專利名稱：：用于生產(chǎn)長鏈過酸的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的方法和組合物，其包含至少一種過水解酶(perhydrolase)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的某些實施方案在涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用中尤其有用。
背景技術(shù)：
：洗滌劑和其它清潔組合物通常含有活性成分的復(fù)雜組合。例如，大部分清潔產(chǎn)品含有表面活性劑體系、用于清潔的酶、漂白劑、助洗劑、抑泡劑、污垢懸浮劑、污垢釋放劑(soil-releaseagent)、光學(xué)增白劑、柔軟劑、M劑、染料傳遞抑制化合物、磨料、殺菌劑和香料。盡管明確洗滌劑多種多樣，但是仍存在許多難以完全去除的污漬。另外常存在殘余物積累，這導(dǎo)致歸因于不完全清潔的變色(例如發(fā)黃)和減少的美觀。這些問題由于低(例如冷水)洗滌溫度和更短的洗滌循環(huán)的增加的使用而嚴(yán)重。另夕卜，許多污漬包括纖維性材料(主要包括糖類和糖類衍生物)、纖維，和細(xì)胞壁組分(例如植物材料、木材、基于泥/粘土的污物，和水果)的復(fù)雜混合物。這些污潰為清潔組合物的配制和使用的帶來了困難的挑戰(zhàn)。另外，有色的衣物趨向于磨損并顯示外觀損耗。這樣的顏色損耗部分歸因于洗燙過程中的磨損，尤其是在自動洗衣機和烘干機中。另外，織物拉伸強度的損失似乎是使用、穿著和/或洗滌和千燥引起的機械和化學(xué)作用的不可避免的結(jié)果。因此需要下述手段，所述手段能有效率和有效地洗滌有色衣物，從而將這些外觀損耗最小化。包含酯酶、脂肪酶和角質(zhì)酶(cutinase)的清潔組合物是本領(lǐng)域公知的。然而，這些酶具有非常低的過水解與水解的比例。這導(dǎo)致大部分酯底物被轉(zhuǎn)化為酸而不是更想要的過酸。這是一個嚴(yán)重的缺陷，因為配方空間(formulaspace)和成本考慮使得只能包括有限量的底物?？偠灾?，盡管清潔組合物的能力有所改進，但是本領(lǐng)域仍然存在對下述洗滌劑的需要，所述洗滌劑去除污漬、維持織物顏色和外觀，并且防止染料轉(zhuǎn)移。另外，仍然存在對下述洗滌劑和/或織物護理組合物的需要，其提供和/或重建拉伸強度，并且對織物提供抗皺、抗起球、和/或抗縮水性質(zhì)，并且提供靜電控制(staticcontrol)、織物柔軟性、維持想要的色彩外觀，和織物抗磨損性質(zhì)和益處。特別地，仍然存在包括下述組合物的需要，所述組合物能夠去除污漬的有色組分，所述有色組分常在洗衣后仍附著于織物。另夕卜，仍然存在對適用于紡織品(textile)漂白的改進的方法和組合物的需要。除了織物和衣物清潔領(lǐng)域以外，漂白通常用于紙漿和造紙工業(yè)。在生產(chǎn)紙之前，通常處理紙漿以去除不想要的有色污染物。這提供了與未經(jīng)處理的紙漿相比適合生產(chǎn)更高品質(zhì)的紙張的紙漿，所述處理用于去除有色污染物和紙漿中存在的其它不想要的組分。例如，在紙回收工業(yè)中，去除墨是必需的。盡管標(biāo)準(zhǔn)的方法適用于將有油或基于水的墨的紙脫墨，但是增加的靜電墨使用使得脫墨成為問題，因為這些墨難以去除得多。存在可用于對紙脫墨的多種方法，包括^f吏用酶(見例如美國專利No.5,370,770)。然而，本領(lǐng)域仍然存在對有效的、有成本收益的方法的需要，所述方法用于處理紙漿以用于生產(chǎn)紙(回收和新的)產(chǎn)品生產(chǎn)。在個人護理市場(例如牙齒增白劑、頭發(fā)漂白劑等)中漂白也是常用的。盡管個人護理漂白產(chǎn)品在數(shù)年中已經(jīng)改進，但是對用于該環(huán)境的溫和、易用、有成本收益的漂白方法仍然存在需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的方法和組合物，其包含至少一種過水解酶。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的某些實施方案在涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用中尤其有用。本發(fā)明提供了過水解長鏈?；サ孜锏姆蛛x的過水解酶。在一些實施方案中，該酶在存在長鏈?；サ孜锖瓦^氧化物時生產(chǎn)長鏈過酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，長鏈?；サ孜锖兄辽?個碳原子的鏈。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，長鏈?；サ孜锖兄辽?個碳原子的鏈。在某些實施方案中，主題過水解酶具有與天然存在的過水解酶(即細(xì)胞基因組編碼的野生型過水解酶)的氨基酸序列至少80%同一的列。在一些實施方案中，酶具有與天然存在的恥垢分枝桿菌(Ms附化附fl&)過水解酶(SEQIDNO:2)至少80%同一的氨基酸序列。在一些實施方案中，過水解酶在下述氨基酸位置上包含至少一個取代，所述位置等價于包含SEQIDNO:2中所示的^J^酸序列的恥垢分枝桿菌過水解酶中的位置，其中所述至少一個取代選自位置12、22、59、153、154、194、196和204。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，酶具有以下氨基酸的任一或組合位置12上的Gly、Pro或Gln，位置22上的Trp,位置59上的Pro，位置153上的Pro，位置154上的Thr、Ser、Val或Gln，位置194上的Gly，位置196上的Ser、Gln、Val、Gly、Pro、lie或His，位置204上的Tyr或Trp，其中所述氨基酸位置在位置上等價于SEQIDNO:2的恥垢分枝桿菌過水解酶中的位置12、22、59、153、154、194、196和204。在一些實施方案中，酶含有以下的氨基酸位置154上的AIa和位置194上的Met,位置154上的Gly和位置194上的Val，或位置12上的Gly和位置194上的Met,位置154上的Thr和位置196上的lie,位置12上的Gin和位置154上的Val，位置12上的Met和位置154上的Glu，位置12上的Gly和位置154上的Gly，位置154上的Glu和位置194上的Ser，或位置12上的Gly和位置22上的Trp,或其任意組合，其中所述M酸位置在位置上等價于SEQIDNO:2的恥垢分枝桿菌過水解酶中的位置12、22、59、153、154、194、196和204。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶具有至少為1的過水解:水解比例，和/或與SEQIDNO:2相比低的水解率。本發(fā)明還提供了分離的過水解酶，其中該酶水解長鏈?；サ孜?。在一些實施方案中，酶在存在長鏈?；サ孜锖瓦^氧化物時生產(chǎn)長鏈過酸。在另外的實施方案中，鏈酰基酯底物含有至少6個碳原子的鏈。還在其它實施方案中，長鏈?；サ孜锖兄辽?個碳原子的鏈。本發(fā)明還提供了分離的核酸，其編碼本發(fā)明的分離的過水解酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，重組核酸含有啟動子和分離的核酸，其中所述啟動子和分離的核酸有效連接，以提供分離的核酸的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組核酸的栽體。還提供了包含該載體的宿主細(xì)胞。如果存在于宿主細(xì)胞中，則重組核酸可存在于細(xì)胞的基因組中，或存在于在細(xì)胞中自主復(fù)制的栽體中。在特定的實施方案中，重組核酸使得分離的過水解酶蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌或真菌宿主細(xì)胞。提供了含有主題宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物和培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可含有由細(xì)胞分泌的過水解酶蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的過水解酶的方法。一般而言，該方法包括在適合生產(chǎn)過水解酶的條件下培養(yǎng)主題宿主細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，從生長培養(yǎng)基中回收過水解酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，將回收的過水解酶與其它試劑組合，產(chǎn)生清潔組合物。本發(fā)明還提供了包含至少一種本發(fā)明的過水解酶的清潔組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，清潔組合物還包含長鏈酰基酯底物和過氧化物來源，其與過水解酶一起生產(chǎn)長鏈過酸。在某些實施方案中，清潔組合物還含有性劑。在一些特定的實施方案中，清潔組合物是洗衣洗滌劑。可通過將組合物與底物接觸，使用本發(fā)明的清潔組合物清潔底物(例如織物)。發(fā)明描述本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的方法和組合物，其包含至少一種過水解酶。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的某些實施方案在涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用中尤其有用。除非另有說明，本發(fā)明的實踐涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)工程、蛋白質(zhì)和DNA測序、重組DNA、化學(xué)、生物化學(xué)和酶學(xué)領(lǐng)域普遍使用的常規(guī)技術(shù)，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技藝。事實上，這類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在大量文件和參考工作中描述(見例如Sambrook等人，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",第二版(ColdSpringHarbor),[1989);和Ausubel等人，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"[1987)。本文(包括上文和下文)提到的所有專利、專利申請、文章和出版物均明確地通過參考并入本文。另外，本文提供的標(biāo)題并非本發(fā)明多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，本發(fā)明所述多個方面或?qū)嵤┓桨缚赏ㄟ^參照作為整體的說明書而存在。因此，下文緊接著定義的術(shù)語參考作為整體的說明書被更全面地定義。但是，為了便于理解本發(fā)明，在下文中定義大量術(shù)語。定義除非本文另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。例如，Singleton和Sainsbury,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第二版，JohnWiley和Sons,NY(1994);和Hale和Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,NY(1991)為本領(lǐng)域才支術(shù)人員提供了本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的綜合字典。盡管與本文所述的相似或等價的任何方法和材料在本發(fā)明的實踐中適用，但是本文描述優(yōu)選的方法和材料。同樣，如本文所定義的，除非上下文另外清楚地表明，單數(shù)形式"一個"、"一種，，和"這個/種，，("a"、"an，，和"the，，)包括復(fù)數(shù)參考。因此，下文緊接著定義的術(shù)語通過參考作為整體的說明書更全面地,皮描述。除非另有說明，核酸以從左到右5'到3'的取向書寫；M酸序列以從左到右氨基到氛基的取向書寫。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們的背景而變化。本說明書通篇給出的每個最大數(shù)字界限旨在包括每個更低的數(shù)字界限，就好像該更低的數(shù)字界限在本文中明確寫出一樣。本說明書通篇給出的每個最小數(shù)字界限應(yīng)包括每個更高的數(shù)字界限，就好像該更高的數(shù)字界限在本文中明確寫出一樣。本說明書通篇給出的每個數(shù)字范圍應(yīng)包括落入該更寬的數(shù)字范圍內(nèi)的每個更窄的數(shù)字范圍，就好像該更窄的數(shù)字范圍在本文中均明確寫出一樣。本文使用"過酸"是式RC(=0)OOH的酸，其中R是任何有機部分。本文使用"長鏈過酸"是式RC(-O)OOH的過酸，其中R是含有6個或更多碳原子的鏈的任何有機部分。長鏈過酸可含有6-10個碳原子的碳鏈(即C6-do碳鏈)，或至少11個碳原子的碳鏈(即d,+碳鏈)。示范性的長鏈過酸含有C。C7、C8、C9、C1()、C、C12、C13、C14、C15、C16、Cl7、C18、C19、C2。、0!21或(:22碳鏈。示范性的長鏈過酸包括，但不僅限于過己酸、過辛酸、過壬酸、過癸酸、過十二烷酸、過肉豆蔻酸、過棕櫚酸、過^J旨酸和過油酸。本文使用術(shù)語"過水解"是指產(chǎn)生過酸的酶反應(yīng)。在一些實施方案中，過酸由存在過氧化氫(11202)時式R,C(-0)OR2的酯底物的過水解產(chǎn)生，其中R，和R2獨立地是任何有機部分。本文使用"長鏈?；?是式R,C^O)OR2的酯，其中R，是含有至少6個碳原子的鏈的任何有機部分，R2是任何有機部分。長鏈酰基酯可含有說C6-Cm碳鏈)，或至少11個碳原子的碳鏈(即Cn+碳鏈)。示范性的長鏈?；ズ蠧6、C7、C8、C9、C1()、C、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C"或C22碳鏈。示范性的長鏈酰基酯包括己酸酯、辛酸酯、壬酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸酯。本文使用術(shù)語"過氧化氫來源，，包括過氧化氫以及下述體系的組分，所屬體系能夠自發(fā)或通過酶生產(chǎn)過氧化氫作為反應(yīng)產(chǎn)物。本文使用術(shù)語"漂白，，是指，在合適的pH和溫度條件下，處理材料(例如織物、衣物、紙漿等)或任何表面足夠長的時間，以使材料增亮(即變白)和/或使材料清潔。適于漂白的化學(xué)品的例子包括但不僅限于cio2、H202、過酸、NOz等。本文使用術(shù)語"消毒，，是指4面去除污染物，以及抑制或殺死物品表面的微生物。不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或孩l生物。本文^f吏用術(shù)語"過水解酶"是指能夠催化導(dǎo)致形成足夠高量過酸的反應(yīng)的酶，所述過酸適用于如清潔、漂白和消毒用途。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶將長鏈?；ミ^水解產(chǎn)生長鏈過酸，所述長鏈過酸適用于寬泛的多種清潔相關(guān)的應(yīng)用。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶祐束征為具有獨特的三級結(jié)構(gòu)和一級序列。在一些額外的尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶是恥垢分枝桿菌過水解酶的變體。然而，不旨在將本發(fā)明限制于這些特定的過水解酶。本文使用術(shù)語"多體(multimer)"是指共價或非共價結(jié)合并作為復(fù)合物存在于溶液中的兩個或更多個蛋白質(zhì)或肽。"二體"是含有兩個蛋白質(zhì)或肽的多體；"三體"含有三個蛋白質(zhì)或肽，等等。本文使用"的八體"是指八個蛋白質(zhì)或肽的多體。本文使用短語"過水解與水解的比例，，是指由過水解酶在確定的條件下確定的時間內(nèi)齊&產(chǎn)生的過酸量與S^產(chǎn)生的酸量的比例。在一些實施方案中，本文提供的測定法被用于測定酶生產(chǎn)的過酸和酸的量。本文使用"個人護理產(chǎn)品，，是指用于清潔、漂白和/或消毒毛發(fā)、皮膚、頭皮和/或牙齒的產(chǎn)品，包括但不僅限于洗發(fā)劑、潤膚液、沐浴凝膠、局部濕潤劑、牙膏和/或其它局部清潔劑。在一些特定的實施方案中，這些產(chǎn)品用于人，而在其它實施方案中，這些產(chǎn)品用于非人動物(例如用于獸醫(yī)用途)。本文使用"可藥用的"是指下述藥物、藥品和/或惰性成分，其適用于接觸人和其它動物組織而沒有不恰當(dāng)?shù)亩拘?、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激、過敏反應(yīng)等等，與合理的益處/風(fēng)險比例相稱。本文使用術(shù)語"清潔組合物"和"清潔制劑，，是指可用于從待清潔的物品中去除不想要的化合物的組合物，所述物品如織物、盤碟、隱形眼鏡、其它固體底物、毛發(fā)(洗發(fā)劑)、皮膚(肥皂和乳膏)、牙齒(漱口劑、牙膏)等。該術(shù)語包括針對所需的特定類型的清潔組合物及其產(chǎn)品形式(例如液體、凝膠、顆?；驀婌F組合物)而選擇的任何材料/化合物，只要該組合物與組合物中使用的過水解酶和其它酶相容即可。考慮到待清潔的表面、物品或織物，和針對使用期間的清潔條件所需的組合物形式之后，容易對清潔組合物材料做出特定的選擇。該術(shù)語還表示適用于清潔、漂白、消毒和/或滅菌任何物體和/或表面的任何組合物。該術(shù)語旨在包括，但不僅限于洗涂劑組合物(例如液體和/或固體衣物洗滌劑、精細(xì)織物洗滌劑；硬表面清潔制劑，例如用于玻璃、木、陶瓷和金屬臺面和窗戶；地毯清潔劑；烤箱清潔劑；織物翻新劑(freshener);織物柔軟劑；和紡織品及衣物去漬劑(pre-spotter),以及盤碟洗滌劑)。事實上，除非另有說明，本文使用的術(shù)語"清潔組合物，，包括顆?；蚍勰┬问降耐ㄓ?all-purpose)或強效(heavy-duty)清洗劑，特別是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊狀形式的通用清洗劑，特別是所謂的強效液體(HDL)型；液體精細(xì)織物洗滌劑；手工洗碟劑或輕效(light-duty)洗碟劑，特別是高泡沫型的那些；用于家用和機構(gòu)應(yīng)用的機器洗碟劑，包括多種片狀、顆粒、液體和漂清助劑型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌洗手液(hand-wash)型、清潔棒(cleaningbar)、漱口劑、牙齒清潔劑、汽車或地趁清潔劑、浴室清潔劑；洗發(fā)香波(hairshampoo)和洗發(fā)水(hair-ri維s);沐浴凝膠和泡沫浴以及金屬清潔劑；以及清潔助劑，如漂白劑添加劑和"污漬粘除(stain-stick)"或預(yù)處理型。本文使用術(shù)語"洗滌劑組合物"和"洗涂劑制劑"是指旨在用于清洗介質(zhì)中的混合物方面使用，所述洗涂介質(zhì)用于清潔臟污的對象。在特定的實施方案中，使用該術(shù)語涉及洗滌織物和/或衣服(例如"洗衣洗滌劑")。