專利名稱：組織來源細胞的冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織來源細胞的冷凍保存方法，具體地，涉及一種用于簡 便且有效地冷凍保存來源于從哺乳動物獲取的各種組織的所希望的細胞的 方法。
本申請主張日本專利申請?zhí)卦?006-274243號(申請日2006年10 月5日)的優(yōu)先權(quán)，并且將該申請的全部記載內(nèi)容以引用的方式編入本申 請文件中。
背景技術(shù)：
哺乳動物的組織或器官，在從受檢體上取下后不做處理或者對其進行 培養(yǎng)、增殖后，用于調(diào)查填補患者欠損部用的移植用組織、藥劑、或化妝 品的功效。另外，從特定的組織提取出干細胞、并使其增殖而使用的面向 再生醫(yī)療的應(yīng)用也受到了人們的關(guān)注。通常，從活體上獲取的組織或培養(yǎng) 組織在維持其機能的狀態(tài)下儲藏是有期限的，因此不可能在全部長的期間 保持合適的在庫品。為了延長儲藏時間，進行利用冷凍的組織或細胞保 存。已公開有當(dāng)保存組織時在添加有冷凍保護劑的保存液中浸漬培養(yǎng)組織 而冷凍保存的技術(shù)(例如，參照專利文獻1)、將培養(yǎng)上皮層在浸漬到 DMEM中的狀態(tài)下在8 19"C下低溫保存的技術(shù)(例如，參照專利文獻 2)等。
另外，作為哺乳動物細胞的保存方法，確立了冷凍保存的方法，在樹 立細胞的情況下用于使遺傳的變化為最小的限度，在有壽命的細胞的情況 下用于避免老化和形質(zhì)轉(zhuǎn)換(例如，參照非專利文獻1和2)。在該方法 中，為了使活性維持在500%以上來保存培養(yǎng)細胞等細胞，以每分鐘rc左 右的速度逐漸冷卻細胞，在一20(TC左右下保存，保存結(jié)束時急速融解 (解凍)。此時，為了防止細胞由于冷凍而被破壞，將細胞懸濁于含10%甘油三酯的完全培養(yǎng)基、或者含5 10%二甲基亞砜的條件培養(yǎng)基或者無 血清培養(yǎng)基等中。冷凍時，液體凝固而結(jié)晶化，存在著在細胞內(nèi)形成冰晶 的問題。這些冰晶在解凍時對細胞的生長(生育)力造成不良影響。 一般 認(rèn)為，上述甘油三酯等的冷凍保護劑使細胞內(nèi)的液體玻璃化或非晶質(zhì)化， 從而抑制冰晶的生成。
為了從哺乳動物組織得到細胞，通常有利用酶處理等使細胞分散來培 養(yǎng)、或者將組織片段本身浸到培養(yǎng)基中，獲取從組織游走到培養(yǎng)基中的細 胞的方法等。而且，本說明書中引用的全部文獻通過引用而編入到本申請 文件中。
專利文獻1:日本專利文獻特表平9-505032號公報；
專利文獻2:日本專利文獻特許第2693640號公報；
非專利文獻l:井出利憲著、細胞培養(yǎng)入門Note、 1999年、羊土社、
139頁(井出利憲薯、細胞培養(yǎng)入門乂一K、 1999年、羊土社、139
頁)；
非專利文獻2: Sigma細胞培養(yǎng)手冊、2005年、Sigma-Aldrich Japan株 式會社、286頁(、乂夕、、7細胞培養(yǎng)7二二7VP、 2005年、、y夕、、77WK、U :y于"亇八。y株式會社、286頁)。
當(dāng)對獲取的組織通過酶處理等進行分解后回收細胞時，由于多種細胞 混雜，難以只獲得目標(biāo)細胞。因此，使用僅由特定細胞育成的選擇培養(yǎng)基 來培養(yǎng)回收的細胞，會花費用于選擇目標(biāo)細胞的功夫和時間。另外，在將 組織片段本身浸入到培養(yǎng)基中并等待細胞從組織向培養(yǎng)基中游走的方法的 情況下，由于需要長時間的培養(yǎng)并且為了將游走后所得的細胞從組織分離 而需要繼代，因此要花費功夫和時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了如下事實，即當(dāng)從採取的組織僅使作為目標(biāo)的細胞 游走到組織片段的邊緣、并不做任何處理將其冷凍保存時，組織內(nèi)的細胞 發(fā)生冰、溶質(zhì)的結(jié)晶，從而細胞受到重大損傷，相對于此，存在于組織邊 緣的細胞即使在組織中發(fā)生了冰、溶質(zhì)的結(jié)晶也不會因此受到損傷，可以 通過通常的冷凍方法長時間儲藏，并且能夠通過解凍冷凍組織作為可再生
