微生物的酶的羥化反應(yīng)從異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的方法。上述目的通過發(fā)現(xiàn)具有從異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的酶活性的微生物來實現(xiàn)。本發(fā)明的一個目的是提高(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸(用于表示包括它的游離形式和鹽形式兩種，并且可稱作"(2S，3R,4S)-4HIL"，下同)的產(chǎn)生，提供通過使用L-異亮氨酸雙加氧酶或具有所述L-異亮氨酸雙加氧酶活性的細(xì)菌直接酶促羥化L-異亮氨酸來制備(2S,3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法?？紤]前述問題而進(jìn)行了大量研究，結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人從自然界分離了一種具有高水平L-異亮氨酸雙加氧酶活性的細(xì)菌，克隆了編碼該L-異亮氨酸雙加氧酶的基因，并且發(fā)現(xiàn)了該L-異亮氨酸雙加氧酶可優(yōu)選用于合成期望的(2S，3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸，由此完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明的目的包括提供新的L-異亮氨酸雙加氧酶和編碼該L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA,以及使用該L-異亮氨酸雙加氧酶產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4-輕基-L-異亮氨酸的方法。上述目的通過發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新L-異亮氨酸雙加氧酶而實i見。在下文中將詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明的一個目的是提供產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸及其鹽的方法，其包括通過如下產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的步驟在源自微生物的羥化酶存在下對異亮氨酸或其鹽進(jìn)行羥化反應(yīng)，并從異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的產(chǎn)生方法，其中所述微生物是屬于芽孢桿菌屬的微生物。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的產(chǎn)生方法，其中所述屬于芽孢桿菌屬的微生物是選自蘇云金芽孢桿菌(Bo"7/wAwnV^'e"^)、地衣芽孢桿菌C6(3c/〃ws//c/zewy^m&)、3求形芽孑包才干菌(6a"7/w5s//zaen-CMS)、蠟^)犬芽孑包4干菌(Bac/〃wscerew力和韋氏芽孑包桿菌(5ac/〃wswez77erafe;/z"wem^)的孩i生物。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的產(chǎn)生方法，其中所述羥化反應(yīng)在制備自對數(shù)生長期微生物細(xì)胞的細(xì)胞裂解物存在下進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的產(chǎn)生方法，其中對L-異亮氨酸進(jìn)4亍羥卩t反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的產(chǎn)生方法，其中所述羥化酶是雙力口氧酶。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是"l是供如上所述的產(chǎn)生方法，其中所述羥化酶具有以下特性(a)需要氧、Fe2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸作為輔因子，(b)最適反應(yīng)pH為5-8，(c)最適反應(yīng)溫度為45°C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、012+和Zn2+抑制。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供具有以下特性并且可以從芽孢桿菌屬細(xì)菌分離的雙加氧酶(a)需要氧、Fe2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸作為輔因子，(b)最適反應(yīng)pH為5-8,(c)最適反應(yīng)溫度為45。C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、Qj2+和Zn2+抑制，(f)如通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測量，包含分子量為29000士2000的亞基，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的雙加氧酶，其中所述芽孢桿菌屬細(xì)菌是蘇云金芽孢桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供選自下組的DNA:(a)包含SEQIDNo:l的核普酸序列的DNA;(b)與具有SEQIDNo:l核苷酸序列的互補核苷酸序列的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交、并且編碼具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA;(c)編碼包含SEQIDNo:2的氨基,列的蛋白質(zhì)的DNA;(d)編碼具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位(inversion);和(e)編碼具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA,所述氨基S^列與SEQIDNo:2的氨基S^f列是至少98%同源的。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供通過如下獲得的重組DNA:將包含上述DNA的DNA(theDNAcontainingthesame)與載體DNA連4妄。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供由包含上述重組DNA的重組DNA(therecombinantDNAcontainingthesame)壽爭4b的纟田月包。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供用于產(chǎn)生具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含所述重組DNA的細(xì)胞，和在培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供選自下組的蛋白質(zhì)(f)包含SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)與SEQIDNo:2的氨基酸序列至少98%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種蛋白質(zhì)，其包含(A)具有催化通過L-異亮氨酸的羥化產(chǎn)生(2S,3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸的反應(yīng)的活性；(B)所述活性依賴于二價陽離子Fe2,并且(C)如通過SDS-PAGE測量，每個亞基的分子量是約29±2.0kDa。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供用于制備(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法，包括步驟在選自下組的至少一種L-異亮氨酸雙加氧酶存在下，使L-異亮氨酸在水性溶劑(aqueoussolvent)中反應(yīng)(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基Sl^列的蛋白質(zhì)，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)與SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)；分離產(chǎn)生的(2S，3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供用于制備(2S,3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法，包括步驟在包含選自下組的L-異亮氨酸雙加氧酶的細(xì)菌存在下，使L-異亮氨酸在水性溶劑中反應(yīng)(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)與SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)；和分離產(chǎn)生的(2S，3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌被修飾以增強L-異亮氨酸雙加氧酶的活性。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中通過增加L-異亮氨酸雙加氧酶的表達(dá)來增強所述L-異亮氨酸雙加氧酶的活性。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中通過修飾編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的基因的表達(dá)調(diào)控序列或通過增加編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的基因的拷貝數(shù)來增加所述L-異亮氨酸雙加氧酶的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(E!sc/zen'c/z/a)、j艮單月包菌屬(i^ewfifcwww(3s)、才奉桿菌屬(C07we6acfeWwm)、節(jié)桿菌屬(^W/2ra6acfer)、曲霉屬(y^/erg7'〃w力或芽孢桿菌屬。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于大腸桿菌(￡^c/zen,c/z/aco/z〕、筒單節(jié)一干菌(^W/zroZacterw'w//ex)、谷氛酉交才奉牙干菌(Cwywe6acfen,w附g/wtomz'cwm)、3求形節(jié)4干菌(/lW/2ro6actorg7o6^/brm/力、石危石黃節(jié)4干菌(^^/^(60^07-w^/rew力、粘液節(jié)^干菌(v4rf/zra6actorv&cosM力或才古草芽孑包本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌是細(xì)菌培養(yǎng)物、細(xì)月包、經(jīng)處理的細(xì)胞(treatedcells)或細(xì)胞裂解物。附圖簡述圖1顯示的圖示展現(xiàn)了菌株2-e-2的培養(yǎng)物中4-羥基異亮氨酸和AMKP的產(chǎn)生量隨時間的變化。圖2顯示的圖示展現(xiàn)了菌抹2-e-2的培養(yǎng)物中濁度的變化。圖3顯示的圖示展現(xiàn)了通過使用菌林2-e-2的靜息細(xì)胞觀察的產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸和AMKP的活性。圖4顯示的圖示展現(xiàn)了多種樣品的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性。圖5顯示的圖示展現(xiàn)了菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的pH依賴性。圖6顯示的圖示展現(xiàn)了菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度依賴性。圖7顯示的圖示展現(xiàn)了菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度穩(wěn)定性。圖8顯示的圖示展現(xiàn)了純化酶的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的pH依賴性。圖9顯示的圖示展現(xiàn)了純化酶的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度依賴性。圖IO顯示的圖示展現(xiàn)了純化酶的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度穩(wěn)定性。圖11顯示本發(fā)明產(chǎn)生IDO的方法的流程圖(flowchart)。圖12顯示從蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2純化IDO(照片)。描繪了來自純化步驟的蛋白質(zhì)制備物的SDS-PAGE。泳道1-指示分子量的標(biāo)記；2-粗制細(xì)胞裂解物；3-^L酸銨沉淀；4-SEC;5-AEC。圖13顯示來自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的IDO的MS鑒定。圖14顯示蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型(serovarisraelensis)，ATCC35646)RBTH—06809ORF的推定的翻譯起點。圖15顯示重組pMW119-IDO(Lys,32/23)質(zhì)粒的人工表達(dá)模塊(module)。圖16顯示pMW119-IDO(Lys，23)質(zhì)粒的物理圖譜和克隆的包含IDO結(jié)構(gòu)基因的5am//I-&cI片段的測定的DNA序列?；疑珮?biāo)記的調(diào)節(jié)區(qū)中的自發(fā)點突變。圖17顯示pMW119-IDO(Lys,32)質(zhì)粒的物理圖譜和克隆的包含IDO結(jié)構(gòu)基因的^W7州-SacI片^殳測定的DNA序列。圖18顯示對應(yīng)于IDO(Lys,23)、IDO(Lys,32)和RBTH—6809(5'端截短的)的結(jié)構(gòu)基因的DNA比對。用灰色標(biāo)記可變的位置。圖19顯示IDO(Lys,23)、IDO(Lys，32)和RBTH—06890ORF的蛋白質(zhì)比對。用該灰色標(biāo)記可變的位置。圖20顯示來自蘇云金芽孢桿菌的IDO、來自蠟狀芽孢桿菌的BC1061和來自韋氏芽孢桿菌的保守的假設(shè)蛋白的蛋白質(zhì)比對。實施發(fā)明的最佳方式在本說明書中，4-羥基異亮氨酸意指選自下組的非對映異構(gòu)體中的一種類型、或者兩種或更多種類型的混合物(2S，3S，4S)-4-羥基異亮氨酸、(2S,3R,4R)-4-羥基異亮氨酸、(2S，3S，4R)-4-羥基異亮氨酸和(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸。4-羥基異亮氨酸優(yōu)選是(2S，3R，4S)-或(2R,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸，或它們的混合物，更優(yōu)選是(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸。具體而言，術(shù)語"(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸'，或"(2S,3R，4S)-4HIL"可以指單一化合物或含有(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸的混合物。術(shù)語"細(xì)菌，，或"微生物"如用于本說明書中包括產(chǎn)酶的細(xì)菌或微生物、存在或增強了目標(biāo)酶活性的這些細(xì)菌或微生物的突變體和遺傳重組體等。O從異亮氨酸產(chǎn)生4HIL的酶活性作為本發(fā)明基于羥化酶催化的異亮氨酸羥化反應(yīng)來產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的方法中使用的羥化酶，可以使用任何粗制酶如樣i生物培養(yǎng)物、細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞裂解物或純化酶，只要所選材料具有將異亮氨酸轉(zhuǎn)化為4-羥基異亮氨酸的酶活性。粗制酶如破裂的細(xì)胞或純化的酶是理想的。羥化酶的實例包括加氧酶、雙加氧酶等，并且優(yōu)選是雙加氧酶。能夠從菌抹2-e-2分離并且具有以下特性的羥化酶是優(yōu)選的(a)需要氧、Fe2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸作為輔因子，(b)最適反應(yīng)pH為5-8，(c)最適反應(yīng)溫度為45°C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制。能夠從菌抹2-e-2分離的羥化酶進(jìn)一步具有以下特性(f)如通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測量，由分子量為29000±2000的亞基組成，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。當(dāng)羥化酶需要輔因子時，優(yōu)選向體系添加或供應(yīng)所述輔因子。用于雙加氧酶的輔因子的實例包括，例如，F(xiàn)e2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸。當(dāng)它們形成鹽時，可將這些輔因子以它們的鹽的形式添加或供應(yīng)至體系。作為所述微生物，可以使用任何微生物，只要選擇的是在所述羥化反應(yīng)條件下具有將異亮氨酸轉(zhuǎn)化成4-羥基異亮氨酸的酶活性的微生物。