專利名稱：：用于核酸酶活性和dna足跡法的等離子分子標(biāo)尺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用表面等離子共振(surfaceplasmonresonance)進(jìn)行核酸才全測(cè)和足跡法。
背景技術(shù)：
：在遺傳信息加工的許多方面，諸如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、重組、DNA/RNA降解、基因擴(kuò)增/缺失/重排、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)座、逆轉(zhuǎn)錄病毒整合、和基因失活/沉默等中，耙向核酸的蛋白質(zhì)和酶都是必不可少的。檢測(cè)核酸大小變化在各種研究領(lǐng)域，諸如核酸-蛋白質(zhì)交互作用作圖、核酸酶抑制劑藥物篩選、和基于寡核苷酸的治療的開發(fā)都是關(guān)鍵的。這些檢測(cè)方案通常需要合成許多特異性寡核苷酸底物，并且用熒光的、電化學(xué)的或放射性的探針標(biāo)記寡核苷酸(參見(jiàn)，例如Behrens等(2004)Syst.Appl.Microbiol"27:565-572;SmithandAnslyn(1994)Anal.Biochem"220:53-57;Hillier等(2004)Bioelectrochemistry63:307-310),尤其對(duì)于基于核酸酶的方法來(lái)說(shuō)更是如此。在小體積內(nèi)和實(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，隨著微陣列和微量分析裝置的出現(xiàn)以及伴隨而來(lái)測(cè)定體積前所未有地降至納升乃至皮升范圍，這個(gè)問(wèn)題變得更加突出。作為測(cè)量微小改變的有前途的技術(shù)平臺(tái)之一，表面等離子共振(SPR)譜學(xué)是一種超靈敏的光學(xué)方法，其測(cè)量與金屬薄膜表面接觸的液體或介質(zhì)的折射率(refractiveindex)或介電常數(shù)(dielectricconstant)。傳統(tǒng)的大規(guī)模表面等離子共振傳感器已經(jīng)證明能測(cè)量例如絕緣體厚度、薄電介質(zhì)的折射率、檢測(cè)小分子、分析物濃度、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/抗體-抗原交互作用、以及解離動(dòng)力學(xué)、DNA雜交、和混合物比例等性質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及開發(fā)一種平臺(tái)，其能夠在單個(gè)納米顆粒上以高速傳感等離子共振，用于檢測(cè)核酸長(zhǎng)度變化。.所述體系為許多的方法提供了一項(xiàng)快速、容易和靈活的手段，能在無(wú)限小體積(〈fL)內(nèi)表征核酸和/或核酸/蛋白質(zhì)(或其他的分子)交互作用。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方式中，提供了一種納米等離子共振標(biāo)尺(nanoplasmonresonanceruler),用于標(biāo)定在等離子共振體系中的核酸長(zhǎng)度變化。所述標(biāo)尺通常包含納米顆粒，該顆粒上附著核酸(例如，單或雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體等等)，以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，其中所述核酸包含至少兩個(gè)限制性位點(diǎn)，所述限制性位點(diǎn)的位置被安置成使得所述偶聯(lián)物在每一限制性位點(diǎn)被酶切，提供等離子共振信號(hào)，該信號(hào)與所述核酸偶聯(lián)物在其它限制性位點(diǎn)被切割所產(chǎn)生的和/或由完整偶聯(lián)物所產(chǎn)生的等離子共振信號(hào)能區(qū)別開。在一些實(shí)施方式中，所述核酸是雙鏈核酸，其包含附著于納米顆粒的第一鏈，和與第一鏈雜交、但不附著于所述納米顆粒的第二鏈。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含至少三個(gè)、優(yōu)選至少四個(gè)、更優(yōu)選至少五個(gè)、六個(gè)、或七個(gè)不同的限制性位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述核酸進(jìn)一步地包含至少一個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在一些實(shí)施方式中，至少兩個(gè)、三個(gè)、或至少四個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，核酸的長(zhǎng)度范圍從3個(gè)核苦酸(bp)到大約500個(gè)核普酸(或bp),優(yōu)選大約5個(gè)核普酸(或bp)到大約200個(gè)核香酸(或bp)，更加優(yōu)選從大約IO、20、30、或40個(gè)核苷酸(或bp)到大約60、70、80、或100個(gè)核普酸(bp)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、鉬、鉑合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GaAs。