4長的細胞回收?；谶@些事實，完成了本發(fā)明。
艮卩，本發(fā)明涉及的組織來源細胞的冷凍保存方法的特征在于，將含有
目標(biāo)細胞的組織片段化，將片段化的組織片段在規(guī)定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，回 收經(jīng)培養(yǎng)得到的組織片段，并懸濁于冷凍保護溶液中，然后將該組織片段
懸濁物在一7(TC以下的溫度下冷凍。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述組織是從哺乳動物身上採取或培養(yǎng) 而得的組織。而且，所述組織片段的培養(yǎng)進行組織內(nèi)部的細胞游走到組織 片段的邊緣所必要的時間。所述規(guī)定的培養(yǎng)基是能夠使該組織中存在的所 希望的細胞游走到組織片段的邊緣的培養(yǎng)基。
而且，在本發(fā)明的一個實施方式中還包括以下過程，即使所述冷凍 的組織片段懸濁物解凍，對解凍的組織片段進行培養(yǎng)，回收游走到培養(yǎng)基 中的細胞。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供一種來源于真皮的成纖維細胞的 冷凍保存方法，其特征在于，將從哺乳動物身上採取的皮膚片段化，將片 段化的皮膚片段在含血清的最小必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)，回收經(jīng)培養(yǎng)得到的皮
膚片段并懸濁于冷凍保護溶液中，然后將該皮膚片段懸濁物在一7(TC以下 的溫度下冷凍。所述片段化的皮膚片段的最大直徑優(yōu)選為5mm以下，更 優(yōu)選為lmm 0.5mm。所述皮膚片的培養(yǎng)，在通常的細胞培養(yǎng)條件下，例 如約37°C、 5%的二氧化碳的條件下，優(yōu)選進行5 10天，在典型的一個 實施方式中進行約l周(7天)。
在本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方式中，所述冷凍保護溶液含有10%的 甘油三酯或5 10%的二甲基亞砜，所述組織片段懸濁物的冷凍在液氮中 進行。
發(fā)明效果
利用本發(fā)明的方法冷凍的組織片段中含有來源于該組織的可生長的細 胞，因此在解凍該組織片段來培養(yǎng)時能夠回收較多的生存細胞。因此，與 對從活體上採取的組織培養(yǎng)，并只預(yù)先回收細胞來保存的情況相比，可以 在短時間內(nèi)完成冷凍保存，例如，在皮膚成纖維細胞的情況下能夠以約1 周的時間完成冷凍保存，從而能夠在短時間且以低成本保存組織來源細胞。而且，通過在冷凍前的組織片段的培養(yǎng)中使用規(guī)定的培養(yǎng)基，能夠僅 僅將該來源于組織的所希望的細胞誘導(dǎo)到組織片段的邊緣以可生長的狀態(tài) 保存。因而，在冷凍保存結(jié)束后對組織片段進行解凍、培養(yǎng)時，能夠高效 地只獲取所希望的細胞。


圖1是示出在直接冷凍保存皮膚組織的情況(D組)和利用本發(fā)明的 方法進行冷凍的情況(C組)下的剛解凍后所見情形的照片。
圖2是示出在直接冷凍保存皮膚組織的情況(D組)和利用本發(fā)明的 方法進行冷凍的情況(C組)下的解凍后培養(yǎng)第一天所見情形的照片。
圖3是示出在直接冷凍保存皮膚組織的情況(D組)和利用本發(fā)明的 方法進行冷凍的情況(C組)下的解凍后培養(yǎng)第七天所見情形的照片。
具體實施方式
(定義)
