專利名稱：：用于治療和診斷癌癥及癌轉(zhuǎn)移的組合物及方法用于治療和i貪斷癌癥及癌轉(zhuǎn)移的組合物及方法盡管存在跨學科的方法并已充分應用了經(jīng)典的治療方法，但癌癥仍是最主要的死亡原因之一。具體而言，轉(zhuǎn)移是導致癌癥治療失敗的最關鍵因素之一。盡管蛋白質(zhì)表達模式分析、基因陣列分析和腫瘤組織中關鍵因子的確定已改進了腫瘤的預后分類，但是對切除的原發(fā)腫瘤所進行的分析仍然難于預測轉(zhuǎn)移風險。完全切除腫瘤后，存活通常取決于是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前對原發(fā)腫瘤是否已發(fā)生轉(zhuǎn)移的預測即便可能也是十分困難的。腫瘤細胞在生物學方面顯著區(qū)別于其來源的非惡性細胞。這些差異是由于腫瘤發(fā)生過程中獲得的遺傳改變所致，尤其是還導致癌細胞中形成定性或定量改變的分子結(jié)構。特別地，這類胂瘤相關結(jié)構是在惡性轉(zhuǎn)化過程中表達被誘導或增強的基因產(chǎn)物。對獲得轉(zhuǎn)移表型進行調(diào)節(jié)的因素大多尚不明確。已知一些組織病理學參數(shù)(例如腫瘤階段和組織學分級)與無腫瘤存活(tumor-freesurvival)有關。然而，還不能通過定量肺瘤組織中的關鍵因子來預測轉(zhuǎn)移風險。本發(fā)明的一個目的是提供用于診斷和治療癌癥(特別是癌轉(zhuǎn)移)的組合物和方法。具體地，本發(fā)明的一個目的是提供用于診斷癌轉(zhuǎn)移行為的組合物和方法。這些目的通過權利要求書的主題來實現(xiàn)。本文所述研究證明，同時表達TPTE和CXCR4的癌癥與缺少至少一種這些分子的腫瘤相比，顯示出提高近30倍的轉(zhuǎn)移(特別是遠處轉(zhuǎn)移)風險。因此，這些標志物的組合可用于對癌癥患者的臨床預后進行評估，以及用于靶向性治療方法。因此，本發(fā)明涉及使得有可能對癌癥疾病、癌癥疾病的轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的發(fā)生進行評估和/或預后的方法。具體地，本發(fā)明的方法使得有可能對癌轉(zhuǎn)移(特別是遠處轉(zhuǎn)移)的發(fā)生進行評估和/或預后。9優(yōu)選地,本發(fā)明的方法允許區(qū)分惡性病癥和良性病癥。在一些具體的實施方案中，本發(fā)明的方法使得有可能對已施用或?qū)⑹┯玫陌┌Y療法的成功性進行評估和/或預后。具體地，本發(fā)明的方法使得有可能對癌癥治療(例如通過手術、化學治療和/或放射治療)后癌癥復發(fā)的發(fā)生進行評估和/或預后。在一個方面中，本發(fā)明涉及用于對患者中的癌癥、癌轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的出現(xiàn)進行診斷、監(jiān)測(即確定其消退、發(fā)展、病程和/或發(fā)病)和/或預后的方法，該方法包括定量和/或定性測定分離自所述患者的生物樣品中TPTE的表達水平以及定量和/或定性測定分離自所述患者的生物樣品中CXCR4的表達水平。在一個具體的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明在這一方面中涉及診斷患者是否具有癌轉(zhuǎn)移(特別是遠處轉(zhuǎn)移)的方法。在本發(fā)明方法的一些具體實施方案中，TPTE表達水平和CXCR4表達水平在同一樣品中同時或先后測定。在本發(fā)明方法的另一些實施方案中，TPTE表達水平和CXCR4表達水平在不同樣品中測定，其中所述不同樣品可以是同類樣品，例如它們可以是在相同或不同時間點從相同或不同身體部位取自該患者的血樣，或者可以是不同類的樣品，例如一種為血樣，另一種為尿樣。優(yōu)選地，與無癌癥、無癌癥風險、無癌轉(zhuǎn)移、無癌轉(zhuǎn)移風險、無癌癥復發(fā)和/或無癌癥復發(fā)風險的受試者中的表達水平相比，提高的TPTE表達水平和CXCR4表達水平指示了癌癥或癌癥可能性、癌轉(zhuǎn)移行為或癌轉(zhuǎn)移行為可能性和/或癌癥復發(fā)或癌癥復發(fā)可能性。優(yōu)選地，TPTE表達水平的定量和/或定性測定包括在分離自患者的生物樣品中(i)檢測或定量測定選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:l、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或矛汙生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物；和/或(m)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體；和/或(iv)檢測或定量測定對(ii)所迷蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物(任選地在與MHC分子的復合體中)具有特異性的T淋巴細胞。優(yōu)選地，所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。優(yōu)選地，CXCR4表達水平的定量和/或定性測定包括在分離自患者的生物樣品中(i)檢測或定量測定選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或f汙生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有筒并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)檢測或定量測定(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物；和/或(iii)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體；和/或(iv)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物(任選地在與MHC分子的復合體中)具有特異性的T淋巴細胞。優(yōu)選地，所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。用于實現(xiàn)所述定量和/或定性測定表達水平的工具在本文中描述，并且對于技術人員來說是顯然的。根據(jù)本發(fā)明，對核酸的檢測或定量測定可使用與所述核酸特異性雜交的寡核苷酸或多核苷酸探針來進行，或者可以通過選擇性擴增所述核酸(例如通過PCR法擴增)來進行。在一個實施方案中，所述探針包含所述核酸中6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續(xù)核普酸的序列，所述擴增中使用的引物各包含所述核酸中6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續(xù)核苷酸的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中對所述核酸的檢測或定量測定包括(i)將生物樣品與特異性結(jié)合該核酸的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定該試劑與該核酸之間復合體的形成。優(yōu)選地，所述與該核酸特異性結(jié)合的試劑為與所述核酸特異性雜交的寡核苷酸或多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，對蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的檢測或定量測定可使用與所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物特異性結(jié)合的抗體來進行。在一些具體實施方案中，本發(fā)明方法中待檢測或待測定其量的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物存在于與MHC分子的復合體中。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中對所述蛋白質(zhì)或肽或者所述其部分或衍生物的檢測或定量測定包括(i)將生物樣品與特異性結(jié)合該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物之間復合體的形成。優(yōu)選地，所述與該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物特異性結(jié)合的試劑是與所述蛋白質(zhì)或肽或者與所述其部分或衍生物特異性結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明，對抗體的檢測或定量測定可使用與所述抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽來進行。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中對所述抗體的檢測或定量測定包括(i)將生物樣品與特異性結(jié)合該抗體的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該抗體之間復合體的形成。優(yōu)選地，所述與該抗體特異性結(jié)合的試劑是與所述抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。根據(jù)本發(fā)明，對T淋巴細胞的檢測或定量測定可使用呈遞蛋白質(zhì)或肽與MHC分子之間復合體的細胞來進行，其中該T淋巴細胞對所述蛋白質(zhì)或肽具有特異性，其中所述細胞優(yōu)選為抗原呈遞細胞。對T淋巴細胞的檢測或定量測定還可通過檢測由蛋白質(zhì)或肽與MHC分子的復合體的特異性刺激所觸發(fā)的其增殖、細胞因子產(chǎn)生和/或細胞毒活性來進行，其中該T淋巴細胞對所述蛋白質(zhì)或肽具有特異性。對T淋巴細胞的檢測或定量測定還可借助于載有一種或多種蛋白質(zhì)或肽的重組MHC分子或者兩種或更多種MHC分子的復合體來進行。優(yōu)選地，對所述T淋巴細胞的檢測或定量測定包括(i)將生物樣品與特異性結(jié)合該T淋巴細胞的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該T淋巴細胞之間復合體的形成。優(yōu)選地，所述與該T淋巴細胞特異性結(jié)合的試劑是呈遞所述蛋白質(zhì)或肽或者所述其部分或衍生物與MHC分子之間復合體的細胞，其中該T淋巴細胞對所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性。本發(fā)明方法中用于檢測或定量測定的試劑(例如寡核苷酸或多核苷酸探針、抗體、蛋白質(zhì)或肽或者細胞)優(yōu)選地以可檢測方式標記，特別是以可檢測標志物或診斷物質(zhì)(如放射性標志物、熒光標志物或酶標志物)進行標記。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在第一時間點在第一樣品中測定表達水平，在第二時間點在另一樣品中測定表達水平，并比較這兩個樣品。優(yōu)選地，與先前取自患者的樣品相比，樣品中TPTE表達水平和CXCR4表達水平的提高表示該患者已發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生癌癥和/或癌轉(zhuǎn)移和/或癌癥復發(fā)。優(yōu)逸地，與先前取自患者的樣品相比，樣品中TPTE表達水平和CXCR4表達水平的降低表示所述患者中癌癥和/或癌轉(zhuǎn)移的消退，并因此優(yōu)選地表明癌癥治療的成功。在另一實施方案中，將分離自患者的生物樣品與正常生物樣品(例如分離自健康個體的樣品)進行比較。優(yōu)選地，與取自健康個體的樣品相比，患者樣品中TPTE表達水平和CXCR4表達水平的提高表示該患者已發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生癌癥和/或癌轉(zhuǎn)移和/或癌癥復發(fā)。對TPTE表達水平的測定還可包括測定選自以下的核酸的甲基化模式和/或甲基化程度(a)包含選自SEQIDNO:l、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或包含編碼含有選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽、其部分或衍生物(優(yōu)選位于其非編碼區(qū)中，更優(yōu)選位于其啟動子區(qū)中)之核酸序列的核酸。低于對照(例如無癌癥、無癌癥風險、無癌轉(zhuǎn)移、無癌轉(zhuǎn)移風險、無癌癥復發(fā)和/或無癌癥復發(fā)風險的受試者)的甲基化程度或者無甲基化優(yōu)選地指示TPTE表達水平的提高。對曱基化模式和/或甲基化程度的測定可例如通過使用基于PCR的方法、借助于限制性酶或通過測序來進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，在用含有亞硫酸氫鹽的試劑進行處理后選擇性擴增基因組DNA。用于這些擴增的寡核苷酸優(yōu)選地具有與經(jīng)含有亞硫酸氳鹽的試劑處理的核酸互補的序列，并優(yōu)選與其完全互補。優(yōu)選地，所述寡核苷酸適用于不同程度的核酸甲基化，并產(chǎn)生可區(qū)分的擴增產(chǎn)物。適用于此的一種測試可以為(1)從患者的組織樣品中提取DNA，例如使用石蠟包埋的材料，(2)用含有亞硫酸氫鹽的試劑處理該DNA(例如ClarkS丄等，NucleicAcidsRes.22(15):29卯-7,1994所述)，(3)通過PCR擴增DNA,以及(4)分析序列特異性擴增產(chǎn)物的量(例如通過定量PCR、雜交技術如微陣列法)。在本發(fā)明方法的一些具體實施方案中，患者患有癌癥、懷疑患有癌癥或發(fā)生了癌癥或者有發(fā)生癌癥的風險。在本發(fā)明方法的另一些實施方案中，患者具有癌轉(zhuǎn)移、懷疑具有癌轉(zhuǎn)移或正在發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，或者有發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的風險。在本發(fā)明方法的一些具體實施方案中，患者已經(jīng)接受了癌癥治療例如腫瘤切除、放射治療和/或化學治療，或者將要接受這些治療。本發(fā)明對癌癥、癌轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的出現(xiàn)進行診斷、監(jiān)測和/或預后的方法優(yōu)選允許對惡化的病程進行預后，從而使得有可能制定更為積極的療法等。這種預后方法還允許將仍為良性的改變(例如增生)與已被評定為不利的腫瘤前體劃分開來，從而在侵襲性胂瘤形成之前預測癌癥傾向。在另一個方面中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含用于在分離自患者的生物樣品中定量和/或定性測定TPTE表達水平的工具以及定量和/或定性測定CXCR4表達水平的工具。優(yōu)選地，該試劑盒可用于本發(fā)明對癌癥、癌轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的出現(xiàn)進行診斷、監(jiān)測和/或預后的方法中。用于定量和/或定性測定TPTE及CXCR4表達水平的工具如上文所述。優(yōu)選地，所述用于定量和/或定性測定TPTE表達水平的工具選自在分離自患者的生物樣品中(i)用于檢測或定量測定選自以下的核酸的工具(a)包含選自SEQIDNO:l、2、3、4、5、6和7之核酸序列、14其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及U)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)用于檢測或定量測定由(O所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(m)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體的工具；和/或(iv)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物(任選地在與MHC分子的復合體中)具有特異性的T淋巴細胞的工具。優(yōu)選地，所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。優(yōu)選地，所述用于定量和/或定性測定CXCR4表達水平的工具選自在分離自患者的生物樣品中(i)用于檢測或定量測定選自以下的核酸的工具(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及U)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)用于檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(m)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體的工具；和/或(iv)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物(任選地在與MHC分子的復合體中)具有特異性的T淋巴細胞的工具。