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金和/或銀。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒的粒度范圍從大約5nm到大約300、200、或150nm，優(yōu)選從大約5nm或10nm到大約30、40、50、80、或100nm。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面被功能化，以用于附著所述核酸。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面用膦層和/或利用氨基硅烷分子功能化。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約10到大約10，000個(gè)核酸分子，優(yōu)選從大約50到大約500、或1,000個(gè)分子，更加優(yōu)選每個(gè)納米顆粒從大約80到大約150個(gè)分子，最優(yōu)選在每納米顆粒上大約100個(gè)核酸分子。在一些實(shí)施方式中，所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp,在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含選自下組的識(shí)別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)、和酶結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物固定在(例如以化學(xué)方法固定、靜電固定、吸附、磁性固定等等)適合于進(jìn)行表面等離子共振的底層上。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物被靜電固定在玻璃、石英、或陶瓷表面。本發(fā)明還提供一種底層，其用于鑒定與核酸結(jié)合的分子的結(jié)合位點(diǎn)，和/或用于檢測(cè)和/或定量例如在樣品中的這種分子。所述底物典型地包含適合于進(jìn)行表面等離子共振測(cè)量的底層，所述底層攜帶有附著于其上的一組納米等離子共振標(biāo)尺，每個(gè)標(biāo)尺包含納米顆粒并在該顆粒上附著核酸以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，如此一來(lái)，通過(guò)偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化可檢測(cè)出核酸尺寸的變化，這些標(biāo)尺各自包含不同的納米偶聯(lián)物，且每一標(biāo)尺的位置都被標(biāo)注。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物有三維地址。在一些實(shí)施方式中，所述底層帶有三種、優(yōu)選至少5或至少10種不同的納米偶聯(lián)物種類。在一些實(shí)施方式中，所述核酸選自下組單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、和雙鏈RNA。在一些實(shí)施方式中，所述核酸為雙鏈，其包含附著于納米顆粒的第一鏈，和與第一鏈雜交、但不附著于所迷納米顆粒的第二鏈。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含所述分子的一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(例如蛋白結(jié)合位點(diǎn))和/或至少一個(gè)限制性位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含一個(gè)或一個(gè)以上蛋白結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)限制性位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述核酸的長(zhǎng)度范圍從3個(gè)核芬酸(bp)到大約500個(gè)核芬酸(或bp)，優(yōu)選大約5個(gè)核苷酸(或bp)到大約200個(gè)核普酸(或bp),更加優(yōu)選從大約IO、20、30、或40個(gè)核苷酸(或bp)到大約60、70、80、或100個(gè)核苦酸(bp)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、柏、鉑合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GaAs。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金和/或銀。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒的粒徑范圍,人大約5nm到大約300、200、或150nm,優(yōu)選從大約5nm或10nm到大約30、40、50、80、或100nm。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面被功能化，以用于附著所述核酸。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面用膦層和/或利用氨基硅烷分子功能化。