在本說明書中，以下的用語定義如下。用語"組織(tissue)"是指在 多細胞生物中構(gòu)成細胞分化而具有同一機能、形態(tài)的細胞集團。動物的組 織根據(jù)形態(tài)、機能、或者發(fā)生學(xué)可大致分為上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組 織、神經(jīng)組織。組織的成分不僅僅是細胞，還有作為充滿細胞之間的空間 的物質(zhì)的基質(zhì)(matrix)。多個組織或細胞集合起來構(gòu)成器官(organ)。 動物的器官也稱為臟器。在本發(fā)明中，"組織"可以和"器官"或"臟 器"同義使用，例如除了皮膚、骨骼肌、心肌、神經(jīng)等之外，還包括肝 臟、腎臟、胰腺、脾臟、睪丸、卵巢、副腎、腦、甲狀腺等。
用語"冷凍保護溶液"，是指在冷凍保存組織或細胞時，通過液體成 分的結(jié)晶化用于保護細胞使其免受損害的所有保護劑，包括細胞浸透性的 玻璃化劑或細胞非浸透性的玻璃化劑。非細胞浸透玻璃形成劑包括軟骨素 硫酸、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、或羥乙基淀粉等復(fù)合碳水化合物的高 分子量形成體。細胞浸透玻璃化劑包括甘油三酯、丙二醇、乙二醇、二甲 基亞砜(DMSO)等。作為優(yōu)選的冷凍保護溶液，可以例舉有含10%甘油
6三酯的完全培養(yǎng)基、含10%DMSO的完全培養(yǎng)基、含10%甘油三酯的50 %條件培養(yǎng)基+ 50%新鮮培養(yǎng)基、含10%DMSO的50%條件培養(yǎng)基+ 50 %新鮮培養(yǎng)基、含7.5%DMSO的50%條件培養(yǎng)基+ 50%無血清培養(yǎng)基、 以及含7.5XDMSO與10XBSA的新鮮無血清培養(yǎng)基等，但不限于這些。
用語"培養(yǎng)基"乃至"培養(yǎng)液"，是指為了在玻璃器內(nèi)使細胞、組 織、器官等增殖、生長而給予的營養(yǎng)成分。用語"邊緣(border or marginal)"，是指片段化的組織片段的端部區(qū)域，即從組織片段末端到 數(shù)iim以內(nèi)的區(qū)域。用語"游走(migration)"是指在組織、器官或者活 體內(nèi)細胞從某一地點向另一地點移動。血球細胞通過血管壁移動，另外， 腫瘤細胞轉(zhuǎn)移也是一種游走。
(組織來源細胞的冷凍保存)
本發(fā)明的冷凍保存方法，首先將從活體上獲取的組織片段化。可以根 據(jù)各種組織優(yōu)選使用片段化方法，例如，可以是利用胰蛋白酶、膠原酶等 的酶處理的化學(xué)方法，也可以是利用手術(shù)用剪刀或手術(shù)刀細切的物理方 法。在如同哺乳動物的皮膚那樣比較薄而脆弱的組織的情況下，優(yōu)選利用 物理方法的片段化。被片段化的組織片段的大小根據(jù)使用的組織而不同， 例如，在皮膚組織的情況下，優(yōu)選最大直徑為5mm以下，更優(yōu)選最大直 徑為lmm 0.5mm。
然后，將片段化了的組織片段在規(guī)定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可以使 用片段化了的哺乳動物的皮膚。當(dāng)從組織學(xué)的角度觀察人的皮膚時，從表 面以表皮、真皮以及皮下組織的順序形成了層。表皮的主要構(gòu)成細胞包 括角化細胞(Keratinocyte)、黑色素產(chǎn)生細胞(melanocyte)、所謂與 知覺有關(guān)系的Merkel細胞、作為抗原呈遞細胞的來自骨髓的細胞的朗格漢 斯(Langerhans)細胞。表皮非常薄，為0.1 0.3mm，在該表皮中起到防 御作用的是角化細胞。存在于表皮下層的母細胞反復(fù)增殖，在皮膚的表面 上形成物理上以及化學(xué)上都強韌的角化層(細胞內(nèi)以被稱為硬的角蛋白纖 維的物質(zhì)充滿的狀態(tài))，成為壁壘。對于創(chuàng)傷治愈，角化細胞游走覆蓋傷 口表面是比較重要的。另外，真皮由成纖維細胞、以及由該細胞產(chǎn)生的彈 性膠原性間質(zhì)構(gòu)成，其在帶來皮膚的伸縮性和彈性同時，還富含毛細血管，具有與表皮協(xié)調(diào)的作用。真皮(膠原纖維、彈性蛋白纖維、成纖維細 胞)被保護在表皮下而不易受到來自外部的損傷，通過保持水分支持皮膚 的機能，主要起到保持皮膚的彈性、張力的作用。