使用的微生物的實例包括屬于芽孢桿菌屬或假單胞菌屬的微生物，它們的突變體或衍生物，等等。另外，所述微生物可以是這樣的微生物，其中通過基因重組技術(shù)表達(dá)所述的羥化酶，并且所述微生物具有4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性。具體實例包括蘇云金芽孢桿菌(菌抹2-e-2、菌林AKU238、菌林NBRC3958、菌株ATCC35646等)、地衣芽孢桿菌(菌抹AKU223、菌抹IAM11054等)、球形芽孢桿菌(菌林AKU227、菌林NBRC3526等)、蠟狀芽孢桿菌菌株ATCC14579和韋氏芽孢桿菌菌抹KBAB4。將菌抹2-e-2命名為AJ110584菌抹，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定在2006年9月27日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(independentadministrativeagency,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepositary)(TsukubaCentral6，1-1，Higashi1-Chome,Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566,Japan),并獲得登錄號FERMBP-10688。在上述微生物中，菌林名稱以AKU起始的那些能夠從LaboratoryofFermentationPhysiologyandAppliedMicrobiology,DivisionofAppliedLifeSciences,GraduateSchoolofAgriculture,KyotoUniversity(京都大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)部發(fā)酵生理學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)實驗室)獲得。菌林名稱以IAM起始的那些子果存在LaboratoryofBioresources,InstituteofMolecularandCellularBiosciences,theUniversityofTokyo(東京大學(xué)分子和細(xì)胞生物科學(xué)研究所生物資源實驗室)的IAM培養(yǎng)物保藏中心，并且可以通過使用登記號來獲得。與所述菌抹對應(yīng)的登記號在IAM目錄(IAMCatalogueofStrainsThirdEdition(IAM菌抹目錄第三版)，2004)中列出。菌抹名稱以NBRC起始的那些能夠從獨立行3支；去人產(chǎn)品^平i"介4支術(shù)基石出片幾#勾(independentadministrativeagency,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(2畫5-8，KazusaKamatari，Kisarazu-shi，Chiba,292-0818)獲得。菌抹名稱以ATCC起始的那些能夠從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(郵政地址ATCC，P.O.Box1549,Manassas,VA20108，1,UnitedStatesofAmerica)。韋氏芽孢桿菌菌抹KBAB4能夠從法國國家農(nóng)業(yè)研究院(InstitutNationaldelaRechercheAgronomique)(由卩3支i也iit:GenetiqueMicrobienne，INRA,DomainedeVilvert,79352JouyenJosascedex,France)獲得。蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2是由本發(fā)明的發(fā)明人從京都市的土壤中新近分離的一種菌抹，該菌抹的科學(xué)特性示于下文。蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的分類學(xué)特性1.表型細(xì)胞形態(tài)芽孢桿菌(大小1.0-1.2x2.0-3.0|im)革蘭氏染色+內(nèi)生孑包子(endospore):+對氧的態(tài)度需氧生長溫度在20-35。C生長良好(favorablegrowth)最優(yōu)pH:pH7.0-7.52.基于16SrDNA核苷酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化(phylogenetic)分析通過使用BLAST在細(xì)菌類型菌株數(shù)據(jù)庫(NCIMBJapan,Shizuoka(靜岡》和國際核苷S餅列數(shù)據(jù)庫(GenBank/DDBJ/EMBL)中搜索與菌林2-e-2的16SrDNA核苷酸序列(SEQIDNO:9)的同源性，各檢索到30個最同源的菌抹。然后，使用從細(xì)菌類型菌林?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索到的30個最同源菌抹和根據(jù)鄰接法的各種樣本的16SrDNA核苷酸序列來創(chuàng)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。對于同源性檢索和生成筒化的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，孑吏用DNAsisPro(HitachiSoftwareEngineeringCo.,Ltd.,Tokyo)。使用BLAST對細(xì)菌類型菌抹數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索的結(jié)果是，菌抹2-e-2的16SrDNA的部分核苷酸序列與蘇云金芽孢桿菌ATCC10792菌抹的16SrDNA以100%的同源性匹配。對GenBank/DDBJ/EMBL進(jìn)行同源性搜索的結(jié)果是，菌林2-e-2的16SrDNA與蘇云金芽孢桿菌的顯示高同源性。另外，使用菌林2-e-2的16SrDNA和從細(xì)菌類型菌抹數(shù)據(jù)庫檢索到的30個最同源菌抹的16SrDNA的簡化分子系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果是，菌抹2-e-2與蘇云金芽孢桿菌的16SrDNA形成了基本上相同的系統(tǒng)進(jìn)化分支，說明它們是非常緊密相關(guān)的。3.分類和鑒定的結(jié)果簡化的形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果是，菌抹2-e-2顯示了芽孢桿菌屬細(xì)菌的共有特性，并且對部分16SrDNA序列的分析結(jié)果也顯示菌抹2-e-2屬于蘇云金芽孢桿菌。由于沒有發(fā)現(xiàn)微生物與菌抹2-e-2顯示出同樣水平的AMKP產(chǎn)生活性，所以將這種菌林鑒定為新菌林。本發(fā)明中使用的微生物可以根據(jù)常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基均可用于培養(yǎng)，只要所述培養(yǎng)基含有能由所述微生物同化的碳源、氮源、無機鹽等，并且在該培養(yǎng)基中能夠有效地培養(yǎng)所述微生物。碳源可以是能由所述微生物同化的碳源，并且可以使用糖類如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、淀粉水解物和糖蜜，有機酸如乙酸、乳酸和葡糖酸，以及醇如乙醇和丙醇。作為氮源，可以使用氨、各種無機酸和有機酸的銨鹽如硫酸銨、氯化銨、醋酸銨和磷酸銨、其它含氮化合物、胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆粉、大豆粉水解物、各種發(fā)酵細(xì)胞及其消化產(chǎn)物等，只要所述微生物能夠同化它們。作為無機鹽，可以使用磷酸鉀、硫酸銨、氯化銨、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳等，只要使用的微生物能夠同化它們。此外，4丐鹽、鋅鹽、硼鹽、銅鹽、鈷鹽、鉬鹽等可以作為痕量元素添加。另外，維生素如硫胺素和生物素，氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸，核酸相關(guān)物質(zhì)如腺噤呤和鳥嘌呤等可以根據(jù)需要添加。培養(yǎng)在有氧條件下進(jìn)行，如通過振蕩培養(yǎng)物或深通氣攪拌培養(yǎng)物(deepaerationstirringculture)而獲得的條件。培養(yǎng)溫度優(yōu)選10-37。C，培養(yǎng)時間是5-40小時。在培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)物的pH保持在5.0-9.0。通過使用無機酸或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸釣、氨等來調(diào)節(jié)pH。本發(fā)明中使用的粗制酶如破裂的細(xì)胞，即微生物細(xì)胞裂解物，可為包含胞外羥化酶的粗制酶，它的實例包括用表面活性劑、有機溶劑或酶處理的細(xì)菌細(xì)胞，經(jīng)過超聲、機械破裂或溶劑處理的細(xì)胞，細(xì)胞蛋白級分，經(jīng)處理細(xì)胞的固化產(chǎn)物，等等。所述細(xì)胞裂解物優(yōu)選制備自對數(shù)生長期的細(xì)胞。為了制備細(xì)胞裂解物，可以將培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞用等滲溶液如生理鹽水洗滌，然后通過任意手段使其破裂，例如，使用弗氏壓碎器(Frenchpress)、玻璃珠、超聲破碎儀(ultrasonicdisruptor)、MantonGaulin均質(zhì)儀、研砵(mortar)或它們的組合等的擠壓破裂。為了進(jìn)一步有效的破裂，可以通過冷凍處理、酶處理等以物理或化學(xué)方法處理細(xì)胞膜表面。在細(xì)胞破裂期間，使細(xì)胞總是保持在低溫，并且當(dāng)細(xì)胞裂解溫度因破裂處理升高時，可以立即將溫度降低。用于細(xì)胞裂解物的水性介質(zhì)的實例包括，但不限于，水和緩沖液如硼酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽的緩沖液和Good緩沖液。另外，可以添加甘油、DTT等作為酶穩(wěn)定劑，而且可以添加EDTA、EGTA、PMSF、胃蛋白酶抑制劑、E-64等作為蛋白酶抑制劑。也可添加抑制劑的組合、抑制劑混合物(inhibitorcocktail)等。關(guān)于使用上述細(xì)胞裂解物的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生反應(yīng)的底物溶液的組成，可以使用體積為100(il的含有5mM異亮氨酸、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和5mMFe"的100mMHEPES緩沖液(pH7.0)，并且將反應(yīng)在30。C進(jìn)行60分鐘。除了HEPES緩沖液，也可以使用任意緩沖液如MES緩沖液和GTA廣域緩沖液(GTAwiderangebuffer)。根據(jù)需要將酶失活之后，將反應(yīng)溶液的離心上清級分過濾，并通過高效液相層析或TLC來確認(rèn)4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^任何方法來定量4-羥基異亮氨酸，只要使用了能夠?qū)?-羥基異亮氨酸與其它成分分離的分析系統(tǒng)，并且所述分析系統(tǒng)的實例包括TLC和高效液相層析。在它們之中，高效液相層析優(yōu)選用于定量分析，原因是它的高靈敏度和高分離能力。實例包括MJ交分析方法WatersAccQ-TagTM法，等等。通過改進(jìn)的WatersAccQ-TagTM法(參見下文描述的實施例)，能夠分離4-羥基異亮氨酸的非對映異構(gòu)體們，并且能夠分離天然存在的4-羥基異亮氨酸和2-氨基-3-曱基-4-酮戊酸(一種通過氧化4-羥基異亮氨酸的羥基形成的酮類化合物)。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸可以通過使用常規(guī)采用的氨基酸純化方法來分離。例如，通過使用離子交換樹脂處理、膜處理、結(jié)晶等的組合，可以將4-羥基異亮氨酸自反應(yīng)混合物的上清(通過離心從中去除固體)分離。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，用于異亮氨酸羥化反應(yīng)的pH優(yōu)選是5-8。關(guān)于反應(yīng)混合物的組成，優(yōu)選在所述混合物中存在對酶反應(yīng)關(guān)鍵的因子。當(dāng)Fe"是關(guān)鍵因子時，期望反應(yīng)混合物組成不太可能引起與Fe"的螯合，如HEPES緩沖液、MES緩沖液和GTA廣域緩沖液。然而，對反應(yīng)混合物組成根本無限制，只要保持Fe^的作用即可。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，用于異亮氨酸羥化反應(yīng)的溫度通常是15-30。C，優(yōu)選45。C或更低。反應(yīng)時間通常是5分鐘至200小時，盡管它依賴于酶量變化。作為用于羥化反應(yīng)的異亮氨酸，優(yōu)選使用L-異亮氨酸。在其中進(jìn)行反應(yīng)的溶劑的實例包括水性溶劑，例如，水，緩沖液如碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、種檬酸鹽和Tris的緩沖液，有機溶劑，例如，醇如曱醇和乙醇，酯如乙酸乙酯，酮如丙酮，酰胺如乙酰胺，含有這些有機溶劑的水性溶劑，等等。另外，可以根據(jù)需要添加用于激活羥化反應(yīng)的因子。本發(fā)明中使用的微生物細(xì)胞裂解物的蛋白濃度是0.1-50mg/ml，優(yōu)選0.5-20mg/ml(按照細(xì)胞重量(濕重))。4-羥基-L-異亮氨酸可以通過如下產(chǎn)生向水性介質(zhì)以合適的濃度添加細(xì)胞裂解物、底物和輔因子，并且使所述反應(yīng)在45。C或更低的溫度，優(yōu)選30。C,和pH5-12，優(yōu)選pH5-7.5進(jìn)行5分鐘至120小時。<11>L-異亮氨酸雙加氧酶和編碼該L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA和它們的用途以下參考附圖提供關(guān)于[I]L-異亮氨酸雙加氧酶，[II]使用本發(fā)明的L-異亮氨酸雙加氧酶產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸的方法的詳細(xì)說明。[I]L-異亮氨酸雙加氧酶根據(jù)本發(fā)明發(fā)明人的研究，確認(rèn)了芽孢桿菌屬中的細(xì)菌菌抹包含具有形成(2S，3R,4S)-4HIL能力的L-異亮氨酸雙加氧酶。在下文將來自微生物細(xì)胞的L-異亮氨酸雙加氧酶縮寫為IDO。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人提供的對環(huán)境微生物的篩選揭示了獨特的微生物蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2具有能夠催化從L-異亮氨酸(用于表示包括它的游離形式和鹽形式兩種，下同)直接形成(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)的活性。亮氨酸雙加氧酶，在下文縮寫為IDO(Lys，23)。另外，本發(fā)明的發(fā)明人通過純化源自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的雙加氧酶確定了IDO(Lys，23)的>^-末端#^酸序列。將蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2命名為蘇云金芽孢桿菌AJ110584，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定在2006年9月27曰保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Central6，1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki305-8566，Japan)并獲得登錄號FERMBP-10688。另外，本發(fā)明的發(fā)明人還合成了從IDO(Lys，23)的氨基酸序列推定的約30個堿基對的DNA分子，使用來自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的染色體DNA和下文縮寫為IDO(Lys，23)的來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹(ATCC35646)的L-異亮氨酸雙加氧酶作為對照分離并獲得了編碼IDO(Lys,23)的DNA的全長，構(gòu)建了重組質(zhì)粒并用它們轉(zhuǎn)化了大腸桿菌菌林的細(xì)胞。對重組大腸桿菌IDO活性的后續(xù)分析揭示了與IDO(Lys,32)相比高得多(5倍高)的IDO(Lys,23)活性，原因是來自蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的IDO(Lys，23)基因中的獨特突變。中的SEQIDNo:1。此外，由SEQIDNo:1的核苦酸序列編碼的IDO(Lys，23)的氨基酸序列示于SEQIDNo:2。SEQIDNo:2是由SEQIDNo:1的核苷酸序列編碼的IDO(Lys,23)的氨基酉拼歹'j。SEQIDNO:2的IDO(Lys，23)具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性，并且催化從一個分子的L-異亮氨酸直接合成下文式(1)中所示(2S,3R，4S)-4HIL的反應(yīng)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其次，依次提供關(guān)于(l)編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA，p)L-異亮氨酸雙加氧酶的特性和(3)用于產(chǎn)生L-異亮氨酸雙加氧酶的方法。