優(yōu)選地，所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或^f生物；和/或所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。優(yōu)選地，所述用于檢測或定量測定所述核酸的工具包括與該核酸特異性結(jié)合的試劑。優(yōu)選地，所述與該核酸特異性結(jié)合的試劑是與所述核酸特異性雜交的寡核苷酸或多核苷酸。優(yōu)選地，所述用于檢測或定量測定蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具包括與所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物特異性結(jié)合的試劑。優(yōu)選地，所述與該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物特異性結(jié)合的試劑是與所述蛋白質(zhì)或肽或與所述其部分或衍生物特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，所述用于檢測或定量測定所述抗體的工具包括與該抗體特異性結(jié)合的試劑。優(yōu)選地，所述與該抗體特異性結(jié)合的試劑是與所述抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，所述用于檢測或定量測定所述T淋巴細胞的工具包括與該T淋巴細胞特異性結(jié)合的試劑。優(yōu)選地，所述與該T淋巴細胞特異性結(jié)合的試劑是呈遞蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物與MHC分子之間復合體的細胞，其中該T淋巴細胞對于所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物是特異性的。在另一個方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含(i)有效降低或抑制TPTE的表達或活性和/或與TPTE結(jié)合并具有肺瘤破壞或腫瘤抑制活性的試劑，和(ii)有效降低或抑制CXCR4的表達或活性和/或與CXCR4結(jié)合并具有肺瘤破壞或胂瘤抑制活性的試劑。術語"TPTE的活性，，和"CXCR4的活性，，涉及TPTE或CXCR4在細胞或生物體中的任何活性，例如酶活性或調(diào)節(jié)活性，特別是細胞遷移調(diào)控活性。優(yōu)選地，所述與TPTE或CXCR4結(jié)合并具有腫瘤破壞或肺瘤抑制活性的試劑分別對表達或異常表達TPTE或CXCR4的細胞具有特異性。優(yōu)選地，這樣的試劑包含治療性物質(zhì)。在本發(fā)明藥物組合物的一些實施方案中，所述試劑是與編碼TPTE的核酸選擇性雜交和/或與編碼CXCR4的核酸選擇性雜交的反義核酸。在另一些實施方案中，所述試劑是siRNA，其優(yōu)選包含有義RNA鏈和反義RNA鏈，其中所述有義及反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與TPTEmRNA中和/或CXCR4mRNA中約19至約25個連續(xù)核苷酸的乾序列基本一致的核苷酸序列。在另一些實施方案中，所述試劑是與TPTE和/或CXCR4選擇性結(jié)合的抗體。可以在本發(fā)明的藥物組合物中組合上述反義核酸、siRNA和/或抗體。在另一個方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含(I)一種或多種選自以下的組分(i)TPTE或其部分或衍生物，(ii)編碼TPTE或其部分或衍生物的核酸，(iii)與TPTE或其部分結(jié)合的抗體，(iv)與編碼TPTE的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對編碼TPTE之核酸的siRNA,(vi)表達TPTE或其部分或衍生物的宿主細胞，和(vii)TPTE或其部分或衍生物與MHC分子之間的分離的復合體；以及(II)一種或多種選自以下的組分(i)CXCR4或其部分或衍生物，(ii)編碼CXCR4或其部分或衍生物的核酸，(m)與CXCR4或其部分或衍生物結(jié)合的抗體，(iv)與編碼CXCR4的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對編碼CXCR4之核酸的siRNA，(vi)表達CXCR4或其部分或衍生物的宿主細胞，和(vii)CXCR4或其部分或衍生物與MHC分子之間的分離的復合體。在一個實施方案中，編碼TPTE或CXCR4或其部分或矛汙生物的核酸在上述藥物組合物中存在于表達載體中并與啟動子功能性連接。在另一實施方案中，存在于本發(fā)明藥物組合物中的宿主細胞分泌TPTE或CXCR4或其部分或衍生物、在表面上表達它們以及優(yōu)選地還表達與所述TPTE或CXCR4或其部分或衍生物結(jié)合的MHC分子。在一個實施方案中，所述宿主細胞內(nèi)源性表達該MHC分子。在另一實施方案中，所述宿主細Jf&以重組方式表達該MHC分子和/或TPTE或CXCR4或其部分或衍生物。該宿主細胞優(yōu)選為非增殖性細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞為抗原呈遞細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。在另一實施方案中，存在于本發(fā)明藥物組合物中的抗體是單克隆抗體。在另一實施方案中，所述抗體為嵌合抗體或人源化抗體、天然抗體的片段或合成抗體。存在于本發(fā)明藥物組合物中的反義核酸可包含編碼TPTE或其部分或衍生物的核酸和/或編碼CXCR4或其部分或衍生物的核酸中6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續(xù)核苷酸的序列。在另一些實施方案中，本發(fā)明藥物組合物中直接提供或通過核酸表達而提供的TPTE或CXCR4或其部分或f汴生物與細胞表面的MHC分子結(jié)合，所述結(jié)合優(yōu)選導致溶胞應答和/或誘導細胞因子的釋放。本發(fā)明藥物組合物中所包含的抗體可以與治療性物質(zhì)偶聯(lián)。在本發(fā)明藥物組合物中包含的針對編碼TPTE之核酸的siRNA的一些具體實施方案中，靶序列具有選自以下的核酸序列SEQIDNO:15的3-21位核普酸、SEQIDNO:18的3-21位核苷酸、SEQIDNO:21的3-21位核苷酸、SEQIDNO:24的3-21位核苷酸、SEQIDNO:27的3-21位核香酸、SEQIDNO:30的3-21位核苷酸、SEQIDNO:33的3-21位核普酸。在siRNA的另一些具體實施方案中，有義RNA鏈具有SEQIDNO:16的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:17的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:19的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:20的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:22的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:23的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:25的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:26的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:28的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:29的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:31的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:32的序列，或者有義RNA鏈具有SEQIDNO:34的序列且反義RNA鏈具有SEQIDNO:35的序列。本發(fā)明的藥物組合物可包含藥物相容性載體和/或輔藥。在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療或預防癌癥、癌轉(zhuǎn)移或癌癥復發(fā)的方法，其包括對患者施用(I)一種或多種選自以下的組分(i)TPTE或其部分或^f斤生物，(ii)編碼TPTE或其部分或^f生物的核酸，(iii)與TPTE或其部分結(jié)合的抗體，(iv)與編碼TPTE的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對編碼TPTE之核酸的siRNA，(vi)表達TPTE或其部分或衍生物的宿主細胞，和(vii)TPTE或其部分或衍生物與MHC分子之間的分離的復合體；以及(II)一種或多種選自以下的組分(i)CXCR4或其部分或衍生物，(ii)編碼CXCR4或其部分或衍生物的核酸，(iii)與CXCR4或其部分或衍生物結(jié)合的抗體，(iv)與編碼CXCR4的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對編碼CXCR4之核酸的siRNA,(vi)表達CXCR4或其部分或矛汴生物的宿主細胞，和(vii)CXCR4或其部分或衍生物與MHC分子之間的分離的復合體。本發(fā)明還涉及治療或預防癌癥、癌轉(zhuǎn)移或癌癥復發(fā)的方法，其包括施用本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，所述癌癥為肺腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺肺瘤、黑素瘤、結(jié)腸腫瘤、胃腫瘤、胰腺腫瘤、耳鼻喉(ENT)腫瘤、腎細胞癌或?qū)m頸癌、結(jié)腸癌或乳腺癌。優(yōu)選地，所述癌癥、癌轉(zhuǎn)移或癌癥復發(fā)的特征在于表達或異常表達以下分子(i)選自以下的核酸(a)包含選自SEOIDNO:1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其片段或衍生物；和/或(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其片段或衍生物。更優(yōu)選地，所述癌癥、癌轉(zhuǎn)移或癌癥復發(fā)的特征在于還表達或異常表達以下分子(i)選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其片段或矛廳生物；和/或(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其片段或衍生物。在本發(fā)明的方法中，所述藥物組合物優(yōu)選與放射療法、化學療法或手術組合施用，其中所述化學治療劑優(yōu)選地選自順鉑、卡鉑、環(huán)磷醜胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素和他莫昔芬。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中的受試者或患者為人。發(fā)明詳述本發(fā)明中有關TPTE或CXCR4的表述"測定表達水平"涉及測定TPTE基因或CXCR4基因之基因產(chǎn)物(核酸和蛋白質(zhì)/肽)的存在與否和/或絕對量和/或相對量。本發(fā)明中"測定表達水平"這一表述還包括檢測不到基因產(chǎn)物或者所述基因產(chǎn)物的量低于檢出限的情況。一般而言，適于檢測和分析核酸、蛋白質(zhì)和/或肽的所有方法都可用于在本發(fā)明方法中測定表達水平。例如，PCR、基因芯片/微陣列系統(tǒng)、Northern印跡、RNA酶保護測定(RDA)可用于檢測和分析核酸。用于檢測和分析蛋白質(zhì)和/或肽的合適的免疫學方法包括使用如抗體、抗體片段、受體、配體或?qū)﹄幕虻鞍踪|(zhì)具有特異性的其他結(jié)合劑進行的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA);夾層、直接、間接或竟爭性ELISA測定、酶聯(lián)免疫斑點測定(ELISPOT)、放射免疫測定(RIA)、流式細胞術測定(FACS,即熒光激活細胞分選)、免疫組織化學、Western印跡、熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)測定、蛋白質(zhì)芯片測定等等。根據(jù)本發(fā)明，術語"結(jié)合"優(yōu)選涉及特異性結(jié)合。"特異性結(jié)合"是指試劑(如抗體)與其特異性靶標(如表位)的結(jié)合強于與另一靶標的結(jié)合。如果試劑與第一靶標結(jié)合的解離常數(shù)(KD)低于與第二靶標的解離常數(shù)，則該試劑與第一靶標的結(jié)合強于與第二靶標的結(jié)合。優(yōu)選地，試劑與特異性結(jié)合之靼標的解離常數(shù)(KD)比該試劑與非特異性結(jié)合之靶標的解離常數(shù)(KD)低多于IO倍，優(yōu)選多于20倍，更優(yōu)選多于50倍，更優(yōu)選多于100倍、200倍、500倍或1000倍。根據(jù)本發(fā)明，可使用"參照，，如參照樣品或參照生物將本發(fā)明方法中得自測試樣品或測試生物(即患者)的結(jié)果進行關聯(lián)和比較。參照生物一般是健康生物，特別是未患癌癥、癌轉(zhuǎn)移和/或癌癥復發(fā)的生物?？赏ㄟ^測量足夠大量的參照而經(jīng)驗性地從參照中測得"參照值"。優(yōu)選地，通過測量至少2、優(yōu)選至少3、優(yōu)選至少5、優(yōu)選至少8、優(yōu)選至少12、優(yōu)選至少20、優(yōu)選至少30、優(yōu)選至少50或優(yōu)選至少100個參照來測得參照值。術語"TPTE，，涉及"具有張力蛋白同源性的跨膜磷酸酶，，，并包括TPTE的任何變體，特別是剪接變體、構象、同工型和物種同源物，它們由細胞天然表達，或者由轉(zhuǎn)染有TPTE基因的細胞表達。"測定TPTE的表達水平，，這一表述涉及測定TPTE核酸(如mRNA)的水平和/或測定TPTE蛋白的水平。優(yōu)選地，"TPTE的核酸"、"編碼TPTE的核酸，，或"TPTE基因"涉及選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有筒并性的核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸。該術語還可包括編碼TPTE的mRNA。優(yōu)選地，"TPTE"蛋白(或筒稱為"TPTE")包含由上述核酸編碼的氨基酸序列，優(yōu)選為選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。本領域技術人員會理解，如上述的TPTEcDNA序列與TPTEmRNA將是等同的，并可用于本發(fā)明的同樣目的，即產(chǎn)生抑制TPTE表達的siRNA。術語"TPTE"還包括人TPTE的翻譯后修飾變體、同工型和物種同源物，它們由細胞天然表達，或者由轉(zhuǎn)染有TPTE基因的細胞表達。術語"CXCR4"涉及"趨化因子(C-X-C基序)受體4",并包括CXCR4的任何變體，特別是剪接變體、構象、同工型和物種同源物，它們由細胞天然表達，或者由轉(zhuǎn)染有CXCR4基因的細胞表達。"測定CXCR4的表達水平，，這一表述涉及測定CXCR4的核酸(如mRNA)的水平和/或測定CXCR4蛋白的水平。優(yōu)選地，"CXCR4的核酸"、"編碼CXCR4的核酸"或"CXCR4基因，，涉及選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸。該術語還可包括編碼CXCR4的mRNA。優(yōu)選地，"CXCR4"蛋白(或簡稱為"CXCR4")包含由上述核酸編碼的氨基酸序列，優(yōu)選為選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。本領域技術人員會理解，如上述的CXCR4cDNA序列與CXCR4mRNA將是等同的，并可用于本發(fā)明的同樣目的，即產(chǎn)生抑制CXCR4表達的siRNA。術語"CXCR4"還包括人CXCR4的翻譯后修飾變體、同工型和物種同源物，它們由細胞天然表達，或者由轉(zhuǎn)染有CXCR4基因的細胞表達。