通過調(diào)節(jié)用于培養(yǎng)組織片段的培養(yǎng)基成分以及有無血清添加或者其添 加量，能夠使該組織中存在的所希望的細胞游走到組織片段的邊緣。作為 本發(fā)明的一個實施方式，在皮膚組織的情況下，可以通過使用含血清的最 小必需培養(yǎng)基來使來源于真皮的成纖維細胞良好地游走。作為最小必需培 養(yǎng)基，是可進行細胞培養(yǎng)、含有定義的數(shù)量的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基，例如可以
例舉有Eagle的MEM培養(yǎng)基、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、 Ham的培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基等。另外，為了抑制成纖維細胞的增殖 并使能增殖的角化細胞選擇性地游走，已知可使用無血清、低鈣濃度的培 養(yǎng)基。而且，為了使角化細胞、黑色素產(chǎn)生細胞游走，向培養(yǎng)基中添加的 肽添加物(上皮成長因子、胰島素、堿性成纖維細胞增殖因子)是重要 的。
作為其他實施方式，已公開了使作為末梢神經(jīng)損傷時誘導(dǎo)神經(jīng)再生的 材料有用的施沃恩(Schwann)細胞選擇性地游走的方法(參照日本專利 文獻特開2003-70465號公報)。根據(jù)該方法，在用含血清的培養(yǎng)基對經(jīng)酶 處理過的末梢神經(jīng)片培養(yǎng)規(guī)定時間后，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)規(guī)定時間，從 而能夠在抑制了成纖維細胞增殖的情況下誘導(dǎo)施沃恩細胞游走。而且，也 可以使用2.5%左右的FCS等、低濃度的含血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在另 外的實施方式中，可以從臍帶靜脈、大動脈、肺動脈等使血管內(nèi)皮細胞或 血管平滑肌細胞等選擇性地游走。其中使用的培養(yǎng)基能夠從Sigma公司、 Aldrich公司、Invitrogen / GIBCO公司、Clontech公司、Qiagen公司、 Kumbo、 Takara-bio株式會社等銷售商購得。
上述組織片段的培養(yǎng)，優(yōu)選進行為了使組織內(nèi)部的所希望的細胞游走 到組織片段的邊緣所必需的時間，例如，在皮膚組織的情況下，在約37°C 的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)5 10天，優(yōu)選約l周(7天)。如果培養(yǎng)時間短，那 么真皮成纖維細胞就不能完全游走到皮膚組織片段的邊緣，由于停留在組 織內(nèi)(皮膚片內(nèi))，所以在冷凍組織片段時，這些細胞會受到損傷，另外，如果培養(yǎng)時間較此更長，那么細胞就游走到組織片段的外部，與通常 的細胞冷凍保存沒有什么變化。
然后，回收上述培養(yǎng)組織片段，在去除培養(yǎng)基后，懸濁于冷凍保護溶 液中。培養(yǎng)組織片段由于是浮游在培養(yǎng)基中或者是緩緩地黏附到培養(yǎng)容 器，所以能夠通過對容器給予輕輕的敲擊或吸管操作等容易地回收。
最后，在一7(TC以下的溫度下冷凍上述組織片段懸濁物。優(yōu)選在約一 14(TC 約一18(TC下冷卻。冷卻速度優(yōu)選緩慢的1分鐘一rc左右，使用 程序冷凍儀，或者用小瓶立放到絕熱箱(發(fā)泡苯乙烯制箱等)中，放入一 70°C —9(TC的冷凍庫中冷凍。冷凍后，優(yōu)選轉(zhuǎn)移到液氮保存容器中在進 一步低的溫度下保存。
(冷凍保存的組織片段懸濁物的解凍)
冷凍的組織片段懸濁物通過高速升溫解凍，以便在約1 數(shù)秒以內(nèi)解 凍。例如，可以將冷凍組織片段懸濁物的管在水浴中加熱、或者誘導(dǎo)加 熱。優(yōu)選地，通過將在管內(nèi)冷凍的組織片段懸濁物浸漬到37。C的水浴中來 解凍。