(l)編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA具有SEQIDNo:1的核香酉lL^列的本發(fā)明的IDO(Lys,23)基因分離自實施例部分描述的蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的染色體DNA。編碼IDO(Lys,23)的、來自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的SEQIDNo:1的核苷S交序列顯示與蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌株(ATCC35646)基因組核苷S吏序列無注釋的部分(non-annotatedpart)在核苷酉餅歹'j(圖19)和tt,歹'j(圖18)中的高水平同源性，其中之一在2007年1月17日提交至NationalCenterforBiotechnologyInformation(美國國家生物信息中心)，NIH(美國國家衛(wèi)生研究所)，Bethesda,MD20894,USA(登錄號AAJM00000000.1,GI:74494335)，另一個獲得自相同蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹的編碼IDO(Lys,32)的基因組DNA的測序結(jié)果，所述蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹以登錄號VKPMB-197由俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)得到。來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹VKPMB-197的編碼IDO(Lys，32)的核苷S交序列示于SEQIDNO:7。下文將提供關(guān)于從產(chǎn)IDO細(xì)菌獲得IDO氨基酸序列的方法的說明。從凝膠回收主要蛋白并通過MS分析鑒定為來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)ATCC35646菌林的推定的RBTH_06809蛋白(圖l3)。對提取自SDS-PAGE的蛋白樣品進(jìn)行了質(zhì)譜分析。根據(jù)Govorun,V.M.等(Theproteomecomparativeanalysisof7/e//coZ""erclinicalisolates.Biochemistry(Rus)，68，42_49pO(B))的規(guī)程進(jìn)行凝膠處理、胰蛋白酶水解(trypsinolysis)、蛋白質(zhì)提取和通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)的質(zhì)量分析。使用Mascot軟件(MatrixScience,USA)的PeptideFingerprint(肽指紋)選項通過成組的蛋白質(zhì)的光解肽質(zhì)量來鑒定該蛋白質(zhì)。能夠使用基于蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹(ATCC"6M)的序列設(shè)計的適當(dāng)引物通過PCR來獲得編碼IDO的DNA片段。用于PCR的方法在公開文獻(xiàn)如White,T丄等，TrendsGenet.5,185(1989)中描述。用于分離染色體DNA的方法，以及使用DNA分子作為探針從基因文庫分離期望的DNA分子的方法，在公開文獻(xiàn)如MolecularCloning,3rdedition(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。用于測定編碼IDO的分離的DNA核苷酸序列的方法在APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWiley&Sons,Inc.(1985)中描述。另外，可以通過使用由AppliedBiosystems制造的DNA測序儀來測定核苷酸序列。源自蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的編碼IDO(Lys，23)的DNA示于SEQIDNo:1。來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌株VKPMB-197的編碼IDO(Lys,32)的核普酸序列示于SEQIDNo:7。催化從L-異亮氨酸形成(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)的IDO的編碼DNA不僅僅是SEQIDNo:1中所示的DNA。這是因為在形成催化從L-異亮氨酸產(chǎn)生(2S,3R，4S)-4HIL的反應(yīng)的IDO的芽孢桿菌屬菌種中，從各個菌種和菌抹觀察到的核苷il/f列中應(yīng)該存在差異。本發(fā)明的DNA不僅包括編碼IDO的分離的DNA,本發(fā)明的DNA中還包括向分離自產(chǎn)IDO孩i生物染色體DNA的編碼IDO的DNA人工添加了突變的DNA，只要該DNA編碼具有催化所述反應(yīng)的活性的IDO。用于人工添加突變的方法包括通常使用的方法，如Method,inEnzymol.,154(1987)中描述的用于導(dǎo)入位點特異性突變的方法。在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNo:1核苷酸序列的互補核苷酸序列的DNA雜交、并且編碼具有IDO活性的蛋白質(zhì)的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中。如用于本文，"嚴(yán)緊條件"指這樣的條件，在該條件下形成特異性雜合體而不形成非特異性的雜合體。盡管難以明確地用數(shù)字表示這些條件，但作為示例，值得一提的是以下條件在該條件下同源性高于例如優(yōu)選70%或更高、更優(yōu)選80%或更高、還更優(yōu)選90%或更高、并且尤其優(yōu)選95%或更高同源性的DNA分子相互雜交，而具有較低同源性的DNA分子不相互雜交；或者在該條件下，在Southern雜交的常規(guī)洗滌條件下產(chǎn)生雜交，所述常規(guī)條件即鹽濃度相當(dāng)于O.lxSSC和0.1%SDS在37°C,優(yōu)選O.lxSSC和0.1°/。SDS在60°C，并更優(yōu)選O.lxSSC和0.1%SDS在65。C?！奖酷橀L度可以依賴于雜交條件合適地選擇，并且通常在100bp至1kbp變化。另外，"L-異亮氨酸雙加氧酶活性，，對于從L-異亮氨酸合成(2S,3R，4S)-4HIL的活性可能是足夠的。然而，在核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNo:l核苷酸序列的互補核苷酸序列雜交的情況下，優(yōu)選在37°C和pH8條件下保留具有SEQIDNo:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的L-異亮氨酸雙加氧酶活性的10%或更多，優(yōu)選30%或更多，更優(yōu)選50%或更多，并且還更優(yōu)選70%或更多。另夕卜，編碼基本上與由SEQIDNo:1的DNA編碼的IDO相同的蛋白質(zhì)的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中。即，以下DNA也包括在本發(fā)明的DNA中(a)包含SEQIDNo:1的核香酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNo:1核苷酸序列的互補核苷酸序列的DNA雜交并且編碼具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA;(c)編碼包含SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA;(d)編碼具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，所述4J^酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(e)編碼具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，所述氨基酸序列與SEQIDNo:2的氨基酸序列是至少70%同源的，優(yōu)選至少80%同源的，更優(yōu)選至少90%同源的，并且還更優(yōu)選至少95%同源的。在此，"一個或幾個"指蛋白質(zhì)氨基酸殘基的3D結(jié)構(gòu)或L-異亮氨酸雙加氧酶活性不受顯著損壞的范圍，更具體而言，范圍是1-78,優(yōu)選1-52，更優(yōu)選1-26,并且還更優(yōu)選1-13。一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位應(yīng)該是保守的突變以便保留活性。代表性的保守突變是保守取代。保守取代的實例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys,用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取孑義Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取4戈Glu,用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile,用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met,用Trp、Tyr、Met、lie或Leu取代Phe,用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr,用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。另外，"L-異亮氨酸雙加氧酶活性"指如上所述從L-異亮氨酸合成(2S，3R,4S)-4HIL的活性。然而，在氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基S吏序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位的情況下，優(yōu)選在30。C和pH6.0的條件下保留具有SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)L-異亮氨酸雙加氧酶活性的10%或更多，優(yōu)選30%或更多，更優(yōu)選50%或更多，并且還更優(yōu)選70%或更多。本發(fā)明的IDO的L-異亮氨酸雙加氧酶活性可以通過使用高效液相層析(HPLC)分析(2S，3R，4S)-4HIL從L-異亮氨酸的形成來測量。另夕卜，SEQIDNO:1的同源物DNA可以用作本發(fā)明的編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的基因。同源物基因是否編碼L-異亮氨酸雙加氧酶能夠通過測量細(xì)胞裂解物或過表達(dá)所述同源物DNA的微生物的細(xì)胞裂解物的L-異亮氨酸雙加氧酶活性來確認(rèn)。SEQIDNO:1的同源物DNA也可以作為本發(fā)明的L-異亮氨酸雙加氧酶從另外的芽孢桿菌屬菌種(例如，蠟狀芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌)的基因組制備。蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌的氨基酸序列的比對示于圖20，而芽孢桿菌屬之間的保守序列示于SEQIDNO:6。另外，可以基于與來自芽孢桿菌屬(5""7/w)、埃希氏菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、曲霉屬、假單胞菌屬、顆粒桿菌屬(Gra柳/沾acter)、曱基菌屬0W^/^/o6ad〃M力、茅貞^i4干菌屬(GWmw/沾acfer)、p耆酉臾菌屬04c/力)/n7/MW)、農(nóng)4干菌屬(v4gra6a"en'wm)、葡一唐4干菌屬(G7"cowo6ac/er)、才丙一干菌屬(Caw/c^<3cter)、才示才莊菌屬(5Wgmate〃a)、凈'占3求菌屬(^Vfyx:ococc附)、尸o/aro附o"os、才丙4干菌屬(Caw/okifcfer)、尸o/ara附o"05、鞘氨醇單月包菌屬(iS^/zz'"gomoww)、食酸菌屬(v4cWovorax)、分才支一干菌屬(A^co6acfen'wm)、固氮菌屬(ylzoto6(3cte。、《瓜菌屬(M》/0)、多核桿菌屬(尸o/，wc/eo/)a"e。、鏈霉菌屬(5yre/toWFe力等的下列基因(表l)的同源性，通過克隆獲得來自其它細(xì)菌的編碼同源物DNA?？梢允褂美鏢EQIDNO:3和4中所示的合成寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增所述同源物。表1.推定的編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA列表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(2)IDO的特性其次，提供關(guān)于源自蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的、純化的L-異亮氨酸雙加氧酶(IDO(Lys,23))特性的說明。本發(fā)明的IDO(Lys,23)具有SEQIDNo:2的氨基酸序列，如通過前文描述的基因分離和分析所清楚確定的。然而，本發(fā)明包括具有如下氨基酉l/f列并且也具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、在夾失、插入、添加或倒位。即，本發(fā)明的IDO包括以下蛋白質(zhì)(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基S交序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)與SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源、優(yōu)選至少80%同源、更優(yōu)選至少90%同源、并且還更優(yōu)選至少95同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)。在此，"幾個，，和"L-異亮氨酸雙加氧酶活性，，的定義與部分(l)編碼L-異亮氨酸雙加氧酶的DNA中的定義相同。本發(fā)明的IDO催化從L-異亮氨酸通過羥化反應(yīng)合成(2S，3R,4S)-4HIL的反應(yīng)。本發(fā)明的IDO的L-異亮氨酸雙加氧酶活性可以通過使用高效液相層析(HPLC)分析(2S,3R，4S)-4HIL從L-異亮氨酸的形成來測量。本發(fā)明的IDO能夠催化從L-異亮氨酸通過羥化反應(yīng)合成(2S，3R,4S)-4HIL的反應(yīng)。在雙加氧酶催化的羥化反應(yīng)中，分子氧的一個原子被納入L-異亮氨酸，而另一個氧原子納入其它氧受體，例如a-酮戊二酸，導(dǎo)致形成(2S，3R,4S)-4HIL和琥珀酸并釋放二氧化碳。雙加氧酶能夠以立體特異性的方式羥化脂肪族碳鏈。盡管迄今為止已經(jīng)報導(dǎo)了能夠催化L-異亮氨酸作為底物的羥化反應(yīng)的植物酶的一個實例，所述植物酶由源自胡盧巴提取物的L-異亮氨酸雙加氧酶組成(Phytochemistry,Vol.44，No.4,pp.563-566，1997)。但是，這種方法作為制備4-羥基-L-異亮氨酸的方法并不令人滿意，因為在20mM及以上的異亮氨酸濃度所述酶的活性受到底物的抑制，所述酶未經(jīng)鑒定，所述酶源自植物提取物并且不易大量獲得，并且所述酶不穩(wěn)定。其后，下文將提供針對純化IDO(Lys,23)調(diào)查的酶特性的描述。IDO(Lys,23)催化下面所示反應(yīng)中L-異亮氨酸十a(chǎn)-酮戊二酸+02^4HIL+琥珀酸+C02從L-異亮氨酸形成由以下通式(I)代表的(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)因此，通過使用本發(fā)明的IDO(Lys,23)從L-異亮氨酸產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4HIL的方法也屬于本發(fā)明。另外，本發(fā)明的IDO(Lys,23)的活性嚴(yán)格依賴于二價陽離子Fe^并且在EDTA存在下完全封閉。IDO(Lys，23)能夠催化將一個氧原子轉(zhuǎn)移至L-異亮氨酸并且將另一個氧原子轉(zhuǎn)移至作為受體分子的a-酮戊二酸。所以，IDO(Lys，23)可能屬于a-酮戊二酸(a-ketoglutamate)依賴性雙加氧酶。由于通過SDS-PAGE測得的IDO(Lys,23)每個亞基的分子量是約29±2.0kDa。因此，本發(fā)明還包括由以下特征限定的蛋白質(zhì)(A)具有催化從L-異亮氨酸和a-酮戊二酸產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)的活性；(B)所述活性依賴于二價陽離子包括Fe2、并且(C)如通過SDS-PAGE測量，每個亞基的分子量是約29±2.0kDa。來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)菌抹VKPMB-197的IDO(Lys,32)具有SEQIDNO:8的氨基S臾序列。(3)用于產(chǎn)生L-異亮氨酸雙加氧酶的方法接下來，提供關(guān)于產(chǎn)生本發(fā)明IDO的方法的說明。有兩種方法來產(chǎn)生本發(fā)明的IDO。這兩種方法由(i)培養(yǎng)產(chǎn)IDO的孩i生物以形成和積累IDO的方法，和(ii)通過重組DNA技術(shù)制備形成IDO的轉(zhuǎn)化體，并且培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體來積累IDO的方法組成。(i)通過微生物培養(yǎng)形成和積累IDO的方法在通過培養(yǎng)產(chǎn)IDO微生物來形成和積累IDO的方法中充當(dāng)獲得IDO的來源的微生物實例包括屬于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、曲霉屬或芽孢桿菌屬的微生物。