根據(jù)本發(fā)明，核酸優(yōu)選是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根據(jù)本發(fā)明，核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組產(chǎn)生的分子及化學合成的分子。根據(jù)本發(fā)明，核酸可以作為單鏈或雙鏈的線性或共價環(huán)狀閉合分子存在。本發(fā)明的簡并性核酸是由于遺傳密碼的簡并性而在密碼子序列中與參照核酸存在差異的核酸。本發(fā)明的術語"核酸"還包括核酸的"衍生物"。根據(jù)本發(fā)明，核酸的"衍生物"指所述核酸中存在一個或多個(例如至少2個、至少4個或至少6個)并優(yōu)選多至3個、多至4個、多至5個、多至6個、多至10個、多至15個或多至20個核苷酸替換、缺失和/或添加。此外，術語"衍生物"還包括在核苷酸堿基、糖或磷酸上對核酸進行化學衍生。術語"衍生物"還包括含有非天然核苷酸及核普酸類似物的核酸。本發(fā)明所述核酸優(yōu)選是分離的。根據(jù)本發(fā)明，術語"分離的核酸"指該核酸是(0體外擴增的，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的，(iii)純化的，例如通過切割和凝膠電泳分級分離，或(iv)合成的，例如通過化學合成。分離的核酸是可用于通過重組DNA4支術進行操作的核酸。本文使用的術語"RNA"指包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。"核糖核苷酸"指p-D-呋喃糖部分的2，位帶有羥基的核苷酸。該術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA(例如部分純化的RNA、基本純化的RNA、合成RNA、重組產(chǎn)生的RNA)以及由于一個或多個核苷酸的添加、缺失、替換和/或改變而不同于天然RNA的改變的RNA。這樣的改變可包括添加非核苷酸的物質(zhì)，例如向RNA的末端或內(nèi)部添加，例如在RNA的一個或多個核苷酸處添加。RNA分子中的核苷酸還可包括非標準核苷酸，例如非天然核苷酸或化學合成的核苷酸或脫氧核普酸。這些改變的RNA可稱為天然RNA的類似物。本文使用的術語"互補性"或"互補"指核酸可通過常規(guī)的Watson-Crick相互作用或其他非常規(guī)類型的相互作用而與另一核酸形成氫鍵。就本發(fā)明所述核酸分子而言，核酸分子與其互補序列的結(jié)合自由能足以允許該核酸發(fā)揮相關功能，例如RNAi活性。例如，siRNA構建體中有義鏈與反義鏈之間的互補性程度可以與該siRNA反義鏈與耙標RNA序列之間的互補性程度相同或不同?；パa性百分比表示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(例如Watson-Crick堿基配對)的連續(xù)殘基的百分比(例如10個中有5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70°/。、80%、90%和100o/。互補)。"完全互補"指核酸序列的所有連續(xù)殘基與第二核酸序列中相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。優(yōu)選地，如果兩序列能彼此雜交并形成穩(wěn)定雙鏈體，雜交優(yōu)選在允許多核苷酸間發(fā)生特異性雜交的條件(嚴格條件)下進行，則核酸與另一核酸"互補"。嚴格條件描述于例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook等編輯，第二版,ColdSpringHarborLaboratorypress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubd等編輯,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,其是指例如在65C在雜交緩沖液(3.5xSSC、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5mMNaH2P04(pH7)、0.5%SDS、2mMEDTA)中雜交。SSC為0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉(pH7)。雜交后，清洗已轉(zhuǎn)移有DNA的膜，例如在室溫下用2xSSC清洗，接著在高至68"C的溫度用0.1-0.5xSSC/0.1xSDS清洗。優(yōu)選地，本發(fā)明的互補性程度為至少70%,優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少卯％，最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%。優(yōu)選地，本文所述特定核酸序列與作為該特定核酸序列之^t生物的核酸序列、與該特定核酸序列雜交和/或與該特定核酸序列具有簡并性的核酸序列之間的同一性程度將為至少70。/。，優(yōu)選至少75%,優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%或最優(yōu)選至少95%、96%、97°/。、98%或99%。同一性程度優(yōu)選在至少約30個、至少約50個、至少約70個、至少約90個、至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約1000個、至少約1500個或至少約2000個核苷酸的區(qū)域中給出。在一些優(yōu)選的實施方案中，同一性程度在參照核酸序列(例如序列表中給出的核酸序列)的全長中給出。"序列相似性"表示相同氨基酸或代表保守性氨基酸替換的氨基酸的百分比。兩多肽或兩核酸序列間的"序列同一性，，表示在所述序列之間相同的氨基酸或核苷酸的百分比。術語"同一性百分比"旨在表示待比較的兩序列之間在最佳比對后獲得的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比，該百分比純粹是統(tǒng)計學意義上的，兩序列間的差異隨機分布并分布在其全長上。兩核苷酸或氨基酸序列之間的序列比較常規(guī)地通過在將其最優(yōu)比對后比較其序列來進行，所述比較在區(qū)段或在"比較窗，，中進行，以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。除了手動進行比較以外，還可通過以下方法來為比較進行最優(yōu)序列比對Smith和Waterman,1981，AdsApp.Math.2，482的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、Pearson和Lipman,1988，Proc.NaftAcad.Sci.USA85，2444的相似性檢索法或者使用這些算法的計算機程序(WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wis)。同一性百分比如下計算測定兩個所比較序列之間相同位置數(shù)，用該數(shù)除以所比較的位置數(shù)并將所得結(jié)果乘以100，以獲得這兩個序列之間的同一性百分比。本文所述與靶序列(例如靶mRNA中含有的靼序列)"基本一致"的核酸序列是與該靶序列相同的核酸序列或者與該靶序列存在一個或多個核苷酸差異的序列。本文所述包含與靶序列基本一致之核酸序列的siRNA有義鏈的特征在于含有這樣有義鏈的siRNA誘導含有該靶序列的mRNA發(fā)生RNAi介導的降解。例如，siRNA可包含與靶序列存在一個、兩個、三個或更多個核苦酸差異的有義鏈，只要該siRNA誘導該靼mRNA發(fā)生RNAi介導的降解即可。根據(jù)本發(fā)明，核酸可單獨存在或者與同源或異源的其他核酸組合存在。在一些優(yōu)選的實施方案中，核酸與表達調(diào)控序列功能性連接，所述表達調(diào)控序列對于所述核酸而言可以是同源或異源的。術語"同源"指核酸還與表達調(diào)控序列具有天然的功能性連接，術語"異源"指核酸與表達調(diào)控序列不具有天然的功能性連接。如果核酸(例如表達RNA和/或蛋白質(zhì)或肽的核酸)與表達調(diào)控序列以所述核酸的表達或轉(zhuǎn)錄處于所述表達調(diào)控序列的調(diào)控或影響之下的方式彼此共價連接，則它們是"功能性"連接的。如果核酸待翻譯成功能性蛋白，則使用與編碼序列功能性連接的表達調(diào)控序列時，所述表達調(diào)控序列的誘導引起所述核酸的轉(zhuǎn)錄，而不導致該編碼序列的移碼或不導致所述編碼序列不能翻譯成期望的蛋白質(zhì)或肽。根據(jù)本發(fā)明，術語"表達調(diào)控序列"包括啟動子、核糖體結(jié)合位點、增強子以及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的其他調(diào)控元件。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述表達調(diào)控序列可受到調(diào)節(jié)。表達調(diào)控序列的確切結(jié)構可作為物種或細胞類型的函數(shù)而變化，但一般包含分別參與轉(zhuǎn)錄起始及翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄序列以及5，和3，非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具體地，5，非轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控序列包括啟動子區(qū)，其包含與核酸功能性連接的用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的啟動子序列。表達調(diào)控序列還可包含增強子序列或上游激活子序列。根據(jù)本發(fā)明，術語"啟動子"或"啟動子區(qū)"涉及這樣的核酸序列，其位于所表達核酸序列的上游(5，)，并通過提^RNA聚合酶的識別及結(jié)合位點來調(diào)控該序列的表達。"啟動子區(qū)，，還可包含參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的另一些因子的識別及結(jié)合位點。啟動子可調(diào)控原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。此外，啟動子可以為"誘導型，，，可應答于誘導劑而起始轉(zhuǎn)錄；或者可以為"組成型"，即轉(zhuǎn)錄不受誘導劑的調(diào)控。如果不存在誘導劑，則誘導型啟動子調(diào)控下的基因不表達或僅少量表達。在誘導劑存在時，基因被啟動，或者轉(zhuǎn)錄水平提高。這通常通過特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來介導。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括SP6、T3和T7聚合酶的啟動子；人U6RNA啟動子和CMV啟動子。根據(jù)本發(fā)明，術語"表達"以其最廣泛的含義使用，其包括產(chǎn)生RNA或者RNA和蛋白質(zhì)/肽。還包括核酸的部分表達。此外，表達可以瞬時進行或穩(wěn)定進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸分子根據(jù)本發(fā)明存在于載體中，其中適當時帶有調(diào)控該核酸表達的啟動子。本文使用的術語"載體，，以其最廣泛的含義使用，包括用于核酸的任何中間載體，其使得所述核酸可以例如引入原核和/或真核細胞中并在適當時整合進基因組中。這類載體優(yōu)選在所述細胞中復制和/或表達。載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文使用的術語"質(zhì)粒"一般涉及可獨立于染色體DNA復制的染色體外遺傳物質(zhì)構建體，通常為環(huán)狀DNA雙鏈體。根據(jù)本發(fā)明，術語"宿主細胞"涉及可用外源核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何細胞。本發(fā)明的術語"宿主細胞"包括原核細胞(如大腸桿菌(Eco//))或真核細胞(例如哺乳動物細胞，特別是人細胞、酵母細胞和昆蟲細胞)。特別優(yōu)選哺乳動物細胞，例如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊或靈長類的細胞。細胞可來自多種組織類型，并包括靈長類細胞和細胞系。具體實例包括角質(zhì)形成細胞、外周血白細胞、骨髓干細胞及胚胎干細胞。在另一些實施方案中，宿主細胞為抗原呈遞細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。核酸可以以單拷貝或者兩個或更多拷貝的形式存在于宿主細胞中，在一個實施方案中，其在宿主細胞中表達。在本發(fā)明中MHC分子呈遞蛋白質(zhì)或肽的情況下，表達載體還可包含編碼所述MHC分子的核酸序列。編碼所述MHC分子的核酸序列可與編碼所述蛋白質(zhì)或肽的核酸存在于同一表達載體中，或者這兩種核酸可存在于不同的表達載體中。在后一種情況下，可將這兩種表達載體共轉(zhuǎn)染進細胞中。如果宿主細胞既不表達所述蛋白質(zhì)或肽也不表達MHC分子，則可在同一表達載體中或不同表達載體中將編碼它們的兩種核酸轉(zhuǎn)染進該細胞中。如果細胞已表達MHC分子，'則可以僅將編碼所述蛋白質(zhì)或肽的核酸序列轉(zhuǎn)染進該細胞中?？赏ㄟ^擴增核酸來檢測或定量測定所述核酸。核酸擴增可使用與該核酸雜交的一對擴增引物(即寡核苷酸)來進行。引物優(yōu)選包含該核酸中6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續(xù)核苷酸的序列并且不重疊，以避免形成引物二聚體。其中一條引物將與待擴增核酸的一條鏈雜交，而另一引物將以允許該核酸擴增的方式與互補鏈雜交?？墒褂?反義分子"或"反義核酸"來調(diào)節(jié)(特別是降低)核酸表達。本發(fā)明的術語"反義分子"或"反義核酸"指在生理條件下與包含特定基因的DNA或與所述基因的mRNA雜交從而抑制所述基因轉(zhuǎn)錄和/或所述mRNA翻譯的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，"反義分子"還包括含有相對于其天然啟動子而言為倒置取向的核酸或其部分的構建體。核酸或其部分的反義轉(zhuǎn)錄物可與特定蛋白質(zhì)的天然mRNA形成雙鏈體，從而阻止mRNA累積或翻譯成蛋白質(zhì)。另一種可能是使用使核酸失活的核酶。本發(fā)明優(yōu)選的反義寡核苷酸具有靶核酸中6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續(xù)核苷酸的序列，并優(yōu)選與靶核酸或與其部分完全互補。在一些優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸與N端或5，上游位點(如翻譯起始位點、轉(zhuǎn)錄起始位點或啟動子位點)雜交。在另一些實施方案中，反義寡核苷酸與3，非翻譯區(qū)或mRNA剪接位點雜交。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸可以是寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、修飾的寡核糖核苷酸或修飾的寡脫氧核糖核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸由核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其組合組成，其中一個核苷酸的5'末端與另一核苷酸的3，末端通過磷酸二酯鍵彼此連接。這些寡核苷酸可以常規(guī)方式合成，或者可以重組產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸為"^f務飾的"寡核苷酸。這時，可以不同的方式來修飾寡核苷酸而不破壞其結(jié)合其靶標的能力，從而提高例如其穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，術語"修飾的寡核苷酸"指這樣的寡核苷酸，其中(i)其至少兩個核苷酸通過合成的核苷間鍵(即并非磷酸二酯鍵的核苷間鍵)彼此連接，和/或(ii)通常不存在于核酸中的化學基團與該寡核苷酸連接。優(yōu)選的合成的核苷間鍵為硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯和肽。術語"修飾的寡核苷酸"還包括具有一個或多個共價修飾的堿基和/或一個或多個共價修飾的糖的寡核苷酸。例如，"修飾的寡核苷酸"包括帶有這樣的糖殘基的寡核苷酸，所述糖殘基與低分子量有機基團共價連接，而非在3，位與羥基共價連接并在5，位與磷酸基共價連接。例如，修飾的寡核苷酸可包括2，-0-烷基化核糖殘基或者代替核糖的另一種糖(如阿拉伯糖)。本文使用的"小干擾RNA"或"siRNA"指用于識別待降解的耙基因或mRNA的分離的RNA分子，優(yōu)選長度大于10個核苷酸，更優(yōu)選長度大于15個核苷酸，最優(yōu)選長度為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。