如果長時間與冷凍保護劑接觸就有損傷細胞的可能，因此優(yōu)選在維持 在組織片段的邊緣部存在的細胞的活力的基礎(chǔ)上，在盡可能短的時間內(nèi)從 解凍的組織片段上去除冷凍保護劑溶液。例如，將安瓿或小瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn) 移到加有15 20ml培養(yǎng)基的燒瓶或者適當(dāng)?shù)娜萜髦?，照常進行培育。在 黏附細胞的情況下，大部分的細胞黏附后(通常3 4小時)立即將已稀 釋的含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基除去，更換成新的培養(yǎng)基。在對冷凍保護劑 具有易感性的細胞的情況下，可以通過低速離心分離而容易地將舊的培養(yǎng) 基除去。例如，將安瓿或小瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到加入有新的10ml培養(yǎng)基的 15ml的離心管中，以100Xg離心分離5分鐘，將含有冷凍保護劑的上清 廢棄，使組織片段切片再次懸濁于新的培養(yǎng)基。隨后，將組織片段的懸濁 物轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)容器中，照常進行培育。
而且，在以下的實施例中，具體說明了本發(fā)明實施所使用的材料以及 方法，但所述實施例并不是對本發(fā)明的限定。實施例1
成人女性3名(年齡33歲、27歲以及35歲)和成人男性1名(年齡 50歲)，經(jīng)本人的同意，採取了皮膚進行以下的實驗。麻醉各被驗者后， 從耳廓后面採取lmm 3mm的全層皮膚。立即進行2小時酶(dispase 2000單位/ml、合同酒精)處理，將全層皮膚分離為表皮層和真皮層，廢 棄掉表皮層后，細切真皮層(直徑約0.5mm)，制作10切片標(biāo)本。將得 到的10個標(biāo)本切片分成2組，以供以下的實驗。
D組(直接組)將標(biāo)本切片不作任何處理而浸到冷凍保存液(10% DMSO、 80%aMEM、 10%人血清)或者市售的細胞冷凍保存液cell banker (注冊商標(biāo))1 (十慈field株式會社)，在一8(TC下保管12小時 后，用液氮冷凍2周。
C組(培養(yǎng)組)將標(biāo)本切片在含10X人血清的aMEM培養(yǎng)基中， 并在5%二氧化碳濃度、37"下培育1周。隨后，將切片回收到離心管 中，去除上清后，與上述同樣地浸入到冷凍保存液中，在—8(TC下保管12 小時后，用液氮冷凍2周。
經(jīng)過2周后，將上述D組以及C組的各標(biāo)本從液氮中取出并解凍，在 含10X人血清的aMEM培養(yǎng)基中，并在5%二氧化碳濃度、37。C下培 育。用顯微鏡觀察各標(biāo)本剛解凍后、培養(yǎng)第1天、以及培養(yǎng)第7天的情 形，各自的代表例如圖1、圖2以及圖3所示。如圖1所示，剛解凍后的 標(biāo)本，D組和C組都沒有差異。從圖2可見，D組在剛解凍后沒有特別的 變化，但C組中細胞開始向組織片段的附近游走了。在培養(yǎng)第7天的D組 中，在2個皮膚片中發(fā)現(xiàn)了細胞游走(參照圖3的d—l)，而在其他3個 皮膚片中未發(fā)現(xiàn)細胞游走而死滅(參照圖3的d—2)。另外，在培養(yǎng)第7 天的C組中，從全部5個皮膚片都發(fā)現(xiàn)了良好且大量的細胞游走(參照圖 3的c—1以及c一2)。
如上所述，D組中，細胞的游走數(shù)明顯少，而且在真皮內(nèi)細胞死滅、 完全沒有細胞游走的皮膚片在半數(shù)以上。與此相對，C組中，細胞的游走 數(shù)明顯多，而且在真皮內(nèi)細胞死滅、完全沒有細胞游走的皮膚片一個也沒 有。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性
以往，關(guān)于保存細胞，如果不完全是細胞的形態(tài)，則很難實現(xiàn)半永久 性保存。但是，例如通過將皮膚這樣的組織細切、并使目標(biāo)細胞游走到組 織邊緣后、冷凍保存每個組織片段，能夠簡便且有效地保存所希望的細 胞，由此在使用細胞的診斷、治療等的生命科學(xué)相關(guān)產(chǎn)業(yè)、以及醫(yī)藥品產(chǎn) 業(yè)中有用。