屬于芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、曲霉屬、假單胞菌屬、顆粒桿菌屬、曱基菌屬、顆粒桿菌屬、嗜酸菌屬、農(nóng)桿菌屬、葡糖桿菌屬、柄桿菌屬、標(biāo)樁菌屬、粘球菌屬、尸o/ara附owos、柄桿菌屬、尸o/"ramowos、鞘氨醇單胞菌屬、食酸菌屬、分枝桿菌屬、固氮菌屬、弧菌屬、多核桿菌屬、鏈霉菌屬的任何微生物可以在本發(fā)明中使用，只要它們是形成IDO的微生物，所述IDO催化從L-異亮氨酸和a-酮戊二酸合成(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)，并且優(yōu)選的微生物包括蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2和蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型；ATCC35646)菌林。在這些之中，蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2是尤其優(yōu)選的。和固體培養(yǎng)，但是在工業(yè)上有利的方法是深通氣攪拌培養(yǎng)(deep-aeratedstircultivation)。通常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源、無機鹽和其它痕量營養(yǎng)元素可以用作營養(yǎng)培養(yǎng)基的營養(yǎng)元素?？梢允褂盟袪I養(yǎng)來源，只要它們能夠為使用的微生物菌抹所利用。通過振蕩培養(yǎng)、深換氣攪拌培養(yǎng)(deepventilationstirculturing)等使培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度在可以滿足微生物生長并產(chǎn)生IDO的范圍內(nèi)。因此，盡管條件并不嚴(yán)格，但是培養(yǎng)溫度通常是10-50°C,并且優(yōu)選15-42。C。培養(yǎng)時間根據(jù)其它培養(yǎng)條件而改變。例如，可以將微生物培養(yǎng)至產(chǎn)生最大量的IDO，而這通常是大約5小時至7天，并且優(yōu)選大約10小時-96小時。在培養(yǎng)之后，通過離心(例如，10,000xgIO分鐘)回收微生物細(xì)胞。由于大部分IDO存在于細(xì)胞中，通過破裂或溶解微生物細(xì)胞來使IDO溶解。超聲破裂、弗氏壓碎破裂或玻璃珠破裂可以用來使微生物細(xì)胞破裂。在溶解細(xì)胞的情況下，采取使用卵白溶菌酶(eggwhitelysozyme)的方法、肽酶處理或它們的合適組合。當(dāng)純化源自產(chǎn)IDO微生物的IDO時，盡管是通過使用酶溶解溶液作為起始材料來純化IDO，但是如果殘存未破裂或未溶解的殘余物，那么重新離心溶解溶液并去除沉淀的任何殘余物對于純化是有利的。所有通常使用的用于純化普通酶的方法可以用于純化IDO,其實例包括硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析和羥磷灰石層析。結(jié)杲，可以獲得具有較高比活性的含IDO級分。(ii)使用重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生方法接下來，提供關(guān)于使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生IDO的方法的說明。存在許多使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生有用蛋白諸如酶和生理學(xué)活性物質(zhì)的已知實例，并且重組DNA技術(shù)的使用使得大量產(chǎn)生僅以痕量存在于自然界的有用蛋白成為可能。圖ll是用于產(chǎn)生本發(fā)明IDO的方法的流程圖。首先，制備編碼本發(fā)明的IDO的DNA(步驟Sl)。其次，將制備的DNA與載體DNA連接以產(chǎn)生重組DNA(步驟S2)，并且通過所述重組DNA來轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體(步驟S3)。接著將所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且允許IDO形成并在培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累(步驟S4)。其后，所述方法進(jìn)行至步驟S5，其中通過回收和純化所述酶來產(chǎn)生純化的IDO。通過在羥化反應(yīng)中使用在步驟S5產(chǎn)生的純化IDO或任何在步驟S4積累了IDO的培養(yǎng)基和/或細(xì)胞可以大量產(chǎn)生期望的(2S，3R，4S)-4HIL(步驟S6)。與載體DNA連接的DNA可以允許本發(fā)明IDO的表達(dá)。在此，連接入載體DNA的IDO基因的實例包括如前文在[I]中所述的DNA。在使用重組DNA技術(shù)大規(guī)模產(chǎn)生蛋白質(zhì)的情況下，細(xì)胞諸如細(xì)菌細(xì)胞、放線菌屬G4"/w^yc")細(xì)胞、酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞可以用作進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了宿主載體系統(tǒng)的細(xì)菌細(xì)胞的實例包括埃希氏菌屬菌種、假單胞菌屬菌種、棒桿菌屬菌種、節(jié)桿菌屬菌種、曲霉屬菌種和芽孢桿菌屬菌種，并且優(yōu)選使用大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。這是因為有許多關(guān)于使用大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌或芽孢桿菌屬細(xì)菌大量產(chǎn)生蛋白質(zhì)的技術(shù)的相關(guān)知識。下文提供關(guān)于使用經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生L-異亮氨酸雙加氧酶的方法的說明。用于大腸桿菌的以下方法也可用于谷氨酸棒桿菌或芽孢桿菌屬細(xì)菌。通常用于大腸桿菌中異源蛋白產(chǎn)生的啟動子可以作表達(dá)編碼IDO的DNA的啟動子，其實例包括強(powerfiil)啟動子如T7啟動子、tip啟動子、lac啟動子、tac啟動子和PL啟動子。為了以融合蛋白包含體的形式產(chǎn)生IDO，在融合蛋白基因中將編碼另一種蛋白(優(yōu)選親水性肽)的基因連接至IDO基因的上游或下游。所述編碼另一種蛋白的基因可以是這樣的基因，其增加積累的融合蛋白的量并且增強融合蛋白在變性和再生步驟之后的可溶性，所述基因的候選實例包括T7基因10、p-半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因(dehydrofolatereductase),干擾素y基因、白細(xì)胞介素-2基因和凝乳酶原基因。當(dāng)將這些基因與編碼IDO的基因連接時，使密碼子閱讀框匹配?？稍诤线m的限制酶位點連接所述基因或者使用適當(dāng)序列的合成DNA連接。為了增加產(chǎn)量，優(yōu)選以融合蛋白基因下游終止子的形式偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止序列。這種終止子的實例包括T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環(huán)素抗性基因終止子和大腸桿菌^x4基因終止子。對于用于將編碼IDO或IDO與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白的基因?qū)氪竽c桿菌的載體，優(yōu)選多拷貝載體，其實例包括具有源自ColEl的復(fù)制起點的質(zhì)粒諸如pUC質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；蛩鼈兊难苌铩?衍生物"在此指通過堿基取代、缺失、插入、添加或倒位而經(jīng)過變化的質(zhì)粒。此處所指的變化包括由使用誘變劑或UV照射的突變處理引起的變化或由自發(fā)突變或隨機突變引起的變化。為了選擇轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選所述載體具有標(biāo)記如氨千青霉素抗性基因。這些質(zhì)粒的實例包括具有強啟動子的商業(yè)上可以獲得的表達(dá)載體(例如pUC(Takara)、pPROK(Clontech)和pKK233-2(Clontech))。重組DNA可以由連接DNA片段獲得，其中將啟動子、編碼IDO或由IDO和另一種蛋白質(zhì)組成的融合蛋白的基因、和終止子按照這種順序與載體DNA連接。當(dāng)使用重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌然后培養(yǎng)該大腸桿菌時，表達(dá)并產(chǎn)生IDO或IDO與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白。通常用于表達(dá)異源基因的菌林可以用于所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主，并且大腸桿菌菌林JM109(DE3)和大腸桿菌菌抹JM109是尤其優(yōu)選的。轉(zhuǎn)化方法和用于選4奪轉(zhuǎn)化體的方法在例如MolecularCloning,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。在作為融合蛋白表達(dá)的情況下，可以使用識別不存在于IDO中的序列作為識別序列的限制性蛋白酶如凝血因子Xa或激肽釋放酶來將IDO切下。通常用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基可以用作生產(chǎn)培養(yǎng)基(productionmedium),其實例包括M9酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)和產(chǎn)生誘導(dǎo)的條件可以根據(jù)載體使用的標(biāo)記物和啟動子的類型，以及使用的宿主微生物的類型來適當(dāng)?shù)剡x擇。以下方法可以用于回收IDO或IDO與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白。如果IDO或其融合蛋白溶解在微生物細(xì)胞中，那么在回收所述微生物細(xì)胞并且破裂或溶解回收的細(xì)胞之后，可以將IDO或其融合蛋白以粗制酶溶液的形式使用。另外，IDO或其融合蛋白也可以在通過沉淀、過濾、柱層析或必要的其它常規(guī)技術(shù)純化之后使用。在這種情況下，使用IDO或其融合蛋白的抗體的純化方法也可以使用。當(dāng)形成蛋白包含體時，用變性劑使其溶解。盡管可以將其與微生物細(xì)胞蛋白一起溶解，但是考慮到后續(xù)的純化流程，優(yōu)選將包含體取出然后再將其溶解?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的方法可以用來從;敞生物細(xì)胞回收包含體。例如，可以通過使微生物細(xì)胞破裂繼而離心分離來回收包含體。溶解蛋白包含體的變性劑的實例包括鹽酸胍(例如，6M,pH5-8)和尿素(例如，8M)。通過用處理(如透析)去除這些變性劑，可將蛋白包含體作為活性蛋白再生。透析溶液例如Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液可以用于透析，并且濃度可以是20mM-0.5M，pH可以是pH5-pH8。再生步驟過程中的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選保持在約500|ig/ml或更低。為了防止再生的IDO進(jìn)行自交聯(lián)，透析溫度優(yōu)選是5。C或更低。另外，預(yù)期也可以通當(dāng)IDO基因源自屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌時，可以通過使用埃希氏菌屬、假單胞菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、曲霉屬或芽孢桿菌屬的細(xì)菌作為宿主以一種優(yōu)選的模式來表達(dá)和產(chǎn)生IDO?；虻目截悢?shù)可以通過將基因插入多拷貝載體，然后將所述載體導(dǎo)入微生物來增加。能夠使用的載體包括大腸桿菌質(zhì)粒載體如pMW118、pBR322、pUC19、pBl薦riptKS+、pACYC177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b，大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體如pHY300PLK、pGK12、pLF14、pLF22等，噬菌體載體如11059、舊FIOI、M13mp9、Mu噬菌體(日本專利申請公開No.2-109985)等，和轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.,Bio/Techno1.,1,417(1983))如Mu、TnlO、Tn5等。還可能的是通過利用質(zhì)粒的同源重組將基因整合入染色體等來增加基因的拷貝數(shù)。在這種情況下的宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)的實例包括ShawP.C.等對節(jié)桿菌屬菌種中重組表達(dá)方法的報導(dǎo)(JGenMicobiol.134(1988)p.903-911)，SanduC.等對噬煙堿節(jié)桿菌04w/zraZ)acferm'co""ovoram)中重組表達(dá)方法的報導(dǎo)(ApplEnvironMicrobiol.71(2005)p8920-S924)和Morikawa，M.等對節(jié)桿菌屬菌種中重組表達(dá)方法的報導(dǎo)(ApplMicrobiolBiotechnol.,42(1994),p.300-303)。同樣，有數(shù)個報導(dǎo)稱開發(fā)用于棒狀桿菌型細(xì)菌(Coryneformbacteria)的表達(dá)系統(tǒng)也可用于節(jié)桿菌屬菌種(SanduC.等)。然而，用作宿主細(xì)胞的芽孢桿菌屬菌種細(xì)菌和可用于芽孢桿菌屬IDO的表達(dá)系統(tǒng)不限于本文所述的那些。用于產(chǎn)生ps,311,48)4-羥基-L-異亮氨酸的方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的通式(I)代表的(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸((2S，3R，4S)-4HIL)的方法包括直接酶促羥化L-異亮氨酸以產(chǎn)生(2S，3R,4S)-4HIL的一步反應(yīng)，其由以下反應(yīng)代表L-異亮氨酸+a-酮戊二酸+02+4HIL+琥珀酸+C02其中所述反應(yīng)在如下存在下進(jìn)行作為一個氧原子的受體分子的L-異亮氨酸、作為另一個氧原子的受體分子的a-酮戊二酸、作為兩個氧原子的供體的一個氧分子和催化所述反應(yīng)的IDO。在本發(fā)明中，"酶促羥化"的意思是通過IDO酶進(jìn)行的羥化反應(yīng)。尤其細(xì)菌IDO是優(yōu)選的。對催化所述反應(yīng)的IDO沒有具體限制，并且可以使用任何蛋白質(zhì)，只要該蛋白質(zhì)能夠催化在a-酮戊二酸和氧存在下羥化L-異亮氨酸的反應(yīng)。這種IDO的優(yōu)選實例是描述IDO的部分[l]中說明的IDO。在本發(fā)明的方法中，IDO可以以任何形式使用，所述任何形式如細(xì)菌(包括培養(yǎng)物、細(xì)菌細(xì)胞或經(jīng)處理的細(xì)胞)、純化的酶或粗制酶，只要其包含(incorporate)催化產(chǎn)生上述(2S，3R，4S)-4HIL的反應(yīng)的上述IDO。當(dāng)使用細(xì)菌作為IDO來源時，(l)天然產(chǎn)生IDO的細(xì)菌，如屬于芽孢桿菌屬的微生物，和(2)如部分[1]中所述的由重組DNA轉(zhuǎn)化的重組微生物，這二者均可用于通過培養(yǎng)這些微生物來積累IDO。用于表征IDO的蛋白質(zhì)序列歸類為L-異亮氨酸雙加氧酶(SEQIDNO:2，SEQIDNO:8表1)。本發(fā)明的L-異亮氨酸雙加氧酶還包括通過以下特征限定的蛋白質(zhì)(A)具有催化從L-異亮氨酸和a-酮戊二酸產(chǎn)生(2S,3R,4S)-4HIL的反應(yīng)的活性；(B)所述活性依賴于二價陽離子包括Fe2、并且(C)如通過SDS-PAGE測量，每個亞基的分子量是約29±2.0kDa。例如，在使用產(chǎn)IDO細(xì)菌或已經(jīng)由重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生(2S，3R,4S)-4HIL的步驟中，可以在培養(yǎng)時將底物直接添加至培養(yǎng)基，或者可以以細(xì)菌細(xì)胞或已經(jīng)與培養(yǎng)物分離的經(jīng)洗滌細(xì)菌細(xì)胞的形式使用。此外，已經(jīng)破裂或溶解的經(jīng)處理細(xì)菌細(xì)胞可以直接使用，或者可以從經(jīng)處理的細(xì)菌細(xì)胞回收IDO并且用作粗制酶溶液，或者在將酶純化之后使用。即，只要是具有IDO的級分的形式，即可用在本發(fā)明的產(chǎn)生(2S，3R，4S)-4HIL的方法中。為了使用IDO進(jìn)行羥化反應(yīng)，將包含L-異亮氨酸、a-酮戊二酸和催化所述反應(yīng)的蛋白質(zhì)或含IDO組合物的反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)至20-50。C的合適溫度并且允許其靜置(standundisturbed),振蕩或攪拌30分鐘至5天，同時保持pH5-12。也可以通過向所述反應(yīng)混合物添加二價陽離子如Fe"來改進(jìn)反應(yīng)速度。當(dāng)向反應(yīng)溶液添加這些二價陽離子時，盡管可以使用任何鹽，只要其不阻礙反應(yīng)，然而FeS04等可以優(yōu)選使用。這些二價陽離子的濃度可以通過由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行的簡單初步研究來確定。這些二價陽離子添加的范圍可以在0.01mM-50mM,優(yōu)選0.1mM-25mM的范圍內(nèi)。