在一些實(shí)施方式中，所述納米偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約10到大約10,000個(gè)核酸分子，優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上從大約50到大約500、或1,000個(gè)分子，更加優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上從大約80到大約150個(gè)分子，最優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上大約100個(gè)核酸分子。在一些實(shí)施方式中，所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp，在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含選自下組的識(shí)別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)、和酶結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物固定在(例如以化學(xué)方法固定、靜電固定、吸附、磁性固定等等)底層上。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物被靜電固定在玻璃、石英、或陶瓷表面。本發(fā)明還提供一種納米等離子共振標(biāo)尺，其包含納米顆粒，所述納米顆粒具有附著于其上的核酸以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，借此通過(guò)偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化檢測(cè)出核酸尺寸的變化。在一些實(shí)施方式中，所述核酸選自下組單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、和雙鏈RNA。在一些實(shí)施方式中，所述核酸為雙鏈核酸，其包含附著于納米顆粒的第一鏈，和與第一鏈雜交、但不附著于所述納米顆粒的第二鏈。在一些實(shí)施方式中，所14述核酸包含至少三個(gè)、^尤選至少四個(gè)、更加^尤選至少五個(gè)、六個(gè)、或七個(gè)不同的限制性位點(diǎn)和/或至少一個(gè)蛋白位點(diǎn)，在一些實(shí)施方式中至少兩個(gè)、三個(gè)、或至少四個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述核酸的長(zhǎng)度范圍從3個(gè)核普酸(bp)到大約500個(gè)核苷酸(或bp),優(yōu)選大約5個(gè)核苷酸(或bp)到大約200個(gè)核苷酸(或bp),更加優(yōu)選從大約IO、20、30、或40個(gè)核香酸(或bp)到大約60、70、80、或100個(gè)核芬酸(bp)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、4自、鉑合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GaAs。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含金和/或4艮。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒的粒度范圍從大約5nm到大約300、200、或150nm，優(yōu)選從大約5nm或10nm到大約30、40、50、80、或100nm。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面被功能化，以用于附著所述核酸。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒表面用膦層和/或利用氨基硅烷分子功能化。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約IO到大約IO,OOO個(gè)核酸分子，優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上從大約50到大約500或1,000個(gè)分子，更加優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上從大約80到大約150個(gè)分子，最優(yōu)選在每個(gè)納米顆粒上大約100個(gè)核酸分子。在一些實(shí)施方式中，所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp，在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。在一些實(shí)施方式中，所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp,在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。