在可選的實施方案中，該術(shù)語是指其它洗滌劑，例如用于清潔盤碟、刀叉等的洗滌劑(例如"洗盤碟洗涂劑")。不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的洗滌劑制劑或組合物。事實上，除了過水解酶以外，該術(shù)語還旨在包括含有表面活性劑、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍(lán)劑和焚光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑、酶激活劑、抗氧化劑和增溶劑的洗滌劑。在本文使用時，洗滌劑中"增強的性能"被定義為如在標(biāo)準(zhǔn)的清洗循環(huán)后通過通常的評價所確定的，對漂白敏感性污漬(例如草、茶、酒、血、臟物等)的清潔增強。在特定的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶在有色污漬和污物的氧化和去除中提供了增強的性能。在其它實施方案中，本發(fā)明的過水解酶在污漬的去除和/或脫色中提供了增強的性能。還在另外的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶在基于脂質(zhì)的污漬和污物的去除中提供了增強的性能。還在其它實施方案中，本發(fā)明的過水解酶在從盤碟和其它物品上去除污物和污漬中提供了增強的性能。本文使用術(shù)語"硬表面清潔組合物"是指用于清潔硬表面如地板、墻壁、資磚、浴室和廚房設(shè)備等等的洗滌劑組合物。這類組合物以任何形式提供,包括但不僅限于固體、液體、乳劑等等。本文使用術(shù)語"盤碟清洗組合物"是指用于清潔盤碟的組合物的所有形式，包括但不僅限于顆粒和液體形式。本文使用術(shù)語"織物清潔組合物"是指用于清潔織物的所有形式的清潔組合物，包括但不僅限于顆粒、液體和條棒(bar)形式。本文使用術(shù)語"紡織品(textile)"是指機織織物(wovenfabric),以及適用于轉(zhuǎn)化為或用作紗、機織織物(woven)、編織用線(knit)和非機織織物的定長纖維(staplefiber)和絲。該術(shù)語包括由天然纖維以及合成(例如人造的)纖維制成的紗。本文使用術(shù)語"紡織品材料"是表示纖維、紗中間產(chǎn)物、紗、織物和來自織物制備的產(chǎn)物(例如衣物和其它物品)的通用術(shù)語。本文使用"織物，，包括任何紡織品材料。因此，該術(shù)語旨在包括衣物以及織物、紗、纖維、非機織材料、天然材料、合成材料，和任何其它紡織品材料。本文使用術(shù)語"相容的"是指清潔組合物材料不會將過水解酶的酶活性降低至下述程度，所述程度使得過水解酶在正常使用的情況下不能如所期望的有效。特定的清潔組合物材料在下文中詳細(xì)舉例。本文使用"有效量的過水解酶"是指達(dá)成具體應(yīng)用(例如個人護理產(chǎn)品、清潔組合物等)中所需酶活性必需的過水解酶量。這類有效量可由本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員容易地確定，并且以許多因素為基礎(chǔ)，例如使用的特定酶變體、清潔組合物、清潔組合物的具體組成，和需要液體還是干燥(例如顆粒、條棒)的組合物，等等。本文使用術(shù)語"非織物清潔組合物"包括硬表面清潔組合物、盤碟清洗組合物、個人護理清潔組合物(例如口腔清潔組合物、牙齒清潔組合物、個人清潔組合物等)和適用于紙漿和造紙工業(yè)的組合物。本文使用"口腔清潔組合物"是指牙粉(dentifrice)、牙膏、牙凝膠、牙粉、漱口劑、口腔噴霧、口腔凝膠、口香糖、錠劑、嚢劑、片劑、生物凝膠、預(yù)防糊劑(prophylaxispaste)、牙齒治療溶液等等。適合與本發(fā)明的過水解酶組合使用的口腔護理組合物是本領(lǐng)域公知的(見例如美國專利Nos.5,601,750、6,379,653和5,989,526，其均通過參考并入本文)。本文使用"紙漿處理組合物"是指本發(fā)明的過7K解酶在適用于造紙用途的組合物中使用。該術(shù)語旨在包括適用于處理任何紙漿材料的組合物，所述紙漿材料包括木材料以及非木材料，例如"農(nóng)業(yè)剩余物"和"纖維作物"，包括但不僅限于小麥稈、稻稈、玉米稈、甘蔗渣(甘蔗)、黑麥草稈、種子亞麻稈(seedflaxstraw)、亞麻稈、洋麻、工業(yè)大麻、劍麻、紡織品平稈(textileflatstraw)、hesperaloe等。因此，本發(fā)明還包括本發(fā)明的過水解酶在紙漿處理方法中的用途。本文使用"氧化化學(xué)品"是指具有漂白紙漿或任何其它材料的能力的化學(xué)品。氧化化學(xué)品以適合漂白的量、pH和溫度存在。該術(shù)語包括但不僅限于過氧化氫和過酸。本文使用"酰基"是有機酸基團的通用名稱，其為去除-OH基后羧酸的剩佘部分(例如乙?；菴H3CO-Cl是由冰醋酸CH3COO-H形成的酰基氯)。單個?；拿Q通過用"-基"替換"-酸"形成。本文使用術(shù)語"?；?是指下述化學(xué)轉(zhuǎn)化，其將?；?RCO-)取代進分子中，通常取代-OH基的活性氫。本文使用術(shù)語"轉(zhuǎn)移酶"是指催化官能化合物到底物范圍的轉(zhuǎn)移的酶。本文使用術(shù)語"離去基團"是指這樣的親核體，其在被另一親核體取代后從酰基供體上被切割。本文使用術(shù)語"酶轉(zhuǎn)化，，是指通過將底物或中間產(chǎn)物與酶接觸，將底物修飾為中間產(chǎn)物或?qū)⒅虚g產(chǎn)物修飾為終產(chǎn)物。在一些實施方案中，通過將底物或中間產(chǎn)物直接暴露于適當(dāng)?shù)拿钢圃旖佑|。在其它實施方案中，接觸包括將底物或中間產(chǎn)物暴露于下述生物，所述生物表達(dá)和/或分泌酶，和/本文使用短語"洗滌劑穩(wěn)定性"是指洗滌劑組合物的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，在^f吏用洗滌劑期間評價穩(wěn)定性，而在其它實施方案中，該術(shù)語是指洗涂組合物在儲存期間的穩(wěn)定性。本文使用短語"對蛋白酶解(proteolysis)的穩(wěn)定性"是指蛋白質(zhì)(例如酶)承受蛋白酶解的能力。不旨在將該術(shù)語限制于使用任何特定的蛋白酶用于評價蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。本文使用"氧化穩(wěn)定性"是指蛋白質(zhì)在氧化條件下發(fā)揮作用的能力。特別地，該術(shù)語是指蛋白質(zhì)在存在多種濃度11202和/或過酸時發(fā)揮功能的能的穩(wěn)定性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)步驟測量和/或通過本文所述方法測量。氧化穩(wěn)定性的重大改變由以下證明與無氧化化合物存在時的酶活性相比，酶活性的半衰期提高或降低(在大部分實施方案中，優(yōu)選地為增加)至少約5%或更大。本文使用"pH穩(wěn)定性"是指蛋白質(zhì)在特定pH下發(fā)揮作用的穩(wěn)定性。一般，大部分酶能夠作用的pH范圍是有限的。除了在中度范圍(mid-range)pH(即pH7左右)下作用的酶以外，存在能夠在非常高或非常低pH條件下工作的酶。多種pH下的穩(wěn)定性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)步驟測量，和/或通過本文所述的方法測量。pH穩(wěn)定性的重大改變由以下證明與酶最適pH下的酶活性相比，酶活性的半衰期增加或減少(在大部分實施方案中，優(yōu)選地為增加)至少約5%或更大。然而，不旨在將本發(fā)明限制于任何pH穩(wěn)定性水平或pH范圍。本文使用"熱穩(wěn)定性"是指蛋白質(zhì)在特定溫度下發(fā)揮功能的能力。通常，大部分酶能夠發(fā)揮功能的溫度范圍是有限的。除了在中度溫度(例如室溫)下工作的酶以外，存在能夠在非常高或非常低溫度下工作的酶。熱穩(wěn)定性可通過已知步驟或通過本文所述方法測量。熱穩(wěn)定性的重大改變通過以下證明暴露于與酶活性的最適溫度不同的溫度(例如更高或更低)下時，突變體催化活性的半衰期增加或減少(在大部分實施方案中，優(yōu)選地為增加)至少約5%或更大。然而，不旨在將本發(fā)明限制于任何溫度穩(wěn)定性水平或溫度范圍。本文使用術(shù)語"化學(xué)穩(wěn)定性"是指蛋白質(zhì)(例如酶)對于不利地影響其活性的化學(xué)品的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，這類化學(xué)品包括，但不僅限于過氧化氫、過酸、陰離子洗涂劑、陽離子洗滌劑、非離子洗滌劑、螯合劑等。然而，不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的化學(xué)穩(wěn)定性水平或化學(xué)穩(wěn)定性范圍。本文使用短語"過水解酶活性提高"是指與標(biāo)準(zhǔn)酶相比，過水解酶活性的相對提高。在一些實施方案中，該術(shù)語是指提高的過水解產(chǎn)物速率，而在其它實施方案中，該術(shù)語包括產(chǎn)生更少水解產(chǎn)物的過水解酶組合物。在另外的實施方案中，該術(shù)語是指具有改變的底物特異性的過水解酶組合物。本文使用短語"底物特異性的改變"是指酶的底物特異性的改變。在一些實施方案中，底物特異性的改變被定義為用酶觀察到的Kcat/Km比例與用酶變體或其它酶組合物觀察到的之間的差異。酶底物特異性才艮據(jù)測試的底物而變化。通過比較酶對不同底物展示的催化效率測定酶的底物特異性。這些測定尤其適用于評價突變體酶的效率，因為通常期望產(chǎn)生下述變體酶，其對特定的目的底物顯示更大的比例。例如，與目前用于清潔、漂白和消毒應(yīng)用的酶相比，本發(fā)明的過水解酶在從酯底物生產(chǎn)過酸中更加有效。本發(fā)明的另一實例是與野生型相比對過酸降解具有更低活性的過水解酶。本發(fā)明的另一實例是對比乙酸更疏水的?；哂懈呋钚缘倪^水解酶。然而，本文使用的"表面性質(zhì)，，是關(guān)于蛋白質(zhì)表面所展示的靜電荷以及下述特性使用的，所述特性例如疏水性和/或親水性。本文使用短語"獨立地選自......"表示從所參照的馬庫什組中選擇的部分或元件可以是相同的、可以是不同的或是以下實例中所指的元件的任何混合物具有3個R基團的分子，其中各R基團獨立地選自A、B和C。此處三個R基團可以是AAA、BBB、CCC、AAB、AAC、BBA、BBC、CCA、CCB或ABC。對化學(xué)組合物而言，本文使用術(shù)語"取代的"表示該術(shù)語所應(yīng)用的有機組合物或基團(a)通過消除至少一個元件或基團^L制成不飽和的；或(b)用含有一個或多個(i)碳、(ii)氧、(iii)石克、(iv)氮或(v)鹵素原子的部分替換化合物或基團中至少一個氫；或(c)(a)和(b)二者。可如緊鄰的上文(b)中所述替換氫的部分(其僅含有碳和氫原子)是烴部分，其包括但不僅限于烷基、鏈烯基、炔基、烷基二烯基(alkyldienyl)、環(huán)烷基、苯基、烷基苯基、萘基、蒽基、菲基、芴基、甾類基團，和這些基團彼此和與多價烴基的組合，所述多價烴基例如亞烷基(alkylene)、亞烷基(alkylidene)和alkylidyne基團?？扇缇o鄰的上文(b)中所述替換氫的含有氧原子的部分包括，但不僅限于含有羥基、酰基或酮基、醚、環(huán)氧、和酯的基團?？扇缇o鄰的上文(b)中所述替換氫的含有減源子的部分包括，但不僅限于含硫的酸和酸酯基團、硫醚基、巰基和硫酮基?？扇缇o鄰的上文(b)中所述替換氫的含有氮原子的部分包括，但不僅限于氨基、硝基、偶氮基、銨基、酰胺基、疊氮基、異氰酸基、氰基和腈基?？扇缇o鄰的上文(b)中所述替換氫的含S素原子的部分包括氯基、溴基、氟基、碘基及前述任何部分，所述部分中的氫或側(cè)烷基被卣素基團取代形成穩(wěn)定的被取代的部分。應(yīng)當(dāng)理解，可如下將從(b)(i)到(b)(v)的任何上述部分取代為彼此在單價取代中，或在多價取代中通過丟失氫來形成可替換有機化合物或基團中氫的另一單價部分。本文使用術(shù)語"純化的"和"分離的"是指從樣品中去除污染物。例如，通過去除溶液或制品中不是過水解酶的污染蛋白質(zhì)和其它化合物純化過水解酶。在一些實施方案中，重組的過水解酶在細(xì)菌或真菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，并通過去除其它宿主細(xì)胞成分純化這些重組的過水解酶；因而提高樣品中重組的過水解酶多肽的百分比。本文使用"目的蛋白質(zhì)，，是指要被分析、鑒定和/或修飾的蛋白質(zhì)(例如酶或"目的酶")。天然存在的以及重組的蛋白質(zhì)適用于本發(fā)明。本文使用"蛋白質(zhì)，，是指包含M酸并被本領(lǐng)域技術(shù)人員識別為蛋白質(zhì)的任何復(fù)合物。術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"肽"和多肽在本文中可互換使用。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解該術(shù)語在上下文中的使用。如本文使用的，功能上和/或結(jié)構(gòu)上類似的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是"相關(guān)蛋白質(zhì)"。在一些實施方案中，這些蛋白質(zhì)來自不同的屬和/或物種，包括生物類別(例如細(xì)菌蛋白質(zhì)和真菌蛋白質(zhì))之間的差異。在一些實施方案中，這些蛋白質(zhì)源自不同的屬和/或物種，包括生物類別(例如細(xì)菌酶和真菌酶)之間的差異。在另外的實施方案中，提供來自相同物種的相關(guān)蛋白質(zhì)。事實上，不旨在將本發(fā)明限制為來自任何特定來源的相關(guān)蛋白質(zhì)。另外，術(shù)語"相關(guān)蛋白質(zhì)，，包括三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如本發(fā)明的過水解酶)。在其它實施方案中，該術(shù)語包括免疫上交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一些最尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的相關(guān)蛋白質(zhì)顯示非常高的過水解與水解的比例。本文使用術(shù)語"衍生物"是指如下衍生自蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)向C-端或N-端之一或二者中添加一個或多個氨基酸，在氨基酸序列中一個或許多不同的位點取代一個或多個氨基酸，和/或在蛋白質(zhì)的一端或兩端或在氨基酸序列中的一個或多個位點上缺失一個或多個氨基酸，和/或在氨基酸序列中的一個或多個位點上插入一個或多個氨基酸。優(yōu)選如下達(dá)成蛋白質(zhì)衍生物的制備修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列、將該DNA序列轉(zhuǎn)化進合適的宿主中，并表達(dá)經(jīng)修飾的DNA序列，形成衍生的蛋白質(zhì)。相關(guān)(和衍生)蛋白質(zhì)包括"變體蛋白質(zhì)"。在一些優(yōu)選的實施方案中，變體蛋白質(zhì)與親本蛋白質(zhì)之間以及彼此之間由于小量的氨基酸殘基而不同。不同氨基酸殘基的數(shù)量可以是一個或多個，優(yōu)選地約l、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個氨基酸殘基。在一些優(yōu)選的實施方案中，變體之間不同氨基酸的數(shù)量在1和10之間。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)并且尤其是變體蛋白質(zhì)包含至少約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70°/。、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%或約99%的氨基酸序列同一性。另夕卜，如本文中使用的相關(guān)蛋白質(zhì)或變體蛋白質(zhì)是指與另一相關(guān)蛋白質(zhì)或親本蛋白質(zhì)在顯著區(qū)域(prominentregion)的數(shù)量上不同的蛋白質(zhì)。例如，在一些實施方案中，變體蛋白質(zhì)具有約l、2、3、4、5或IO個與親本蛋白質(zhì)不同的相應(yīng)的顯著區(qū)域。本領(lǐng)域已知適用于產(chǎn)生本發(fā)明的過水解酶變體的若干種方法，包括但不僅限于位點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、定點誘變和定向進化，以及多種其它重組途徑。在某些實施方案中，同源蛋白質(zhì)被改造為生產(chǎn)具有想要的活性的酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，被改造的蛋白質(zhì)包括在蛋白質(zhì)的SGNH-水解酶家族中。在一些實施方案中，被改造的蛋白質(zhì)包含以下保守殘基的至少一個或其組合L6、W14、W34、L38、R56、D62、L74、L78、H81、P83、M90、K97、GllO、L114、L135、F180、G205。在可選的實施方案中，這些被改造的蛋白質(zhì)包括GDSL(SEQIDNO:28)和GRTT(SEQIDNO:29)和/或ARTT(SEQIDNO:30)基序。在一些其它實施方案中，酶是多體，包括但不僅限于二體、八體和四體。在另外的實施方案中，被改造的蛋白質(zhì)顯示大于1的過水解與水解的比例。如果過水解酶的氨基酸殘基與恥垢分枝桿菌過水解酶中特異殘基或該殘基的部分同源(即在一級和/或三級結(jié)構(gòu)任一中具有相應(yīng)的位置)或類似(即具有用于組合、反應(yīng)和/或化學(xué)相互作用的相同或類似的功能性能力)，則過水解酶的該氨基酸殘基等價于恥垢分枝桿菌過水解酶的該殘基。在一些實施方案中，為了建立對一級結(jié)構(gòu)的同源性，將過水解酶的氨基酸序列直接與恥垢分枝桿菌過水解酶的一級序列比較，尤其是直接與在所有序列已知的過水解酶中已知不變的一組殘基比較。比對保守殘基后，定義等價于恥垢分枝桿菌過水解酶一級序列中特定氨基酸的殘基，所述比對允許為了維持比對進行必要的插入和缺失(即通過任意缺失和插入避免保守殘基的消失)。在某些實施方案中，保守殘基的比對定義了100%的等價殘基。然而，大于約75%或低至約50%的保守殘基的比對也足以定義等價殘基。在優(yōu)選的實施方案中，維持催化性絲氨酸和組氨酸殘基的保守。使用保守的殘基定義其它過水解酶(例如，來自其它分枝桿菌(A0^W""c'm附)物種以及任何其它生物的過水解酶)中恥垢分枝桿菌過水解酶的相應(yīng)等價氨基酸殘基。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼恥垢分枝桿菌過水解酶的DNA序列被修飾。在一些實施方案中，以下殘基4皮修飾Cys7、AsplO、Serll、Leul2、Thrl3、Trpl4、Trpl6、Pro24、Thr25、Leu53、Ser54、Ala55、Thr64、Asp65、Arg67、Cys77、Thr91、Asn94、Asp95、Tyr99、Val125、Pro138、Leul40、Pro146、Pro148、Trpl49、Phel50、Uel53、Phel54、Thrl59、Thrl86、Ilel92、Uel94和Phel96。