氧通過攪拌從空氣進(jìn)入反應(yīng)，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物體積為固定狀態(tài)(withfixedregimeofculturevolumeduringcultivation)。在所述反應(yīng)混合物中形成的通式(I)的(2S，3R，4S)-4HIL可以根據(jù)已知技術(shù)分離或純化，或者照現(xiàn)狀(asitis)進(jìn)一步使用，特別是當(dāng)所述反應(yīng)用表達(dá)IDO的重組孩i生物進(jìn)行時。分離和純化方法的實例可以包括這樣的方法，其中將(2S，3R，4S)-4HIL與離子交換樹脂接觸來吸附堿性氨基酸，其后進(jìn)行洗脫和結(jié)晶；和這樣的方法，其中將通過洗脫獲得的產(chǎn)物用活性炭脫色并過濾，其后結(jié)晶以獲得(2S，3R,4S)-4HIL。來自其它微生物的編碼IDO的未注釋基因(non-annotatedgene)可以通過與已知IDO基因的同源性，其后評估由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來鑒定。兩個氨基酸序列之間的同源性可以使用已知的方法確定，例如，計算機程序BLAST2.0，其計算三個參數(shù)得分(score)、.同一性(identity)和相似性(similarity)。因此，利用基于氨基酸和核苷酸序列的已知片段制備的引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參見White,T丄等，TrendsGenet,5，185(1989))能夠獲得編碼全長IDO的來自蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2和蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型；ATCC35646)菌林的DNA片段。來自其它微生物的編碼IDO的DNA片段能夠以類似的方式獲得。由于細(xì)菌菌林之間的DNA序列中可能存在某些差異，使用的上述編碼IDO的片段不限于SEQIDNO:1、7、12、16、20、圖18或表1中所示的核苷酸序列，而且還可包括與SEQIDNO:1、7、12、16、20、圖18或表1中所示的那些相似的核苦酸序列。因此，由上述基因編碼的蛋白質(zhì)變體可以相對于SEQIDNO:2、8、13、17、21、圖19或表1中所示的完整氨基酸序列具有不少于80。/。，優(yōu)選不少于90%,并且最優(yōu)選不少于95%的相似性，只要該蛋白質(zhì)催化所述反應(yīng)的能力得到保留。另外，上述DNA片段可以表示為這樣的變體，其能夠在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:l、7、12、16、20、圖18或表1中所示核苦酸序列、或與基于這些核苷酸序列制備的探針雜交，條件是它們編碼功能性蛋白質(zhì)。"嚴(yán)緊條件"用于此處與前述部分"[l](l)編碼IDO的DNA，，相同。本發(fā)明中采用的經(jīng)處理細(xì)菌細(xì)胞形式的實例包括干燥的細(xì)菌物質(zhì)(driedbacterialmass)、凍干的細(xì)菌物質(zhì)、用表面活性劑或有機溶劑處理的產(chǎn)物、酶處理產(chǎn)物、超聲處理產(chǎn)物、機械研磨產(chǎn)物、溶劑處理產(chǎn)物、細(xì)菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)級分、細(xì)菌物質(zhì)的固定化產(chǎn)物和經(jīng)加工的細(xì)菌物質(zhì)。IDO可以如上所述分開制備并添加至反應(yīng)溶液中。表達(dá)編碼IDO的DNA的細(xì)菌(宿主細(xì)胞)可以通過以能夠在具有那些活性的宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式轉(zhuǎn)染功能性含有所述編碼IDO的DNA的表達(dá)載體來制備。另外，優(yōu)選使用通過增加編碼IDO的基因的表達(dá)而具有增強的IDO活性的宿主細(xì)胞。短語"增加基因的表達(dá)"的意思是所述基因的表達(dá)高于未經(jīng)修飾的菌抹，例如，野生型菌抹。這種修飾的實例包括增加每個細(xì)胞表達(dá)的基因的拷貝數(shù)，增加基因的表達(dá)水平等。例如，通過限制(restrict)染色體DNA，然后使用基于所述基因序列的探針進(jìn)行Southern印跡，熒光原位雜交(FISH)等來測量表達(dá)基因的拷貝數(shù)的量?；虮磉_(dá)的水平可以通過多種已知的方法來測量，包括Northern印跡、定量RT-PCR等。由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的量可以通過已知方法測量，包括SDS-PAGE后進(jìn)行免疫印跡測定法(Westem印跡分析)等。"用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌"的意思是將所述DNA導(dǎo)入細(xì)菌，例如，通過常規(guī)方法導(dǎo)入。轉(zhuǎn)化這種DNA將導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增加，并且將增強細(xì)菌細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的活性。轉(zhuǎn)化方法包括迄今已經(jīng)報導(dǎo)的任何已知方法。例如，用氯化4丐處理受體細(xì)胞從而增加細(xì)胞對DNA的透過性的方法，所述方法已經(jīng)報導(dǎo)用于大腸桿菌K-12(Mandel,M.和Higa，A.,J.Mol.Biol.,53，159(1970)),并且可以使用該方法。增強基因表達(dá)的方法包括增加基因拷貝數(shù)。將基因?qū)肽軌蛟诒景l(fā)明的細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體使所述基因的拷貝數(shù)增加。為此，可以優(yōu)選使用多拷貝載體。多拷貝載體的示例為pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等?；虮磉_(dá)的增強也可以通過將所述基因的多個拷貝通過例如同源重組、Mu整合等導(dǎo)入細(xì)菌染色體來實現(xiàn)。例如，一次Mu整合允許向細(xì)菌染色體中導(dǎo)入多至3個拷貝的所述基因?；蚩截悢?shù)的增加也可以通過將所述基因的多個拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體DNA中來實現(xiàn)。為了將基因的多個拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體中，使用以多個拷貝存在于所述染色體DNA中的序列作為靶進(jìn)行同源重組。在染色體DNA中具有多個拷貝的序列包括，但不限于重復(fù)DNA或轉(zhuǎn)座元件末端存在的反向重復(fù)序列。同樣，如美國專利No.5,595,889中公開的，可以將基因并入轉(zhuǎn)座子，并且允許所述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移以將所述基因的多個拷貝導(dǎo)入染色體DNA。增強基因表達(dá)也可以通過將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的調(diào)控下來實現(xiàn)。例如，Ptac啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、人嗟菌體的PR或Pt啟動子已知為強啟動子。強啟動子的使用可以與基因拷貝的增加結(jié)合?；蛘撸梢栽鰪妴幼拥男Ч?，通過例如向所述啟動子導(dǎo)入突變以增加位于該啟動子下游的基因的轉(zhuǎn)錄水平。另外，已知在核糖體結(jié)合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中取代幾個核香酸，特別是在起始密碼子的緊鄰上游的序列中取代幾個核芬酸，顯著影響mRNA的翻譯能力。例如，依賴于起始密碼子之前三個核苷酸的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了20倍的表達(dá)水平變化范圍(Gold等，Annu,Rev.Microbiol.，35,365-403，1981;Hui等，EMBOJ"3，623-629,1984)。先前，證明了rhtA23突變是在相對于ATG起始密碼子的-1位置的A對G的取代(ABSTRACTSof17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwith1997AnnualMeetingCaliforniaAugust24-29，1997，abstractNo.457)。另外，也可以將核苷酸取代導(dǎo)入細(xì)菌染色體上所述基因的啟動子區(qū)中，其導(dǎo)致更強的啟動子功能。例如，表達(dá)調(diào)控序列的改變可以按照與使用溫度敏感質(zhì)粒的基因取代相同的方式進(jìn)行，如國際/>開WO00/18935和日本專利申請公開No.1-215280中7>開。用于制備質(zhì)粒DNA的方法包括，但不限于消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化、選擇作為引物的寡核苷酸等，或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法。這些方法在例^口"MolecularCloningALaboratoryManual,ThirdEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。實施例將參考下文所示實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明，然而本發(fā)明不限于此。實施例丄篩選具有L-異亮氨酸羥化酶的菌株<1〉篩選產(chǎn)4-鞋基異亮氨酸的菌抹和培養(yǎng)液分析通過使用L-異亮氨酸作為底物，對具有產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的能力的微生物進(jìn)行篩選。在水中，溶解0.4。/。(w/v)的可溶性淀粉、0.4%的酵母提取物、1%的麥芽提取物(maltextract)和0.2%的L-異亮氨酸，然后將溶液調(diào)節(jié)至pH7-7.5以獲得培養(yǎng)基，并且將土壤細(xì)菌接種至所述培養(yǎng)基中。在28。C振蕩培養(yǎng)2天之后，通過對離心上清液的氨基酸分析來分析4-羥基異亮氨酸。氨基酸分析條件通過使用WatersAccQ-Tag方法來檢測4-鞋基異亮氨酸。將稀釋至適當(dāng)濃度的5iil反應(yīng)混合物中的氨基酸以常規(guī)方式衍生化，并且通過HPLC分析來測量4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌菌林(菌林2-e-2)具有產(chǎn)生與4-羥基異亮氨酸顯示相同保留時間的物質(zhì)的活性。基于16SrDNA分析，將菌抹2-e-2鑒定為蘇云金芽孢桿菌。因此，對其它芽孢桿菌屬細(xì)菌也進(jìn)行了篩選，并且在地衣芽孢桿菌(菌抹AKU223、菌抹IAM11054)，球形芽孢桿菌(菌林AKU227、菌林NBRC3526)和蘇云金芽孢桿菌(菌抹AKU238、菌抹NBRC3958)中也發(fā)現(xiàn)了類似的活性。鑒定產(chǎn)物對由上述篩選中獲得的芽孢桿菌屬菌林從作為底物的L-異亮氨酸產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)行了鑒定。首先，通過MS分析了所述產(chǎn)物的分子量，發(fā)現(xiàn)分子量是145，比4-羥基異亮氨酸的分子量小2。另外，當(dāng)使用高分辨率質(zhì)譜儀(Q-TofMS)通過精確質(zhì)量測量估計組成化學(xué)式(compositionformula),獲得了C6HuN03并且發(fā)現(xiàn)具有的氫原子在數(shù)目上比4-羥基異亮氨酸少2個。以上結(jié)果說明由上述芽孢桿菌屬菌抹產(chǎn)生的物質(zhì)可能是2-氨基-3-酮-4-曱基戊酸(AMKP)。根據(jù)有關(guān)芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生AMKP的報告中描述的實驗方法(BioorganicChemistry，Vol.6，pp,263-271，1977),合成并純化了AMKP。進(jìn)而根據(jù)BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271，1977的AMKP純化方法從上述芽孢桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基純化了產(chǎn)物，并且進(jìn)行了NMR分析。結(jié)果，二者均顯示了類似的化學(xué)位移。以上內(nèi)容揭示了在此實驗中發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生AMKP。由菌抹2-e-2產(chǎn)生的AMKP的量是大約1-2mM。另一方面，由BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271，1977中所述芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的AMKP的估計量是0.04mM，因此確認(rèn)了菌株2-e-2的高AMKP產(chǎn)生活性。<2〉建立用于分離和分析AMKP和HIL的方法由于發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬細(xì)菌(如菌抹2-e-2)具有AMKP產(chǎn)生活性，因此發(fā)現(xiàn)有必要建立用于分離和分析AMKP和4-羥基異亮氨酸的方法。多種考察之后，通過修改WatersAccQ-TagTM方法建立了用于分離和分析AMKP和4-羥基異亮氨酸的方法。具體而言，將柱變?yōu)閄BridgeC185mm,2.1x150mm(Waters),將EluentB(洗脫劑B)變?yōu)镸eOH,并且將洗脫劑流速變?yōu)?.3ml/min。洗脫劑的梯度示于下表。表2:同時分析HIL和AMKP的洗脫劑條件<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在上述條件下，培養(yǎng)基中的AMKP在大約11.0分鐘洗脫，4-羥基異亮氨酸在大約11.9分鐘洗脫，因此能夠?qū)⑦@些產(chǎn)物分離。<3>通過在培養(yǎng)過程中添加輔因子改變AMKP產(chǎn)量作為AMKP產(chǎn)生活性的機制，考慮了通過羥化攝取分子氧的可能性。因此，通過在菌抹2-e-2的培養(yǎng)過程中添加單加氧酶的輔因子NAD(P)H,或添加雙加氧酶的輔因子Fe2+、2-酮戊二酸和抗壞血酸來分析AMKP產(chǎn)生活性。通過使用先前篩選中使用的培養(yǎng)基作為對照，比較了10mMNADP和10mMNADPH添加組，F(xiàn)e"添加組，以及Fe"、2-酮戊二酸和抗壞血酸添加組的AMKP產(chǎn)生活性。培養(yǎng)溫度是30。C，培養(yǎng)實踐是22小時。測量了培養(yǎng)物上清中的AMKP濃度。結(jié)果示于表3。表3:菌抹2-e-2的培養(yǎng)中輔因子的添加對AMKP產(chǎn)生活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>這說明雙加氧酶可能參與了AMKP的產(chǎn)生過程。<4>菌抹2-e-2培養(yǎng)液隨時間的變化將AMKP產(chǎn)生培養(yǎng)基(0.4。/o(w/v)的可溶性淀粉、0.4%的酵母提取物、1%的麥芽提取物、0.2。/。的L-異亮氨酸、0.5%的葡萄糖、lmM抗壞血酸、lmM2-酮戊二酸、1mMCaCl"lmMMgS04,pH7-7,5)置于3升Sakaguchi燒瓶中，并且在23。C振蕩培養(yǎng)菌抹2-e-2。在培養(yǎng)開始后的0、6、8、10、12、14、16、18和20小時，取樣培養(yǎng)液(culturebroth),并且通過上文描述的<2〉中所述方法定量培養(yǎng)液中的4-羥基異亮氨酸和AMKP。另外，還測量了濁度(00660)。4-羥基異亮氨酸(HIL)和AMKP的濃度示于圖1。培養(yǎng)液的濁度示于圖2。4-羥基異亮氨酸和AMKP的總量在對數(shù)生長期增高并且隨后達(dá)到平臺。進(jìn)一步地，在水平達(dá)到平臺之后，4-羥基異亮氨酸逐漸減少，而AMKP逐漸增力口。在每個上述培養(yǎng)時間，從200pl的所述培養(yǎng)液獲得菌株2-e-2的細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，然后懸浮在100iil雙加氧酶反應(yīng)混合物(lOmM異亮氨酸、1mMFe2+、10mM2-酮戊二酸、10mM抗壞血酸、50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0))中，使反應(yīng)在30°C在振蕩條件下進(jìn)行1小時，并且測量上清液中4-羥基異亮氨酸和AMKP的產(chǎn)量。結(jié)果，僅當(dāng)使用在對數(shù)生長期的細(xì)胞時，能夠確認(rèn)4-羥基異亮氨酸和AMKP的產(chǎn)生，盡管它們以痕量產(chǎn)生，如圖3所示。<5>用菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物產(chǎn)生HIL將細(xì)胞在AMKP產(chǎn)生培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至達(dá)到00660為3,2,在研缽中使收集并經(jīng)洗滌的菌抹2-e-2細(xì)胞破裂，然后懸浮在懸浮用緩沖液(50mMHEPES(pH7.0)、10%甘油、CompleteMini(Roche))中以獲得具有約10mg/ml蛋白質(zhì)濃度的懸液(裂解物)，并且獲得了所述懸液的離心沉淀物。最終將所述離心沉淀物懸浮在與所述細(xì)胞裂解物等體積的生理鹽水中。