在一些實(shí)施方式中，所述核酸是SEQIDNO:11的雙鏈DNA，其中SEQIDNO:11中的X是任何插入的DNA序列或特征，長(zhǎng)度從大約3到大約50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，X選自下組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、錯(cuò)配序列、單核苷酸多態(tài)性、外遺傳改變的序列、蛋白結(jié)合位點(diǎn)、和酶結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述核酸包含選自下組的識(shí)別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)、和酶結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物固定在(例如，以化學(xué)方法固定、靜電固定、吸附、磁性固定，等等)適于進(jìn)行表面等離子共振的底層上。在一些實(shí)施方式中，所述納米偶聯(lián)物被靜電固定在玻璃、石英、或陶瓷表面。在一些實(shí)施方式中，提供了鑒定與核酸結(jié)合的一或多個(gè)分子的結(jié)合位點(diǎn)是否存在和/或決定所述結(jié)合位點(diǎn)位置的方法。所述方法典型地涉及提供一種偶聯(lián)物，其包含附著于核酸上的納米顆粒，所述核酸包含所述分子的結(jié)合位點(diǎn)，例如在此所描述的；將所述偶聯(lián)物標(biāo)尺與預(yù)期包含所述分子的組合物在使得所述分子與所述核酸結(jié)合、以形成結(jié)合偶聯(lián)物的條件下接觸；用非特異性核酸外切酶(或特異性核酸外切酶，此酶在被所述分子結(jié)合的位點(diǎn)裂解、但是這種活性卻被所述分子的結(jié)合所阻斷)消化所述核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振方面的變化，其中納米等離子共振變化指示所述分子的存在和所述分子結(jié)合所述核酸的結(jié)合位點(diǎn)的位置。在一些實(shí)施方式中，所述分子是蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、或酶。在各個(gè)實(shí)施方式中，提供了鑒定分子的結(jié)合位點(diǎn)的存在和/或表征所述結(jié)合位點(diǎn)的方法，其中所述方法涉及提供一組納米等離子共振標(biāo)尺(例如在此描述的)，其中每一標(biāo)尺包含納米顆粒并在該顆粒上附著核酸以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，借此通過(guò)偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化可檢測(cè)出核酸尺寸的變化，這些標(biāo)尺各自包含不同的核酸，且每一標(biāo)尺的位置都被標(biāo)注；酸結(jié)合成偶聯(lián)物的條件下接觸；用非特異性核酸外切酶(或特異性核酸外切酶，在被所述分子結(jié)合的位點(diǎn)處裂解、但是這種活性在所述分子結(jié)合時(shí)被阻斷)消化所述核酸；并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振方面的變化，其中納米等離子共振方面的變化指示這組標(biāo)尺中被所述分子結(jié)合的納米偶聯(lián)物，以及所述分子在所述核酸上的結(jié)合位點(diǎn)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述偶聯(lián)物附著于與等離子共振檢測(cè)相適合的底層，以形成如上所述的底層。在一些實(shí)施方式中，所述分子是蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、或酶。本發(fā)明還提供了檢測(cè)核酸雜交中錯(cuò)配的方法。所述方法典型地涉及提供一種偶聯(lián)物，其包含附著于單鏈核酸探針(例如在此所描述的)上的納米顆粒；在被試核酸可以與所述探針核酸雜交、并且盡管存在錯(cuò)配但仍能形成雙鏈核酸的條件下將所述核酸探針與被試核酸接觸；將所述核酸探針與結(jié)合所述錯(cuò)配的分子相接觸；以及用非特異性核酸外切酶(或用特異于錯(cuò)配結(jié)構(gòu)域、但被所述錯(cuò)配結(jié)合蛋白阻斷的核酸酶)消化所述雙鏈核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振變化，其中納米等離子共振變化指示所述錯(cuò)配的存在以及位置。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合所述錯(cuò)配的分子選自下組結(jié)合單個(gè)堿基錯(cuò)配的蛋白質(zhì)、結(jié)合鼓泡(bubble)的蛋白質(zhì)、結(jié)合環(huán)的蛋白質(zhì)、結(jié)合切口的蛋白質(zhì)、結(jié)合單鏈DNA-雙鏈DNA轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)、結(jié)合瓣(flap)的蛋白質(zhì)、結(jié)合Y形叉的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述錯(cuò)配是多態(tài)性或突變的結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，所述錯(cuò)配是對(duì)應(yīng)于SNP的單堿基錯(cuò)配。