然而，并非旨在將本發(fā)明限制于在這些位置上被修飾的序列。事實上，本發(fā)明旨在包括多種修飾和修飾的組合。在另外的實施方案中，如下定義等價殘基針對其三級和四級結(jié)構(gòu)已通過x-射線晶體學(xué)被確定的過水解酶，測定三級和四級結(jié)構(gòu)水平上的同源性。在該上下文中，"等價殘基"被定義為下述殘基比對后，羰基水解酶和恥垢分枝桿菌過水解酶的特定氨基酸殘基的兩個或更多主鏈原子(N對N,CA對CA，C對C和O對O)的原子坐標(biāo)在0.13nm之內(nèi)，優(yōu)選地在O.lnm之內(nèi)。在最佳模型已被定向和定位，以給出所述過水解酶與恥垢分枝桿菌過水解酶的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊后，達(dá)成比對。如本領(lǐng)域所已知的，最佳模型是在可獲得的最高分辨率下，針對實驗衍射數(shù)據(jù)給予最低R因子的晶體模型。功能上和/或結(jié)構(gòu)上與恥垢分枝桿菌過水解酶的特定殘基類似的等價殘基定義為過水解酶的下述氨基酸，所述M酸優(yōu)先采取使得它們改變、修飾或調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，從而以下述方式影響底物結(jié)合和/或催化中的改變，所述方式由恥垢分枝桿菌過水解酶的特定殘基確定和導(dǎo)致。另外，它們是過水解酶的下述殘基(在已通過x-射線晶體學(xué)獲得三級結(jié)構(gòu)時)，所述殘基以下述程度占據(jù)類似的位置，所述程度為盡管給定殘基的主鏈原子可能不滿足以占據(jù)同源位置為J^出的等價標(biāo)準(zhǔn)，但是殘基的至少兩個側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)位于恥垢分枝桿菌過水解酶的相應(yīng)側(cè)鏈原子的0.13nm之內(nèi)。恥垢分枝桿菌過水解酶的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)在WO05/056782的實施例14中測定并公開，并如上文所述適用于在三級結(jié)構(gòu)水平上確定等價殘基。在一些實施方案中，針對取代、插入或缺失鑒定的一些殘基是保守殘基，而其它的則不是。本發(fā)明的過水解酶突變體包括多種突變體，包括由包含信號序列的核酸編碼的突變體。在一些實施方案中，由這樣的序列編碼的過水解酶突變體由表達(dá)宿主分泌。在一些另外的實施方案中，由這樣的序列編碼的過水解酶突變體由表達(dá)宿主在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生。在一些其它實施方案中，核酸序列包含具有分泌信號的同源物。野生型和突變體蛋白質(zhì)的表征通過任何合適的手段完成，并優(yōu)選地基于目的特性的評估。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中測定pH和/或溫度，以及洗滌劑和/或氧化穩(wěn)定性。事實上，預(yù)期可使用在一個或多個這些特征中(例如pH、溫度、蛋白酶解穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性和/或氧化穩(wěn)定性)具有不同穩(wěn)定性程度的酶。還在其它實施方案中，選擇具有低過酸降解活性的過水解酶。還在另外的實施方案中，選擇具有更高過酸形成的過水解本文使用"表達(dá)載體"是指含有DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述DNA序列與能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適控制序列有效連接。這類控制序列包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制這類轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒，或單純是潛在的基因組插入物。一旦被轉(zhuǎn)化進合適宿主，栽體可以獨立于宿主的基因組復(fù)制和發(fā)揮功能，或在一些情況下自身整合進基因組中。本文使用"質(zhì)粒"、"表達(dá)質(zhì)粒，，和"載體，，通常可互換使用，因為質(zhì)粒是目前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類其它形式的表達(dá)載體，其發(fā)揮等價功能，并且是或者成為本領(lǐng)域已知的。在一些優(yōu)選的實施方案中，過水解酶基因被連接進適宜的表達(dá)質(zhì)粒中。然后使用被克隆的過水解酶基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，從而表達(dá)該過水解酶基因。在一些實施方案中，該質(zhì)粒在宿主中復(fù)制，在該種情形下其含有質(zhì)粒復(fù)制必需的^^知元件，而在其它實施方案中，質(zhì)粒被設(shè)計為整合進宿主染色體中。為了有效的基因表達(dá)提供必需的元件(例如與目的基因有效連接的啟動子)。在一些實施方案中，這些必需的元件如果被識別(即被宿主轉(zhuǎn)錄)則作為基因自身的同源啟動子凈皮提供，作為轉(zhuǎn)錄終止子(例如用于真核宿主細(xì)胞的多聚腺苷酸化區(qū))被提供，所述轉(zhuǎn)錄終止子是外源的或由過水解酶基因的內(nèi)源終止子區(qū)提供。在一些實施方案中，還提供了選擇基因例如抗樣i生物劑抗性基因，通過在含抗微生物劑培養(yǎng)基上生長，所述基因使得能夠連續(xù)培養(yǎng)維持被質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，以下的盒誘變方法可用于簡化本發(fā)明的過水解酶變體的構(gòu)建，盡管其它方法也可用于本發(fā)明。首先，如本文所述，獲得編碼過水解酶的天然存在的基因，并對其整體或部分測序。然后就期望在^f皮編碼的過水解酶中制造一個或多個氨基酸突變(例如一個或多個缺失、插入和/或取代)的點掃描序列。針對限制性位點的存在評價該點側(cè)翼的序列，所述限制性位點用于用寡核苷酸庫替換基因的短區(qū)段，所述寡核苷酸庫被表達(dá)時會編碼多種突變體。這類限制性位點優(yōu)選是蛋白質(zhì)基因內(nèi)特有的位點，從而便于替換基因區(qū)段。然而，在一些實施方案中，過水解酶基因中不是過度冗佘的任何便利的限制性位點是適用的，只要通過限制性消化產(chǎn)生的基因片段可以以適當(dāng)?shù)捻樞蛑匦卵b配即可。如果限制性位點并非存在于與所選點具有便利距離的位置上(例如距離10個到15個核苷酸)，則可通過以下述方式取代基因中的核苷酸產(chǎn)生這類位點，所述方式中最終構(gòu)建體中讀碼框或編碼的氨基酸均未改變。在一些實施方案中，根據(jù)普遍已知的方法，通過M13引物延伸完成基因的突變，從而將其序列改變?yōu)榕c所需的序列一致。遺傳密碼子的冗余、基因的限制性酶圖譜和大量不同的限制性酶使得下述任務(wù)成為常規(guī)，所述任務(wù)定位合適的側(cè)翼區(qū)并評價所需的改變以達(dá)成兩個便利的限制性位點序列。注意如果可獲得便利的側(cè)翼限制性位點，則上述方法需要僅在涉及不含有位點的側(cè)翼區(qū)時被使用。一旦克隆了天然存在的DNA和/或合成的DNA，用關(guān)聯(lián)的限制性酶消化位置側(cè)翼要被突變的限制性位點，并將大量末端-互補的寡核苷酸盒連接在基因中。通過該方法簡化誘變，因為可以合成所有的寡核苷酸，使得其具有相同的限制性位點，并且不需^成的接頭來創(chuàng)建限制性位點。本文使用"對應(yīng)于"是指蛋白質(zhì)或肽中所列位置上的殘基，或與蛋白質(zhì)或肽中所列殘基類似、同源或等價的殘基。本文使用"相應(yīng)的區(qū)域"一般是指沿著相關(guān)蛋白質(zhì)或親本蛋白質(zhì)的類似位置。術(shù)語"編碼......的核酸分子"、"編碼......的核酸序列"、"編碼......的DNA序列"和"編碼......的DNA"是指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核普酸的順序確定了沿著多肽(蛋白質(zhì))鏈的氨基酸的順序。DNA序列因此編碼氨基酸序列。本文使用術(shù)語"類似序列"是指蛋白質(zhì)中提供與目的蛋白質(zhì)(即通常為初始的目的蛋白質(zhì))相似的功能、三級結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的序列。例如，在含有a-螺旋或P-折疊結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，類似序列中的替換氨基酸優(yōu)選地維持相同的特異結(jié)構(gòu)。該術(shù)語還表示核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實施方案中，開發(fā)類似序列使得替換氨基酸導(dǎo)致變體酶，所述變體酶顯示相似或改進的功能。在一些優(yōu)選的實施方案中，目的蛋白質(zhì)中氨基酸的三級結(jié)構(gòu)和/或保守的殘基位于目的區(qū)段或片段中或其附近。因此，當(dāng)目的區(qū)段或片段含有例如a-螺旋或(5-折疊結(jié)構(gòu)時，替換M酸優(yōu)選地維持該特異結(jié)構(gòu)。本文使用"同源蛋白質(zhì)"是指與目的蛋白質(zhì)(例如來自另一來源的過水解酶)具有相似功能和/或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(例如過水解酶)。不旨在該同源物必須是進化上相關(guān)的。因此，該術(shù)語旨在包括得自不同物種的相同或相似的酶(即在結(jié)構(gòu)和功能方面)。在一些優(yōu)選的實施方案中，期望鑒定與目的蛋白質(zhì)具有相似的四級、三級和/或一級結(jié)構(gòu)的同源物，因為用來自同源物的類似區(qū)段替換目的蛋白質(zhì)中的區(qū)段或片段會降低改變的破壞性。在一些實施方案中，同源蛋白質(zhì)誘導(dǎo)與目的蛋白質(zhì)類似的免疫應(yīng)答。本文使用"同源基因"是指至少一對來自不同物種的基因，所述基因彼此對應(yīng)并且彼此相同或非常相似。該術(shù)語包括通過物種形成(即新物種的發(fā)生)被分離的基因(例如直向同源基因)，以及通過遺傳重復(fù)被分離的基因(例如旁系同源基因)。這些基因編碼"同源蛋白質(zhì)"。本文使用"野生型"、"天然的"和"天然存在的"蛋白質(zhì)是天然中存在的蛋白質(zhì)。術(shù)語"野生型序列"和"野生型基因"在本文中可互換使用，表示在宿主細(xì)胞中是天然或天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列是指下述目的序列，其為蛋白質(zhì)工程項目的起點?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域^L術(shù)人員已知的一般方法獲得編碼天然存在的蛋白質(zhì)的基因。該方法通常包括合成標(biāo)記的探針(其具有編碼目的蛋白質(zhì)區(qū)域的推定序列)、從表達(dá)蛋白質(zhì)的生物中制備基因組文庫，和通過與探針雜交篩選目的基因的文庫。然后對陽性雜交克隆作圖和測序。本文使用術(shù)語"重組DNA分子"是指包含DNA區(qū)段的DNA分子，所述DNA區(qū)段借助于分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合在一起。術(shù)語"重組寡核苷酸"是指使用分子生物學(xué)操作創(chuàng)建的寡核苷酸，所述分子生物學(xué)操作包括但不僅限于，連接兩條或更多通過限制性酶消化多核苷酸序列產(chǎn)生的寡核苷酸序列，合成寡核苷酸(例如合成引物或寡核苷酸)等等。可使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法測定序列之間的同源性程度(見例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.，2:482[1981；Needleman和Wu獄h,J.Mol.Biol"48:443[1970];Pearson和Lipman,Pro"Natl.Acad.Sci.USA85:2444[1988；程序如威斯康辛遺傳學(xué)軟件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(GeneticsComputerGroup,Madison,WI);和Devereux等人，Nucl.AcidRes"12:387-395[1984)。例如，PILEUP是測定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用遞進的、配對的比對從一組相關(guān)序列中創(chuàng)建多重序列比對。其也可以繪制樹狀圖，顯示用于創(chuàng)建比對的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35:351-360[1987)的遞進比對方法的簡化版。該方法與Higgins和Sharp(Higgins和Sharp,CABIOS5:151-153[1989)所述方法相似。有用的PILEUP參數(shù)包括3.00的默認(rèn)空位權(quán)重、0.10的默認(rèn)空位長度權(quán)重，和加權(quán)的末端空位。有用的算法的另一個實例是BLAST算法，其由Altschul等人(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410，[1990；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787[1993J)描述。一個尤其有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(見Altschul等人，Meth,Enzymol"266:460-480[1996)。參數(shù)"W"、"T"和"X"確定了比對的靈敏度和速度。BLAST算法使用下述默認(rèn)值11的字長(W)、BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1989])、50的比對(B)、IO的期望(E)、M，5、N，-4和比較兩條鏈。本文使用的"百分比(％)核#列同一性"被定義為候選序列中與序列核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。本文使用術(shù)語"雜交"是指下述過程，如本領(lǐng)域所已知的，核酸鏈通過所述過程經(jīng)由堿基配對與互補鏈結(jié)合。本文使用短語"雜交條件"是指進行雜交反應(yīng)的條件。這些條件通常通過在測量雜交的條件的"嚴(yán)格性"程度來分類。嚴(yán)格性程度例如可基于核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的退火溫度(Tni)。例如，"最大嚴(yán)格性"通常在約Tm-5。C(低于探針Tm5X:)發(fā)生；"高嚴(yán)格性"在約低于Tm5-10。C;"中嚴(yán)格性"在約低于探針Tm10-20°C;"低嚴(yán)格性"在約低于Tm20-25。C?？蛇x地，或另外地，雜交條件可基于雜交和/或一次或多次嚴(yán)格性洗滌的鹽或離子強度條件。例如，6xSSC:非常低嚴(yán)格性；3xSSC—氐到中嚴(yán)格性；lxSSC=中嚴(yán)格性；且0.5xSSC=高嚴(yán)格性。功能上地，最大嚴(yán)格性條件可用于鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或接近嚴(yán)格同一性的核列，而高嚴(yán)格性條件用于鑒定與探針具有約80%或更多序列同一性的核^列。為了需要高選擇性的應(yīng)用，可期望使用相對嚴(yán)格的條件形成雜交體(例如使用相對低鹽和/或高溫的條件)。在至少兩條核酸或多肽的語境中，短語"基本相似"和"基本同一"通常表示多核苷酸或多肽包含與參考(例如野生型)序列相比具有至少約40%同一性，更優(yōu)選至少約50%同一性，還更優(yōu)選至少約60%同一性，優(yōu)選至少約75%同一性，更優(yōu)選至少約80%同一性，還更優(yōu)選至少約卯％同一性，仍然更優(yōu)選約95%同一性，最優(yōu)選約97%同一性，有時多達(dá)約98%和約99%序列同一性的序列。序列同一性使用已知的程序測定，所述程序如使標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST、ALIGN和CLUSTAL(見例如AItschuI，等人，丄Mol.Biol.215:403-410[19卯；Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1989；Karin等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA90:5873[1993；和Higgins等人，Gene73:237-244[1988)。公眾可通過國家生物技術(shù)信息中心(NationaICenterforBiotechnologyInformation)獲得用于進行BLAST分析的軟件。還可使用FASTA(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-24481988)搜索數(shù)據(jù)庫。兩條多肽基本同一的一個指征是第一條多肽與第二條多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。通常，由于保守M酸取代而有差異的多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。因此，例如當(dāng)兩條肽差異僅為保守取代時，多肽與第二條多肽基本同一。兩條核^列基本同一的另一指征是兩種分子在嚴(yán)格條件(例如在中到高嚴(yán)格性范圍內(nèi))下彼此雜交。本文使用術(shù)語"雜交體過水解酶，，和"融合過水解酶，，是指從至少兩種不同或"親本"蛋白質(zhì)改造的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，這些親本蛋白質(zhì)彼此是同源物。例如在一些實施方案中，優(yōu)選的雜交體過水解酶或融合蛋白含有蛋白質(zhì)的N-端和該蛋白質(zhì)同源物的C-端。在一些實施方案中，將兩個末端組合，對應(yīng)于全長活性蛋白質(zhì)。本文使用術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"是指控制核酸序列表達(dá)的一些方面的遺傳元件。例如，啟動子是促進有效連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)元件。另外的調(diào)節(jié)元件包括剪接信號、多聚腺苷酸化信號和終止信號。本文使用"宿主細(xì)胞"通常是用栽體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主，所述載體使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能夠復(fù)制編碼蛋白質(zhì)變體的載體或表達(dá)期望的蛋白質(zhì)變體。