本發(fā)明基于上述實施例進行了說明，但不限于上述實施例。在本發(fā)明 全部公開(包含權(quán)利要求書)的范圍內(nèi)，基于本發(fā)明的基本技術(shù)思想，可 進一步對實施方式或?qū)嵤├M行變更和調(diào)整。而且，在本發(fā)明權(quán)利要求書 的范圍內(nèi)，可進行各種公開要素的多樣組合或選擇。并且，本發(fā)明進一步 的要解決的問題、目的以及展開方式可從包含權(quán)利要求書在內(nèi)的本發(fā)明的 全部公開事項得以明確。
權(quán)利要求
1. 一種組織來源細胞的冷凍保存方法，其特征在于，將含有目標(biāo)細胞的組織片段化，將片段化的組織片段在規(guī)定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，回收經(jīng)培養(yǎng)得到的組織片段，并懸濁于冷凍保護溶液中，然后將該組織片段懸濁物在—70℃以下的溫度下冷凍。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織是從哺乳動物 身上採取或者培養(yǎng)而得的組織。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織片段的培養(yǎng)進 行組織內(nèi)部的細胞游走到組織片段的邊緣所必要的時間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述規(guī)定的培養(yǎng)基是能 夠使該組織中存在的所希望的細胞游走到組織片段的邊緣的培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，還包括以 下過程，即使所述冷凍的組織片段懸濁物解凍，對解凍的組織片段進行 培養(yǎng)，回收游走到培養(yǎng)基中的細胞。
6. —種來源于真皮的成纖維細胞的冷凍保存方法，其特征在于，將從 哺乳動物身上採取的皮膚片段化，將片段化的皮膚片在含血清的最小必需 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，回收經(jīng)培養(yǎng)得到的皮膚片并懸濁于冷凍保護溶液中，然后 將該皮膚片懸濁物在一7(TC以下的溫度下冷凍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述片段化的皮膚片的 最大直徑為5mm以下。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述片段化的皮膚片 的最大直徑為lmm 0.5mm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述皮 膚片的培養(yǎng)在約37。C的溫度下進行5 10天。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述皮 膚片的培養(yǎng)在約37"的溫度下進行約7天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡便且有效地冷凍保存來源于各種組織的所希望的細胞的方法。該方法包括以下步驟，即將含有目標(biāo)細胞的組織片段化，將片段化的組織片段在規(guī)定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，回收經(jīng)培養(yǎng)得到的組織片段并懸濁于冷凍保護溶液中，然后將該組織片段懸濁物在-70℃以下的溫度下冷凍。在優(yōu)選的方式中，所述細胞為來源于皮膚組織的成纖維細胞。
文檔編號C12N5/06GK101522890SQ20078003743
公開日2009年9月2日 申請日期2007年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月5日
發(fā)明者北條元治 申請人:細胞銀行株式會社