在一些實(shí)施方式中，所述錯(cuò)配是在野生型序列中插入和/或缺失的結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，錯(cuò)配指示被試核酸的來(lái)源生物的物種或品系。在一些實(shí)施方式中，被試核酸包含基因組DNA、cDNA、和/或mRNA。本發(fā)明提供了檢測(cè)核酸雜交中錯(cuò)配的方法，其中所述方法涉及提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含附著于單鏈核酸探針(例如在此所描述的)上的納米顆粒；在盡管存在錯(cuò)配、并且所述錯(cuò)配導(dǎo)致部分鏈遠(yuǎn)離帶有納米顆粒的單鏈、但被試核酸仍可以與探針核酸雜交的情況下，將所述核酸探針與被試核酸接觸；用單鏈特異性核酸外切酶消化所述末端單鏈核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振變化，其中納米等離子共振變化指示所述錯(cuò)配的存在和位置。在一些實(shí)施方式中，所述錯(cuò)配是移碼突變。在一些實(shí)施方式中，提供利用納米等離子共振標(biāo)尺檢測(cè)靶特征或定量結(jié)合事件的方法，其中所述方法涉及提供金-DNA納米顆粒偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含與單鏈DNA寡核苷酸連接的納米顆粒，其中所述寡核苷酸包含限制性位點(diǎn)；將互補(bǔ)的寡核苷酸與所述單鏈DNA寡核苷酸雜交，其中所述互補(bǔ)寡核苷酸包含靶特征或待檢測(cè)序列被插入到所述限制性位點(diǎn)；讓蛋白質(zhì)結(jié)合到所述靶特征或序列；利用核酸外切酶在所述納米偶聯(lián)物上進(jìn)行DNA消化；以及利用表面等離子共振觀察隨時(shí)間推移的(time-lapse)散射譜，其中金-DNA納米顆粒偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)作為核酸外切酶反應(yīng)時(shí)間的函數(shù)來(lái)測(cè)量，借此通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間的不同的納米等離子共振譜，檢測(cè)出納米偶聯(lián)物的尺寸和結(jié)合事件。定義術(shù)語(yǔ)"核酸"或"寡核苷酸"指的是共價(jià)連接的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸優(yōu)選是單鏈或雙鏈的，并且通常包含磷酸二酯^k，雖然有時(shí)如17下面所概括的包括核酸模擬物，該模擬物具有別的骨架，例如磷酰胺(Beaucage等.(1993)Tetrahedron49(10):1925)和其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35:3800;Sprinzletal.(1977)Eur.J.Biochem.81:579;Letsingeretal.(1986)Nucl.AcidsRes.14:3487;Sawaietal.(1984)Chem.Lett.805,Letsingeretal.1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470;和Pauwelsetal.(1986)ChemicaScripta26:1419)，碌u代石粦酸酯(Magetal.(1991)NucleicAcidsRes.19:1437;和美國(guó)專利號(hào)5，644,048)，二石克代石粦酸酯(Briuetal.(1989)J.Am.Chem.Soc.Ill:2321，O-methylphophoroamidite連樹參見(jiàn)Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress),和肽核酸骨架和連接(參見(jiàn)Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895;Meieretal.(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31:1008;Nielsen(1993)Nature,365:566;Carlssonetal.(1996)Nature380:207)。其他的核酸才莫擬物包括具有陽(yáng)性骨架(Denpcyetal.(1995)Proc,Natl.Acad.Sci.USA92:6097;非離子骨架(美國(guó)專利號(hào)5,386，023、5,637,684、5,602,240、5，216,141和4，469,863;Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English30:423;Letsingeretal.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470;Letsingeretal.(1994)Nucleoside&Nucleotide13:1597;Chapters2and3,ASCSymposiumSeries580，"CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch",Ed.Y.S.SanghuiandP.DanCook;Mesmaekeretal.