在編碼蛋白質(zhì)變體的前形式或前原形式的栽體的情況下，這類變體被表達(dá)時通常從宿主細(xì)胞中被分泌至宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。在將核酸序列插入細(xì)胞中的語境中，術(shù)語"引入的"是指例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的方法。轉(zhuǎn)化的手段包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、氯化釣沉淀、電穿孔、棵DNA等，如本領(lǐng)域所已知的(見Chang和Cohen，Mol.Gen.Genet.，168:111-115[1979;Smith等人，Appl.Env.Microbiol"51:634[1986;和Ferrari等人,在Harwood，Bacillus中，PlenumPublishingCorp.,第57-72頁[1989]的綜述文章)。本文使用術(shù)語"啟動子/增強子"表示下述DNA區(qū)段，其含有能夠提供啟動子和增強子兩種功能的序列(例如反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)含有啟動子和增強子兩種功能)。增強子/啟動子可以是"內(nèi)源的"或"外源的，，或"異源的"。內(nèi)源增強子/啟動子是與基因組中給定基因天然連接的增強子/啟動子。外源(異源)增強子/啟動子是借助于遺傳操作(即分子生物學(xué)技術(shù))被置于與基因并列的增強子/啟動子。表達(dá)載體上"剪接信號"的存在常導(dǎo)致重組轉(zhuǎn)錄本更高水平的表達(dá)。剪接信號介導(dǎo)從初級RNA轉(zhuǎn)錄本上去除內(nèi)含子，并由剪接供體和受體位點組成(見例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork[19891，第16.7-16.8頁)。常用的剪接供體和受體位點是來自SV40的16SRNA的剪接點。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"是指外來DNA進入被轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組中的引入和整合。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子"是指被轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA中穩(wěn)定整合了外來或外源DNA的細(xì)胞。本文使用術(shù)語"可選擇標(biāo)記物"或"可選擇基因產(chǎn)物，，是指編碼下述酶活性的基因的4吏用，所述酶活性賦予表達(dá)可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞對抗生素或藥物的抗性。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的方法和組合物，其包含至少一種過水解酶。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的某些實施方案在涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用中尤其有用。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了過水解酶，其適用于從酯底物和過氧化氫酶促產(chǎn)生長鏈過酸。主題過水解酶產(chǎn)生的過酸取決于被主題過水解酶過水解的酯底物。在一些實施方案中，主題過水解酶產(chǎn)生的過酸包括但不僅限于過己酸、過辛酸、過壬酸、過癸酸、過十二烷酸、過肉豆蔻酸、過棕櫚酸、過^f更脂酸或過油酸。在另外的實施方案中，多種底物適用于本發(fā)明。在一些實施方案中，如下文所更詳細(xì)描述的，長鏈酯底物為Q到C1()底物或Cu+底物(例如<:-<:22底物)，取決于期望的過酸。如下文所更詳細(xì)描述的，多種不同的長鏈酯底物適用于本發(fā)明。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，酯底物選自以下一種或多種己酸酯、辛酸酯、壬酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸酯，或其任何飽和或取代的形式。在另外的實施方案中，多種酯適用于本發(fā)明。本發(fā)明的過水解酶和過酸適用于在廣泛的pH和溫度范圍下清潔、漂白和/或消毒。在一些實施方案中，這一代中使用的pH范圍是約4到約12。在一些可選的實施方案中，使用的溫度范圍在約5。C和約90。C之間。事實上，本發(fā)明的一些實施方案提供了超過目前使用的體系(見例如EPAppln.87-304933.9)的優(yōu)點，因為4吏用本發(fā)明，可能在過酸氧化的最適pH下進行漂白，以及在中性pH、酸性pH和低溫下提供漂白。長鏈過酸是低氣味或無氣味的。同樣，本發(fā)明過水解酶的使用提供了超過其它體系(例如局限于生產(chǎn)更短鏈過酸的其它過水解酶，所述更短鏈過酸具有顯著的氣p未)的某些優(yōu)點。盡管在本文中大部分完全涉及洗衣和織物護理描述本發(fā)明，但是不旨在將本發(fā)明限制于這些應(yīng)用。事實上，本發(fā)明適用于多種情況，尤其是其中期望通過過酸和/或過氧化氫漂白的情況，包括但不僅限于洗衣、盤碟清洗、織物處理、紙漿和紙張加工、個人護理應(yīng)用、硬表面的消毒和清潔。例如，預(yù)期本發(fā)明的組合物會適用于漂白紙漿，包括在如美國專利Nos.6,569,286、5,785,812、6,165,318和4,400,237中公開的方法中使用，所述專利均通過參考并入本文。歷史上過硼酸鈉和更近期的過碳酸鈉均被用作漂白化合物，尤其是在歐洲的洗衣洗滌劑中。這些化合物趨向于在水溶液中快速分解，產(chǎn)生過氧化氫(11202)，所述過氧化氫是活性漂白種類。因為過硼酸鈉在高于80。C的溫度下更有活性，在40-60。C(即如在50年代已成為最普遍優(yōu)選的洗滌溫度)的溫度范圍內(nèi)活性較低，所以向含有過硼酸鈉的洗衣洗滌劑中摻入漂白活化劑。事實上，大部分洗衣洗'滌劑含有漂白活化劑。這些活化劑是具有O-或N-結(jié)合的乙?；幕衔铮淠軌蚺c強親核過氧氫陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生過氧乙酸。因為反應(yīng)種類是過氧氫陰離子，所以堿性pH對于將這些活化劑有效轉(zhuǎn)化為過酸是必需的。過氧乙酸在弱堿性介質(zhì)中分解，形成單線態(tài)氧(見例如Hofmann等人，J.Prakt.Chem.，334:293-297[1992)。過氧化氫是在高溫度(例如>40°0和pH(〉10)下尤其有效的漂白劑，所述條件在一些情況下通常用于洗滌織物。然而，如上文所示，冷水洗滌開始更普遍地被使用，并導(dǎo)致比使用熱水時更不有效的11202漂白。為了克服該低溫缺點，洗滌劑制劑通常包含漂白助促進劑如TAED(N，N，N，N，-四乙酰基乙二胺)、NOBS(壬酰氧基苯磺酸鹽(nonanoyloxybenzenesulfonate))等。當(dāng)NOBS與11202組合形成過壬酸時，TAED與11202組合形成過乙酸，其為比單獨的H202更有效的過酸種類。盡管其有助于洗滌劑的漂白能力，但是TAED反應(yīng)僅約50%有效，因為TAED中四個乙酰基中只有兩個被轉(zhuǎn)化為過酸。另外，TAED被過氧化氫轉(zhuǎn)化為過乙酸僅在堿性pH和高溫下是有效的。因此，TAED反應(yīng)未被優(yōu)化為在所有漂白應(yīng)用(例如涉及中性或酸性pH和冷水的應(yīng)用)中使用。本發(fā)明提供了克服TAED使用的缺點的手段。例如，本發(fā)明的一些尤其優(yōu)選的實施方案適用于冷水應(yīng)用，以及涉及中性或酸性pH水平的應(yīng)用。另外，本發(fā)明另外的尤其優(yōu)選的實施方案提供了從過氧化氫產(chǎn)生過酸的手段，具有高的過水解與水解的比例。這類手段提供了超過下述組合物的優(yōu)點，所述組合物含有具有非常低的過水解與水解比例的酶，如酯酶和脂肪酶。除了在洗滌劑中的應(yīng)用外，本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案提供了用于在紡織品漂白和多種其它應(yīng)用中使用過酸的方法和組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于紡織品加工應(yīng)用的一步驟方法，包括但不僅限于一步驟脫漿(desizing)、擦洗(scouring)和漂白過程(見例如WO03/002810、EP1255888、WO01/64993和US2002/0007516，其均通過參考并入本文)。如在本文中更詳細(xì)描述的，在一些實施方案中，漂白涉及在將紡織品材料染色之前和/或?qū)⑵鋼饺爰徔椘飞唐?goods)之后加工紡織品材料。然而，不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的使用方案或任何特定的紡織品材料。另夕卜，許多過酸適合用作有效的殺菌劑(見Baldry，J.Appl.Bacteriol.，54:417-423[1983)。因此，本發(fā)明的某些實施方案提供了用于滅菌/消毒多種對象的組合物和方法，所述對象包括但不僅限于醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)療裝置、工業(yè)裝置和發(fā)酵罐，以及需要被滅菌和/或消毒的任何對象。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了適用于生物膜控制(例如在冷卻塔中)的組合物和方法。如在下文實施例中還更詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了用于清潔和/或滅菌大范圍對象的許多優(yōu)點。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了在洗滌溫度和pH范圍內(nèi)有效清潔、漂白和消毒的組合物。還在其它實施方案中，本發(fā)明適用于通過過水解酶過酸降解活性降解過酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，該活性凈皮用于過晚良物凈化應(yīng)用中。另外，本發(fā)明的某些過水解酶對多種?；w底物是有活性的，并且在低底物濃度下是有活性的，并且提供了由于高過酸:酸比例而有效過水解的手段。事實上，已經(jīng)認(rèn)識到更高的過水解與水解的比例對于漂白應(yīng)用是優(yōu)選的(見例如美國專利No.5,352,594、5,108,457、5,030,240、3974,082和5，296，616，其均通過參考并入本文)。本發(fā)明的某些過水解酶提供了大于l的過水解與水解的比例。在特定的實施方案中，過水解酶提供了大于l的過水解與水解的比例，并且適用于漂白。另外，本發(fā)明的過水解酶已顯示在常用的洗滌劑制劑(例如ArielFutur、WOB等)中是有活性的。因此，主題過水解酶在多種清潔情況下提供了許多優(yōu)點。如上所述，通過酶促過水解生產(chǎn)過酸的特定組分為酶、酯底物和過氧化氫。在一些實施方案中，過氧化氫直接分批添加，而在其它實施方案中，其持續(xù)原位產(chǎn)生。目前的清洗粉末以過碳酸鹽或過硼酸鹽的形式使用H202的分批添加，所述鹽自發(fā)分解為11202。本發(fā)明的過水解酶也適用于與H202來源相同的清洗粉末分批方法中。然而，這些酶也適合與任何其它合適的11202來源一起使用，包括通過化學(xué)、電化學(xué)和/或齊&手段產(chǎn)生的H202。化學(xué)來源的實例包括但不僅限于上述過碳酸和過硼酸。電化學(xué)來源的非限，而酶促實例的非限制性實例包括由葡萄糖和氧與葡糖氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)生H202。以下的方程提供了適用于與本發(fā)明一起使用的偶聯(lián)體系的實例。g糖氧化酶--------------------------------》葡糖酸+11202+過水解酶---------------------------------醇+過酸不旨在將本發(fā)明的任何實施方案限制于任何具體的酶，因為與合適的底物產(chǎn)生H202的任何酶均適用于本發(fā)明。例如，來自乳桿菌屬(丄《"0紐"7/附)物種的乳酸氧化酶適用于本發(fā)明，已知所述酶從乳酸和氧產(chǎn)生11202。事實上，本發(fā)明的某些方法的一個優(yōu)點是酸(例如在上述實例中為葡糖酸)的產(chǎn)生將堿性溶液的pH降低至下述pH范圍，過酸在所述pH范圍中(即接近pKa)在漂白中最有效。能夠產(chǎn)生過氧化氫的其它酶(例如醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、氨基酸氧化酶等)也適合與本發(fā)明的過水解酶組合與酯底物一起用于產(chǎn)生過酸。如本文中更詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的包含至少一種過水解酶的方法和組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案尤其適用于涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用。本發(fā)明提供了包含過水解酶的組合物及其使用方法，所述過水解酶將長鏈?；サ孜镞^水解，產(chǎn)生長鏈過酸。在一些實施方案中，本發(fā)明尤其適用于包括清潔、漂白和/或消毒的應(yīng)用。如上所述，本申請要求專利申請WO05/056782的優(yōu)先沖又。WO05/056782的完整公開內(nèi)容通過參考并入本文用于所有的目的，所述公葡萄糖+O:H202+酯底物開內(nèi)容包括但不僅限于對過水解酶、氨基酸變更、晶體結(jié)構(gòu)、測定方法、使用方法、序列、同源物、直向同源物、序列比對、圖、表、清潔組合物等的所有描述。還應(yīng)注意，在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本文提供的酶水解以及過水解長鏈酰基酯底物。過水解酶如上所述，本發(fā)明提供了過水解長鏈?；サ孜锏倪^水解酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，存在長鏈?；サ孜锖瓦^氧化氫時，酶產(chǎn)生長鏈和中鏈過酸。在一些實施方案中，過水解酶相對于天然存在的過水解酶(例如天然存在的恥垢分枝桿菌(SEQIDNO:2)過水解酶)具有變更的底物特異性，因為主題過水解酶能夠以比對短鏈酯底物水解速率更高的速率過水解長鏈乙酯底物。在一些特定的實施方案中，過水解酶能夠以下述速率過水解長鏈酯底物，所述速率比對小鏈酯底物的過水解速率高至少大約10%,至少大約50%，至少大約100%，至少大約200%，至少大約500%或至少大約10,000%。在一些實施方案中，主題過水解酶的長鏈酯過水解速率:短鏈酯水解速率比值是至少約1，至少約2，至少約3，至少約IO，至少約100或至少約10,000，其中短鏈酯底物包括過乙酸酯和過丁酸酯，長鏈酯底物包括過辛酸酯。主題過水解酶中的多個氨基酸在本文中根據(jù)它們在酶的一級J^,列中的位置命名(例如"主題過水解酶可在12位上含有Gly")。如上所述，并如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，主題過水解酶的氨基酸位置相對于SEQIDNO:2的過水解酶(即野生型恥垢分枝桿菌的過水解酶)的相應(yīng)位置定義。在優(yōu)選的實施方案中，相應(yīng)的M酸位置通過結(jié)構(gòu)分析和/或通過將主題過水解酶的一級氨基酸序列與SEQIDNO:2比對鑒定。比對相關(guān)酶一級氨基^jf列的方法是^^知的(見例:ft口Upton和Buckley,TrendsBiochem.Sci，，20:178[1995)。另夕卜，WO05/056782中提供了非限制性的比對。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶具有下述M酸序列，其與親本酶(例如由孩史生物編碼的野生型酶，但是不旨在將本發(fā)明限制于野生型酶的變體，因為經(jīng)改造的酶可用作親本酶)的氨基酸序列至少約35%同一。在一些實施方案中，本發(fā)明的過水解酶與微生物基因組編碼的野生型酶相關(guān)，但不相同。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶具有下述氨基酸序列，所述JU^酸序列與親本酶(例如恥垢分枝桿菌的野生型過水解酶，或WO05/05678中所示的過水解酶的變體，或如WO05/05678中所示的細(xì)菌基因組編碼的、天然存在的?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)酶)氨基#列至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%,至少約60%，至少約65%,至少約70%,至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約卯％，至少約95%，至少約97%，至少約98%，或至少約99%。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明過水解酶的M酸序列與親本酶差異在于小量的氨基酸殘基。差異氨基酸殘基的數(shù)量可以是約1個，約2個，約3個，約4個，約5個，至少約10個，至少約15個，至少約20個，至少約30個，至少約40個，至少約50個，或更多個氨基酸殘基。在一些實施方案中，變體之間差異氨基酸的數(shù)量在約1個到約10個之間。在一些實施方案中，本發(fā)明的過水解酶包含以下氨基酸的任何一個或組合位置12上的Gly、Pro或Gln，位置22上的Trp，位置59上的Pro,位置153上的Pro，位置154上的Thr、Ser、Val或Gln,位置194上的Gly，位置196上的Ser、GIn、Val、Gly、Pro、lie或His和/或位置204上的Tyr或Trp。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶包含a)位置154上的Ala和位置194上的Met,b)位置154上的Gly和位置194上的Val，或c)位置12上的Gly和位置194上的Met,d)位置154上的Thr和位置196上的lie,e)位置12上的Gin和位置154上的Val，f)位置12上的Met和位置154上的Glu，g)位置12上的Gly和位置154上的Gly，h)位置154上的Glu和位置194上的Ser，或i)位置12上的Gly和位置22上的Trp，或其任意組合。盡管不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的機制，但是這些氨基酸的存在提供了能夠水解長鏈?；ギa(chǎn)生長鏈過酸的過水解酶。在一些實施方案中，用上述氨基酸之一取代野生型過水解酶的^酸產(chǎn)生與野生型過水解酶相比具有變更的底物特異性的過水解酶。在一些實施方案中，過水解酶過水解長鏈?；サ孜铮缓幸粋€在一些其它實施方案中，本發(fā)明的過水解酶對長鏈酰基酯底物具有比短鏈?；サ孜锔蟮奶禺愋?。如WO05/05678中所述，詳細(xì)研究了若干種過水解酶的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，所述酶包括天然存在的恥垢分枝桿菌過水解酶及其數(shù)百個活性變體和來自其它物種的同源酶。