將這些中的每個與等體積的2x雙加氧酶反應(yīng)混合物(IOmM異亮氨酸、2mMFe2+、10mM2-酮戊二酸、10mM抗壞血酸、100mMHEPES(pH7.0))混合，并且使反應(yīng)在30。C進(jìn)行1小時。類似地，洗滌用于制備所述細(xì)胞裂解物的靜息細(xì)胞，并且以IO倍于培養(yǎng)液中的濃度懸浮在生理鹽水中，將所述懸液與等體積的2x雙加氧酶反應(yīng)混合物混合，并且使其進(jìn)行反應(yīng)。樣品中AMKP和4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量示于圖4。通過使用細(xì)胞裂解物，能夠毫無疑義地確認(rèn)使用11e作為底物產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的活性。<6〉輔因子對菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物中的酶的作用通過使用在對數(shù)生長期的菌抹2-e-2細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，檢驗了輔因子對通過羥化lie產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的反應(yīng)的作用。使所述反應(yīng)在50mMHEPES(pH7)反應(yīng)混合物中進(jìn)行，在所述反應(yīng)混合物中含有終濃度為5mMlie和5mM多種輔因子之一，以及通過上述<5>中描述的方法制備的對數(shù)生長期菌抹2-e-2細(xì)胞(裂解物)的細(xì)胞裂解物，并且測量了4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量。如表4中所示，F(xiàn)e2+(Fe)和2-酮戊二酸(a-KG)對于4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)生是關(guān)鍵的，而通過進(jìn)一步添加抗壞血酸(Asc.)使4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量最大化。因此，有力地說明了雙加氧酶可能涉及通過羥化異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸。表4:多種輔因子對菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><7>使用菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物獲得的產(chǎn)物的空間構(gòu)型4-羥基異亮氨酸在3個位置具有不對稱碳原子，并且存在8種類型的非對映異構(gòu)體和4對對映異構(gòu)體。具體而言，所述4對對映異構(gòu)體是(2S,3S,4S)和(2R，3R,4R)對映異構(gòu)體(在后也稱為HIL1),(2S,3S,4R)和(2R,3R,4S)對映異構(gòu)體(在后也稱為HIL2)，PS，SR，4R)和PR^S，化)對映異構(gòu)體(在后也稱為HIL3),以及(2S,3R,4S)和(2R，3S，4R)對映異構(gòu)體(在后也稱為HIL4)。胡盧巴中存在的天然存在的HIL等是(2S，3R,4S)對映異構(gòu)體。由于在本發(fā)明中將(2S,3S)-異亮氨酸用作底物，通過羥化反應(yīng)產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸是(2S,3R，4S)或(2S,3R，4R)對映異構(gòu)體。因此，決定要確定由菌抹2-e-2產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸的空間構(gòu)型。作為不同的對映異構(gòu)體對，(2R，3R,4R):HIL1和(2S，3R，4R):HIL3才艮據(jù)Tetrahedron47(32)，6469-6482,(1991)獲得，而(2R，3R，4S):HIL2和(2S,3R,4S):HIL4根據(jù)Eur.J.Org.Chem.834-839,(2002)獲得。當(dāng)在上述<2〉中所述同時分析4-羥基異亮氨酸和ANKP的條件下分析由化學(xué)合成獲得的HIL1至HIL4時，保留時間如表5中所示。表5:4-羥基異亮氨酸的非對映異構(gòu)體的保留時間<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>當(dāng)分析上述<6>中制備的含4-羥基異亮氨酸的樣品時，保留時間是11.99分鐘。當(dāng)將它與HIL4標(biāo)準(zhǔn)品的4-羥基異亮氨酸混合并分析時，峰完全匹配。因此，證明了當(dāng)使用(2S,3S)-異亮氨酸作為底物時，在可能產(chǎn)生的HIL3和HIL4中，由這種酶產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸是HIL4，即，天然存在的4-羥基異亮氨酸。<8>菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物中的酶的最適pH通過使用根據(jù)上述<5>中描述的方法從0066()為7的菌株2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的pH依賴性。測量了由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMGTA組成的雙加氧酶反應(yīng)混合物在反應(yīng)之后的組成，和所述反應(yīng)混合物的pH。反應(yīng)溫度為30°C。通過<2>中所述方法分析了產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸。在多個pH值的活性按照相對活性比例示于圖5，所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的pH產(chǎn)生的HIL量(取作100%)計算。在pH5-8確認(rèn)了所述活性。<9>菌林2《-2細(xì)胞裂解物中的酶的最適溫度通過使用根據(jù)上述<5〉中描述的方法從0066()為7的菌抹2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度依賴性。雙加氧酶反應(yīng)混合物的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMGTA(pH6)組成，并且反應(yīng)溫度為15-50°C。通過<2〉中所述方法分析了產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸。在多個溫度的活性按照相對活性比例示于圖6,所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的溫度產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量(取作100%)計算。最適溫度低于45。C。<10>菌抹2《-2細(xì)胞裂解物中的酶的溫度穩(wěn)定性通過使用根據(jù)上述〈5〉中描述的方法從OD66o為7的菌抹2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度穩(wěn)定性。將細(xì)胞裂解物在0-50。C溫育1小時，然后測量Ile羥化活性。底物反應(yīng)混合物的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH7)組成，并且反應(yīng)溫度為30°C。通過實施例2中所述方法分析了產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸。在多個溫度的溫度穩(wěn)定性按照相對活性比例示于圖7，所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的溫度產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量(取作100%)計算。所述酶在50。C或更高溫度失活。<11>菌林2-e-2細(xì)胞裂解物中酶的底物反應(yīng)特性通過使用根據(jù)上述<5>中描述的方法從0066()為7的菌抹2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物，評估了多種氨基酸的反應(yīng)特性。將細(xì)胞裂解物和底物溶液混合，然后使反應(yīng)在30。C進(jìn)行1小時，并且通過TLC或氨基酸分析來評估新物質(zhì)的產(chǎn)生。底物反應(yīng)混合物的組成由5mM氨基酸、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH7)組成。除了L-異亮氨酸，作為氨基酸還獨立評估了L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸。通過實施例1中所述方法分析了產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸。結(jié)果示于表6。對于除L-異亮氨酸以外的氨基酸無法確認(rèn)新物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，說明了這種酶是異亮氨酸特異性雙加氧酶。表6:對于多種氨基酸的反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><12〉抑制劑對菌抹2-e-2細(xì)胞裂解物中的酶的作用通過使用根據(jù)上述0中描述的方法從OD660為7的菌林2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物，檢驗了抑制劑對4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的作用。使用了根據(jù)上述〈5〉中描述的方法從OD66o為7的菌抹2-e-2細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物。雙加氧酶反應(yīng)混合物的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH6)組成，反應(yīng)溫度為30。C，并且反應(yīng)時間為l小時。測量了當(dāng)向反應(yīng)體系添加10mM的每種抑制劑(EDTA、Cu2+、Zn2+)時產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量。通過上述<2>中所述方法分析了4-羥基異亮氨酸。異亮氨酸羥化活性因所述抑制劑而喪失。實施例2.L-Ile羥化酶的分離和純化(l)無細(xì)胞提取物的制備將菌抹2-e-2培養(yǎng)在總體積2升的AMKP生產(chǎn)培養(yǎng)基中直至0066()達(dá)到6.0，然后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌。將所述細(xì)胞懸浮在細(xì)胞膜處理溶液(10mg/ml裂解酶(SIGMA)、5mg/ml纖維素酶"ONOZUKA"R-10(Yakult)、Yatalase(TakaraBio)、1mg/ml溶菌酶(SIGMA)，溶于0.2MNaH2P04和0.6MKC1(pH5.5))中，然后在30。C溫育1小時。將經(jīng)溫育的細(xì)胞用生理鹽水洗滌，然后懸浮在緩沖液A(50mMHEPES(pH7.0)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))中，并且在以冰冷卻的條件下通過使用超聲破碎儀(Branson)使所述細(xì)胞破裂。將這種經(jīng)處理的懸液在4。C和18,500xg離心60分鐘以獲得上清。后續(xù)的分離和純化步驟全部在4。C或用冰冷卻的條件下進(jìn)行。(2)陰離子交換層析將前述步驟中獲得的上清通過孔徑0.45pm的濾器過濾，并且施加于預(yù)先用緩沖液A平衡的DEAE柱(16mmx100mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩沖液A洗滌該柱，并且用溶于緩沖液B(50mMHEPES(pH7.0)、10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、0.5MNaCl、Complete(Roche))的線性濃度梯度的氯化鈉進(jìn)行洗脫。(3)活性級分的檢測將每種級分用于在30。C進(jìn)行30分鐘的使用lie羥化活性反應(yīng)混合物(終濃度為100mMHEPES(pH6.0)、5mML-Ile、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸)的反應(yīng)。在100。C使酶失活，然后通過前述AMKP和HIL分離和測量方法來定量4-羥基異亮氨酸的量。在后續(xù)分析中提及的4-羥基異亮氨酸意指基本上僅由與天然存在的4-羥基異亮氨酸具有相同保留時間的異構(gòu)體組成的物質(zhì)。將每分鐘產(chǎn)生1nmolHIL的酶活性定義為1U。(4)陽離子交換層析將前述步驟中獲得的活性級分在脫鹽柱(GEHealthcareBio-Sciences)中用緩沖液C(50mMMES(pH5.2)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))替換。將這種替代的級分施加于預(yù)先用緩沖液C平^f軒的MonoS柱(IOmmx100mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩沖液C洗滌該柱，然后用溶于緩沖液D(50mMMES(pH5.2)，10%甘油，2mMDTT,1mMEDTA,0.5MNaCl,Complete(Roche))的線性濃度梯度的氯化鈉進(jìn)行洗脫，并且測量每種級分的Ile羥化活性。C5)硫酸銨沉淀向前述步驟中獲得的可溶性級分添加2M^L酸銨并溶解。充分?jǐn)嚢杷鋈芤?，然后通過離心分級成可溶性級分和沉淀級分，并且將所述沉淀級分溶解在緩沖液A中。在測量每種級分的Ile羥化活性時，4企測沉淀級分中的所述活性。(6)大小排阻層析將前述步驟中獲得的活性級分上樣至預(yù)先用緩沖液A平衡的Superdex75柱(10mmx300mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩沖液A進(jìn)行洗脫，并且測量了每種級分的lie羥化活性。(7)疏水相互作用層析將前述步驟中獲得的活性級分用緩沖液E(50mMMES(pH6.5)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、1M硫酸銨、Complete(Roche》替換。將經(jīng)緩沖液替代的樣品施加于預(yù)先用緩沖液E平衡的ResourcePHE柱(lml，GEHealthcareBio-Sciences)。用緩沖液E洗滌該柱，然后通過使用反向線性濃度梯度的硫酸銨用緩沖液F洗脫(50mMMES(pH6.5)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))包含具有l(wèi)ie羥化活性的酶的級分。純化和分離L-Ile羥化酶的概要總結(jié)在表7中。表7:分離和純化的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實施例3.L-Ile羥化酶的表征<1>通過電泳分析通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠PAGMini"Daiichi"15/25(13孑L),由DaiichPureChemicalsCo.,Ltd.生產(chǎn)，分子量標(biāo)準(zhǔn)PrestainedSDS-PAGEStandards(預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)物)，LowRange,由Bio-Rad產(chǎn)生)分析實施例2中獲得的純化樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了所述酶基本上由具有約31,000±20,000分子量的相同(uniform)亞基組成。<2>添加輔因子的作用通過使用純化酶檢驗了輔因子對通過羥化lie產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的反應(yīng)的作用。將通過實施例2中所述方法制備的L-Ile羥化酶用于100mMHEPES(pH6)反應(yīng)混合物中的所述反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含按終濃度計5mML-Ile和5mM多種輔因子之一，并且測量了4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量。如表8所示，F(xiàn)e"和2-酮戊二酸對于4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)生是關(guān)鍵的，并且通過進(jìn)一步添加抗壞血酸使4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量最大化。因此，有力地說明了雙加氧酶可能參與了通過羥化L-異亮氨酸的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生。這種結(jié)果與使用細(xì)胞裂解物的檢驗結(jié)果相同。表8:多種輔因子對純化酶的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><3>最適pH通過使用根據(jù)實施例2中所述方法制備的L-異亮氨酸羥化酶，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的pH依賴性。酶反應(yīng)溶液的組成由5mML-Ile、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和200mMGTA(pH3至12)組成。反應(yīng)溫度為30。C。在多種pH值的活性按照相對活性比例示于圖8,所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的pH產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量(取作100%)計算。在pH4至8確認(rèn)了活性，并且確認(rèn)了在pH5至8的高活性。