(1994)，Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4:395;Jeffsetal.(1994)J.BiomolecularNMR34:17;TetrahedronLett.37:743(1996))和非核糖骨架，包括在美國(guó)專利號(hào)5，235,033和5,034,506和第6和7章ASCSymposiumSeries580,CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,Ed.Y.S.SanghuiandP.DanCook中描述的那些。包含一或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義之內(nèi)(參見(jiàn)Jenkinsetal.(1995)，Chem.Soc.Rev.ppl69-176)。若干核酸模擬物在Rawls,C&ENewsJune2、1997page35中描述?？梢詫?duì)核糖-磷酸酯骨架進(jìn)行這些修飾，以幫助添加附加部分例如標(biāo)記物，或提高這種分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。核酸包括單或雙鏈核酸，包括但不限于單或雙鏈DNA或RNA或DNA/RNA雜合體(嵌合體)。在各個(gè)的實(shí)施方式中，所述核酸的長(zhǎng)度范圍從5個(gè)到大約500個(gè)核苷酸(對(duì)于雙鏈分子而言是堿基對(duì))，優(yōu)選大約從5個(gè)到大約400、300、或200個(gè)核苷酸(或堿基對(duì)),更加優(yōu)選從大約10、5、20、25、30、或40個(gè)核苷酸(或;咸基對(duì))到大約150、100、80、或60個(gè)核苷酸(或堿基對(duì))。術(shù)語(yǔ)"納米顆粒"指一種顆粒，其具有小于大約500nm的特征性尺寸，優(yōu)選小于大約400nm，更優(yōu)選小于大約300nm，更優(yōu)選小于大約200或100納米，和最優(yōu)選小于大約80、50、40、或30nm。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒具有大約20nm的特征性尺寸(例如直徑)。納米顆粒的"大小"指由"特征長(zhǎng)度"所決定的納米顆粒的尺寸，例如，球體的直徑，或線，棒的寬度，橢圓體的短軸長(zhǎng)度，通常指較短主軸的長(zhǎng)度，等等。在納米顆粒群體中，大小指平均"特征長(zhǎng)度"。如在此使用的，"納米等離子標(biāo)尺"或"納米偶聯(lián)物"指包含一或多個(gè)納米顆粒的結(jié)構(gòu)，其中核酸(單或雙鏈)附著于納米顆粒上。"一組納米偶聯(lián)物"指由所附著的核酸性質(zhì)而區(qū)別開來(lái)的許多種類的納米偶聯(lián)物組成的組。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述組包含至少2個(gè)、優(yōu)選至少5或10個(gè)、更加優(yōu)選至少20、50、或100個(gè)、和最優(yōu)選至少200、500、1,000、或1o,ooo個(gè)不同的納米偶Jf關(guān)物。當(dāng)納米偶聯(lián)物包含不同的納米顆粒或不同的核酸(即核酸在骨架和/或序列和/或堿基修飾方面不同)時(shí)，納米偶聯(lián)物被認(rèn)為是"不同種類的"。當(dāng)納米偶聯(lián)物被稱為"被標(biāo)注位置"(例如在一組納米偶聯(lián)物中)時(shí)，它指不同種類的納米顆?？梢员槐舜藚^(qū)分開來(lái)(例如每個(gè)種類可以被唯一地鑒定)。在各種實(shí)施方式中，所述納米偶聯(lián)物可以通過(guò)將不同種類定位在底層的不同位置而從空間上被標(biāo)注位置，從而形成納米偶聯(lián)物"陣列"。在一些實(shí)施方式中，所述納米偶聯(lián)物被標(biāo)注位置可以是提供每種納米偶聯(lián)物獨(dú)特的信號(hào)或可鑒別的相關(guān)信號(hào)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)可通過(guò)附著的標(biāo)記物而提供。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)可以通過(guò)包含納米偶聯(lián)物的所述核酸序列的一部分而提供(例如允許例如標(biāo)記的互補(bǔ)解碼探針雜交)。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)可以通過(guò)選擇包含納米偶聯(lián)物的納米顆粒的一種或多種材料而提供。"DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白"指一種蛋白質(zhì)，其通常不依賴于DNA結(jié)構(gòu)的序列組成而結(jié)合所述DNA結(jié)構(gòu)。DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白包括、但是不限于與下列結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如發(fā)夾、環(huán)、鼓泡、切口、單鏈DNA-雙鏈DNA轉(zhuǎn)換、單鏈RNA-雙鏈RNA轉(zhuǎn)換、RNA-DNA轉(zhuǎn)換、瓣、Y形叉，等等。