事實上，預(yù)期可對過水解酶進行大范圍的氨基酸取代而不消除其活性。另外，可以將上述特異M酸取代進任何過水解酶中，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生長鏈過酸的過水解酶。WO05/056782中提供了天然存在的恥垢分枝桿菌過水解酶的氨基酸坐標(biāo)及其晶體結(jié)構(gòu)的討論。另外如WO05/056782中所報道的，已對恥垢分枝桿菌過水解酶進行飽和誘變，從而系統(tǒng)地測試酶中每個M酸位置上氨基酸取代的作用。在這些實驗中，將恥垢分枝桿菌過水解酶的每個M酸用其余19個氨基酸的每個來取代，并系統(tǒng)地針對多種活性測試每個變體，所述活性包括其水解活性、其過水解("PAF")活性、過酸降解("PAD")活性、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性等。WO05/056782中顯示了數(shù)百個氨基酸取代的列表，所述氨基酸取代是某些實施方案所容許并且在某些實施方案中可用于變更恥垢分枝桿菌過水解酶的水解活性、過水解活性、過酸降解活性或穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一些實施方案中，賦予過水解長鏈酯底物的能力的任何氨基酸變更與WO05/056782中所述的任何氨基酸變更組合，產(chǎn)生本文所述蛋白質(zhì)的變體。在一些實施方案中，氨基酸變更^L組合，以產(chǎn)生了過酸水解率提高或降低、和/或過水解/水解比例提高或降低的變體。在一些優(yōu)選的實施方案中，將提供長鏈過酸的一個或多個氨基酸變更與提供具有更高的過水解與水解比例(例如大于1.0的比例)和更低的過酸水解率(例如與SEQIDNO:2相比少于0.8的過酸水解率)的過水解酶的變更組合，以提供有效生產(chǎn)長鏈過酸的過水解酶。在一些實施方案中，并且沒有任何意圖將本發(fā)明的任何方面限制于任何特定的序列，本發(fā)明的過水解酶包含a)提供一條或多條上述長鏈過酸的變更，和b)—個或多個變更，其提供與野生型恥垢分枝桿菌過水解酶相比約0.8或更少的過酸水解率。在一些這樣的實施方案中，提供約0.8或更少的過酸水解率的一個或多個變更包含至少一個選自以下的取代A122,A23，A29，A55，D45,D62,D65，E26,E50,F150,F46,Gl10，G124,G43，L109,Ll19,L42,L68，L78,L82,L84,N59,P66,詣l，R27,R4，R67，Sl12,S54，S76,Tl16,T120，T25,V125,V48,W149,Y73，A44,A79，D85,E51，G124，G126,G15,G52,1194,K97,LI19,L12，L38,L53,L68,L86，N94,P18,RlOl，R27,R4,R67，S54,S72，T58,T80，V118，V87,W34,R4，15，DIO，L12,W14,V19,T25，W34,149,E50,E51，L53,S54,A55,R56，N59，D62,T64,D65,R67，L68,N69,S76，C77,T80,L82,P83,L86,V87,N94,T96,F100,RlOl,L109,Ml11,L4,Ll19,W149,Yld29,A22,G26,T27'A23，A55,A79,D65,D85,E26，F(xiàn)154,Gl10,G124,G126,G22,G36，G43,G52，G70,149,K97,L109,Ll14,Ll19,L12,L38,L42，L53,L68,L86,P104,P83,Q41,R102,R56,R67,S54,T57，VI18,V125,W14,W149，Y129,Y73,A22,A23，A79,D45,D65,D85，E26,E47,E51'F150'F196，F(xiàn)28,Gl10'G124，G36，G43,G52，G70，1107,15,160,L109,Ll19'L53，L6,L68,L82,Ml11,P104,P66,R102，R67,Sl1,Sl12，S121,S54,S72，T25,T35,T57,T58,VI18,V125,V19,W149,W16,A108,A122,A23,A29，A79，C7'D106，D21，D45,D62,D65,D85,E50，F(xiàn)150,F28，G124，G126,G22，G36,G52,1107,1194，K97，L105,L109,Ll14'Ll19,L38,L68，L78，L82,L84,Ml11，N69，N94,P104,P63，P66，R102,R27，Sl1，Sl12,S54,S72,Tl16,T120,T127，T13,T25，T57，T80,T96,VI13,A122,A29,A71，A79,C7,D106,D21,D61，D65,D85，E47,E50,F150,F196,F28,F46，G124,G126,G15,G36,G70,149,15,160,L105，L109,L12,L38,L42，L53,L84，L86,Ml11,N59，P146,P24，P66,Q化R102,R27,R56，S112,S121，S54,S72,Tl16,T120,T127，T128'T13,T57，T64,V125,V17,V19,W14，W149,W16,Y129,Y99,A108,A122，A23，A29，A44，A55,A71,A79，C77,D45,D61，D65，D85,D95,E47，E51,F150，F(xiàn)196,F46,Gl10,G126,G36,G43,G52，II07,固，149，15'160,189，Ll14，L42,L53,L68,L78，L84，Ml11,N59,簡，P146,P24，P30,P63,P66，P83，Ql17，RlOl，R4，Sl12,S121,S72，Tl16'T120,T127,T13,T57，T96,VI13,V125'V17,V19,V32,V87,W149,Y129,Y73，G190，V191，G193,T197,N201,D203，L208，A209,V212,L215，和L216,在一些實施方案中，一個或多個變更提供約0.1或更少的過酸水解率，所述變更是至少一個選自以下的取代R4、L12、G15、P18、R27、W34L38、A44、E51、G52、L53、S54、T58、R67、L68、S72、A79、T80、D85、L86、V87、N94、K97、RlOl、V118、L119、G124、G126和1194。在其它實施方案中，并再次沒有任何意圖將本發(fā)明的任何方面限制于任何特定的序列，本發(fā)明的過水解酶包含a)提供一條或多條上述長鏈過酸的變更，和b)—個或多個變更，其提供過水解的改變，使得變體過水解酶過水解與野生型過水解酶過水解的比例為至少約1.2。在一些這樣的實施方案中，提供一個或多個變更(其提供過水解改變，使得變體過水解酶過水解與野生型過水解酶過水解的比例為至少約1.2)的一個或多個變更選自C7，D10'L12,G15，P18，V19,G22，T25,E26，R27,F28，A29,P30，D31,G36,Q40,Q41，L42,G43,A44,D45,F46，E47，149,E51，L53，S54,A55，T57,D61，P63,T64,D65,P66,R67，L68，N69，A71，S72,Y73,S76,L78,A79，T80，L82,P83，D85，L86，D95，K97，R101,T103,P104,L105，D06,1107,L109,Ml11,VI13，Ql17'VU8，S121,G124，V125'G126,T127，P148,F150,1153，F(xiàn)154，和F196。在一些優(yōu)選的實施方案中，一個或多個變更提供過水解改變，使得變體過水解酶過水解與野生型過水解酶過水解的比例為至少約2，所述變更選自A44、C7、D10、D85、D95、E26、E47、1107、L12、L42、P104、P148、S54、Q40、Q117、D203、V206、E210、K97、L12、P104、V125、D85、L53和L78。在一些可選的優(yōu)選的實施方案中，并再次沒有任何意圖將本發(fā)明的任何方面限制于任何特定的序列，本發(fā)明的過水解酶包含一個或多個提供上述長鏈的變更，以及提供下述過7jC解酶的jL^酸取代，所述過水解酶顯示與野生型過水解酶相比至少約1.2的過水解活性比例，和約0.8或更少的過酸水解活性比例。在一些這樣的實施方案中，取代選自A29、A44、A55、A71、A79、C7、D10、D106、D31、D85、E26、E47、F150、F154、F196、F28、G124、G126、G36、G43、1153、L109、L42、L53、L109、L42、L53、L109、L42、L53、L68、L82、L86、Mlll、N69、P104、P148、P18、P63、P66、P83、Q117、Q40、RlOl、R67、S54、S121、S72、S76、T25、T64、V115和V19。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用以下的氨基酸取代L12I和S54V;L12M和S54T;L12T和S54V;L12Q、T25S和S54V;L53H和S54V;S54P和V125R;S54V和V125G;S54V和F196G;S54V、K97R和V125G;以及A55G、R67T、K97R和V125G，如WO05/056782中所述。主題過水解酶活性必需的M酸描述于WO05/056782中，如過水解酶中適合變更而不消除其活性的氨基酸。WO05/056782還描述了來自除恥垢分枝桿菌以外的物種的若干過水解酶，以及在該過水解酶家族中保守的結(jié)構(gòu)域，包括但不僅限于發(fā)根土壤桿菌C4g/Y^ffcteWw附Wl&Og^lM)(Q9KWA6)、發(fā)根土壤桿菌(AWi/wge"es)(Q9KWB1)、根癌農(nóng)桿菌(A,w附e/""V附)(Q8UFG4)、根癌農(nóng)桿菌(Q8UAC0)、根癌農(nóng)桿菌(Q9ZI09)、才艮癌農(nóng)桿菌(ACA)、戶n^幼ea^tf"w(RVM04532)、百脈才艮才艮瘤菌(//i/z。6,"附./W)(Q98MY5)、苜蓿根瘤菌(兄附e/Z/W)(Q92XZ1)、苜蓿根瘤菌(Q9EV56)、毛根根瘤菌(/.M/^g^iM)(NF006)、毛根根瘤菌(NF00602875)、凡so/朋fl"mrw附(Q8XQI0)、苜蓿中華根瘤菌(S/"oWi/z^/"附me///^/)(RSM02162)、苜蓿中華根瘤菌(RSM05666)、百脈根中慢生根瘤菌(AfesoW^oWw/w/W)(RML000301)、發(fā)根土壤桿菌(Q9KWA6)、發(fā)根土壤桿菌(Q9KWB1)、根癌農(nóng)桿菌(AAD02335)、百樂M艮中慢生根瘤菌(Q98MY5)、百脈根中慢生根瘤菌(ZP00197751)、茄科雷爾氏菌(ifl/stow/aso/"wami尸m附)(Q8XQI0)、富養(yǎng)產(chǎn)械菌(/a/5tomVi)(ZP00166901)、牛莫拉菌(^^0^//6ov/s)(AAK53448)、洋蔥伯克氏菌(JwrA^0/f/eWflce/7"dfl)(ZP00216984)、紫色色桿菌(CAro附06a"en7i附v"/fl""附)(Q7NRP5)、小小梨形菌屬物種(尸/"〃"/"5/7.)(NP_865746)、創(chuàng)傷弧菌(v幼Wovw/my^M)(AA007232)、鼠傷寒沙門氏菌(Sfl/附o"e〃"(V/7A/附wWm柳)(AAC38796)、苜蓿中華根瘤菌(SMa1993)、苜蓿中華根瘤菌(Q92XZ1)和苜蓿中華根瘤菌(Q9EV56)。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列、序列比對和涉及上文的所有其它信息從WO05/056782中通過參考并入本文用于所有的目的。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，過水解酶是GDSL-GRTT/ARTT或38SGNH7jC解酶，如WO05/056782中所述。在一些實施方案中，該酶包含至少一個以下的保守殘基或其組合L6、W14、W34、L38、R56、D62、L74、L78、H81、P83、M卯、K97、GllO、L114、L135、F180和G205。如WO05/056782中所述，多種方法適用于測定過水解酶的活性。然而，不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的測定方法。用于確定過水解酶是否能夠使用長鏈乙基底物的合適的報告子底物包括，但不僅限于至少含有C6碳鏈的對硝基苯基酯(例如對硝基苯基己酸酯、對硝基苯基辛酸酯、對硝基苯基壬酸酯、對硝基苯基癸酸酯、對硝基苯基十二烷酸酯、對硝基苯基肉豆蔻酸酯、對硝基苯基棕櫚酸酯、對硝基苯基硬脂酸酯和對硝基苯基油酸酯)。適用的其它長鏈酯底物包括，但不僅限于己酸酯、庚酸酯、辛酸酯、壬酸酯和更高級羧酸如C10到C18或更高的酯。過水解酶生產(chǎn)野生型恥垢分枝桿菌過水解酶在其天然宿主中是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，本發(fā)明的過水解酶在非天然的宿主中細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。在一些實施方案中，對過水解酶添加信號序列，所述信號序列通過分泌^周質(zhì)(即在革蘭氏陰性生物如大腸桿菌中)或i^細(xì)胞外空間(即在革蘭氏陽性生物如芽孢桿菌屬(5fl"7/附)和放線菌屬(J"/wo附j(luò);c^)中)或真菌宿主(例:i口木霉屬(7Wc/ioflfer附fl)、曲霉屬(y45/7ew7/"s)、酵母屬(/S"flcc/raro附y(tǒng)ces)和畢赤酵母屬(尸/c/hVi))而幫助過水解酶的表達(dá)。不旨在將本發(fā)明限制于這些具體的宿主，因為多種其它生物，包括其它原核生物和真核生物適合用作本發(fā)明中的表達(dá)宿主。多種可商業(yè)獲得的表達(dá)體系，包括但不僅限于pBAD、plac、T7，適用于過水解酶在革蘭氏陰性宿主(例如大腸桿菌)中的表達(dá)。在一些實施方案中，相同類型的啟動子適用于另一革蘭氏陰性宿主檸檬泛菌芽孢桿菌屬物種是公知的用于表達(dá)細(xì)胞外蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)的合適宿主。蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較不公知。在一些實施方案中，在基因5'末端無信號序列時，^使用下述任何多種啟動子完成過水解酶蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌(及s"6說&)中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所述啟動子包括但不僅限于pVeg、pSPAC、pAprE或pAmyE。在一些實施方案中，從復(fù)制質(zhì)粒(高或低拷貝數(shù))達(dá)成表達(dá)，而在可選的實施方案中，通過將想要的構(gòu)建體整合進染色體中達(dá)成表達(dá)。整合可在任何基因座上完成，包括但不僅限于fl尸W、或/;/w基因座。在一些實施方案中，過水解酶由被整合的構(gòu)建體的一個或多個拷貝表達(dá)。在可選的實施方案中，通過整合能夠擴增的構(gòu)建體(例如與抗微生物劑盒連接，且側(cè)翼是直接重復(fù)的序列)獲得多重整合的拷貝，或通過將多拷貝連接并隨后整合進染色體中獲得多重整合的拷貝。在一些實施方案中，使用pNB活性測定(本文所述)在適宜的培養(yǎng)物中監(jiān)測用復(fù)制質(zhì)粒或整合構(gòu)建體對過水解酶的表達(dá)。如使用芽孢桿菌時一樣，在一些實施方案中，使用復(fù)制質(zhì)粒完成過水解酶在鏈霉菌屬(&"/7towj;c^)中的表達(dá)，而在其它實施方案中，通過將載體整合進鏈霉菌屬基因組中完成過水解酶的表達(dá)。能夠在鏈霉菌屬中被識別的任何啟動子適用于驅(qū)動過水解酶基因的轉(zhuǎn)錄(例如葡糖異構(gòu)酶啟動子，或A4啟動子)。復(fù)制質(zhì)粒也適用于本發(fā)明中用于表達(dá)，無論其為穿梭栽體或僅為鏈霉菌屬載體(例如pSECGT)。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的過水解酶從宿主細(xì)胞中分泌，從而過水解酶可從培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中被回收。清潔組合物如上所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的長鏈過水解酶的清潔組合物。在一些實施方案中，清潔組合物包含至少一種本發(fā)明的過水解酶、至少一種長鏈酯底物，和至少一種過氧化氫來源。在一些優(yōu)選的實施方案中，長鏈酯底物具有式R,C(K))OR2，其中R，包含至少5個碳原子的取代或未取代的碳鏈，且R2是任何有機部分。酯底物和過氧化氫來源在本文中更詳細(xì)描述。還在許多實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物中存在多種其它化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物適用于洗衣應(yīng)用、硬表面清潔和/或自動盤碟清洗應(yīng)用，以及個人護理/美容應(yīng)用(例如用于清潔假牙、牙齒、毛發(fā)和皮膚)。然而，由于它們的下述特有性質(zhì)，本發(fā)明的過水解酶理想地適用于洗衣應(yīng)用(例如織物的漂白)，所述特有性質(zhì)是在更低溫度溶液中提高的有效性和良好的色彩安全模式(superiorcolor-safetyprofile).另外，本發(fā)明的酶適用于顆粒和/或液體組合物，包括凝膠和乳劑。本發(fā)明的過水解酶還適用于清潔添加劑產(chǎn)品。在一些優(yōu)選的實施方案中，清潔添加劑產(chǎn)品理想地適合于包含在需要額外的漂白作用的清洗過程中。這類狀況包括但不僅限于低溫溶液清潔應(yīng)用。在一些實施方案中，添加劑產(chǎn)品最簡單的形式是本發(fā)明的一種或多種酶。在一些實施方案中，添加劑被包裝為用于添加至清潔過程中的劑型，所述清潔過程中使用過氧(peroxygen)來源并需要提高的漂白效果。這類單一劑型包括，但不僅限于丸劑、片劑、軟膠嚢或其它單一劑量單位(例如預(yù)先測量的粉末或液體)。在一些實施方案中，包含至少一種填料和/或運載體材料，從而增加清潔組合物的體積。合適的填料和/或運載體材料包括但不僅限于多種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽，以及滑石、粘土等。在一些實施方案中，用于液體組合物的填料和/或運載體材料包括水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇。這類醇的實例包括但不僅限于曱醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，組合物含有從約5%到約90%的這類材料。還在其它實施方案中，使用酸性填料降低pH。在一些可選的實施方案中，清潔添加劑包括活性過氧來源，例如醇的酯、二元醇的酯或多元醇的酯。還在另外的實施方案中，清潔添加劑包含一種或多種輔助成分。本發(fā)明的清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的本發(fā)明所提供的酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含至少0.0001重量百分比，從約0.0001到約1、從約0.001到約0.5或甚至從約0.01到約0.1重量百分比的至少一種本發(fā)明的過水解酶。