19-25個核苷酸對于siRNA來說是最優(yōu)選的。本發(fā)明的siRNA可包括部分純化的RNA、基本純化的RNA、合成RNA或重組產(chǎn)生的RNA以及由于一個或多個核苷酸的添加、缺失、替換和/或改變而區(qū)別于天然RNA的改變的RNA。這樣的改變可包括添加非核苷酸的物質(zhì)，例如向siRNA的末端或者向siRNA的一個或多個內(nèi)部核苷酸添加；修飾以使siRNA抵抗核酸酶消化(例如，使用2，-取代的核糖核苷酸或修飾糖-磷酸骨架)；或者用脫氧核糖核苷酸替換該siRNA中的一個或多個核苷酸。此外，可以如上文修飾寡核苷酸所述修飾siRNA以提高其穩(wěn)定性，特別是引入一個或多個硫代磷酸酯鍵。siRNA的一條或兩條鏈可包含3，突出端。本文使用的"3，突出端"是指RNA鏈3，末端伸出的至少一個未配對核苷酸。因此在一個實施方案中，siRNA包含至少一個3，突出端，其長度為1至約6個核苷酸(包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，優(yōu)選長度為1至約5個核苷酸，更優(yōu)選長度為1至約4個核苷酸，尤其優(yōu)選長度為約2至約4個核苷酸。在siRNA分子的兩條鏈均包含3，突出端的實施方案中，每條鏈的突出端長度可以相同或不同。在一個最優(yōu)選的實施方案中，siRNA的兩條鏈上均存在3，突出端，并且長度為2個核苷酸。例如，本發(fā)明siRNA的每條鏈可包含二脫氧胸苷酸("TT")或二尿苷酸("im，，)的3'突出端。為了增強siRNA的穩(wěn)定性，還可以對3，突出端進行穩(wěn)定以避免降解。在一個實施方案中，通過包含嘌呤核苷酸(如腺苷或鳥苷核苷酸)來穩(wěn)定突出端?；蛘?，用經(jīng)修飾的類似物替換嘧咬核苷酸(例如用2，-脫氧胸苷替換3，突出端中的尿苷核苷酸)是可以耐受的，并且不影響RNAi降解的效率。特別地，2，-脫氧胸苷中缺少2，-羥基顯著增強了該3，突出端在組織培養(yǎng)基中的核酸酶抗性。siRNA的有義及反義鏈可包含兩個互補的單鏈RNA分子，或者可包含單個分子，其中兩個互補區(qū)堿基配對并通過單鏈"發(fā)夾"區(qū)共價連接。也就是說，有義區(qū)和反義區(qū)可通過連接分子共價連接。該連接分子可以是多核苷酸或非核苷酸連接。不限于任何理論，相信后一類型siRNA分子的發(fā)夾區(qū)在細胞內(nèi)被"Dicer"蛋白(或其等價物)切割形成兩條單獨堿基配對RNA分子的siRNA。本文使用的"靼mRNA"是指作為下調(diào)靶標的RNA分子。本領域才支術人員會理解，cDNA序列等同于mRNA序列，并且可用于本文的相同目的，例如產(chǎn)生siRNA。本文使用的與人TPTE或CXCR4"同系(cognate)"的基因或mRNA是來自其他哺乳動物物種的與人TPTE或CXCR4同源的基因或mRNA?？梢允褂帽绢I域熟知的技術來分析轉(zhuǎn)錄自人TPTE或CXCR4基因的mRNA的選擇性剪接形式。這些技術包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、northern印跡和原位雜交。稱為"RNA酶保護"的技術也可用于鑒定選擇性剪接的TPTEmRNA或CXCR4mRNA。RNA酶保護涉及將基因序列轉(zhuǎn)錄成與來自其他細胞(例如誘導表達TPTE的細胞)之RNA雜交的合成RNA。接著，將雜交的RNA與識別RNA:RNA雜交錯配的酶一起孵育。比預計的片段更小表示存在選擇性剪接的mRNA?？梢酝ㄟ^本領域技術人員熟知的方法克隆并測序推定的選擇性剪接mRNA。也可使用RT-PCR來鑒定選擇性剪接的TPTEmRNA或CXCR4mRNA。在RT-PCR中，使用本領域技術人員熟知的方法，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將來自已知表達TPTE或CXCR4的細胞的mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA。接著使用位于3，非翻譯區(qū)的正向引物和位于5，非翻譯區(qū)的反向引物，通過PCR擴增該cDNA的完整編碼序列?？煞治鰯U增產(chǎn)物的選擇性剪接形式，例如通過將擴增產(chǎn)物的大小與正常剪接mRNA的預計產(chǎn)物的大小進行比較(例如通過瓊脂糖凝膠電泳來實現(xiàn))。擴增產(chǎn)物大小的任何改變都可能指示選擇性剪接。還可以使用上述用于鑒定選擇性剪接形式的技術來容易地鑒定突變體TPTE或CXCR4基因產(chǎn)生的mRNA。本文使用的"突變體"TPTE或CXCR4基因或mRNA包括序列不同于本文所述TPTE或CXCR4序列的人TPTE或CXCR4基因或mRNA。因此，TPTE或CXCR4的等位基因形式以及由它們產(chǎn)生的mRNA都認為是用于本發(fā)明目的的"突變體"。本文使用的"降低"或"抑制"指導致蛋白質(zhì)或mRNA的水平與參照樣品(如未經(jīng)siRNA處理的樣品)相比總體降低的能力，優(yōu)選降低20%或更多，更優(yōu)選降低50%或更多，最優(yōu)選降低75%或更多。這種RNA或蛋白質(zhì)表達的降低或抑制可通過靶向mRNA切割或降解而發(fā)生。蛋白質(zhì)表達或核酸表達的測定為本領域已知，包括例如用于蛋白質(zhì)表達的ELISA、western印跡分析以及用于RNA的northern印跡或RNA酶保護測定?？梢詮木酆厦窱II(polIII)來表達載體表達siRNA而不改變耙位點，因為認為從聚合酶III啟動子開始的RNA表達僅在第一個轉(zhuǎn)錄的核苷酸是噤呤時才有效。本發(fā)明的siRNA可靶向任何靶mRNA序列("靶序列")中任何約19-25個連續(xù)核苷酸的節(jié)段。選擇siRNA乾序列的技術在例如TuschlT.等，"ThesiRNAUserGuide(siRNA用戶指南)",2002年10月11日修訂版中給出，其全部>^開內(nèi)容均以參考方式并入本文。"siRNA用戶指南，，在互聯(lián)網(wǎng)上由ThomasTuschl博士，RNA分子生物學實驗室,RockefellerUniversity,NewYork,USA維護的站點上提供，并可通過進入RockefellerUniversity網(wǎng)站并搜索關鍵詞"siRNA，，而找到。因此，本發(fā)明siRNA的有義鏈包含與耙mRNA中任何約19至約25個核苷酸的連續(xù)節(jié)段基本一致的核苷酸序列。一般而言，靶mRNA中的乾序列可從對應于該靶mRNA的給定cDNA序列中選擇，優(yōu)選從起始密碼子下游(即3，方向)50至100nt開始。然而，靶序列可以位于5，或3，非翻譯區(qū)中，或者位于起始密碼子附近的區(qū)域中。例如，TPTEcDNA中合適的乾序列選自以下靼序列組(i)TCGGTACTTGATAACATTACA(SEQ工DNO:15)(i幻CAGACTTGTGTTATTCTAGCA(SEQIDNO:18)(iii)CTGAAATATGTTCAACTGCAA(SEQIDNO:21)(iv)CAGATTGGCAACCAAGACTAA(SEQIDNO:24)(v)AACCCTGCCACATGTTCATAT(SEQIDNO:27)(vi)AATGACAGTCCACAGACAAGT(SEQIDNO:30)(vii)AAGCTGATAAGAAGGCGGGTT(SEQIDNO:33)靶向序列(i)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選s腦A為gguacuugauaacauuacaTTAGccaugaacuauuguaaugu靶向序列(ii)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選siRNA為gacuuguguuauucuagcaTTGTcugaacacaauaagaucgu靶向序列(m)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選siRNA為gaaauauguucaacugcaaTTGAcuuuauacaaguugacguu靶向序列(iv)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選siRNA為gaimggcaaccaagacuaaTTGTcuaaccguugguucugauu靶向序列(v)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選siRNA為cccugccacauguucauauTTTTgggacgguguacaaguaua靶向序列(vi)并在每條鏈上具有3，突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選siRNA為、ugacaguccacagacaaguTTTTacugucaggugucuguuca靶向序列(vii)并在每條鏈上具有3'突出端(突出端以粗體顯示)的優(yōu)選s歸A為gcugauaagaaggcggguuTTTTcgacuauucuuccgcccaa在以上列表中，核酸序列中的所有脫氧核糖核苷酸均以大寫字母表示(例如脫氧胸苷為"T，，)，核酸序列中的核糖核苷酸以小寫字母表示(例如尿苷為"u，，)。應該理解，本文給出的耙序列是參考人TPTEcDNA給出的，因此這些序列含有以"T"表示的脫氧胸普。本領域技術人員會理解，在TPTEmRNA的實際靶序列中，脫氧胸苷將被尿苷("u")替代。同樣，本發(fā)明siRNA中包含的靶序列也將含有替代脫氧胸苷的尿苷?？墒褂帽绢I域技術人員已知的多種技術來獲得siRNA。例如，可使用本領域技術人員已知的方法來化學合成或重組產(chǎn)生siRNA，例如Tuschl等的美國公開申請2002/0086356中描述的果蠅體外系統(tǒng)，其全部公開內(nèi)容以參考方式并入本文。優(yōu)選地，使用經(jīng)適當保護的核糖核普亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀來化學合成siRNA。siRNA可以作為兩個獨立的互補RNA分子而合成，或者作為帶有兩個互補區(qū)的單個RNA分子而合成?；蛘?，還可以使用任何合適的啟動子從重組的環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒中表達siRNA。用于從質(zhì)粒中表達本發(fā)明siRNA的合適的啟動子包括例如U6或HlRNA聚合酶III的啟動子序列以及巨細胞病毒啟動子。選擇其他合適的啟動子在本領域技術范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可包含用于在特定組織或在特定的胞內(nèi)環(huán)境中表達siRNA的誘導型或調(diào)節(jié)型啟動子。從重組質(zhì)粒中表達的siRNA可通過標準技術從培養(yǎng)的細胞表達系統(tǒng)中分離，或者可以胞內(nèi)表達。下文將更詳細地討論使用重組質(zhì)粒將siRNA體內(nèi)遞送至細胞。siRNA可以作為兩個獨立的互補RNA分子或作為帶有兩個互補區(qū)的單個RNA分子從重組栽體中表達。選擇適于表達siRNA的質(zhì)粒、用于將表達siRNA的核酸序列插入該質(zhì)粒的方法以及將重組質(zhì)粒遞送至目的細胞的方法在本領域^支術范圍之內(nèi)。還可以在體內(nèi)從重組病毒載體胞內(nèi)表達siRNA。所述重組病毒載體包含編碼該siRNA的序列以及用于表達該siRNA的任何適當?shù)膯幼?。所述重組病毒載體還可包含用于在特定組織或在特定胞內(nèi)環(huán)境中表達siRNA的"i秀導型或調(diào)節(jié)型啟動子。下文更詳細地討論了使用重組病毒載體將siRNA體內(nèi)遞送至細胞。siRNA可以作為兩個獨立的互補RNA分子或作為帶有兩個互補區(qū)的單個RNA分子從重組病毒載體中表達。根據(jù)本發(fā)明，術語"肽"是指包含通過^鍵共價連接的兩個或更多個(優(yōu)選3個或更多個，優(yōu)選4個或更多個，優(yōu)選6個或更多個，優(yōu)選8個或更多個，優(yōu)選10個或更多個，優(yōu)選13個或更多個，優(yōu)選16個或更多個，優(yōu)選20個或更多個，直至優(yōu)選8、10、20、30、40或50特別是100個)氨基酸的物質(zhì)。術語"蛋白質(zhì)"是指大的肽，優(yōu)選具有多于IOO個氨基酸殘基的肽，但一般而言，術諶"肽"和"蛋白質(zhì)"在本申請中是同義的并可互換使用。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)和肽已被分離。術語"分離的蛋白質(zhì)，，或"分離的肽"指該蛋白質(zhì)或肽已從其天然環(huán)境中分離出來。分離的蛋白質(zhì)或肽可以為基本純化的狀態(tài)。術語"基本純化的"指該蛋白質(zhì)或肽基本不含在自然界或體內(nèi)與其相關的其他物質(zhì)。例如，這樣的蛋白質(zhì)和肽可用于產(chǎn)生抗體以及用于免疫和診斷測定。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)和肽可從生物樣品(如組織或細胞勻漿)中分離，也可在多種原核或真核表達系統(tǒng)中重組表達。就本發(fā)明的目的而言，蛋白質(zhì)或肽或者氨基酸序列的"衍生物"包括氨基酸插入變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。氨基酸插入變體包括氨基和/或羧基端融合以及在特定氨基酸序列中一個、兩個或多個氨基酸的插入。對于含有插入的氨基酸序列變體的情形，一個或多個氨基酸殘基被插入氨基酸岸列的特定位點中，但也可以隨機插入并對所得產(chǎn)物進行適當篩選。氨基酸缺失變體的特征在于從該序列中去除了一個或多個氨基氨基酸替換變體的特征在于去除了該序列中至少一個殘基并在其位置插入另一殘基。優(yōu)選地，該修飾位于氨基酸序列中在同源蛋白質(zhì)或肽之間不保守的位置中和/或?qū)被崽鎿Q為具有相似特性(如疏水性、親水性、電負性、側(cè)鏈體積等)的其他氨基酸(保守性替換)。例如，保守性替換涉及將一個氨基酸替換為下表中與該待替換氨基酸在同一組中的氨基酸。1.非極性或弱極性的小脂肪殘基Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)2.帶負電的殘基及其酰胺Asn、Asp、Glu、Gln3.帶正電的殘基His、Arg、Lys4.非極性的大脂肪殘基Met、Leu、Ile、Val(Cys)5.大芳香殘基Phe、Tyr、Trp。由于在蛋白質(zhì)結(jié)構中的特殊作用，三種殘基在括號中顯示。Gly是惟一沒有側(cè)鏈并因而賦予鏈以柔性的殘基。Pro具有對鏈產(chǎn)生很大限制的不常見的幾何構造。Cys可形成二硫橋。優(yōu)選地，本文所述特定氨基酸序列與作為所述特定氨基酸序列之衍生物的序列之間的相似性程度為至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少卯％，最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%。相似性或同一性的程度優(yōu)選針對至少約10、至少約20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400或500個氨基酸的區(qū)域而給出。在一些優(yōu)選的實施方案中，相似性或同一性程度針對參照氨基酸序列的全長而給出。上述氨基酸變體可借助于已知的肽合成技術(例如固相合成(Merrifield,1964)及類似技術)或通過重組DNA操作而容易地制備。用于制備含有替換、插入或缺失的蛋白質(zhì)和肽的DNA序列操作詳細描述于例如Sambrook等(1989)。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)和肽的"衍生物"還包括該蛋白質(zhì)或肽中任34意相關分子(例如碳水化合物、脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)或肽)的一個或多個替換、缺失和/或添加。術語"衍生物，，還擴展至所述蛋白質(zhì)和肽的所有功能性化學等同物，它們不僅含有氨基酸組分，還含有非氨基酸組分如糖和磷酸結(jié)構；還擴展至含有諸如酯鍵、硫醚鍵和二硫鍵等鍵的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)或肽的部分或片段優(yōu)選具有其來源蛋白質(zhì)或肽的功能特性。這樣的功能特性包括與抗體相互作用以及與其他肽或蛋白質(zhì)相互作用。一個具體特性是能與MHC分子形成復合體，并且適當時產(chǎn)生免疫應答，優(yōu)選通過刺激細胞毒細胞或T輔助細胞來產(chǎn)生。蛋白質(zhì)或肽的部分或片段優(yōu)選包含該蛋白質(zhì)或肽中至少6個、特別是至少8個、至少10個、至少12個、至少15個、至少20個、至少30個并優(yōu)選多至8個，特別是多至10個、多至12個、多至15個、多至20個、多至30個或多至50個連續(xù)氨基酸的序列。