<4>最適溫度通過使用根據(jù)實施例2中所述方法制備的L-Ile羥化酶，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的最適溫度。酶反應(yīng)溶液的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH6)組成。在多種溫度的活性按照相對活性比例示于圖9，所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的溫度產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量(取作100°/。)計算。在0至40°C的溫度范圍確認(rèn)了高活性。<5>溫度穩(wěn)、定性通過使用根據(jù)實施例2中所述方法制備的L-Ile羥化酶，評估了4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的溫度穩(wěn)定性。將pH7.0的酶溶液在0至70°C溫育1小時，然后測量lie羥4b活性。酶反應(yīng);容液的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH6)組成，并且反應(yīng)溫度為30。C。在各種溫度的溫度穩(wěn)定性按照相對活性比例示于圖10，所述比例基于在提供最大產(chǎn)量的儲藏溫度產(chǎn)生的羥基異亮氨酸量(取作100%)計算。所述酶在60°C或更高溫度失活。<6>底物反應(yīng)特性通過使用根據(jù)實施例2中所述方法制備的L-Ile羥化酶，評估了多種氨基酸的反應(yīng)特性。將酶溶液和所述反應(yīng)混合物混合，然后使反應(yīng)在30。C進(jìn)行l(wèi)小時，并且通過HPLC分析來評估新物質(zhì)的產(chǎn)生。酶反應(yīng)溶液的組成由5mM氨基酸、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH6)組成。除了L-異亮氨酸，作為氨基酸還獨立評估了D-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸。通過實施例1中所述方法分析了產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸。結(jié)果示于表9。正如使用細(xì)胞裂解物的檢驗結(jié)果，對于除L-異亮氨酸以外的氨基酸無法確認(rèn)新物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，說明了所述酶是L-異亮氨酸特異性雙加氧酶，并且具有產(chǎn)生天然存在的HIL的活性，與使用細(xì)胞裂解物的檢驗結(jié)果所示類似。表9:每種氨基酸的反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><7>抑制劑的作用通過使用根據(jù)實施例2中所述方法制備的L-Ile羥化酶，檢驗了抑制劑對4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性的作用。酶反應(yīng)溶液的組成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗壞血酸和100mMHEPES(pH6)組成，反應(yīng)溫度為30°C，并且反應(yīng)時間為1小時。測量了當(dāng)向反應(yīng)體系添加10mM的每種抑制劑(EDTA、Cu2+、Zn,時產(chǎn)生的4-羥基異亮氨酸量。添加抑制劑的條件下觀察的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性按照相對活性示于表10，所述相對活性是相對于未添加抑制劑的條件下所觀察的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)生活性(取作100%)而言的。異亮氨酸羥化活性因所述抑制劑而喪失。表10:抑制劑的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><8>忭末端氨基酸對根據(jù)實施例2中描述的方法制備的L-Ile羥化酶根據(jù)實施例3的方法進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(sequi-BlotTMPVDF膜，Bio-Rad),并用于PPSQ-10(其為由ShimadzuCorporation生產(chǎn)的蛋白質(zhì)測序儀)。作為通過上述方法獲得的酶的N-末端序列得到了如下結(jié)果。ILysMetSerGlyPheSerlleGluGluLys10IIValHisGluPheGluSerLysGlyPheLeu20(SEQIDNO:5)實施例4.從蘇云金芽孢桿菌(2-e-2)菌抹純化IDO對本發(fā)明的發(fā)明人提供的環(huán)境微生物的篩選揭示了具有a-酮戊二酸依賴性L-異亮氨酸雙加氧酶活性的獨特微生物。將其鑒定為蘇云金芽孢桿菌，并作為蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2(FERMBP-10688)保藏(stock)。1.1.培養(yǎng)條件。在實驗中使用了以下培養(yǎng)基CM1(胰蛋白胨1Og/l;酵母提取物10g/l;通過NaOH調(diào)節(jié)的pH7.0);CM6(胰蛋白胨10g/l;酵母提取物40g/l;通過NaOH調(diào)節(jié)的pH7.0)。1，2.接種物制備。將蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2在補充有90mMKPi緩沖液(90mMKH2P04(pH7)通過KOH調(diào)節(jié))的CM1培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)過夜。然后，向完成生長的生物質(zhì)添加多至20%的甘油。將獲得的細(xì)胞懸液分裝入1.9ml小瓶并儲存在-70。C直至使用。1.3.發(fā)酵條件。使用Marubischi發(fā)酵器進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e_2發(fā)酵。使用了以下培養(yǎng)參數(shù)起始培養(yǎng)物體積-600ml;攪拌-800轉(zhuǎn)/分；通氣(air)-1:1;使用1HNaOH/HCl補料穩(wěn)定在pH7.0。使用來自一個小瓶(1.9ml)的冷凍懸液(參見前項)接種600mlCM6培養(yǎng)基。將菌林2-e-2培養(yǎng)約7.5小時。然后通過離心收獲細(xì)胞并且儲藏在-70。C直至^f吏用。1.4.IDO活性測定法。通蹤4°C離心從25-100ml蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2培養(yǎng)物收獲細(xì)胞，并且將細(xì)胞重懸在2ml緩沖液A(50mMMOPS、10%甘油、lmMEDTA、lmMDTT、蛋白酶抑制劑，pH7.2)中。使用弗氏細(xì)胞壓碎器(French-pressurecell)(3X在1000Psi)破碎細(xì)胞。反應(yīng)混合物(50ial)包含50mMHEPESpH7.0;5mMIle;5mM抗壞血酸；10mMFeSO4;5mMa-酮戊二酸和蛋白質(zhì)制備物的等分試樣。將反應(yīng)在振蕩條件下在34°C溫育40分鐘。使用TLC分析檢測合成的4HIL。用顯影溶劑(2-丙醇:丙酮氨水二100:100:25:16)顯影用反應(yīng)溶液的等分試樣(l-2pl)點樣的薄層硅膠板(10x15cm)，并且使用茚三酮試劑檢測4HIL。如實施例4中所述進(jìn)行了HPLC分析。1.5從蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2純化和鑒定IDO使用AKTAbasiclOO系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行所有層析步驟。純化規(guī)程包括以下步驟。將冷凍的細(xì)胞(62g重量生物質(zhì))解凍并且重懸在150ml緩沖液A[50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA，1mMDTT，蛋白酶抑制劑，通過HC1調(diào)節(jié)的pH7]中。,4fA通過兩次經(jīng)過(2passages)弗氏細(xì)胞壓碎器(最大P=1000Psi)使細(xì)胞破裂，其后離心(14000g，4°C，20分鐘)以去除細(xì)胞碎片。將獲得的蛋白制備物添加至150ml在緩沖液A中平衡的DEAE樹脂。將最終的懸液在輕柔振蕩條件下在4。C溫育約IO分鐘。然后，將吸附了蛋白的樹脂轉(zhuǎn)移至柱(26X30cm)并進(jìn)行兩步蛋白質(zhì)洗脫。首先，通過溶于緩沖液A的50mMNaCl洗滌柱子。然后，通過溶于緩沖液A的250mMNaCl洗脫IDO活性。通過硫酸銨沉淀(以1.9M)濃縮IDO活性并且重懸在約3ml緩沖液B[50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA,1mMDTT,100mMNaCl,pH7]中。,-翬3.將1.5ml獲得自#嚴(yán)2的制備物施加于用緩沖液B平衡的Superdex200HR10門0A柱。以0.5ml/min流速進(jìn)行等度洗脫。匯集活性級分。,嚴(yán)？.將獲得自,嚴(yán)3的蛋白制備物施加于用緩沖液A平衡的1.6mlSoursel5Q柱。以0.5ml/min流速通過溶于緩沖液B的線性梯度0-0.5MNaCl(10柱體積)進(jìn)行洗脫。收集每個lml級分。匯集活性級分。結(jié)果，將IDO純化約120倍(見表11)。最終蛋白制備物的SDS-PAGE顯示了僅一個主條帶(總蛋白質(zhì)的約70%,見圖12)。_表ll.從蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2純化IDO<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>1.6鑒定IDO。從SDS-PAGE提取了主要的蛋白質(zhì)，并且通過質(zhì)譜分析進(jìn)行了分析。凝膠處理、胰蛋白酶水解、蛋白質(zhì)提取和通過基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間(MALDI-TOF)的質(zhì)量分析根據(jù)由Govorun，V.M.等，(TheproteomecomparativeanalysisofT/e/z'coZ)ocfer/y/on'clinicalisolates.Biochemistry(Mosc),68,1,42-49(2003))描述的規(guī)程進(jìn)行。使用Mascot軟件(MatrixScienceUSA)的PeptideFingerprint(肽指紋)選項通過成組的所述蛋白質(zhì)的光解肽質(zhì)量鑒定了該蛋白質(zhì)。通過MS分析將所分析的蛋白質(zhì)鑒定為來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型；ATCC35646)菌抹的推定的RBTH—06809蛋白(圖13)。實施例5.從蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2和蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型，ATCC35646)菌抹克隆IDO基因在SDS(15-25。/。)聚丙烯酰胺凝膠中對純化的樣品進(jìn)行電泳。在室溫以1mAcn^在1小時的過程中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。在用CBB染色之后，將IDO條帶切下并進(jìn)行用蛋白質(zhì)測序4義PPSQ-10型(ShimadzuCo.Ltd.,Kyoto,Japan)進(jìn)行的自動埃德曼降解(Edmandegradation),測定了所述純化蛋白質(zhì)的前20個N-末端氨基酸。測定31-kDa多肽的N-末端氨基酸為KMSGFS正EKVHEFESKGFL(SEQIDNO:5)。BLAST搜索之后，這種tt酸序列與來自蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型)ATCC35646的假設(shè)蛋白RBTH—06809和來自蠟狀芽孢桿菌ATCC14579的BC1061顯示了高同源性，如表1中所示。對RBTH—06809ORF的序列分析和對純化蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸的測定說明僅存在一個潛在的IDO翻譯起點，因為典型的SD序列位于ATG起始密碼子上游8bp處(圖14)。然而，Lys(7)是純化蛋白的N-末端氨基酸。推斷N-末端加工(N-末端氨基酸的切割)是IDO活性所需的?？雌饋恚@種切割是特異性蛋白酶的特征(attribute),所述蛋白酶與芽孢桿菌屬菌種中的IDO共表達(dá)，但是在大腸桿菌中缺乏該蛋白酶。所以，為了在大腸桿菌中產(chǎn)生成熟的IDO，構(gòu)建了特殊的重組質(zhì)粒。2丄細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型，ATCC35646)菌抹獲得自俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),登錄號B-197。2,2構(gòu)建pMW119-IDO(Lys，32)質(zhì)粒。為了構(gòu)建pMWl19-IDO(Lys,32)，進(jìn)行了以下步驟。使用寡核苷酸SVS170(SEQIDNo:3)和SVS169(SEQIDNo:4)作為引物(具體參見圖15)和純化的染色體DNA作為模板擴(kuò)增了蘇云金芽孢桿菌(以色列血清變型，ATCC35646)菌林染色體的0.8kbDNA片段。使用了以下PCR規(guī)程初始循環(huán)為94。C30秒；4個循環(huán)的94°C40秒，49°C30秒，72。C40秒；35個循環(huán)的94。C30秒，54。C30秒，72。C30秒。將獲得的PCR片段用Sam7/I和&cl內(nèi)切核酸酶消化，然后連接至先前用相同的限制酶(restrictase)處理的pMW119載體中。2.3構(gòu)建pMW119-IDO(Lys，23)質(zhì)粒。使用寡核苷酸SVS170(SEQIDNo:3)和SVS169(SEQIDNo:4)作為引物(具體參見圖15)和純化的染色體DNA作為模板擴(kuò)增了蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2染色體的0.8kbDNA片段。使用了以下PCR規(guī)程初始循環(huán)為94。C30秒；4個循環(huán)的94。C40秒，49。C30秒，72。C40秒；35個循環(huán)的94。C30秒，54。C30秒，72。C30秒。將獲得的PCR片段用和5"acl內(nèi)切核酸酶消化，然后連接至先前用相同的限制酶處理的pMWl19載體中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌抹TG1的細(xì)胞。在X-gal/IPTG瓊脂板上選擇所得克隆(藍(lán)/白測試)。然后，檢測所選克隆的粗制細(xì)胞裂解物中的IDO活性。結(jié)果，選擇了TG1[pMW119-(Lys,32)]和TG1[pMW119-(Lys，23)]兩個克隆。分離了相應(yīng)的質(zhì)粒，并且對于每個質(zhì)粒的克隆&m//l-&cl片段進(jìn)行了序列分析(參見圖16、圖17)。分析測定的DNA序列顯示了克隆的基因和已知RBTH—06809ORF間的差異(圖18、圖19)。此外，測定了在質(zhì)粒pMW119上IDO(Lys，23)調(diào)節(jié)區(qū)中的點突變，導(dǎo)致消除前導(dǎo)肽(l)的TAA終止密碼子并且使它的翻譯延伸至TGA終止密碼子(前導(dǎo)肽(2)),其與ATG起始密碼子重疊(參見圖15A、C)。在"-2"位置檢測到額外的突變，其中A取代了C(參見圖15,C)。2.4.TGl[pMW119-IDO(Lys，23)和TGl[pMW119-IDO(Lys，32)菌抹的粗制細(xì)胞裂解物中IDO活性的測定。為了研究重組大腸桿菌菌抹的粗制細(xì)胞裂解物中的IDO活性，進(jìn)行了以下步驟。通過在4。C離心從5ml培養(yǎng)物收獲了細(xì)胞，重懸在0.5ml緩沖液A915(50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA，lmMDTT,通過HC1調(diào)節(jié)的pH7)中并通過在4。C的超聲處理使其破裂。反應(yīng)混合物(50)uil)包含50mMHEPESpH7.0;5mMlie;0.5mMa-酮戊二酸；5mM抗壞血酸；5mMFeS04和蛋白制備物的等分試樣。將反應(yīng)在振蕩條件下在34°C溫育1小時。使用TLC或HPLC分析如實施例4中所述牙全測合成的4HIL。結(jié)果總結(jié)在表12中。表12.<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實施例6.使用IDO活性將L-異亮氨酸生物轉(zhuǎn)化為4HIL在補充了氨芐青霉素(100mg/l)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌菌株TGl[pMW119-IDO(Lys,23)]和TGl[pMW119-IDO(Lys,32)]的細(xì)胞，直至達(dá)到光密度A54Q=4-5(約6小時)。其后通過離心從2ml培養(yǎng)液收獲細(xì)胞，重懸于lml溶液MI50(100mMKH2P04(通過NaOH調(diào)節(jié)pH7)，NH4C120mM，MgS042mM,CaCl20.1mM，氨千青霉素150pg/ml,lie50mM,0，5mMa-酮戊二酸，甘油1%，酵母提取物-0.005g/l)。然后，將細(xì)胞培養(yǎng)約12小時。其后，通過TLC(HPLC)分析檢查4HIL的濃度。將獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)在表13中。從表12中可以看出，與TGl[pMW119-IDO(Lys，32)]相比，TGl[pMW119-IDO(Lys，23)]引起了較大量4HIL的積累。表13.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實施例7.