除了典型的清潔組合物以外，容易理解本發(fā)明的過水解酶變體適用于在使用天然或野生型酶的任何目的中用途。因此，這類變體適用于例如條棒和液體急應(yīng)用、盤碟護理應(yīng)用(dishcareformulation)、表面清潔應(yīng)用、隱形眼鏡清潔溶液和/或產(chǎn)品、廢物處理、織物應(yīng)用、紙漿漂白、消毒劑、皮膚護理、口腔護理、毛發(fā)護理等等。事實上，不旨在將本發(fā)明的過水解酶的任何變體限制于任何特定的用途。例如在一些實施方案中，本發(fā)明的變體過水解酶除了包含降低的變應(yīng)原性外，還在洗滌劑組合物中具有增強的性能(與野生型或未經(jīng)修飾的過水解酶相比)。過氧化氫來源在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含過氧化氫來源，其可以是過氧化氫自身或是作為反應(yīng)產(chǎn)物生產(chǎn)過氧化氫的組合物。作為反應(yīng)產(chǎn)物生產(chǎn)過氧化氬的合適過氧化氫來源包括，但不僅限于選自以下的過氧來源(i)從約0.01到約50、從約0.1到約20、或從約1到10重量百分比的過酸鹽、有機過氧酸、脲過氧化氫及其混合物；(ii)從約0.01到約50、從約0.1到約20、或從約1到10重量百分比的糖類和從約0.0001到約1、或從約0.001到約0.5、從約0.01到約0.1重量百分比的糖類氧化酶；和(iii)其混合物。合適的過酸鹽包括但不僅限于選自堿金屬過硼酸鹽、堿金屬過碳酸鹽、堿金屬過磷酸鹽、堿金屬過硫酸鹽及其混合物的那些。在一些優(yōu)選的實施方案中，糖類選自單-糖類、二-糖類、三-糖類、寡-糖類及其混合物。合適的糖類包括選自以下的糖類D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-纖維二糖、2-脫氧-D-半乳糖、2-脫氧-D-核糖、D-果糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘油-D-古洛-庚糖(D-glycero-D-gulo-heptose)、D-乳糖、D-來蘇糖、L-來蘇糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、松三糖、L-蜜二糖、帕拉金糖(palatinose)、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-核糖、L-山梨糖、水蘇糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、L-木糖及其混合物。事實上，不旨在將本發(fā)明限制于任何特定的糖類，因為多種糖類適用于本發(fā)明。合適的糖類氧化酶包括，但不僅限于選自以下的糖類氧化酶搭糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.9)、半乳糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.9)、纖維二糖氧化酶(IUPAC分類EC1丄3.25)、吡喃糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.10)、山梨糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.11)和/或己糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.5)、葡糖氧化酶(IUPAC分類EC1.1.3.4)及其混合物。酯底物在一些實施方案中，與至少一種本發(fā)明的過水解酶一起利用了至少一種酯底物，所述酯底物包含脂族羧酸和/或芳香族羧酸和醇。在一些實施方案中，底物選自以下一種或多種己酸酯、辛酸酯、壬酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸酯，以及更長鏈的酯底物。在一些優(yōu)選的實施方案中，酯底物以下述量存在，所述量為清潔組合物重量的約0.01%到約99.9%，從約0.01%到約50%，從約0.1%到20%，或從約1%到約15%。在一些實施方案中，包含酯部分的合適分子具有式R'Ox[(R2)m(R3)np其中R'是選自以下的部分H或取代或未取代的烷基、雜烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和雜芳基；在本發(fā)明的一些實施方案中，R1包含1到50,000個碳原子，1到IO，OOO個碳原子或2到100個碳原子；各個W是被任選地取代的烷氧基化物部分，在本發(fā)明的一些實施方案中，各個W獨立地為乙氧基化物、丙氧基化物或丁氧基化物部分；R"是具有式R"CO-的酯-形成部分；所述式RtO-中，在本發(fā)明的一些實施方案中，R"選自H，取代或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和雜芳基；而在其它實施方案中，W是包含5到22個或更多個碳原子的取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈?；蛉不糠郑?到12個或更多個碳原子的芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、或雜芳基部分，或R4是取代或未取代的Qrdo或更長的烷基部分，或R"是取代或未取代的<:-<:22或更長的烷基部分；當(dāng)Ri是H時x是l;當(dāng)W不是H時x是等于或小于R'中碳數(shù)量的整數(shù)，p是等于或小于x的整數(shù)，m是從0到50的整數(shù)，從0到18的整數(shù)，或從0到12的整數(shù)，且n至少是l。在本發(fā)明的一些實施方案中，包含酯部分的分子是具有式WCM(R"m(R^p的烷基乙氧基化物或丙氧基化物，其中R1是C2-C32的取代或未取代烷基或雜烷基部分；各個112獨立地是乙氧基化物或丙氧基化物部分；Rs是具有式RtO-的酯-形成部分，所述式R"CO-中，在本發(fā)明的一些實施方案中，R"選自H，取代或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和雜芳基；而在其它實施方案中，R"選自包含5到22個或更多個碳原子的取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基或炔基部分，包含5到12個或更長原子的取代或未取代的芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、或雜芳基部分，或R"是取代或未取代的Cs-C，。或更長的烷基部分，或R"是取代或未取代的0<:22或更長的烷基部分；x是等于或小于R1中碳數(shù)量的整數(shù)，p是等于或小于x的整數(shù)，m是從l到12的整數(shù)，且n至少是l。在本發(fā)明的一些實施方案中，包含酯部分的分子具有式R'Ox[(R2)m(R3)np其中R'是H或包含伯胺、仲胺、叔胺或季胺部分的部分，包含胺部分的所述W部分選自取代或未取代的烷基、雜烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和雜芳基；在一些實施方案中，W包含i到50，ooo個碳原子，1到IO，OOO個碳原子或2到100個碳原子；各個W是烷氧基化物部分，在本發(fā)明的一些實施方案中，各個W獨立地是乙氧基化物、丙氧基化物或丁氧基化物部分；Rs是具有式R"CO-的酯-形成部分，所述式RtO-中，在本發(fā)明的一些實施方案中，議4選自H，取代或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基和雜芳基；在其它實施方案中，R"選自包含5到22個碳原子的取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基或炔基部分，包含9到12個或更多個碳原子的取代或未取代的芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、或雜芳基部分，或R"是取代或未取代的CVd?；蚋L的烷基部分，或R"是取代或未取代的C『C22或更長的烷基部分；當(dāng)I^是H時x是l;當(dāng)R'不是H時x是等于或小于RJ中碳數(shù)量的整數(shù)，p是等于或小于x的整數(shù)，m是從0到12或甚至從1到12的整數(shù)，且n至少是l。在本發(fā)明的任何上述實施方案中，包含酯部分的分子可具有下述重均分子量，所述重均分子量少于600,000道爾頓，少于300,000道爾頓，少于100,000道爾頓或甚至少于60,000道爾頓。包含酯部分的合適分子包括但不僅限于包含酯部分的多聚糖類。輔助材料盡管不是本發(fā)明的用途所必需的，但是下文闡述的輔料(adjunct)的非限制性列表適用于本發(fā)明的清潔組合物中。在一些實施方案中，摻入這些材料以幫助或增強清潔性能，用于處理待清潔的底物，或根據(jù)情況例如用香料、著色劑、染料等等修飾清潔組合物的美觀。應(yīng)當(dāng)理解這類輔料是除本發(fā)明的酶、過氧化氫來源和酯底物之外的。這些額外組分的精確性質(zhì)的性質(zhì)。合適的輔助材料包括但不僅限于表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、沉積助劑、*劑、額外的酶和酶穩(wěn)定劑、催化材料、漂白活化劑、漂白助促進劑、預(yù)形成的過酸、聚合物分歉劑、粘土污物去除/抗再沉積劑、增亮劑、抑泡劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)增彈劑、織物柔軟劑、運栽體、水溶助長劑、操作助劑和/或色素。除了下文的公開以外，這類其它輔料的合適實例和使用水平參見美國專利Nos.5，576，282、6,306,812和6,326,348，其通過參考并入本文。在一些實施方案中，上述輔助成分構(gòu)成本發(fā)明的清潔組合物的平衡。表面活性劑-在一些實施方案中，本發(fā)明提供的清潔組合物包含至少一種表面活性劑或表面活性劑體系，其中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑(ampholyticsurfactant)、兩性離子表面活'I"生劑(zwitterionicsurfactant)、半極性非離子表面活性劑及其混合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，表面活性劑通常以占主題清潔組合物重量從約0.1%到約60%、從約1%到約50%，或甚至從約5%到約40%的水平存在。大量已知的化合物是適用于包含本發(fā)明的過水解酶的組合物中的合適表面活性劑。這些包括非離子的、陰離子的、陽離子的、陰離子的或兩性離子的洗滌劑(見例如美國專利Nos.4,404,128和4,261,868)。合適的洗滌劑制劑是美國專利No.5,204,015(通過參考并入)中所述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用作清潔組合物的不同制劑。如上文所述，在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的洗滌劑組合物使用由于其在洗滌劑組合物中的用途而公知的表面活性劑(surfaceactiveagent)(即表面活性劑(surfactant)),包括陰離子的、非離子的和兩性表面活性劑。適合在本發(fā)明中使用的一些表面活性劑描述于英國專利申請No.2094826A中，其通過參考并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明中使用表面活性劑的混合物。本發(fā)明的洗滌劑組合物中使用的合適的陰離子表面活性劑包括但不僅限于線性或分支的烷基M酸鹽；具有線性或分支烷基或鏈烯基的烷基或鏈烯基醚硫酸鹽；烷基或鏈烯基硫酸鹽；烯烴磺酸鹽；鏈烷磺酸鹽等等。陰離子表面活性劑的合適抗衡離子包括但不僅限于堿金屬離子如鈉和鉀；堿土金屬離子如鈣和鎂；銨離子；和具有1到3個碳數(shù)量為2或3的鏈烷醇基的鏈烷醇胺。適用于本發(fā)明的兩性表面活性劑包括但不僅限于磺酸季銨鹽，甜菜堿型兩性表面活性劑等等。這類兩性表面活性劑在相同的分子中既具有正電荷基團又具有負(fù)電荷基團。適用于本發(fā)明的非離子型表面活性劑通常包括聚氧化烯醚，以及高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或其烯化氧加合物，脂肪酸甘油單酯等等。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的洗滌劑組合物中包含的表面活性劑或表面活性劑混合物以下述量提供，所述量為總洗滌劑組合物的從約1重量百分比到約95重量百分比，并優(yōu)選為總洗滌劑組合物的從約5重量百分比到約45重量百分比。如本文所述，在本發(fā)明的多個實施方案中，本發(fā)明的組合物中包含大量其它組分。然而，不旨在將本發(fā)明限制于這些具體的實例。事實上，預(yù)期額外的化合物會適用于本發(fā)明。下文的描述僅用于闡述一些任選的組分。蛋白質(zhì)，尤其是本發(fā)明的過水解酶可以以按重量計約0.001%到約5。/o(優(yōu)選0.1%到0.5%)的水平被配制進已知的粉末和液體洗滌劑中，所述洗滌劑具有3和12.0之間的pH。在一些實施方案中，這些洗滌劑清潔組合物還包含其它酶，例如蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、過氧化物酶、氧化還原酶、纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、膠質(zhì)裂合酶、木聚糖酶和/或內(nèi)切糖苷酶以及助洗劑和穩(wěn)定劑。向常規(guī)清潔組合物中添加蛋白質(zhì)不創(chuàng)造任何特殊的使用限制。換言之，適用于洗滌劑的任何溫度和pH也適用于本組合物，只要該pH在酶具有活性的范圍內(nèi)，并且溫度低于所述蛋白質(zhì)的變性溫度即可。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)適用于不含洗滌劑的清潔、漂白和消毒組合物，所述蛋白質(zhì)還是單獨的或與過氧化氫來源、酯底物(例如添加至使用的體系中或是使用的體系中固有的，例如含有酯的染色劑，含有酯的紙漿等)、其它酶、表面活性劑、助洗劑、穩(wěn)定劑等組合。事實上不旨在將本發(fā)明限制于任何具體的配制或應(yīng)用。助洗劑-本發(fā)明的清潔組合物可含有一種或多種洗滌劑助洗劑或助洗劑體系。使用助洗劑時，清潔組合物通常包含按清潔組合物的重量計至少約1%，從約3%到約60%，或從約5%到約40%的助洗劑。助洗劑包括但不僅限于多聚膦酸的堿金屬鹽、銨鹽和鏈烷醇銨鹽，堿金屬硅酸鹽，堿土金屬和堿金屬碳酸鹽，硅鋁酸鹽助洗劑聚羧酸鹽化合物，醚羥基聚羧酸鹽，馬來酐與乙烯或乙烯基.甲基醚的共聚物，1，3，5-三羥基苯-2，4，6-三磺酸，和羧甲基氧琥珀酸，多聚乙酸如乙二胺四乙酸和氨三乙酸的多種堿金屬鹽、銨鹽和取代的銨鹽，以及聚羧酸如苯六曱酸、琥珀酸、檸檬酸、氧基二琥珀酸、多聚馬來酸、苯1，3，5-三羧酸、羧甲基氧琥珀酸及其可溶鹽。螯合劑-在一些實施方案中，本文提供的清潔組合物含有至少一種螯合劑。合適的螯合劑包括但不僅限于銅、鐵和/或錳螯合劑及其混合物。使用螯合劑時，清潔組合物通常包含按主題清潔組合物的重量計從約0.1%到約15%，或從約3.0%到約10%的螯合劑。沉積助劑-在一些實施方案中，本文提供的清潔組合物還包含至少一種沉積助劑。合適的沉積助劑包括但不僅限于聚乙二醇，聚丙二醇，聚羧酸酯，污物釋i文聚合物如聚對苯二甲酸，粘土如高嶺土、蒙脫土、凹凸棒土(atapulgite)、4尹利石、膨潤土、多水高嶺土及其混合物。染料轉(zhuǎn)移抑制劑-還在一些其它的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物還包含一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。合適的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不僅限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基^悉唑烷酮和聚乙烯基咪唑或其混合物。存在于主題清潔組合物中時，染料轉(zhuǎn)移抑制劑通常以按清潔組合物重量計從約0.0001%到約10%、從約0.01%到約5%、或從約0.1%到約3%的水平存在。分散劑_在一些另外的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含*劑。合適的水溶性有機材料包括但不僅限于均聚酸或共聚酸或其鹽，其中多聚羧酸包含至少兩個羧基，其被不多于兩個碳原子彼此隔開。酶-在一些其它的實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑酶，所述酶提供清潔性能和/或織物護理益處。合適的酶的實例包括但不僅限于半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)酶(ligninase)、支鏈淀粉酶、鞣酶、戊聚糖酶(pentosanase)、malanases、卩-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。典型地組合是常規(guī)可應(yīng)用的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶和/或纖維素酶與淀粉酶組合的混合物。酶穩(wěn)定劑-可通過多種技術(shù)穩(wěn)定用于洗滌劑中的酶。本文中使用的酶可通過制成的組合物中水溶性釣和/或鎂離子來源的存在來穩(wěn)定，所述組合物對所述酶提供這類離子。預(yù)期酶穩(wěn)定劑會適用于本文提供的清潔組合物的一些實施方案中。催化金屬復(fù)合物-在一些實施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含催化金屬復(fù)合物。一種類型的含金屬漂白催化劑是下述催化劑體系，其包含具有確定的漂白催化活性的過渡金屬(transitionmetal)陽離子例如銅、鐵、鈦、釕、鴒、鉬或錳陽離子，具有很少或不具有漂白催化活性的輔助金屬(auxiliarymetal)陽離子如鋅或鋁陽離子，和對催化和輔助金屬陽離子具有確定的穩(wěn)定性常數(shù)的多價螯合劑(s叫uestrate)，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)及其水溶性鹽。這些催化劑的實例描述于U.S.4,430,243中，其通過參考并入本文。在一些實施方案中，借助于錳化合物催化本文提供的組合物。這類化合物和使用水平是本領(lǐng)域公知的，并包括例如U.S.5,576,282中公開的基于錳的催化劑，其通過參考并入本文。本文適用的鈷漂白催化劑是已知的，并例如描述于U.S.5,597,936和U.S.5,595,967中，二者均通過參考并入本文。通過已知的步驟容易地制備這類鈷催化劑，所述步驟例如在U.S.5,597,936和U.S.5,595,967中教導(dǎo)。在一些實施方案中，本文提供的組合物還包含巨大多環(huán)剛性配體(macropolycyclicrigidligand，"MRL")的至少一種過渡金屬復(fù)合物。就實踐而言，并非用于限制，在一些實施方案中調(diào)節(jié)本文提供的組合物和清潔過程，以在水性清洗介質(zhì)中提供大約每億活性MRL種中的至少一部分，并在洗液中優(yōu)選地提供從約0.005ppm到約25ppm，更優(yōu)選地從約0.05ppm到約10ppm，最優(yōu)選地從約0.1ppm到約5ppm的MRL。