編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸的部分或片段優(yōu)選涉及該核酸中至少編碼上述蛋白質(zhì)或肽和/或所述蛋白質(zhì)或肽的部分或片段的部分。編碼蛋白質(zhì)或肽之核酸的部分或片段優(yōu)選為該核酸中對應于開放讀碼框的部分?？梢酝ㄟ^多種標準方法來制備含有特異性結(jié)合靶蛋白的特異性抗體的抗血清,參閱例如"MonoclonalAntibodies:APracticalApproach"PhilipShepherd,ChristopherDeanISBN0-19-963722-9;"Antibodies:ALaboratoryManual"EdHarlow,DavidLane,ISBN:0879693142以及"UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO"EdwardHarlow，DavidLane，EdHarlowISBN0879695447。由此還可以產(chǎn)生識別天然形式復雜膜蛋白的親合(affme)的特異性抗體(Azorsa等，J.Immunol.Methods229:35-48，199&Anderson等，J.Immunol.143:1899畫1卯4,1989;Gardsvoll,J.Immunol.Methods234:107-116,2000)。這不僅特別適用于制備治療性應用的抗體，也適用于許多診斷性應用。就此而言，可以用完整蛋白質(zhì)、胞外部分序列以及用表達生理折疊形式的靶分子的細胞來進行免疫。常規(guī)地使用雜交瘤技術來制備單克隆抗體(技術細節(jié)參閱"MonoclonalAntibodies:APracticalApproach"PhilipShepherd,ChristopherDeanISBN0-19-963722-9;"Antibodies:ALaboratoryManual"EdHarlow,DavidLaneISBN:0879693142;"UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO"EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlowISBN:0879695447)。已知抗體分子中僅有一小部分(互補位(parat叩e))參與該抗體與其表位的結(jié)合(參閱Clark,W.R.(1986),r/ie五x/;w/附wto/i^wwto/冊s/附附《腳/柳,Wiley&Sons,Inc"NewYork;Roitt，I.(1991),￡^w&Vi//附柳MWo/o^v，第七版,BlackwellScientificPublications,Oxford)。例如，pFc，和Fc區(qū)是補體級聯(lián)的效應物，但不參與抗原結(jié)合。已酶促去除pFc，區(qū)或以無pFc，區(qū)方式產(chǎn)生的抗體(稱為F(ab，)2片段)帶有完整抗體的兩個抗原結(jié)合位點。類似地，已酶促去除Fc區(qū)或以無所述Fc區(qū)方式產(chǎn)生的抗體(稱為Fab片段)帶有完整抗體分子的一個抗原結(jié)合位點。此外，F(xiàn)ab片段由共價結(jié)合的抗體輕鏈和所述抗體的部分重鏈(稱為Fd)組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定簇(一個Fd片段可與多達10種不同輕鏈相關聯(lián)，而不改變抗體的特異性)，分離的Fd片段保留了與表位結(jié)合的能力。位于抗體的抗原結(jié)合部分中的是與抗原表位直接相互作用的互補決定區(qū)(CDR)以及維持該互補位三級結(jié)構的構架區(qū)(FR)。IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段及輕鏈都包含4個構架區(qū)(FR1至FR4)，它們各自被3個互補決定區(qū)(CDRl至CDR3)分隔開。CDR特別是CDR3區(qū)(更特別地為重鏈的CDR3區(qū))在很大程度上決定了抗體特異性。已知哺乳動物抗體的非CDR區(qū)可以替換為具有相同或不同特異性的抗體的相似區(qū)域，而保留原始抗體的表位特異性。這使得有可能開發(fā)出"人源化"抗體，其中非人CDR與人FR和/或Fc/pFc，區(qū)共價連接而產(chǎn)生功能性抗體。作為另一實例，WO92/04381描述了人源化小鼠RSV抗體的產(chǎn)生和使用，其中至少一部分小鼠FR區(qū)被替換為人源的FR區(qū)。這類抗體(包括具有抗原結(jié)合能力的完整抗體之片段)常稱為"嵌合，，抗體。才艮據(jù)本發(fā)明，術語"抗體"還包括抗體的F(ab，)2、Fab、Fv以及Fd片段；Fc和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已替換為同源的人或非人序列的嵌合抗體；FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已替換為同源的人或非人序列的嵌合F(ab，)2片段抗體；FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已替換為同源的人或非人序列的嵌合Fab片段抗體；以及FR和/或CDR1和/或CDR2區(qū)已替換為同源的人或非人序列的嵌合Fd片段抗體。術語"抗體"還包括"單鏈"抗體?？贵w還可以與用于展示表達特定蛋白質(zhì)或肽的細胞及組織的特定診斷性物質(zhì)偶聯(lián)。診斷性物質(zhì)包括發(fā)揮以下功能的任何標記(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記相互作用以改變該第一或第二標記所提供的可檢測信號，例如FRET(熒光共振能轉(zhuǎn)移)；(m)通過電荷、疏水性、形狀或其他物理參數(shù)而影響遷移率，例如電泳遷移率；或(iv)提供捕獲部分，例如親和力、抗體/抗原或離子絡合。適于作為標記的是諸如以下的結(jié)構熒光標記、發(fā)光標記、生色團標記、放射性同位素標記、同位素標記(優(yōu)選穩(wěn)定同位素標記)、同量異位標記、酶標記、顆粒標記(特別是金屬顆粒標記、磁性顆粒標記、聚合物顆粒標記)、有機小分子如生物素、受體的配體或結(jié)合分子(如細胞粘附蛋白或凝集素)、包含可使用結(jié)合劑檢測的核酸和/或氨基酸殘基的標記序列等。診斷性物質(zhì)包括但不僅限于硫酸鋇、碘西他酸(iocetamicacid)、碘番酸、碘泊酸鉤(calciumipodate)、泛影酸鈉、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸鈉以及放射性診斷劑包括正電子發(fā)射體如氟-18和碳-11、y發(fā)射體如碘-123、锝-99m、碘-131和銦-111,用于核磁共振的核素如氟和釓?？贵w還可以與特定的治療性物質(zhì)偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明，術語"治療性物質(zhì)"指發(fā)揮治療效果的任何分子。根據(jù)本發(fā)明，治療性物質(zhì)優(yōu)選地選擇性導向至患病細胞，并包括抗癌劑、放射性碘標記的化合物、毒素、細胞抑制藥物或細胞裂解藥物等。例如，抗癌劑包括氨魯米特(aminoglutethimide)、硫唑噪呤、硫酸博來霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、阿糖胞苷(cytarabidine)、達卡巴嚷、更生霉素、柔紅霉素(daunorubin)、多柔比星、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干擾素-a、洛莫司汀、巰噤呤、氨甲喋呤、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、硫鳥嘌呤、硫酸長春堿和硫酸長春新堿。其他抗癌劑描述于例如Goodman和GHman，"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",第八版，1990，McGraw-Hill,Inc.,特另'J是第52章(AntineoplasticAgents(PaulCalabresiandBruceA.Chabner)。毒素可以是蛋白質(zhì)如美洲商陸抗病毒蛋白、霍亂毒素、百曰咳毒素、蓖麻毒素、白樹毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或假單胞菌(/^^/^7附rfms)夕卜毒素。毒素殘基(toxinresidue)還可以是高能發(fā)射的放射性核素，例如鈷-60。術語"主要組織相容性復合體，，或"MHC"涉及存在于所有脊推動物中的基因復合體。MHC蛋白或分子在正常免疫反應中通過與肽結(jié)合并呈遞它們用于T細胞受體(TCR)識別而參與淋巴細胞與抗原呈遞細胞之間的信號傳導。MHC分子結(jié)合胞內(nèi)加工區(qū)室內(nèi)的肽并將這些肽呈遞于抗原呈遞細胞的表面以用于T細胞識別。人MHC區(qū)也稱為HLA，其位于6號染色體上，包括I類和II類區(qū)。在本發(fā)明所有方面的一個優(yōu)選實施方案中，MHC分子為HLA分子。本發(fā)明的術語"患者，，或"受試者，，指人、非人靈長類或其他動物，特別是哺乳動物如牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物(如小鼠和大鼠)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，患者為人。本發(fā)明的"異常表達，，指與健康個體中的情況相比表達發(fā)生了改變，優(yōu)選為提高。根據(jù)本發(fā)明，術語"提高的"或"量增加的，，優(yōu)選指提高至少10%，特別是至少20%、至少50%或至少100%。如果物質(zhì)在測試樣品中可檢測到而在參照樣品中不存在或檢測不到，則測試樣品中該物質(zhì)的量(例如生物樣品)與參照樣品相比也是提高的。根據(jù)本發(fā)明，術語"疾病"是指任何病理狀況，特別是包括癌癥，其中本發(fā)明的術語"癌癥，，包括白血病、精原細胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神經(jīng)母細胞瘤、膠質(zhì)瘤、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、血癌、皮膚癌、腦癌、宮頸癌、腸癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、腸癌、頭頸癌、胃腸癌、淋巴結(jié)癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌及其轉(zhuǎn)移癌。其實例為肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、宮頸癌或者上述癌癥類型或腫瘤的轉(zhuǎn)移癌。本發(fā)明的術語"癌癥"還包括癌轉(zhuǎn)移癌。"腫瘤"指通過失控的快速細胞增殖而生長并在起始該新生長的刺激停止后繼續(xù)生長的異常細胞或組織群。腫瘤顯示部分或完全缺少結(jié)構組織以及與正常組織的功能協(xié)調(diào)，并且通常形成可為良性或惡性的獨立的組織塊。"轉(zhuǎn)移"是指癌細胞從其原始部位擴散到機體的其他部位。轉(zhuǎn)移的形成是非常復雜的過程，其依賴于惡性細胞從原發(fā)腫瘤上脫落，侵入細胞外基質(zhì)，穿透內(nèi)皮基底膜i^體腔和血管，然后通*液轉(zhuǎn)運，滲入耙器官。最后，靼部位新胂瘤的生長依賴于血管發(fā)生。即使在已移除原發(fā)腫瘤后仍常常發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，這是因為腫瘤細胞或組分可能保留并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移的潛力。在一個實施方案中，本發(fā)明的術語"轉(zhuǎn)移"涉及"遠處轉(zhuǎn)移，，，其表示距離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)^i^的轉(zhuǎn)移。術語"復發(fā)"涉及患者在病情好轉(zhuǎn)后(例如在諸如腫瘤切除、化學治療和/或放射治療后)再次出現(xiàn)疾病的體征和癥狀。具體而言，術語"復發(fā)"涉及在無疾病期之后再次出現(xiàn)癌癥。例如，在接受癌癥治療后，患者的癌癥消退，無肺瘤的體征或癥狀，消退保持一段時間，但接著復發(fā)，只得再次進行癌癥治療。根據(jù)本發(fā)明，生物樣品可以是組織樣品(包括體液)和/或細胞樣品，并可以常規(guī)方式獲得，例如組織活檢(包括穿刺活檢)以及收集血、支氣管抽吸物、痰、尿、糞便或其他體液。根據(jù)本發(fā)明，術語"生物樣品，，還包括生物樣品的級分。術語"T細胞"和"T淋巴細胞"在本文中可互換使用，包括T輔助細胞和溶細胞性T細胞(其包括細胞毒T細胞)。本發(fā)明所述藥物組合物和治療方法還可用于預防本文所述疾病的免疫或疫苗接種。在本發(fā)明的方法中，核酸可作為棵核酸、與遞送試劑結(jié)合或作為可表達該核酸的重組質(zhì)?；虿《据d體而施用于受試者。本發(fā)明還提供了通過使用靶標受控性脂質(zhì)體在體內(nèi)施用核酸。例如，可以使用來自腺病毒(AV)、斜目關病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒(LV)、彈狀病毒、小鼠白血病病毒)、皰瘆病毒等的載體?？赏ㄟ^以來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原對載體進行假型化或通過在適當時替換不同的病毒衣殼蛋白來改變病毒載體的向性。脂質(zhì)體可幫助將核酸遞送至特定組織(如腫瘤組織)，并且還可提高核酸在血中的半衰期。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)體由標準的嚢泡形成脂質(zhì)而形成，它們一般包括中性或帶負電的磷脂和甾醇(如膽固醇)。脂質(zhì)的選擇通?？紤]諸如期望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期等因素來進行。已知多種方法用于制備脂質(zhì)體，例如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467以及美國專利No.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述，其全部公開內(nèi)容均以參考方式并入本文。在一些具體實施方案中，優(yōu)選將核酸導向至特定細胞。在這樣的實施方案中，用于將核酸施用至細胞的載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體)可與靼標控制分子結(jié)合。例如，可將諸如特異性針對靶細胞表面膜蛋白的抗體或者針對靶細胞上受體的配體的分子摻入所述核酸載體中或附著于其上。優(yōu)選的抗體包括與胂瘤細J^目關抗原選擇性結(jié)合的抗體。如果期望通過脂質(zhì)體施用核酸，則可將與l&^作用相關表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)摻入該脂質(zhì)體配方中，以4吏靼標控制和/或^L取成為可能。這樣的蛋白質(zhì)包括對特定細胞類型具有特異性的衣殼蛋白或其片段、針對內(nèi)化蛋白的抗體、可i^胞內(nèi)位點的蛋白質(zhì)等。RNAi介導的靼mRNA降解可通過測量靼mRNA或蛋白質(zhì)的水平來檢測，其中使用用于分離和定量mRNA的標準技術，例如Northern印跡或點印跡技術或者定量RT-PCR,或使用用于分離和定量蛋白質(zhì)的標準技術，如ELISA或Western印跡。本發(fā)明的治療性組合物可在藥物相容性制劑中施用。這樣的制劑通?？砂幬锵嗳菪詽舛鹊柠}、緩沖物質(zhì)、防腐劑、載體、補充性免疫增強物質(zhì)如佐劑(例如CpG寡核苷酸、細胞因子、趨化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA)并在適當時包含其他治療活性化合物。本發(fā)明的治療活性化合物可通過任何常規(guī)途徑施用，包括注射或輸注。例如，可以經(jīng)口、靜脈內(nèi)、^M內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或透皮施用。用于將核酸遞送至細胞的合適技術包括通過基因槍、電穿孔、納米顆粒、微嚢化等或者通過腸胃外及腸給藥途徑將核酸施用于受試者。合適的腸給藥途徑包括經(jīng)口、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的腸胃外給藥途徑包括血管內(nèi)給藥(例如靜脈內(nèi)團注(intravenousbolusinjection)、靜務，內(nèi)輸注、動樂》內(nèi)團注(intra國arterialbolusinjection)、動脈內(nèi)輸注和導管滴注進脈管系統(tǒng))；組織周圍及組織內(nèi)給藥(例如胂瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如通過滲透泵進行)；在患病區(qū)域處或其附近直接(例如局部)應用，例如利用導管或其他安放裝置(如包含多孑L、非多孔或^狀材料的栓劑或植入物)進行；以及吸入。