術(shù)語(yǔ)"特定地雜交到"和"特異性雜交，，和"有選擇地雜交到"如在此所使用指的是核酸分子在嚴(yán)格條件下優(yōu)先地結(jié)合到一特定核芬酸序列上、與該核苷酸序列成雙鏈、或雜交到該核苦酸序列上。所述術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"指其中探針優(yōu)先雜交到其靶序列、而較少或根本不雜交到其他序列的條件。嚴(yán)格雜交以及嚴(yán)格雜交洗滌條件在核酸雜交的情況中是序列依賴的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下有所不同。核酸雜交的詳盡指導(dǎo)在例如Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbespartI，chapt2,Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,Elsevier,NY(Tijssen)中找到。通常，高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件被選擇成比在給定離子強(qiáng)度和pH下指定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5。C。Tm是(在給定離子強(qiáng)度和pH下)50%的目標(biāo)序列雜交到完美匹配的探針時(shí)的溫度。非常嚴(yán)格條件被選擇成等于特定的探針的丁m。與在Southern或Northem印跡的陣列或?yàn)V膜上有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的嚴(yán)格雜交條件的例子為42。C使用標(biāo)準(zhǔn)雜交溶液(參見(jiàn)例如sambrook(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2nded,)Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,NY、以及以下的詳細(xì)討論)，過(guò)夜進(jìn)行雜交。高度嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)例子是0.15MNaCl72。C大約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)例子是0.2xSSC65。C洗滌15分鐘(參見(jiàn)，例如Sambrook見(jiàn)上，對(duì)于SSC緩沖液的描述)。常常在高嚴(yán)格洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌以除去背景探針信號(hào)。對(duì)例如超過(guò)100個(gè)核芬酸的雙鏈的中等嚴(yán)格洗滌的例子為lxSSC45。C15分鐘。對(duì)例如超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈的低嚴(yán)格洗滌的例子為4x到6xSSC40°C15分鐘。"放寬的雜交條件"指的是盡管存在一定錯(cuò)配、但仍允許雜交的雜交條件。在各個(gè)實(shí)施方式中，錯(cuò)配可以是單個(gè)堿基錯(cuò)配。在各個(gè)實(shí)施方式中，錯(cuò)配可以是包含至多2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50、或更多個(gè)堿基對(duì)(bp)的錯(cuò)配。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B說(shuō)明金-DNA納米等離子分子標(biāo)尺的設(shè)計(jì)。圖1A:單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物的合成過(guò)程。用膦單層修飾的20nm金納米顆粒用合成的54-bp雙鏈DNA層包裹。分別在雙鏈DNA兩端合成碌iJ享基和FITC熒光團(tuán)。通過(guò)硫醇-金化學(xué)作用，雙鏈DNA被系在20nm金納米顆粒上。所述雙鏈DNA可以用四種核酸內(nèi)切酶消化^wI,Sa/I，為oI，和歷^111，它們切出不同長(zhǎng)度。圖1B顯示所述雙鏈DNA的序列(SEQIDNO:l上方鏈和SEQIDNO:2下方鏈)。酶切割位點(diǎn)標(biāo)注在雙鏈DNA的對(duì)應(yīng)位置上。所述雙鏈DNA包含核酸內(nèi)切酶/7/mflII、屈ol、和《/wI的限制性位點(diǎn)，它們的切割位置中央分別距離系綽金納米顆粒那一端12、24、36和48bp。熒光標(biāo)記(FITC)只是用于進(jìn)一步確認(rèn)核酸酶反應(yīng)，因此對(duì)于等離子體共振測(cè)量不是必需的。核酸內(nèi)切酶對(duì)合成的雙鏈DNA的消化通過(guò)凝膠電泳來(lái)確認(rèn)(參見(jiàn)，例如圖6)。圖2A-2D顯示DNA偶聯(lián)使分子標(biāo)尺的等離子共振峰紅移(red-shifted)。圖2A顯示納米偶聯(lián)物的透射電子顯微鏡(TEM)圖像圖片a:金(Au);圖片b:金(Au)-DNA;圖片c:金(Au)-DNA,其中DNA用醋酸雙氧鈾(uranylacetate，UA)染色，從而進(jìn)一步增加了復(fù)合物的直徑(不均勻的DNA密度是由于固定引起的)；圖片d，金納米顆粒之間的距離。