即時過渡金屬漂白催化劑中優(yōu)選的過渡金屬包括錳、鐵和鉻。本文中優(yōu)選的MRL是特異類型的超剛性(ultra-rigid)配體，其為交聯(lián)的(cross-bridged),例如5，12-二乙基-1,5,8,12-四氮二環(huán)6.6.21十六烷(5,12-diethyl-l，5，8，12-tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane)。通過已知步驟容易地制備合適的過渡金屬MRL，所述已知步驟例如在WO00/332601中，和U,S.6,225,464教導(dǎo)，二者均通過參考并入本文。清潔和洗滌制劑本發(fā)明的洗滌劑組合物以任何合適的形式提供，包括但不僅限于液體、顆粒、乳劑、凝膠和糊劑。使用固體洗滌劑組合物時，優(yōu)選地將洗滌劑配制為顆粒的形式。優(yōu)選地，將顆粒配制為額外含有保護劑(見例如1991年l月17日提交的美國申請系列No.07/642,669，其通過參考并入本文)。類似地，在一些實施方案中，顆粒被配制為含有下述材料，所述材料降低顆粒溶解進入清洗介質(zhì)中的速率(見例如美國專利號No.5，254，283，通過參考并入本文)。另外，本發(fā)明的過水解酶適用于下述制劑，其中底物和酶存在于相同顆粒中。因此在一些實施方案中，通過提供酶和底物的高局部濃度來提高酶的功效(見例如美國專利申請公開號US2003/0191033，通過參考并入本文)。本發(fā)明的清潔組合物被配制為任何合適的形式，并通過設(shè)計選擇的任何工藝制備，所述工藝的非限制性實例描述于美國專利No.5,879,584、美國專利No.5,691,297、美國專利No.5，574，005、美國專利No.5,569,645、美國專利No.5,565,422、美國專利No.5，516，448、美國專利No,5,489,392和美國專利No.5,486,303中；其均通過參考并入本文。本文提供的清潔組合物通常被配制為在含水清潔操作中使用時，清洗水會具有從約5.0到約11.5，或從約7.5到約10.5的pH。液體產(chǎn)品制劑通常凈皮配制為具有從約3.0到約9.0的pH。顆粒洗衣產(chǎn)品通常^皮配制為具有從約9到約11的pH。用于在推薦的使用水平上控制pH的技術(shù)包括使用緩沖液、堿、酸等，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在顆粒組合物或液體中使用本發(fā)明的酶時，有時需要酶是被包封的顆粒形式，從而保護該酶在儲存過程中免于接觸顆粒組合物的其它組分。另外，包封也是控制清潔過程中酶的有效性的手段，并可增強酶的性能。就這點而言，用本領(lǐng)域已知的任何合適的包封材料包封酶。包封材料通常包封至少部分酶。通常，包封材料是水溶性的和/或水分散性的。包封材料可具有0。C或更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)(見例如WO97/11151，其通過參考并入本文)。在一些實施方案中，包封劑(encapsulating)選自糖類、天然或合成的樹膠、甲殼質(zhì)和脫乙酰殼多糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟及其組合。當(dāng)包封材料是糖類時，其通常選自單糖、寡糖、多糖及其組合。通常，包封材料是淀粉。合適的淀粉描述于EPO922499、美國專利No.4,977,252、美國專利No.5,354,559和美國專利No.5，935，826中，其各通過參考并入本文。在一些實施方案中，包封材料是由塑料(例如熱塑塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球體。有用的可商業(yè)獲得的微球體包括但不僅限于由伊盤瑟公司(Expancel)(Stockviksverken，瑞典)在商標(biāo)EXPANCEL下提供的微球體，和由PQ公司(PQCorp.)(ValleyForge,PA)在商品名PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、EXTENDOSPHERES、LUXSIL、Q畫CEL⑧和SPHERICEL⑧下提供的微球體。除了上文所述的成分外，香料、緩沖劑、防腐劑、染料等等也可用于本發(fā)明。這些組分以本領(lǐng)域人員已知的濃度和形式提供。在一些實施方案中，通過任何已知的制備方法制備本發(fā)明的粉末狀洗滌劑基質(zhì)，所述方法包括噴霧干燥方法和成粒方法。尤其優(yōu)選通過噴霧干燥方法和/或噴霧干燥成粒方法獲得的洗滌劑基質(zhì)。通過噴霧干燥方法獲得的洗滌劑基質(zhì)不受制備條件的限制。通過噴霧干燥方法獲得的洗滌劑基質(zhì)是空心顆粒的形式，其通過將抗熱成分的含7^於漿噴霧進入熱的空間中獲得，所述抗熱成分例如表面活性劑和助洗劑。需要時，在噴霧干燥后添加香料、酶、漂白劑、無枳堿性助洗劑。對例如通過噴霧干燥成粒方法獲得的高密度、顆粒狀洗滌劑基質(zhì)而言，也可在制備基質(zhì)后添加多種成分。在包含液體洗滌劑基質(zhì)的一些實施方案中，該基質(zhì)是同質(zhì)的溶液，而在其它實施方案中，其為非同質(zhì)的M體。在一些實施方案中，在工業(yè)和家居用途中，在這些環(huán)境中常規(guī)^f吏用的溫度、反應(yīng)時間和液比例下，將本發(fā)明的洗滌劑組合物與這些用途中的織物(例如污織物)一起孵育。孵育條件(即對于用根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物處理材料有效的條件)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確認(rèn)。因此，對用如上所述，在一些實施方案中，本發(fā)明提供的洗滌劑在適當(dāng)?shù)娜芤褐杏谥卸萷H下被配制為預(yù)洗物(pre-wash)，其中存在足以提供下述想要的改進的活性，所述改進是柔軟、去毛球、防止起球、表面纖維去除或清潔中的改進。當(dāng)洗涂劑組合物是預(yù)浸漬(例如預(yù)洗或預(yù)處理)組合物時，通常使用以預(yù)浸漬或預(yù)處理組合物的總重為1^出從約0.00001%到約5%重量百分比的過水解酶，所述組合物為液體、噴霧、凝膠或糊劑組合物任一。在這樣的組合物中可任選地使用表面活性劑，使用表面活性劑時，其通常以下述濃度存在，所述濃度是以預(yù)浸潰物總重為基礎(chǔ)從約0.0005到約1的重量百分比。組合物的剩余部分包含預(yù)浸漬物(pre-soak)中使用的常規(guī)組分(例如稀釋劑、緩沖劑、其它酶(蛋白酶)等)，它們的濃度為其常規(guī)濃度。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的清潔組合物可用于清潔部位(situs)(例如表面或織物)。通常該部位的至少一部分與至少一種本文提供的清潔組合物(純的形式或在洗液中稀釋)接觸，然后任選地清洗和/或沖洗該部位。就本發(fā)明的目的而言，清洗包括但不僅限于擦洗和機械攪動?？椢锇軌蛟谡ＯM者使用條件下被洗滌的大部分任何織物。本文提供的清潔組合物通常在從約500ppm到約15,000ppm的濃度在溶液中使用。當(dāng)清洗溶劑是水時，水溫范圍通常從約5。C到約卯。C,當(dāng)部位包含織物時，水與織物的質(zhì)量比通常從約l:l到約30:1。實驗以下的實施例凈皮提供用于證明和進一步闡述本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案和方面，并且不應(yīng)被解釋為限制其范圍。PCT公開WO05/056782提供了過水解酶的鑒定和使用方法。該公開中的各個實施例單獨地通過參考并入本文，用于公開其中公開的所有方法，包括但不僅限于下述公開過水解酶的制備方法，鑒定過水解酶的方法，測試過水解酶、過水解酶多核苷酸和多肽序列的方法，使用過水解酶和其中可使用過水解酶的組合物的方法。在下文的實驗公開中，應(yīng)用以下的縮寫。C(攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；H20(7jc);HC1(鹽酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；照和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；nl和ul(孩吏升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；nm和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；jiM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特);MW(分子量);sec(秒);min(s)(分鐘);hr(s)(小時);MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD280(280nm下的光密度)；OD600(600nm下的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸緩沖鹽溶液[150mMNaCl、10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2)；SDS(十二烷基琉酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氬基甲烷)；TAED(N，N，N，N，-四乙?；叶?；w/v(重量比體積)；v/v(體積比體積)；Per(過水解酶)；嚴(yán)r(過水解酶基因)；Ms(恥垢分枝桿菌)；MS(質(zhì)鐠法)；AATCC(美國紡織品和有色化學(xué)家聯(lián)合會(AmericanAssociationofTextileandColoringChemists));WFK(wfk泰斯特韋博公司(wfkTestgewebeGmbH),Bruggen-Bracht，德國)；Amersham(阿默海姆生命科學(xué)7^司(AmershamLifeScience,Inc.)ArlingtonHeights,IL);Pierce(皮爾斯生物才支術(shù)7>司(PierceBiotechnology)，Rockford，IL);Amicon(艾米肯公司(Amicon，Inc.)，Beverly,MA);ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA);Amersham(阿默海姆生物科學(xué)公司(AmershamBiosciences,Inc.)，Piscataway，NJ);BectonDickinson(百科頓畫迪克森公司(BectonDickinsonLabware)，LincolnPark,NJ);BioRad(博奧雷德公司(BioRad)，Richmond,CA);Clontech(克隆技術(shù)實驗室公司(CLONTECHLaboratories)，PaloAlto，CA);Difco(蒂夫科實驗室公司(DifcoLaboratories)，Detroit,MI);GIBCOBRL或GibcoBRL(生命技術(shù)公司(LifeTechnologies,Inc.)，Gaithersburg，MD);Novagen(諾華公司(Novagen，Inc.)，Madison，WI);Qiagen(強基因公司(Qiagen，Inc.)，Valencia,CA);Invitrogen(英杰生命科學(xué)公司(InvitrogenCorp,)，Carlsbad,CA);Dionex(迪奧耐克斯公司(DionexCorp.)，Sunnyvale,CA);Sigma畫Aldrich(西格瑪-阿爾德里克化學(xué)品公司(Sigma-AldrichChemicalCo.)，St.Louis,MO);Sorvall(索沃儀器公司(SorvallInstruments)，杜邦公司(DuPontCo.)的子公司，生物技術(shù)系統(tǒng)(BiotechnologySystems)Wilmington,DE);Stratagene(斯萊特因克隆系M/^司(StratageneCloningSystems)，LaJolla,CA);Roche(霍夫曼-拉-羅切^^司(HoffmannLaRoche,Inc.)，Nutley，NJ);MolecularDevices(分子設(shè)備公司(MolecularDevices,Corp)，Sunnyvale,CA);和Agilent(安捷倫4支術(shù)z〉司(AgilentTechnologies)，PaloAlto,CA)。實施例1鑒定水解對硝基苯基己酸酯(pNC6)的過水解酶如PCT公開WO05/056782中所述，克隆了恥垢分枝桿菌過水解酶基因的過水解酶基因。恥垢分枝桿菌過水解酶基因的過水解酶基因核苷^列為ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCgccgccaccgctggcgcccatgccgcacccctggttccagttgatC:ttcgagggcggcgagcagaagaccactgagctcgcccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatgaaggtgCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA(SEQ工DN0:1)恥垢分枝桿菌過水解酶的#^酸序列為MAKR工LCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTN工DDPTDPRLNGASYLPSCLATHIjPLD]LVI工MIjGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTGVLTSAGGVGTTYPAPKVLWSPPPLAPMPHPWFQL工FEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDG工HFTEANNRDK3VALAEQVRSI^(SEQ工DN0:2).還如PCT^S開WO05/056782中所述，將恥垢分枝桿菌過水解酶的各個和每個JL&酸位置突變?yōu)槠溆?9個氨基酸的每一個，產(chǎn)生位點飽和文庫。使用如PCT公開WO05/056782的實施例2中所述的方法，對野生型過水解酶和位點飽和文庫中的各個過水解酶變體測試其水解c6酰基酯底物——對硝基苯基己酸酯的能力。野生型過水解酶不能夠水解pNC6。以下的過水解酶變體被鑒定為具有水解pNC6的能力表l.能夠水解pNC6的過水解酶變體野生型殘基/位置氣基酸變體<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實施例2生產(chǎn)和篩選組合文庫使用野生型過水解酶(SEQIDNO:2)和L12G變體作為親本分子，將表l中鑒定的突變組合在一起，產(chǎn)生四種不同的文庫NSAL1、NSAL2、NSAL3和NSAL4。用于制備組合文庫的引物如下，其中"NNS"序列代表編碼所有20個氬基酸的簡并密碼子NNG/C(N=G、A、T或C)和一個終止密碼子表2.用于組合文庫的突變和引物突變引物序列L12GGTGTTTCGGTGATTCCGGCACCTGGGGCTGGGTCC(SEQIDNO:3)L12PGTGTTTCGGTGATTCCCCGACCTGGGGCTGGGTCCC(SEQIDNO:4)GTGTTTCGGTGATTCCCAGACCTGGGGCTGGGTCCC(SEQIDNO:5)Iil2NNSGTGTTTCGGTGATTCCNNSACCTGGGGCTGGGTCC(SEQIDNO:6)I194GGACGGCGTCGACGGAGGCCACTTCACCGAGGCCAAC(SEQIDNO:7)工194NNSGACGGCGTCGACGGANNSCACTTCACCGAGGCCAAC(SEQIDNO:8)F154TTGGTTCCAGTTGATCACCGAGGGCGGCGAGCAGAAG(SEQIDNO:9)F154STGGTTCCAGTTGATCAGCGAGGGCGGCGAGCAGAAG(SEQIDNO:10)F154NNSTGGTTCCAGTTGATC麗SGAGGGCGGCGAGCAGAAG(SEQIDNO:11〉F196SGCGTCGACGGAATCCACAGCACCGAGGCCAACAATCG(SEQ工DNO:12)F196GGCGTCGACGGAATCCACCAGACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:13)F196VGCGTCGACGGAATCCACGTTACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:14〉F196GGCGTCGACGGAATCCACGGTACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:15)F196PGCGTCGACGGAATCCACCCGACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:16)F196IGCGTCGACGGAATCCACATCACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:17)F196NNSGCGTCGACGGAATCCACNNSACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:18)F154VTGGTTCCAGTTGATCGTTGAGGGCGGCGAGCAGAAG(SEQIDNO:19)F196HGCGTCGACGGAATCCACCATACCGAGGCCAACAATCG(SEQIDNO:20)F154QTGGTTCCAGTTGATCCAGGAGGGCGGCGAGCAGAAG(SEQIDNO:21)N59PAGCGCGCGCACCACCCCGATCGACGACCCCACCGATC(SEQIDNO:22)L204YGCCAACAATCGCGATTATGGGGTGGCCCTCGCGGAAC(SEQ工DNO:23)L204WGCCAACAATCGCGATTGGGGGGTGGCCCTCGCGGAAC(SEQIDNO:24)L204NNSGCCAACAATCGCGATNNSGGGGTGGCCCTCGCGGAAC(SEQIDNO:25)工153PCCCTGGTTCCAGTTGCCGTTCGAGGGCGGCGAGCAG(SEQIDNO:26)G22WGTCCCCGTCGAAGACTGGGCACCCACCGAGCGGTTC(SEQIDNO:27)使用WO05/056782中所述方法，使用QuikChange多位點定向誘變(QCMS)創(chuàng)建組合文庫NSAL1-NSAL4。QCMS反應(yīng)由以下組成16.5無菌蒸餾H20、2.5nL來自試劑盒的10x緩沖液、1nL來自試劑盒的dNTP、3jiL的20引物混合物(提前將各IOjiL的100ngL的引物混合在一起)、1nL作為模板的pMSAT-Ncol小量制備DNA(50ng)和1來自試劑盒的酶摻合物，總計25fiL。循環(huán)條件為95°C1分鐘一次，95°C1分鐘，55。C1分鐘，65°C10分鐘進行30個循環(huán)。接著將先后用1或0.5nL酶(QCMS試劑盒)在37。C下進行4小時的Z)/wI消化兩次。根據(jù)制造商的說明將2nL反應(yīng)物轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)pZ^S感受態(tài)細(xì)胞(Novagen)中。將轉(zhuǎn)化涂布在LB平板上，所述平板含有100ppm羧節(jié)青霉素、O.lmMIPTG和0.25%己酸甘油酯(通過超聲處理混合在培養(yǎng)基中的C6酰基鏈底物)。