本發(fā)明的組合物以有效量施用。"有效量"是指單獨或與其他給藥一起獲得期望^^應或期望效果的量。在治療特定疾病或特定病癥的情形中，期望的>^應優(yōu)選涉及抑制該疾病的病程。這包括減緩該疾病的t艮，特別是中斷或逆轉(zhuǎn)該疾病的m。疾病或病癥治療中期望的反應還可以是延緩或預防所述疾病或所述病癥的發(fā)病。本文使用的siRNA的"有效量"優(yōu)選為足以在受試者中導致RNAi介導的靶mRNA降解的量。本發(fā)明組合物的有效量將取決于諸如以下的因素待治療的疾??；該疾病的嚴重程度；患者的個體參數(shù)，包括年齡、生理狀況、身高和體重；治療的持續(xù)時間；聯(lián)合治療(如果有的話)的類型；具體的給藥途徑以及類似的因素。本發(fā)明的組合物可以與i殳計用于治療該疾病的其他治療方法組合施用于受試者。例如，它們可以與目前用于治療癌癥或預防腫瘤轉(zhuǎn)移的治療方法(例如it射療法、化學療法和手術)組合施用。就治療肺瘤而言，本發(fā)明的組合物優(yōu)選與ii射療法組合或者與化學治療劑(如順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素或他莫昔芬)組合施用于受試者。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為無菌的并含有有效量的治療活性物質(zhì)，以產(chǎn)生期望的反應或期望的效果。所施用的本發(fā)明組合物的劑量可取決于多種參數(shù)，例如給藥類型、患者的狀況、期望的給藥周期等。對于起始劑量不足以在患者中獲得反應的情況，可以使用更高的劑量(或通過不同的更加局部的給藥途徑實現(xiàn)的更有效劑量)。本發(fā)明的藥物組合物一般以藥物相容性的量在藥物相容性組合物中施用。術語"藥物相容性"是指不與該藥物組合物中活性成分的作用發(fā)生相互作用的無毒物質(zhì)。這類制劑通?？珊宣}、緩沖物質(zhì)、防腐劑、載體，適當時還含有其他治療活性化合物。藥用時，鹽應當是藥物相容性的。然而，非藥物相容性的鹽可用于制備藥物相容性鹽，并包括在本發(fā)明中。這類藥理學及藥物相容性鹽包括但不僅限于由以下酸制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、7JC楊酸、梓檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。藥物相容性鹽也可制備成堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鉀鹽。本發(fā)明的藥物組合物可包含藥物相容性載體。根據(jù)本發(fā)明，術語"藥物相容性載體，，是指適于對人施用的一種或多種相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。術語"載體，，是指與活性成分組合以利于施用的天然或合成性質(zhì)的有機或無機組分。本發(fā)明藥物組合物的成分通常使得不發(fā)生顯著損害所期望藥效的相互作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含合適的緩沖物質(zhì)，例如鹽形式的乙酸、鹽形式的檸檬酸、鹽形式的硼酸和鹽形式的磷酸。適當時，所述藥物組合物還可包含合適的防腐劑，例如苯扎氯銨、三氯叔丁醇、對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。所述藥物組合物通常以均一劑型提供，并可以已知的方式制備。本發(fā)明的藥物組合物可采用例如膠嚢劑、片劑、錠劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、酏劑的形式，或者采用乳劑的形式適于腸胃外給藥的組合物通常包含活性化合物的無菌含水或非水制劑，其優(yōu)選與受試者的血液等滲。相容性載體和溶劑的實例為休格液和等滲氯化鈉溶液。此外，通常使用無菌的不揮發(fā)油作為溶液或懸液的介質(zhì)。通過以下附圖和實施例詳細描述本發(fā)明，它們僅用于說明目的，并不意在限制。由于這些描述和實施例，本領域技術人員易于理解同樣包括在本發(fā)明中的其他實施方案。附圖圖1.在惡性組織和癌細胞系中選擇性轉(zhuǎn)錄77，ZE。a、b，通過(a)常規(guī)RT-PCR和(b)定量實時RT-PCR分析正常人組織、TPTE陽性的胂瘤樣品及癌細胞系中的7P7五mRNA表達。c,來自正常組織和組成型表達TPTE的癌細胞系的蛋白裂解物的Western印跡分析。對照為轉(zhuǎn)染有TPZEcDNA(+)或?qū)φ召|(zhì)粒(-)的NIH3T3細胞。d,TPTE的睪丸及惡性組織免疫組織化學染色。與緩沖液對照(-)相比，以用于免疫的重組蛋白片段(+)進行封閉證實了多克隆抗血清pAK2091的特異性。e，(左)通過實時RT-PCR分析顯示經(jīng)曱基化抑制劑dAC處理的TPTE陰性BT-549乳腺癌細胞中ZPZEmRNA表達的誘導。(右)與野生型細胞相比，在HCT116細胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶敲除變體中TPTE轉(zhuǎn)錄物的相圖2.TPTE是定位于質(zhì)膜的磷酸肌醇3，-磷酸酶。a，使用PI(3，4,5)P3和PI(4,5)P2作為底物的重組蛋白體外磷酸酶測定。b，TPTE-eGFP熒光與pAK2091染色共定位，用于證實多克隆兔抗血清的特異性。c,顯示組成型表達TPTE的癌細胞系的免疫熒光分析。d，內(nèi)源性TPTE在PC-3前列腺癌細胞的絲足和偽足中的定位；箭頭細胞突起物側(cè)緣的TPTE累積；星號突起物的尖端無TPTE。e，通過用抗TPTE染色轉(zhuǎn)染有PLC-81-PH-eGFP的細胞來顯示PC-3細胞中內(nèi)源表達的TPTE與PIP2共定位。f,將TPTE(但不是無催化活性的突變體TPTEC338S)轉(zhuǎn)染進NIH3T3-her2細胞中減少了組成型的PIP3信號傳導，從而導致AKT-PH-eGFP的胞質(zhì)重新分布。圖3.TPTE在癌細胞中建立生長因子依賴性表型。在轉(zhuǎn)染有siRNA的TPTE陽性腫瘤細胞系(a-d)以及外源表達TPTE或無催化活性突變體TPTEC338S和eGFP(作為對照)的轉(zhuǎn)化細胞(e-i)中，分析了TPTE對AKT磷酸化、細胞增殖以及對由生長因子剝奪所誘導凋亡的抗性的影響。a，轉(zhuǎn)染有siRNA的細胞的Western印跡分析。TPTEsiRNA特異性抑制相應的磷酸酶。值得注意的是，PTEN蛋白水平不受TPTEsiRNA的影響。b,TPTEsiRNA(+)對TPTE的抑制(亂序siRNA雙鏈體(-)則不抑制)導致細胞磷酸化-AKT水平提高。c、d，在補充有多種濃度血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的MDA-MB-435乳腺癌及MelJuso黑素瘤細胞的增殖速率(c)和凋亡分數(shù)(d)證明，TPTE的下調(diào)使細胞增殖及存活與外部生長因子依賴性解《禺聯(lián)。對MDA-MB-231和PC-3細胞獲得了類似的數(shù)據(jù)。RFU代表相對熒光單位。e,野生型及轉(zhuǎn)化有HER2/"e"的NIH3T3成纖維細胞(NIH3T3-her2)中HER2/we"表達和AKT磷酸化的Western印跡分析。f，TPTE降低了轉(zhuǎn)化有Her2/neu的成纖維細胞中細胞PIP3水平，無催化活性的變體則不然。如實施例l所述，使用PIP3特異性ELISA在血清剝奪細胞的裂解物中定量細胞PIP3水平。g，轉(zhuǎn)染有TPTE-eGFP的NIH3T3-her2細胞和對照中的AKT磷酸化。h，通過流式細胞術細胞周期分析確定，穩(wěn)定表達具有催化活性的TPTE-eGFP消除了NIH3T3-her2細胞的自主生長。i,免疫受損小鼠中皮下接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3-her2細胞后的腫瘤生長動力學情況。圖4.TPTE促進細胞的趨化作用。a,用siRNA寡聚物轉(zhuǎn)染細胞48小時后使用PDGF-BB(200ng/ml)和SDF-la/CXCL12*(200ng/ml)作為化學裔導物進行Transwell遷移測定，(*MDA-MB-435細胞不表達CXCL12的受體CXCR4)。b、c,在使用FCS或多種濃度的PDGF-BB作為化學誘導物的transwdl遷移測定中分析MH-3T3-her2轉(zhuǎn)染子的趨化作用。d,無血清培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有TPTE-eGFP或?qū)φ蛰d體的NIH3T3-her2細胞的形態(tài)學特征。e、f、g,單獨及組合的siRNA介導的PTEN及TPTE敲低對肺瘤細胞趨化作用、細胞PIP3水平和pAKT水平的影響(**表示PC-3細胞不表達PTEN)。圖5.TPTE對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散是必需的。a,使用轉(zhuǎn)染有siRNA并以熒光團標記的乳腺癌細胞進行體內(nèi)腫瘤細胞外滲測定。在注射6小時后通過熒光顯微術記錄細胞向肺中的外滲并計數(shù)。b，基于將經(jīng)TPTEsiRNA或?qū)φ誷iRNA處理的乳腺癌和黑素瘤細胞注射進NOD/SCID小鼠(MDA-MB-231)或棵鼠(MCF-7，MelJuso)尾靜脈而進行的實驗性轉(zhuǎn)移測定。使用特異性針對人微衛(wèi)星DNA的寡核苷酸，在接種后5周通過定量PCR測定轉(zhuǎn)移肺瘤負荷。c，通過獨立實驗從接種轉(zhuǎn)染有siRNA的MDA-MB-231細胞4周后的棵鼠獲得的代表性肺和HE染色的肺組織切片。值得注意的是，以轉(zhuǎn)染有PTENsiRNA的MDA-MB-231細胞進行的實驗導致類似的轉(zhuǎn)移肺瘤負荷降低。d，用于說明患者組中轉(zhuǎn)移率的文氏圖。根據(jù)原發(fā)肺瘤樣品中TPTE和CXCR4表達狀況對患者進行分組。統(tǒng)計學數(shù)據(jù)顯示了各組中的轉(zhuǎn)移病例數(shù)和患者總數(shù)。實施例1:材料和方法組織和細胞系本研究由當?shù)氐膫惱碓u審委員會("EthikkommissionderArztekammerdesLandesRheinland國Pfalz，，)批準。重組DNA工作得到了Rheinland-Pfalz州政府的官方許可并按照其規(guī)定進行。組織作為常規(guī)診斷或治療操作中人類剩余材料獲得，并保存于-80n待用。如果沒有另外指明，則細胞系均得自商品供應商。對于去甲基化研究，將細胞分軟為20-30%匯合并與2jaM或10pM5-氮雜-2，-脫氧胞苷(5-Aza-dC)(Sigma-Aldrich)一起培養(yǎng)72小時。結(jié)腸癌細胞系HCT116WT、HCT116"wm"一、HCT116"麗""和HCT116DKO由BertVogelstein惠贈。RNA分離、RT-PCR和實時RT-PCR如前所述進行RNA提取、第一鏈cDNA合成、RT-PCR和實時RT國PCR(Koslowski,M.等,Cfl"cwi^s.62,6750-6755(2002)，Koslowski，M.等，CVmcwiM.64,5988-5993(2004))。對所有同源成員和假基因進行比對，以設計7Pr五的特異性引物對。通it^隨機選擇的擴增產(chǎn)物進行測序來證實特異性。對于終點分析，在35個循環(huán)的RT-PCR中使用ri，ZB特異性寡核苷酸(有義5，-TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3，，反義5，-CCATAGTTCCTGTTCTATCTG-3，，63匸退火)。4吏用7P7^特異性寡核苷酸(有義5，誦GAGTCTACAATCTATGCAGTG-3'，反義5，-CCATAGTTCCTGTTCTATCTG-3，，63C退火)在40個循環(huán)的PCR中一式三份進行實時定量表達分析。以18sRNA(有義5，-CGATGCTCTTAGCTGAGTGTC國3，；反義5，-TAACCAGACAAATCGCTCCAC-3，，65。C退火)歸一化后，使用AACT計算相對于正常組織定量肺瘤樣品中的7PT^轉(zhuǎn)錄物?？寡?、免疫化學實驗和Western印跡通過定制的抗體i殳備(SeqLab)產(chǎn)生針對TPTEn端(1-51位#^酸)的多克隆抗血清pAK2091。通過將載玻片在檸檬酸鹽緩沖液(pH6)中煮沸15分鐘然后室溫冷卻15分鐘來修復抗原后，對經(jīng)甲醛固定石蠟包埋的組織切片進行免疫組織化學實驗。就Western印跡分析而言，使用從以Triton-X裂解的細胞中提取的60照總蛋白。用還原樣品緩沖液(Roth)稀釋提取物，進行SDS-PAGE，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(Pall)上。對于免疫染色來說，使用對HER2/ne"(Abcam)、pAKT(CellSignaling)、AKT(CellSignaling)和p-肌動蛋白(Abeam)具有>^應性的抗體，其后使用與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠和山羊抗兔第二抗體(Dako)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用抗兔Envision十System(Dako)進行抗TPTEpAK2091第一抗體的檢測。在真核細胞中表達以eGFP標記的TPTE擴增TPZB的開放讀碼框(有義引物5，-GAGAGAAAGCTTCCACCATGAATGAAAGTCCTGATCCCACTGACCT-3，，反義引物5，-GAGAGAAAGCTTGATCGGATCCAGCTACAACATCACTGCAAGTC-3，)，引入兩個HindIII位點。將擴增片段連接進載體pEGFP-Cl和pEGFP-N3(BDBiosciences)中。通過PCR介導的定點豫變產(chǎn)生磷酸酶結(jié)構域活性位點中帶有突變的變體TPTEC338S。免疫熒光和共定位研究將內(nèi)源表達或在轉(zhuǎn)染載體構建體后異源表達TPTE的細胞在載玻片上培養(yǎng)12-24小時，并用20/。多聚甲醛/0.lo/。皂苷/PBS固定。使用pAK2091多克隆兔抗血清和熒光標記的第二抗兔IgG抗體進行TPTE的間接免疫熒光染色。為了分析TPTE與F-肌動蛋白的共定位，我們用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(MolecularProbes)染色經(jīng)透化處理的已固定細胞。針對PLC-81和AKT的eGFP標記PH結(jié)構域、以觀察通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用使膜結(jié)合PIP2和PIP3的表達質(zhì)粒分別由Mario.J.Rebecchi和JulianDownward惠贈。將蓋玻片蓋在Slow-Fade(MolecularProbes)中的載玻片上，并通過免疫熒光顯微術進行分析。eGFP融合蛋白的免疫純化在含有l(wèi)%TritonX-100和蛋白酶抑制劑(8亮抑酶肽、3.3胰凝乳蛋白酶抑制劑、2.9jiM胃酶抑素A,lmM鹽酸AEBSF)的緩沖液中裂解表達eGFP融合蛋白的細胞。將裂解物在4C離心5分鐘。為進行預清除(preclearing)，在4匸將裂解物與A蛋白瓊脂糖凝膠CL-4B(Sigma-Aldrich)醉育1小時。將經(jīng)過預清除的裂解物在4C與抗eGFP抗體(DeltaBiolabs)孵育2小時，然后在4匸與A蛋白瓊脂糖^J^CL-4B孵育1小時，并離心2分鐘進行沉淀。用IP緩沖液(50mMHEPES(pH7.5),150mMNaCl)清洗免疫復合物，并重懸于>^應緩沖液(100mMHEPES(pH7.5),150mMNaCL，10mMDTT)中。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并通過免疫印跡進行分析。體外磷酸酶測定為了測量鱗酸酶活性，將PTEN和TPTE融合蛋白在37X:在含有110水溶性磷脂酰肌醇磷酸(Echelon)的反應緩沖液中免疫沉淀并孵育卯分鐘。使用孔雀綠測定(Echelon)來測定從底物中釋放出來的磷酸量。顯色15分鐘后，在TecanSafire讀數(shù)儀上測量620nm的樣品吸光度。每種樣品一式三份進^f于分才斤。siRNA雙鏈體根據(jù)常用規(guī)則設計以及從Ambion購得siRNA雙鏈體。TPTEsiRNA雙鏈體(有義5，-r(GGUACUUGAUAACAUUACA)dTdT畫3，，反義5'畫r(UGUAAUGUUAUCAAGUACC)dGdA隱3，)耙向TPTEmRNA序列(NM_013315)的1722-1742位核苷酸。使用亂序siRNA雙鏈體(有義5，-r(UAACUGUAUAAUCGACUAG)dTdT-5，，反義5，-r(CUAGUCGAUUAUACAGUUA)dGdA-3，)作為對照。