用HPLC測量積累的4-羥基-L-異亮氨酸HPLC分析使用了帶有熒光分光光度計1100系列(Agilent,USA)的高壓層析儀(Waters,USA)。所選4企測波范圍激發(fā)波長250nm,發(fā)射波長范圍320-560nm。在柱Nova-PakTMC18150x3.9誰，4pm(Waters,USA)在+400。C進(jìn)行通過accq-tag(accq-標(biāo)記)法的分離。樣品的注入體積為5|li1。氨基酸書亍生物的形成和它們的分離根據(jù)Waters制造商的建議(Liu，H.等，J.Chromatogr.A,828,383-395(1998);Watersaccq-tagchemistrypackage.Instructionmanual.MilliporeCorporation,pp.1-9(1993))進(jìn)行。為了獲得具有6-氨基喹啉-N-羥基琥玉白醜亞胺基曱酸酉旨(6-aminoquinolil-N-hydroxysuccinymidylcarbamate)的氛基酸衍生物，使用了試劑盒Accq-FluorTM(Waters,USA)。使用濃縮的Accq-tagEluentA(Waters,USA)進(jìn)行了通過accq標(biāo)記法的分析。全部溶液4吏用Milli-Q水制備，將標(biāo)準(zhǔn)溶液儲藏在+4°C。實施例8.從蠟狀芽孢桿菌ATCC14597、蘇云金芽孢桿菌AKU238和韋氏芽孢桿菌KBAB4克隆Wo基因(l)制備染色體DNA將蠟狀芽孢桿菌ATCC14579、蘇云金芽孢桿菌AKU238和韋氏芽孢桿菌KBAB4各自在5mlLB培養(yǎng)基中在28°C培養(yǎng)過夜(預(yù)培養(yǎng))。使用1.5ml培養(yǎng)液作為種子，在50mlLB培養(yǎng)基中進(jìn)行主培養(yǎng)(mainculture)。在培養(yǎng)至對數(shù)生長期之后，通過離心(12000xg,4°C，15分鐘)從50ml培養(yǎng)液收獲細(xì)胞。根據(jù)常規(guī)方法從這些細(xì)胞制備了染色體DNA。(2)通過PCR獲得Wo基因基于公開的關(guān)于蠟狀芽孢桿菌ATCC14579的基因組序列信息(GenBank登錄號AE016877)，合成了以下引物CATATGGAGGTTTTTATAATGACGTTTGTT(SEQIDNO:10)通過使用制備的引物和蠟狀芽孢桿菌ATCC14578的染色體DNA作為模板，使用PrimeSTAR(TaKaRa)在以下條件下進(jìn)行了PCR擴(kuò)增30個循環(huán)的98°C10秒，52。C15秒和72。C1分鐘。對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并且觀察到擴(kuò)增了約750bp的片段。收集所述DNA片段，用AWeI和屈oI內(nèi)切核酸酶消化，并且克隆入已經(jīng)用相同的內(nèi)切核酸酶消化的表達(dá)載體pET21b(Novagene)中。然后測定核苷酸序列并且推導(dǎo)其編碼氨基酸序列(SEQIDNO:12和13)。結(jié)果，基于所得DNA片段的同源性確認(rèn)獲得了同源Wo基因。相對于源自以色列蘇云水平的同源性是98%,并且相對于源自蘇云金芽孢桿菌2-e-2的Wo基因在核香酸序列水平的同源性是98%。至于蘇云金芽孢桿菌AKU238，通過用于從蘇云金芽孢桿菌2-e-2克隆/^基因的引物(SEQIDNO:14和15)，通過PCR克隆了^fo基因并且按照與上文相似的方式測序(SEQIDNO:16和17)。相對于源自以色列蘇云金芽孢桿菌的/必基因在核苦酸序列水平的同源性是98%,并且相對于源自蘇云金芽孢桿菌2-e-2的Wo基因在核苷西拼列水平的同源性是98%。CTCGAGTTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGT(SEQIDNO:15)至于韋氏芽孢桿菌KBAB4，通過基于公開的關(guān)于韋氏芽孢桿菌KBAB4(GenBank登錄號NZ—AAOYO100000l)的基因組序列信息的引物，合成了以下引物(SEQIDNO:18和19)，通過PCR克隆了Wo基因并且按照與上述相似的方式測序(SEQIDNO:20和21)。相對于源自以色列蘇云金芽孢桿菌的Wo基因在核苷酸序列水平的同源性是78%,并且相對于源自蘇云金芽孢桿菌2-e-2的Wo基因在核苷酸序列水平的同源性是78%。CATATGCTAACAACAGTTTCTAATAAGACA(SEQIDNO:18)實施例9.在大腸桿菌中表達(dá)Wo基因和從lie產(chǎn)生HIL(1)大腸桿菌中/cfo基因的表達(dá)將實施例8中構(gòu)建的表達(dá)源自蠟狀芽孢桿菌ATCC14579、蘇云金芽孢桿菌AKU238或韋氏芽孢桿菌KBAB4的Wo基因的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta2(DE3)，并且將所得轉(zhuǎn)化體在振蕩條件下在補充有50嗎/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng))。將預(yù)培養(yǎng)液以1%接種至50mlLB培養(yǎng)基中，在37。C進(jìn)行主培養(yǎng)。在培養(yǎng)起始之后2小時，以終濃度1mM添加IPTG，并且將培養(yǎng)再進(jìn)行3小時。培養(yǎng)完成之后，將細(xì)胞收獲、洗滌、懸浮在1ml的20mMTris-HCl(pH7.6)中，并且用超聲儀(INSONATOR201M,KUBOTA)使其石皮裂。將裂解物在15000rpm離心10分鐘以獲得上清液，將所述上清液用作粗制酶溶液。(2)使用粗制酶溶液從lie產(chǎn)生HIL使用(l)中制備的粗制酶溶液，測量將Ile轉(zhuǎn)化為HIL的活性。反應(yīng)混合物具有如下所述的組成。將所述反應(yīng)混合物在振蕩條件下(300rpm)在28°C反應(yīng)3小時，然后通過HPLC測定產(chǎn)生的HIL。測定結(jié)果示于表14。反應(yīng)混合物細(xì)胞裂解物(超聲破裂)500|il2%lielOQfil1Ma-KG，(xl1M抗壞血酸？(il0.1MFeCl2lp(il1MKPB(pH6)_10Qpi總計1ml表14從異亮氨酸產(chǎn)生HIL的量HILC以色列蘇云金芽孢桿菌ATCC356462150蘇云金芽孢桿菌2e22321蘇云金芽孢桿菌AKU2382016蠟狀芽孢桿菌ATCC1457990韋氏芽孢桿菌KBAB43116對照(pET21b)11結(jié)果，當(dāng)使用表達(dá)源自蠟狀芽孢桿菌ATCC14579的Wo基因的菌抹和表達(dá)源自蘇云金芽孢桿菌AKU238或韋氏芽孢桿菌KBAB4的Wo基因的質(zhì)粒時，清楚地觀察到HIL的產(chǎn)生。由此，確認(rèn)了這些基因可用于HIL產(chǎn)生。序列說明1:源自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的IDO基因的核苷酸序列2:源自蘇云金芽孢桿菌菌林2-e-2的IDO的氨基酸序列3:引物svsl70;用于擴(kuò)增IDO基因4:引物svsl69;用于擴(kuò)增IDO基因5:源自蘇云金芽孢桿菌菌株2-e-2的IDO的N-末端序列6:芽孢桿菌屬中的IDO保守序列7:源自蘇云金芽孢桿菌菌林ATCC35646的IDO基因的核普酸序列8:源自蘇云金芽孢桿菌菌抹ATCC35646的IDO的氨基酸序列9:蘇云金芽孢桿菌菌抹2-e-2的16SrDNA核苷酸序列10:用于從蠟狀芽孢桿菌ATCC14579擴(kuò)增IDO基因的引物11:用于從蠟狀芽孢桿菌ATCC14579擴(kuò)增IDO基因的引物12:源自蠟狀芽孢桿菌ATCC14579的IDO基因的核普酸序列13:源自蠟狀芽孢桿菌ATCC14579的IDO的氨基酸序列14:用于從蘇云金芽孢桿菌AKU238擴(kuò)增IDO基因的引物15:用于從蘇云金芽孢桿菌AKU238擴(kuò)增IDO基因的引物16:源自蘇云金芽孢桿菌AKU238的IDO基因的核苷酸序列17:源自蘇云金芽孢桿菌AKU238的IDO的氨基酸序列18:用于從韋氏芽孢桿菌KBAB4擴(kuò)增IDO基因的引物19:用于從韋氏芽孢桿菌KBAB4擴(kuò)增IDO基因的引物20:源自韋氏芽孢桿菌KBAB4的IDO基因的核苷酸序列21:源自韋氏芽孢桿菌KBAB4的IDO的氨基酸序列工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供了使用酶產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的方法，所述酶源自微生物并且催化通過直接羥化異亮氨酸而產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的反應(yīng)。本發(fā)明在藥物和食品領(lǐng)域非常有用。本發(fā)明的L-異亮氨酸雙加氧酶是一種新的雙加氧酶，其催化L-異亮氨酸的羥化反應(yīng)，并且可以優(yōu)選地用于合成(2S,3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸，(2S，3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸可以用作具有促胰島素活性的藥物組合物的成分。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸或其鹽的方法，包括產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸的步驟，其中通過使異亮氨酸或其鹽在源自微生物的羥化酶存在下進(jìn)行羥化反應(yīng)并從異亮氨酸產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)生方法，其中所述微生物是屬于芽孢桿菌屬的微生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)生方法，其中所述屬于芽孢桿菌屬的微生物是選自以下的微生物蘇云金芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的產(chǎn)生方法，其中所述鞋化反應(yīng)在制備自對數(shù)生長期的微生物細(xì)胞的細(xì)胞裂解物存在下進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的產(chǎn)生方法，其中對L-異亮氨酸進(jìn)行羥化反應(yīng)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的產(chǎn)生方法，其中所述羥化酶是雙加氧酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的產(chǎn)生方法，其中所述羥化酶具有以下特性(a)需要氧、Fe2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸作為輔因子，(b)最適反應(yīng)pH為5-8，(c)最適反應(yīng)溫度為45°C或更低，(d)在S0。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制。8.—種雙加氧酶，其具有以下特性并且可以從芽孢桿菌屬細(xì)菌分離(a)需要氧、Fe2+、抗壞血酸和2-酮戊二酸作為輔因子，(b)最適反應(yīng)pH為5-8，(c)最適反應(yīng)溫度為45°C或更低，(d)在S0。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制，(f)如通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測量，包含分子量為29000±2000的亞基，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的#^酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的雙加氧酶，其中所述芽孢桿菌屬細(xì)菌是蘇云金芽孢桿菌。10.—種選自下組的DNA:(a)包含SEQIDNo:1的核苦酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNo:1核苦酸序列的互補核香酸序列的DNA雜交并且編碼具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA;(c)編碼包含SEQIDNo:2的氨基i^f列的蛋白質(zhì)的DNA;(d)編碼具有如下^JJ臾序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA,所述^Il&酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(e)編碼具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，所述氨基S交序列與SEQIDNo:2的^i^酸序列是至少98%同源的。11.一種重組DNA，其通過將根據(jù)權(quán)利要求10的DNA與載體DNA連接獲得。12.—種由根據(jù)權(quán)利要求11的重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。13.—種用于產(chǎn)生具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，和在培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)。14.一種選自下組的蛋白質(zhì)(f)包含SEQIDNo:2的氨基Sl^列的蛋白質(zhì)；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)與SEQIDNo:2的氨基酸序列至少98%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)。15.—種蛋白質(zhì)，其包含(A)具有催化通過L-異亮氨酸的羥化產(chǎn)生(2S，3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸的反應(yīng)的活性；(B)所述活性依賴于二價陽離子Fe2、并且(C)如通過SDS-PAGE測量，分子量是約29±2.0kDa。16.—種用于制備(2S，3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法，包括步驟在選自下組的至少一種L-異亮氨酸雙加氧酶存在下，使L-異亮氨酸在水性溶劑中反應(yīng)(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的絲酉Uf列的蛋白質(zhì)，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酉l/f列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酉餅歹'J中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)與SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)；分離產(chǎn)生的(2S，3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。17.—種用于制^(2S，3R，4S)-4-雍基-L-異亮氨酸或其鹽的方法，包括步驟在包含選自下組的L-異亮氨酸雙加氧酶的細(xì)菌存在下，使L-異亮氨酸在水性溶劑中反應(yīng)(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酉l/f列的蛋白質(zhì)，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的#^酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)與SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-異亮氨酸雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)；和分離產(chǎn)生的(2S,3R,4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾以增強L-異亮氨酸雙加氧酶活性。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中L-異亮氨酸雙加氧酶的活性通過增加編碼所述L-異亮氨酸雙加氧酶的基因的表達(dá)來增強。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-異亮氨酸雙加氧酶的表達(dá)通過修飾編碼所述L-異亮氨酸雙加氧酶的基因的表達(dá)調(diào)控序列或通過增加編碼所述L-異亮氨酸雙加氧酶的基因的拷貝數(shù)來增加。21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、曲霉屬或芽孢桿菌屬。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)菌屬于大腸桿菌、簡單節(jié)桿菌、谷氨酸棒桿菌、球形節(jié)桿菌、硫磺節(jié)桿菌、粘液節(jié)桿菌或枯草芽孢桿菌。23.根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項的方法，其中所述細(xì)菌是細(xì)菌培養(yǎng)物、細(xì)胞、經(jīng)處理細(xì)胞或細(xì)胞裂解物。全文摘要本發(fā)明提供來自蘇云金芽孢桿菌的新的高活性L-異亮氨酸雙加氧酶。還提供一種制備(2S，3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸或其鹽的方法，該方法包括在L-異亮氨酸雙加氧酶存在下使L-異亮氨酸在水性溶劑中反應(yīng)，和分離產(chǎn)生的(2S，3R，4S)-4-羥基-L-異亮氨酸。文檔編號C12P13/06GK101528940SQ20078003630公開日2009年9月9日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日發(fā)明者小寺智博,小川順,尤里·I·科茲洛夫,日比慎,清水昌,瑟奇·V·斯米爾諾夫,納塔利亞·N·薩姆索諾瓦,納塔利亞·Y·拉什克維克,維羅尼卡·A·科特利亞羅瓦申請人:味之素株式會社