將平板在37。C孵育24小時然后在室溫下孵育2天后，將大部分形成暈圏的菌落在96-孔板中于37。C下過夜培養(yǎng)，所述96-孔板含有含100ppm羧芐青霉素的LB。為了再評估暈圏形成者(halo-former),將培養(yǎng)物影印(replica-stamped)在大瓊脂平板上，所述瓊脂平板含有LB、100ppm羧節(jié)青霉素、0.1mMIPTG和0,25。/o己酸甘油酯。表3描述了組合文庫及其篩選的進一步細(xì)節(jié)。表3，文庫和^皮篩選的菌落的描述文庫使用的引物親本分子篩選的菌落帶有暈圏的菌落NSAUL12NNS,F154NNS,F196NNS,I194NNS,L204NNS野生型18221NSAL2L12NNS，F(xiàn)154NNS，F(xiàn)196NNS，I194NNS,L204NNSL12G16940NSAL3表l中所有引物，NNS密碼子引物除外野生型~1200*4NSAL4表1中所有引物，NNS密碼子引物除外L12G~1000*~100-200**該數(shù)值是近似值。未測定菌落的精確數(shù)量。**一些形成暈圏的菌落在再測試時未形成暈圏。NSAL2和NSAL4中暈圏形成者的數(shù)量比NSAL1和NSAL3中更高，歸因于25%的NSAL2和NSAL4文庫中存在的L12G親本。對下述多核苷酸測序以確定何種突變有助于暈圏形成，所述多核苷酸編碼形成暈圏的菌落的過水解酶(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>*生產(chǎn)暈圏的L12G克隆未列于表中，因為已知該突變在己酸甘油酯平板上產(chǎn)生暈圈。實施例3形成暈圖的變體的生物化學(xué)表征使用PCT公開WO05/056782的實施例2中所述方法，在100mMTris/HClpH8、0.1%Triton-XlOO和1mMpNC6或pNC8中，測試在己酸甘油酯平板上形成暈圏的變體水解對對硝基苯基己酸酯(pNC6)和對硝基苯基辛酸酯(pNC8)的能力，所述變體具有與親本序列不同的氨基酸序列。針對各個形成暈圏的變體記錄對硝基苯酚的出現(xiàn)率。野生型酶顯示不水解pNC6或pNC8。pNC6/pNC8水解的比例顯示于下表5中。表5.具有pNC6/pNC8水解活性的變體<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>變體F154TF196I、L12QF154V、L12MF154E、L12GF154G、F154E解己酸甘油酯的能力，但是不水解pNC6或pNC8。數(shù)據(jù)顯示恥垢分枝桿菌過水解酶的特異變體能夠使用培養(yǎng)基和長鏈酰基酯作為底物。實施例4酶分析在該實施例中，描述了適用于評價酶純度和活性的方法。然而，本發(fā)明不旨在受這些具體方法的限制，因為其它合適的方法也適用。酶活性測定(pNB測定)通過水解對硝基苯基丁酸酯或其它長鏈對硝基苯基化合物測量該活性。通過向含有0.1%TritonX-100的9卯ml100mMTris-HCl緩沖液，pH8.0中添加10ul二甲基亞砜中100mM對硝基苯基丁酸酯，制備反應(yīng)混合物。在添加酶之前于410nm處測量背景水解率。通過向990ml反應(yīng)中添加10ul酶起始反應(yīng)，并在室溫下(23。C)測量410nm處的吸光度改變。將經(jīng)背景校正過的結(jié)果表述為3A41()/min/ml或SA41Q/min/mg蛋白質(zhì)。酯交換在緩沖的含7K反應(yīng)中通過產(chǎn)品GC分離測量酯交換。用丙醇測量乙酸乙酯酯交換的反應(yīng)在1ml50mMKP04，pH7.0中含有200mM乙酸乙酯、200mMl-丙醇和酶。用新戊二醇(NPG)測量乙酸乙酯酯交換的反應(yīng)在1ml50mMKP04，pH7.0中含有303mM乙酸乙酯、100mMNPG和酶。將反應(yīng)在指定的溫度下孵育指定的時間。使用30MFFAP柱(Phenomenex)進行分離。入口分流比約為1:25，進樣器為250。C，壓頭(headpressure)為10psiHe,并通過FID在250。C檢測。色語程序被設(shè)置為在40。C起始4分鐘，然后以15。C/分鐘的梯度達(dá)到180。C。組分按照以下的順序被洗脫并且未定量；乙酸乙酯、乙醇、乙酸丙酯、丙醇、乙酸、NPG雙乙酸酯、NPG單乙酸酯，和NPG。制備底物如本文所述制備底物。在想要的緩沖液中將乙酸乙酯(EtOAc)或其它水溶性酯稀釋至10mM酯的濃度。通過制造底物布樣(swatch)制備三丁精和其它不溶于水的底物。使用5/8英寸沖壓機從未染色的聚酯織物(Polycotton，PCW22)上切下聚酯布樣，并置于24-孔微量滴定板(Costar，CellCulturePlate)中。在己烷中將不溶的酯稀釋至1.03M。然后將10不溶酯溶液吸附在聚酯布樣上。水解的測定(GC測定)下文描述的水解測定適用于測定底物水解的量。在該測定中，測定溶液在0.99ml的總體積中包含50mM磷酸鉀pH7.5、10mM酯底物、29mM過氧化氫和20mM氯化鉀，以及在25。C下每分鐘會生產(chǎn)20納摩爾乙酸的酶量。為了測量不溶于水的酯水解，將反應(yīng)混合物添加至不溶的酯織物布樣。布樣如上文所述制備("制備底物")。除了排除其它酯底物以外，測定的所有其它條件相同。通過使用與火焰離子化檢測偶聯(lián)的氣相層析監(jiān)測酶從?；w底物產(chǎn)生的酸的增加來測量水解活性。如下進行測定首先將含有除酶以外所有組分的50fiL測定溶液移液進入200L甲醇(HPLC級別)中，以測定0時間時測定溶液中酸的量。然后向測定溶液中添加10nL的酶至想要的終濃度，所述終濃度每分鐘生產(chǎn)約20納摩爾的酸。打開計時器，在添加酶后不同的時間(通常為2、5、10、15、25、40和60分鐘)從測定溶液中取出50jiL等分式樣并添加進200甲醇中。然后將這些用甲醇猝滅的樣品注射進與火焰離子檢測器(Agilent68卯N)偶聯(lián)的氣相層析中，并分析水解組分、乙酸和丁酸等。使用經(jīng)硝基對苯二酸修飾的聚乙二醇柱(ZebronFFAP;具有尺寸30m長、250um直徑、250nm膜厚度)進行氣相層析。在1.0mL/分鐘的恒定氦流下，通過無分流注射將3jiL樣品等分式樣上樣在柱上。將入口維持250°C的溫度，并在2分鐘后清除任何剩余的樣品組分。分析乙酸時，將柱溫度在注射后維持為75°C1分鐘，以25。C/分鐘提高至100。C,然后以15。C/分鐘提高至200。C。分析丁酸時，如上所述控制柱的溫度，例外是將溫度額外地以25°C/分鐘提高至225。C并在225。C下保持1分鐘。層析中火焰離子檢測器始終維持在250。C并處于25mL/分鐘的恒定氫流、200mL/分鐘的恒定氣流、和30mL/分鐘復(fù)合的柱和補充氦流下。然后如下測定樣品中被水解的酸量累計層析中的酸峰得到總離子計數(shù)，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線從離子計數(shù)計算酸，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線在上述條件下針對測定溶液(無酶)中不同濃度的乙酸和丁酸產(chǎn)生。過水解的測定(OPD測定)下文所述的過水解活性測定適用于測定反應(yīng)中形成的過酸量。在這些測定中，溶液包含50mM磷酸鉀pH7.5、lOmM酯底物、29mM過氧化氫、20mM氯化鉀和10mM鄰苯二胺。使用不溶于水的酯作為酰基供體時，使用如上所述制備的吸附了酯的織物布樣作為底物("制備底物")。通過監(jiān)測,皮酶產(chǎn)生的過酸氧化的鄰苯二胺(OPD)在458nm處的吸光度提高，測量過水解活性。用與水解活性測定溶液相同的方式制備過水解活性測定溶液，例外是向測定溶液中添加OPD至10mM的終濃度。在進行測定之前即刻如下制備OPD溶液將72mgOPD(Sigma-Aldrich，二鹽酸化物)溶于19.94mL相同的緩沖液中，并通過緩慢添加6013.5M氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH。測量pH,并在需要時添加小量的氫氧化鉀，從而將pH回復(fù)至緩沖液的初始pH。然后將495nL該OPD溶液與另一測定組分一起添加達(dá)到0.9卯mL的最終測定體積。還通過將36mgOPD溶于20mL100mM檸檬酸和70%乙醇中制備測定摔滅溶液。測定通常在25。C下進行。如下開始測定移液IOOjiL測定溶液，然后向200猝滅溶液中添加酶，以測定0時間時測定溶液中過水解組分的量和背景吸光度。然后向測定溶液中添加10jiL酶至想要的終濃度，所述酶每分鐘生產(chǎn)約10納摩爾的過酸。打開計時器，在添加酶后不同的時間(通常為2、5、10、15、25、40和60分鐘)從測定溶液中取出100nL等分式樣并添加進200nL猝滅溶液中。將猝滅測定溶液孵育30分鐘，允許任何剩余的過酸氧化OPD。然后將各100nL被猝滅的測定溶液轉(zhuǎn)移至96-孔微量滴定板(Costar)，并通過分光光度計測量平板讀數(shù)器(MokcularDevices,SpectraMAX250)在458nm處測量溶液的吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各被猝滅的樣品中過酸的量，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線在上述條件下用測定溶液(無酶)中不同濃度的過酸產(chǎn)生。過水解/水解比例過水解/水解比例=在過水解測定中測量的過水解/(水解測定中檢測的總酸-過水解測定中測量的過水解)過水解酶過酸產(chǎn)生測定為了過水解測量，將酶在選擇的緩沖液中于明確的溫度下在存在過氧化氫時與底物酯孵育。測量中等鏈或長鏈酯過水解的典型底物包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸的甲酯或乙酯，或C10-C22或更長的脂肪酸酯，及其它。另外，發(fā)現(xiàn)野生型酶能夠水解短鏈酸的硝基苯基酯。后者是測量酶濃度的便利底物。在一些實施方案中，通過ABTS或HPLC測定測量過酸和乙酸。還在下文中描述了硝基苯基酯水解。ABTS測定(1毫升)該測定提供了測定過水解酶生產(chǎn)的過酸。該方案從Karst等人(Karst等人,Analyst,122:567-571[1997)改編而來。簡言之，將待分析溶液的100pL等分式樣添加至1mL125mM檸檬酸鉀，pH5、1mMABTS、50KI中。在420nm處用最高靈敏度測量吸光度。然而，有時使用ABTS寬吸收光鐠上的多個額外的波長?；谝阎倪^酸濃度系列構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。HPLC(Model-AgilentIIOO)測定過水解酶反應(yīng)產(chǎn)物為了測定過水解酶反應(yīng)中過水解與水解的比例，通過酸化至0.24%曱磺酸終濃度來猝滅過水解酶反應(yīng)樣品，并通過反相HPLC在DionexOA柱(cat#062903;Dionex)上分離產(chǎn)物。流動相為30。C下在等度條件下運行的100mMNaP04，pH3.9(通過用甲磺酸將100mMNa2P04滴定至pH3.9制備緩沖液)。在210nm處檢測。通過將累計的峰面積與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)進行比較，計算產(chǎn)物濃度。硝基苯基酯水解動力學(xué)測定在100mMTris/HClpH8.0(或50mMB(OH)3pH9.5或另一緩沖液)中賻育酶和底物。監(jiān)測402nm處的吸光度。在一些實驗中，測定在標(biāo)準(zhǔn)的lmL比色杯中進行，而在其它實驗中，使用微量滴定板孔。使用后一方法篩選突變體文庫。通過與相同反應(yīng)條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，測定酶濃度。對硝基苯基己酸酯水解測定通過將lmMpNC6(100mM儲存溶液)、1mlDMSO、19mllOOmM磷酸鹽(pH8)和甘油混合至10%的終濃度，制備pNC6底物溶液。為了測定樣品，將10nl細(xì)胞裂解物添加至190nl底物溶液中，并在分光光度計中在405nm處測定15分鐘。結(jié)果表示為兩次實驗的平均。對硝基苯基乙酸酯(pNA)水解測定將裂解細(xì)胞上清液的等分式樣在100mM磷酸鹽緩沖液(pH8)中1-100稀釋。為了測定樣品，向微量滴定板的每個孔中放置5^l-100稀釋的細(xì)胞上清液。然后添加195nl反應(yīng)緩沖'^/底物混合物(1mMpNA、100mM磷酸鹽，pH8，10%甘油)，并在3分鐘期間測量405nm處的吸光度(動力學(xué)程序，微量滴定板讀數(shù)器)。結(jié)果表示為兩次實驗的平均。本說明書中提及的所有專利和出版物指出了本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物通過參考并入本文至這樣的程度，即好像每個單獨的出版物都表示為明確地分別通過參考并入本文。盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，可以對公開的實施方案進行各種修改，而且此種修改旨在被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域^L術(shù)人員容易認(rèn)識到，本發(fā)明完全可以進行調(diào)整以實現(xiàn)目標(biāo)并獲得所提及的以及固有的結(jié)果和優(yōu)勢。本文中描述的組合物和方法，代表了優(yōu)選的實施方案，是示范性的，而不意圖成為對本發(fā)明范圍的限制。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對本文中公開的發(fā)明進行各種置換和修改，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。本文中例證地描述的本發(fā)明可以在缺少本文中未具體/>開的任一元素或許多元素、限定或許多限定的情況下適宜地實施。已祐使用的術(shù)語和表述，是被用作描述性術(shù)語的，而不是限定性的，并且本發(fā)明的意圖不是在使用這些術(shù)語和表述時排除顯示和描述的特征或其部分的等價物，應(yīng)認(rèn)識到在要求保護的發(fā)明范圍內(nèi)各種修改是可能的。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過優(yōu)選的實施方案和可選的特征被具體地公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以重新對本文7>開的概念進行修改和變化，而這些^奮改和變化被i/v為包含在如附帶的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本文中，本發(fā)明已以寬泛的和一般性的方式被描述。落入該概括性公開內(nèi)容中的每一較窄的種類和亞類也形成本發(fā)明的一部分。這包括發(fā)明的這樣的概括性描述，其帶有附加條件或從該類中除去任何主題的負(fù)限定，不論刪除的該物質(zhì)是否在本文中被具體地詳述。權(quán)利要求1.分離的過水解酶，其中所述酶過水解長鏈酰基酯底物。2.權(quán)利要求1的分離的過水解酶，其中所述酶在存在長鏈酰基酯底物和過氧化物時生產(chǎn)長鏈過酸。3.權(quán)利要求l的分離的過水解酶，其中所述鏈酰基酯底物含有至少6個碳原子的鏈。4.權(quán)利要求l的分離的過水解酶，其中所述長鏈?；サ孜锖兄辽?個碳原子的鏈。5.權(quán)利要求l的分離的過水解酶，其中所述酶的氨基酸序列與天然存在的過水解酶的M^列至少80%同一。6.權(quán)利要求l的分離的過水解酶,其中所述酶的氨基^列與如SEQIDNO:2中所示的恥垢分枝桿菌野生型過水解酶的氨基酸序列至少80%同7.權(quán)利要求l的分離的過水解酶，其中所述酶包含至少一個下述#^酸位置上的取代，所述位置等價于包含SEQIDNO:2所示的M酸序列的恥垢分枝桿菌過水解酶中的位置，其中所述至少一個取代選自位置12、22、59、153、154、194、196和204。8.權(quán)利要求7的分離的過水解酶，其中所述酶包含至少一個以下的氨基酸取代位置12上的Gly、Pro或Gln,位置22上的Trp，位置59上的Pro,位置153上的Pro,位置154上的Thr、Ser、Val或Gln，位置194上的Gly,位置196上的Ser、Gln、Val、Gly、Pro、lie或His,位置204上的Tyr或Trp，或其任何組合，其中所述^J^酸位置在位置上等價于SEQIDNO:2的恥垢分4支桿菌過水解酶中的位置12、22、59、153、154、194、196和204。9.權(quán)利要求l的分離的過水解酶，其中所述酶包含至少一個以下的氨基酸取代位置154上的Ala和位置194上的Met,位置154上的Gly和位置194上的Val，或位置12上的Gly和位置194上的Met,其中所述氨基酸位置在位置上等價于SEQIDNO:2的恥垢分枝桿菌過水解酶中的位置12、154和194。10.權(quán)利要求1的分離的過水解酶，其中所述酶具有大于1的過水解與水解的比例。11.權(quán)利要求1的分離的過水解酶，其中所述酶具有比SEQIDNO:2的過酸水解活性率低的過酸水解率。12.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求l的分離的過水解酶。13.分離的過水解酶，其中所述酶水解長鏈?；サ孜?。14.權(quán)利要求13的分離的過水解酶，其中所述酶在存在長鏈?；サ孜锖瓦^氧化物時生產(chǎn)長鏈過酸。15.權(quán)利要求13的分離的過水解酶，其中所述鏈酰基酯底物含有至少6個碳原子的鏈。16.權(quán)利要求13的分離的過水解酶，其中所述長鏈?；サ孜锖兄辽?個碳原子的鏈。17.重組核酸，其包含a)啟動子和b)權(quán)利要求12的分離的核酸，其中所述啟動子和分離的核酸有效連接。18.含有權(quán)利要求17的重組核酸的載體。19.含有權(quán)利要求17的重組核酸的宿主細(xì)胞。20.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述重組核酸存在于所述細(xì)胞的基因組中，或存在于在所述細(xì)胞中自主復(fù)制的載體中。21.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌或真菌宿主細(xì)胞。22.制備過水解酶的方法，其包括在適合生產(chǎn)所述過水解酶的條件下維持權(quán)利要求19的細(xì)胞。23.包含權(quán)利要求1的過水解酶的清潔組合物。24.權(quán)利要求23的清潔組合物，其中所述組合物還包含長鏈酰基酯底物和過氧化物來源。25.權(quán)利要求24的清潔組合物，其中所述組合物還包含表面活性劑。26.權(quán)利要求23的清潔組合物，其中所述組合物是衣物洗滌劑。27.清潔方法，其包括將底物維持于存在權(quán)利要求23的清潔組合物，以清潔所述底物。全文摘要本發(fā)明提供了用于清潔和其它應(yīng)用的方法和組合物，其包含至少一種過水解酶。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生長鏈過酸的方法和組合物。本發(fā)明的某些實施方案在涉及清潔、漂白和消毒的應(yīng)用中尤其有用。文檔編號C12N15/55GK101535481SQ200780041173公開日2009年9月16日申請日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日發(fā)明者A·J·保羅斯,M·A·卡文,N·S·阿明,R·R·博特,W·韋勒申請人:丹尼斯科美國公司