為進行TPTE沉默研究，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)以100nmsiRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染細胞。所有功能測定均在轉(zhuǎn)染siRNA雙鏈體后24小時進行。使用靼向2487-2505位核苷酸的第二組TPTEsiRNA雙鏈體(有義5'-r(GAUUGGCAACCAAGACUAA)dTdT-3，，反義5，-r(UAAGUCUUGGUUGCCAAUC)dTdG-3，)重現(xiàn)了所有結(jié)果。用于PTEN沉默的雙鏈體(5,畫r(GGCGUAUACAGGAACAAUA)dTdT-3,，反義5，國r(UAUUGUUCCUGUAUACGCC)dTdT-3，所對1161-1179位核苷酸(NM—000314)。細胞遷移細胞遷移測定在8.0pm孔膜的transwdl腔室(BDBiosciences)中進行，細胞在實驗前在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時。對于siRNA實驗，在如上述轉(zhuǎn)染siRNA雙鏈體后24小時將細胞轉(zhuǎn)移至無血清條件中。向上層室中加入400jil無血清培養(yǎng)基中的4x104個細胞。下層室中含有補充了作為化學誘導物的FCS、PDGF-BB(Sigma-Aldrich)或SDF-la/CXCL12(R&DSystems)的800jtl培養(yǎng)基。24小時后，用水冷的甲醇將遷移至膜下側(cè)的細胞固定，將膜剪下，置于顯孩i鏡載片上并用Hoechst(Dako)封片以進行熒光顯微術。對每個膜計數(shù)5個隨機視野(100倍放大)中的細胞。所有實驗均一式三份進行。使用(i)上層室和下層室中不添加化學誘導物和(ii)上層室和下層室中均加入化學誘導物的同樣實驗i殳置來分析對細胞化學動態(tài)的影響。細胞增殖分析轉(zhuǎn)染siRNA雙鏈體后24小時，將1x104個細胞在補充有不同濃度FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用DELFIA細胞增殖試劑盒(PerkinElmer)在WallacVictor2多標記計數(shù)器(PerkinElmer)上測量新合成DNA鏈中的BrdU摻入，以分析增殖。細胞周期分析和凋亡將細胞在補充有不同濃度FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48小時后收獲并用碘化丙錠染色，然后進行流式細胞術DNA含量分析。使用CellQuest軟件(BectonDickinson)定量凋亡細胞和處于細胞周期中S/G2/M期的細胞。體內(nèi)肺瘤生長分析和實驗性轉(zhuǎn)移測定為分析體內(nèi)肺瘤生長，將5xl06個細胞(NIH3T3-her2、NIH3T3畫her2畫eGFP、NIH3T3國her2-TPTE-eGFP和NIH3T3-her2-TPTEC338S-eGFP)皮下注射進NOD/SCID小鼠的側(cè)部(每組5只動物)。以卡尺定期測量腫瘤，并計算腫瘤體積(V=axbxb/2)。為了評估腫瘤細胞外滲，將lx106個以CFSE(VybrantCFDASECellTracerKit;Molecularprobes)標記的細胞注射進NOD/SCID小鼠的尾靜脈中(每組3只動物)。6小時后處死小鼠，通過熒光顯孩i術分4斤肺的Hoechst33258標記冷凍切片(20jiM)的外滲腫瘤細胞。每個肺計數(shù)50個隨機現(xiàn)野中的腫瘤細胞。在靜脈內(nèi)注射2xl()6個MDA-MB-231細胞后5周，使用實時PCR對NOD/SCID小鼠(每組4只動物)肺中的胂瘤負荷進行定量。使用QIAampDNAMiniKit(Qiagen)提取DNA，并從l照DNA中擴增人17號染色體a衛(wèi)星區(qū)的226bp片段(有義5，-CAGCTGACTAAACAGAAGCAG國3，；反義5，畫GAGTTGAATGCAGTCATCACAG-3，)。參照由NIH3T3小鼠成纖維細胞中MDA-MB-231細胞連續(xù)稀釋所產(chǎn)生的標準曲線來定量肺瘤負荷。統(tǒng)計學分析使用SPSS軟件(Fisher精確檢驗)將腫瘤中7PZE和CYC/W的表勤目對于患者的轉(zhuǎn)移率進行統(tǒng)計學分析。實施例2:TPTE在人腫瘤中異位表達在大量正常及贅生組織樣品的組中研究7Pr五mRNA表達。TT，r五表ii^P艮在睪丸中，所有其他正常組織樣品中轉(zhuǎn)錄物的量在均低于高靈敏度RT-PCR的檢出限(圖la、b)。相反，在涵蓋了不同癌癥類型(包括惡性黑素瘤(50%)、乳腺癌(4"/。)和肺癌(55%))的155個肺瘤樣品中有59個(38%)以及大量癌細胞系的組(62%)中檢測到了強T7，7五表達(表l)。表l通過RT-PCR和實時PCR分析的人組織和細胞系中7P7五的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>對來自所有測試細胞系和來自任意選擇的胂瘤來源樣品的擴增產(chǎn)物進行克隆和測序，證明它們是來自染色體21p11上的TPTE的轉(zhuǎn)錄物。使用針對TPTEN端(1-51位氨基酸)的多克隆兔抗體(pAK2091)在蛋白質(zhì)水平a^i表達數(shù)據(jù)。通過Western印跡分析在睪丸組織、通過RT-PCR分類為組成型TPTE表達陽性的大量肺瘤細胞系以及用TPTE-cDNA轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到了與預期TPTE大小一致的65kDa條帶，證明了該抗體的特異性(圖lc,左圖)。與RT-PCR數(shù)據(jù)一致，正常組織在Western印跡中的TPTE評分為陰性，而TPTERT-PCR陽性癌組織含有顯著量的TPTE蛋白(圖lc,右圖)。用pAK2091對睪丸組織進行的免疫組織化學實驗顯示出在II型精原細胞和前精細胞中的特異性免疫反應性，這與最近針對小鼠直系同源物描述的原位雜交數(shù)據(jù)一致(Wu，Y.等，/.Oie附.276，21745-21753(2001))(圖Id)。來自肺癌、乳腺癌和前列腺癌以及惡性黑素瘤的組織樣品在免疫組織化學實驗中顯示出腫瘤細胞特異性染色。相反，相鄰的基質(zhì)細胞和非贅生上皮細胞(圖ld)以及與患者匹配的正常組織則無Jl應性(未示出)。確立TPTE作為分子腫瘤標志物之后，研究了導致其在癌細胞中異位活化(ect叩icactivation)的機制。已有報道稱富含CpG的啟動子中的DNA甲基化是沉默體細胞組織中種系特異性基因的一個亞組的主要機制。由此看來，基因組去甲基化似乎足以使肺瘤細胞中的這些基因異?；罨?Koslowski，M.等，C朋cw及仏64，5988-5993(2004),DeSmet，C.等,Mo/.<^//所0/.19,7327-7335(1999))。77>7五啟動子的序列分析顯示出從第一個外顯子上游;^伸至第一個外顯子和內(nèi)含子的經(jīng)典CpG島。由于7號染色體和20號染色體上存在幾乎相同的啟動子序列，因此無法應用基因座特異性亞硫酸氫鹽測序來直接分析腫瘤細胞中7PJE啟動子的甲基化狀態(tài)。因此，研究了總體甲基化改變對7P7五表達的影響。用DNA曱基化抑制劑5-氮雜-2，-脫M苷UAC)處理幾種非表達癌細胞系后，強烈誘導了T7，ZE轉(zhuǎn)錄(圖le)。在野生型HCT116結(jié)腸癌細胞和含有受損的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的子代中進一步評估了7PZE轉(zhuǎn)錄的甲基化依賴性調(diào)節(jié)。HCT116WT細胞以及已知顯示幾乎正?；騼H稍有降低的總體DNA甲基化的2>7\^0^6-/-和/)7\^/77-/-單敲除變體(Rhee，I.等，A^mm416,552-556(2002))不表達7P7五。相反，同時缺少這兩種甲基轉(zhuǎn)移酶并顯示強烈降低的總體DNA甲基化的HCT116DKO細胞導致7Pr五的強表達(圖le)。這兩個實驗獨立地證實，DNA甲基化是7P7^沉默所必需的，并且在肺瘤中經(jīng)常，見察到的基因組去甲基化(Ehrlich，M"0""^"e21,5400-5413(2002)，F(xiàn)dnberg，A.P.&Vogelstein，B.,7V^""301，89-92(1983))足以實現(xiàn)其活化。實施例3:TPTE是質(zhì)膜PIP3磷酸酶TPTE含有磷酸酶結(jié)構域以及與脂質(zhì)結(jié)合的C2結(jié)構域，它們已顯示對于其同源物PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性是必要且充分的(Lee，J.O.等，CW/99,323-334(1999))。盡管先前已顯示TPTE的小鼠直系同源物在體外具有PIPs和PI(3，4)P2底物特異性的脂質(zhì)磷酸酶活性(Wu，Y.等，/.所o/.Oie柳.276，21745-21753(2001)),但其人對應物卻未檢測到酶活性(Walker,S.M.等，說oc/ie附./360，277-283(2001))，這使得PTEN成為迄今惟一已知的人PIP3磷酸酶。由于后一研究使用了細菌來源的重組蛋白，因此用真核產(chǎn)生的蛋白質(zhì)重新評估了人TPTE的酶活性。在HEK293細胞中表達與eGFP融合的TPTE及PTEN的磷酸酶及C2結(jié)構域，用與A蛋白珠偶聯(lián)的抗eGFP抗體通過免疫沉淀純化蛋白質(zhì)，并用于孔雀綠測定。使用從轉(zhuǎn)染有eGFP或TPTEC338S-eGFP(在推定磷酸酶活性的關鍵位點處突變的TPTE變體)的細胞獲得的等摩爾量的免疫沉淀物作為對照，以排除共純化的磷酸酶的污染。意想不到的是，發(fā)現(xiàn)TPTE以與PTEN相當?shù)乃俾侍禺愋缘貜腜IP3釋放磷酸，相應的對照則不然(圖2a)。這一發(fā)現(xiàn)與人類癌癥中TPTE的異?；罨餐砻?，TPTE參與腫瘤細胞中磷酸肌醇介導的質(zhì)膜信號傳導事件。用抗TPTE抗體對轉(zhuǎn)染有TPTE-eGFP的TPTE陰性細胞以及組成型表達TPTE的癌細胞系進行染色，并通過免疫熒光顯微術進行研究。除了先前所述在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位(Wu,Y.等，/.歷o/.CTie附.276,21745-21753(2001))以外，在質(zhì)膜處發(fā)現(xiàn)了TPTE的重要部分(圖2b、2c)。TPTE似乎在膜的褶皺處以及膜突起物(包括偽足和絲足)的側(cè)緣富集，而在這些結(jié)構的尖端則不然(圖2d)。為了研究TPTE與質(zhì)膜磷^醇的空間相關性，使用分別選擇性結(jié)合PIP(4,5)P2(PIPO或3，-磷酸化磷脂的PLC-S1-PH(磷脂酶C-81普列克底物蛋白同源性(phosholipaseC誦S1pleckstrinhomology))(Tall,E.G等，必M10,743-746(2000))和AKT-PH(Watton，S丄&Downward,J"Cwn:9,433-436(1999))結(jié)構域，用普列克底物蛋白結(jié)構域-eGFP融合蛋白進行共定位研究。值得注意的是，用pAK2091對共表達TPTEcDNA和eGFP標記之PH結(jié)構域的細胞進行的染色顯示，TPTE與PLC-81-PH-eGFP幾乎完全重合(圖2f)，但不與AKT-PH-eGFP重合，表明TPTE與PIP2共定位(圖2e)。允許間接測定膜PIP3水平的運輸測定(Halet,G,說V/.CW/97，501-518(2005))表明，在由于HER-2/w"轉(zhuǎn)化造成PI3K過度活化的成纖維細胞中，TPTEcDNA與AKT-PH-eGFP的共轉(zhuǎn)染導致AKT-PH-eGFP從質(zhì)膜完全重新分布到胞質(zhì)溶膠中，而TPTEc338s-cDNA則不然(圖2f)，證明TPTE降低了質(zhì)膜的PIP3水平?？傊?，這些觀察證明，TPTE代謝PIP3，并暗示TPTE可能參與腫瘤細胞中質(zhì)膜磷劇3/L醇的空間調(diào)控。實施例4:使用siRNA沉默TPTE表達分析了內(nèi)源性表達肺瘤相關磷酸酶TPTE的乳腺癌、前列腺癌和惡性黑素瘤細胞系中小干擾RNA(siRNA)所誘導的TPTE基因沉默的效果。定量RT-PCR和Western印]^明，TPTE特異性的siRNA雙鏈體誘導了TPTE轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的強烈敲低，而不影響細胞的PTEN水平(圖3a)。首先，定量測定Ser473被磷酸化的AKT(pAKT)的水平作為細胞PIP3信號傳導的度量。siRNA介導的TPTE下調(diào);所有測試的肺瘤細胞系中均導致細胞pAKT的顯著上調(diào)(圖3b),證明TPTE在癌細胞中對抗PI3K信號傳導。7P7五沉默使pAKT上調(diào)在缺乏PTEN的PC-3細胞中最為明顯，這提示內(nèi)源性TPTE可能在腫瘤細胞中至少部分補償PTEN活性的喪失。最重要的是，TPTE沉默后pAKT的上調(diào)在所有測試的TPTE陽性肺瘤細胞系中都轉(zhuǎn)變成了相應腫瘤細胞中生長因子依賴性的降低，導致持續(xù)的增殖速率(圖3c)并且即便在血清饑餓條件下仍保護其免于發(fā)生凋亡(圖3d)。為了闡明TPTE磷酸酶活性直接介導的效應，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了TPTE或無催化活性的變體TPTEC338S的Her2/neu轉(zhuǎn)化成纖維細胞。Her2/neu轉(zhuǎn)化的成纖維細胞(NIH3T3-her2)顯示出持久的AKT活化(圖3e),這是由于與細胞PIP37JC平提高(圖3f)相關的組成型PBK過度活化所導致的。因此，這些細胞對凋亡有抗性，并在生長因子々幾餓條件下持續(xù)增殖(圖3h)。TPTE(而非突變的TPTEC338S)的表達下調(diào)了細胞中的PIP3(圖3f)，降低了pAKT水平(圖3g)，重^1了增殖和存活的自主性，并在去除生長因子后誘導嚴格的血清依賴性增殖并迅速發(fā)生G0/G1細胞周期阻滯(圖3h)。值得注意的是，在免疫受損小鼠中表達TPTE的NIH3T3-her2細胞的生長與缺乏磷酸酶活性但仍可致瘤的對照相比顯著降低(圖3g)。這些發(fā)現(xiàn)表明，TPTE通過代謝PIP3而對抗上游癌基因誘導的PI3K過度活化，并使腫瘤細胞的生長和存活依賴于外部生長因子，而不消除致瘤性。實施例5:TPTE促進肺瘤細胞的趨化作用在transwell遷移測定和基于趨化因子的侵襲測定中，TPTE特異性siRNA雙鏈體(而非對照雙鏈體)在所有測試的腫瘤細胞系中均降低肺瘤細胞向PDGF或SDF-1/CXCL12梯度的遷移(圖4a)。為了排除siRNA的脫耙活性(offtargetactivity)，用第二組TPTE特異性siRNA雙鏈體和對照來驗證這些發(fā)現(xiàn)。此外，觀察到TPTE(而非其無催化活性的突變體變體)加強了HER-2/e"對細胞遷移的影響。NIH3T3-her2細胞由于轉(zhuǎn)化了該癌基因而提高的基線遷移率(Dittmar，T.爭，i^y五A/16，1823-1825(2002))在共表達TPTE后進一步增強(圖4b)。這樣的雙陽性細胞甚至向最低的化學誘導物梯度有效遷移(圖4c),表明PI3K過度活化與TPTE表達的組M進了趨化因子感知和有效的趨化性遷移。與此一致，TPTE(而非TPTEc338s)的表達導致顯著的形態(tài)學改變，即由圓形細胞轉(zhuǎn)變成有極性的帶有偽足和絲足的多形表型(圖4d)。如組成型表達的癌細胞系所示(圖2d)，TPTE在這些突起物中強烈富集，提示該脂質(zhì)砩酸酶直接參與絲足伸出物的產(chǎn)生。TPTE所觀察到的趨化作用促進活性是出人意料的，特別是鑒于之前PTEN的數(shù)據(jù)(其顯示與TPTE相同的催化性PIP3磷酸酶活性，但報道其抑制遷移)(Tamura,M.等，^/e""280，1614-1617(1998))。然而，這些研究是基于轉(zhuǎn)染有PTENcDNA的腫瘤細胞。相反，最近一項使用siRNA敲低PTEN的報道(Li,Z.爭，iVW.CW/7,399-404(2005);Meili，R"Sasaki,A.T.&Firtd，R.A.,7V^.O//7,334-335(2005))清楚表明，PTEN對于轉(zhuǎn)化Jurkat細胞中SDF-1所介導的趨化作用是必需的。在所有研究的PTEN陽性紳瘤細胞系中，特異性siRNA雙鏈體對PTEN表達的強烈降低導致趨化作用顯著且選擇性的降低(圖4e)，而化學動態(tài)(chemokinesis)則不然。PTENsiRNA在PTEN缺陷型PC-3細胞中無效果，這排除了所觀察到的趨化性遷移抑制由siRNA脫靶活性介導的可能。重要的是，將兩種磷酸酶同時進行抑制導致趨化作用的幾乎完全消除。對經(jīng)siRNA處理的細胞中細胞PIP3水平的分析表明，通過組合siRNA同時消除TPTE和PTEN導致了與單siRNA處理細胞中提高的PIP3水平相比更強烈的細胞PIP3上調(diào)(圖4f)。這與抑制這兩種磷酸酶導致更強的細胞pAKT提高(圖4g)—絲明，TPTE和PTEN的活性在促進腫瘤細胞趨化作用和降低PIP3/AKT信號傳導方面是加和性的。實施例6:TPTE促進轉(zhuǎn)移癌擴散由生長因子受體(如EGF和PDGF)或趨化因子受體(如CXCR4和CCR7)介導的趨化作用促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移(Muller,A.等，A^"^410，50-56(2001);Staller，P.等，A^似^425，307-311(2003))。為了研究TPTE對轉(zhuǎn)移的影響，研究了腫瘤細胞外滲，這是趨化作用所介導的癌細胞轉(zhuǎn)移性擴散中的關鍵步驟(Chambers,A.F.，Groom,A.C.&MacDonald，I.C"Ato.及ev.Owicw2，563-572(2002))。將經(jīng)siRNA處理的熒光團標記的MDA-MB-231或MCF-7乳腺癌細胞注射進NOD/SCID小鼠的尾靜脈中。6小時后處死動物，并通過熒光顯微術在全標本包埋的肺切片中定量外滲至肺中的腫瘤細胞數(shù)。對于這兩種腫瘤細胞系，siRNA介導的TPTE敲低均顯著減少外滲的細胞數(shù)(圖5a)。在接種形成轉(zhuǎn)移的乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-7)或惡性黑素瘤細胞(MdJuso)后數(shù)周，通過人微衛(wèi)星特異性PCR對小鼠肺中亞目視水平(submacrosc叩ic)轉(zhuǎn)移瘤損傷的定量證明，在接受已瞬時轉(zhuǎn)染TPTEsiRNA的腫瘤細胞的動物中，腫瘤負荷減少100-1000倍(圖5b)。另外，使用MDA-MB-231在棵鼠中進行的實驗性轉(zhuǎn)移測定引起目視水平的(macroscopic)損傷，這證實了這些驚人的發(fā)現(xiàn)，并證明了TPTE在轉(zhuǎn)移性擴散中的關鍵作用(圖5c)。實施例7:TPTE和CXCR4是腫瘤轉(zhuǎn)移的標志物評估了TPTE的強遷移促a轉(zhuǎn)移促進活性是否與肺瘤的轉(zhuǎn)移性擴散相關。為此，通過實時RT-PCR對從充分表征的群體中獨立收集34名乳腺癌患者的樣品(Ahr,A.等，l朋c"359，131-132(2002))以及24個非小細胞肺癌樣品進行TPTE表達分型。TPTE表達與腫瘤階段或分化分級之間無顯著相關性。然而，TPTE陽性腫瘤在診斷時顯示比TPTE陰性原發(fā)瘤(37%和0%)明顯更多的局部淋巴轉(zhuǎn)移(76%)和遠處轉(zhuǎn)移(21%)(表2a)。CXCR4表達也是多種癌癥的轉(zhuǎn)移預測標志物。因此，同一組樣品也用于測試CXCR4表達。事實上，CXCR4陽性癌癥(n=23)與CXCR4陰性癌癥(3%)相比顯示出明顯更高的遠處轉(zhuǎn)移率(26%)。重要的是，TPTE和CXCR4表達不相關，并且這兩種分子代表了獨立的轉(zhuǎn)移預測因子(圖5c)。組合表達TPTE和CXCR4的癌癥顯示大大提高的轉(zhuǎn)移率(60%)，而缺少TPTE、CXCR4或同時缺少這兩種分子的腫瘤顯示出甚至降低的轉(zhuǎn)移發(fā)生風險(2o/。，p<0.00005,表2c)，這表明這兩種分子的共表達對于癌癥(特別是乳腺癌和肺癌)的轉(zhuǎn)移性擴散非常重要。表2aTPTE表達與轉(zhuǎn)移性擴散相關。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>權利要求1.用于對患者中的癌癥、癌轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的出現(xiàn)進行診斷、監(jiān)測和/或預后的方法，該方法包括定量和/或定性測定分離自所述患者的生物樣品中TPTE的表達水平以及定量和/或定性測定分離自所述患者的生物樣品中CXCR4的表達水平。2.權利要求l的方法，其中與無癌癥、無癌癥風險、無癌轉(zhuǎn)移、無癌轉(zhuǎn)移風險、無癌癥復發(fā)和/或無癌癥復發(fā)風險的受試者中的表達水平相比，提高的TPTE表達水平和CXCR4表達水平指示癌癥或癌癥可能性、癌轉(zhuǎn)移行為或癌轉(zhuǎn)移行為可能性和/或癌癥復發(fā)或癌癥復發(fā)可能性。3.權利要求1或2的方法，其中所述定量和/或定性測定TPTE的表達水平包括在分離自患者的生物樣品中(i)檢測或定量測定選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:l、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物；和/或(iii)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體；和/或(iv)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的T淋巴細胞，所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物任選地在與MHC分子的復合體中。4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述定量和/或定性測定CXCR4的表達水平包括在分離自患者的生物樣品中(i)檢測或定量測定選自以下的核酸(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或矛汴生物的核酸,(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有簡并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或矛廳生物；和/或(m)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體；和/或(iv)檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的T淋巴細胞，所述蛋白質(zhì)或肽或其部分或衍生物任選地在與MHC分子的復合體中。5.權利要求3或4的方法，其中在所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。6.權利要求4或5的方法，其中所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核,列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。7.權利要求3至6中任一項的方法，其中檢測或定量測定所述核酸包括(i)將所述生物樣品與特異性結(jié)合該核酸的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該核酸之間復合體的形成。8.權利要求3至6中任一項的方法，其中檢測或定量測定所述蛋白質(zhì)或肽或者所述其部分或衍生物包括(i)將所述生物樣品與特異性結(jié)合該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物之間復合體的形成。9.權利要求3至6中任一項的方法，其中檢測或定量測定所述抗體包括(i)將所述生物樣品與特異性結(jié)合該抗體的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該抗體之間復合體的形成。10.權利要求3至6中任一項的方法，其中檢測或定量測定所述T淋巴細胞包括(i)將所述生物樣品與特異性結(jié)合該T淋巴細胞的試劑接觸，以及(ii)檢測或定量測定所述試劑與該T淋巴細胞之間復合體的形成。11.權利要求7的方法，其中特異性結(jié)合所述核酸的試劑是與該核酸特異性雜交的寡核苷酸或多核苷酸。12.權利要求8的方法，其中特異性結(jié)合所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的試劑是特異性結(jié)合該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的抗體。13.權利要求9的方法，其中特異性結(jié)合所述抗體的試劑是特異性結(jié)合該抗體的蛋白質(zhì)或肽。14.權利要求10的方法，其中特異性結(jié)合所述T淋巴細胞的試劑是呈遞該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物與MHC分子之間復合體的細胞，其中所述T淋巴細胞對該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性。15.權利要求1至14中任一項的方法，其中所述監(jiān)測包括確定所述癌癥、所述癌轉(zhuǎn)移行為和/或所述癌癥復發(fā)出現(xiàn)的消退、病程或發(fā)病。16.權利要求15的方法，其包括在第一時間點在第一樣品中測定表達水平，在第二時間點在另一樣品中測定表達水平，并比較這兩個樣叫o17.權利要求1至16中任一項的方法，其中所述患者患有癌癥、癌轉(zhuǎn)移和/或癌癥復發(fā)或者懷疑或有風險發(fā)生癌癥、癌轉(zhuǎn)移和/或癌癥復發(fā)。18.權利要求7至17中任一項的方法，其中所述試劑以可檢測的方式進行標記。19.權利要求1至18中任一項的方法，其中所述生物樣品包括體液和/或機體組織。20.試劑盒，其包含用于在分離自患者的生物樣品中定量和/或定性測定TPTE表達水平的工具以及定量和/或定性測定CXCR4表達水平的工具。21.權利要求20的試劑盒，其中所述用于定量和/或定性測定TPTE表達水平的工具選自在分離自患者的生物樣品中(i)用于檢測或定量測定選自以下的核酸的工具(a)包含選自SEQIDNO:l、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(c)與(a)或(b)中核酸具有筒并性的核酸，以及(d)與(a)、(b)或(c)中核酸互補的核酸；和/或(ii)用于檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(iii)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體的工具；和/或(iv)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的T淋巴細胞的工具，所述蛋白質(zhì)或肽或其部分或衍生物任選地在與MHC分子的復合體中。22.權利要求20或21的試劑盒，其中所述用于定量和/或定性測定CXCR4表達水平的工具選自在分離自患者的生物樣品中(i)用于檢測或定量測定選自以下的核酸的工具(a)包含選自SEQIDNO:47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在嚴格條件下與(a)中核酸雜交的核酸，(ii)用于檢測或定量測定由(i)所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(m)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的抗體的工具；和/或(iv)用于檢測或定量測定對(ii)所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物具有特異性的T淋巴細胞的工具，所述蛋白質(zhì)或肽或其部分或衍生物任選地在與MHC分子的復合體中。23.權利要求21或22的試劑盒，其中所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定TPTE表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。24.權利要求22或23的試劑盒，其中所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(i)所述核酸包含編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性測定CXCR4表達水平中(ii)所述蛋白質(zhì)或肽包含選自SEQIDNO:49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。25.權利要求21至24中任一項的試劑盒，其中所述用于檢測或定量測定所述核酸的工具包括特異性結(jié)合該核酸的試劑。26.權利要求21至25中任一項的試劑盒，其中所述用于檢測或定量測定所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的工具包括特異性結(jié)合該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的試劑。27.權利要求21至26中任一項的試劑盒，其中所述用于檢測或定量測定所述抗體的工具包括特異性結(jié)合該抗體的試劑。28.權利要求21至27中任一項的試劑盒，其中所述用于檢測或定量測定所述T淋巴細胞的工具包括特異性結(jié)合該淋巴細胞的試劑。29.權利要求25的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合所述核酸的試劑是與該核酸特異性雜交的寡核苷酸或多核香酸。30.權利要求26的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的試劑是特異性結(jié)合該蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物的抗體。31.權利要求27的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合所述抗體的試劑是特異性結(jié)合該抗體的蛋白質(zhì)或肽。32.權利要求28的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合所述T淋巴細胞的試劑是呈遞所述蛋白質(zhì)或肽或者其部分或衍生物與MHC分子之間復合體的細胞，其中所述T淋巴細胞對該蛋白質(zhì)或肽或其部分或衍生物具有特異性。33.藥物組合物，其包含當施用于患者時(i)有效降低或抑制TPTE的表達或活性和/或與TPTE結(jié)合并具有腫瘤破壞或腫瘤抑制活性的試劑，和(ii)有效降低或抑制CXCR4的表達或活性和/或與CXCR4結(jié)合并具有腫瘤破壞或腫瘤抑制活性的試劑。34.權利要求33的藥物組合物，其中所述試劑是與編碼TPTE和/或CXCR4的核酸選擇性雜交的反義核酸。35.權利要求33的藥物組合物，其中所述試劑是包含有義RNA鏈和反義RNA鏈的siRNA，其中所述有義和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與TPTEmRNA和/或CXCR4mRNA中約19至約25個連續(xù)核苷酸的靶序列基本一致的核苷酸序列。36.權利要求33的藥物組合物，其中所述試劑是與TPTE和/或CXCR4選擇性結(jié)合的抗體。37.藥物組合物，其包含(I)一種或多種選自以下的組分(i)TPTE或其部分，(ii)編碼TPTE或其部分的核酸，(iii)與TPTE或其部分結(jié)合的抗體，(iv)與編碼TPTE的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對TPTE的siRNA，(vi)表達TPTE或其部分的宿主細胞，和(vii)TPTE或其部分與MHC分子之間的分離的復合體；以及(II)一種或多種選自以下的組分(i)CXCR4或其部分，(ii)編碼CXCR4或其部分的核酸，(iii)與CXCR4或其部分結(jié)合的抗體，(iv)與編碼CXCR4的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)針對CXCR4的siRNA,(vi)表達CXCR4或其部分的宿主細胞，和(vii)CXCR4或其部分與MHC分子之間的分離的復合體。38.權利要求36或37的藥物組合物，其中所述抗體與治療性物質(zhì)偶聯(lián)。39.用于治療癌癥、癌轉(zhuǎn)移或癌癥復發(fā)的方法，其包括施用權利要求33至38中4壬一項的藥物組合物。40.權利要求35的方法，其中所述癌癥為肺腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、黑素瘤、結(jié)腸腫瘤、胃腫瘤、胰腺腫瘤、ENT腫瘤、腎細胞癌或?qū)m頸癌、結(jié)腸癌或乳腺癌。全文摘要本發(fā)明涉及根據(jù)TPTE和CXCR4的表達水平使得有可能對癌癥疾病、癌癥疾病的轉(zhuǎn)移行為和/或癌癥復發(fā)的發(fā)生進行評估和/或預后的方法。具體地，本發(fā)明的方法使得有可能對癌轉(zhuǎn)移(特別是遠處轉(zhuǎn)移)的發(fā)生進行評估和/或預后。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法允許區(qū)分惡性病癥和良性病癥。文檔編號C12Q1/68GK101522918SQ200780037690公開日2009年9月2日申請日期2007年10月9日優(yōu)先權日2006年10月12日發(fā)明者烏爾·沙欣,厄茲萊姆·圖雷奇,米夏埃爾·科斯洛夫斯基申請人:加尼梅德藥物公司;約翰內(nèi)斯·古滕伯格美因茲大學，由校長代表