誤差線表示測(cè)量50個(gè)納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2B顯示納米偶聯(lián)物的電泳圖片a:金-DNA納米偶聯(lián)物(Au-ph是膦包被的金納米顆粒)；圖片b:用四種核酸內(nèi)切酶切割的金-DNA納米偶聯(lián)物，導(dǎo)致雙鏈DNA丟掉42、30、18和6bp,顯示依賴于DNA大小的遷移率。圖2C暗視野散射圖像圖片a:在金-DNA納米顆粒視野中鎖定并隔離單個(gè)納米顆粒供光譜分析；圖片b和c:金(圖片b)(540nm峰)和金-DNA(圖片c)(607nm峰)的真實(shí)色彩圖像。圖2D顯示金和金-DNA的散射語(yǔ)。圖3A和3B顯示用標(biāo)尺測(cè)量核酸內(nèi)切酶活性。圖3A:用多個(gè)納米偶聯(lián)物傳感等離子共振圖片a-c顯示用核酸內(nèi)切酶A7zoI切割的金-DNA納米偶聯(lián)物的暗視野散射圖像(圖片a，切割之前；圖片b,反應(yīng)1小時(shí)，超過(guò)90%被切割；圖片c,反應(yīng)16小時(shí)，100%切割。也參見(jiàn)圖8來(lái)證實(shí)切割)。圖片d顯示圖3A圖片a-c中單個(gè)金納米偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)。誤差線表示測(cè)量20個(gè)納米顆粒時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3B圖片a-c顯示核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的實(shí)時(shí)等離子共振傳感圖片a:核酸內(nèi)切酶反應(yīng)中單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物在不同時(shí)間分辨出的原始散射光譜數(shù)據(jù)；圖片b:等離子共振峰波長(zhǎng)；圖片c:用l:l屈oI(3.5nM，圓圈)、1:("OpM、三角形)、對(duì)照緩沖液?jiǎn)为?dú)(菱形)和抑制齊'J/螯合劑EDTA(正方形)反應(yīng)30分鐘的金-DNA納米偶聯(lián)物散射峰強(qiáng)度。等離子共振波長(zhǎng)數(shù)據(jù)顯示一階(first-order)指數(shù)式衰減(紅色和橙色曲線)。圖4A和4B顯示多種酶的納米等離子共振傳感的標(biāo)定曲線的生成。圖4A顯示典型的散射譜。圖4B顯示用四種核酸內(nèi)切酶切割反應(yīng)之后金-DNA納米偶聯(lián)物的等離子共振峰波長(zhǎng)，以及作為切割后仍與所述金納米顆粒附著的堿基對(duì)數(shù)目的函數(shù)。紅色曲線是使用折射率的Langevin型依賴關(guān)系相對(duì)于雙鏈DNA長(zhǎng)度，從半經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行擬合(fit)而成(參見(jiàn)圖9以及表l)。誤差線表示測(cè)量20個(gè)納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5A-5D說(shuō)明受EcoRI(Ql1l)蛋白質(zhì)阻礙的Bal31核酸外切酶的DNA足跡分析。圖5A顯示Bal31以及被結(jié)合DNA的EcoRI(Ql11)蛋白所妨礙的Bal31水解的足跡分析的示意圖。EcoRI(Q111)阻止Bal31除去單個(gè)Au-DNA納米偶聯(lián)物上的核苷酸(全長(zhǎng)上方鏈(SEQIDNO:3)，全長(zhǎng)下方鏈(SEQIDNO:4)，被消化的上方鏈(SEQIDNO:5),被消化的下方鏈(SEQIDNO:6))。圖5B和5C顯示不存在EcoRI(Ql1l)(圖5B)以及存在EcoRI(Ql1l)(圖5C)時(shí)，單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物在核酸外切酶Ba131水解過(guò)程中隨時(shí)間推移的散射謙。圖5D顯示在核酸外切酶反應(yīng)中金-DNA納米偶聯(lián)物等離子共振波長(zhǎng)作為時(shí)間的函數(shù)，其中的波長(zhǎng)改變顯示于右側(cè)縱軸，雙鏈DNA被除去的堿基對(duì)顯示于左側(cè)縱軸。誤差線表示測(cè)量10個(gè)納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6說(shuō)明DNA用核酸內(nèi)切酶切割。按照廠家說(shuō)明書(NewEnglandBiolab,Beverly,MA)測(cè)試用限制性核酸內(nèi)切酶歷"^in、尺/wI、屈ol、和Sa/I消化54bp雙鏈DNA的產(chǎn)物。各個(gè)酶的切割位點(diǎn)顯示于圖1B。l(xL的每一種酶各與適當(dāng)量的緩沖液和水混合，終反應(yīng)體積100pL。反應(yīng)物37。C保溫過(guò)夜。然后在5%NuSieve瓊脂糖凝膠上在lXTBE中進(jìn)行凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證消化產(chǎn)物，用10bp序列梯作為分子量標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen，Carlsbad,CA)。注意所述凝膠中顯示的DNA不是系在金納米顆粒上的。圖7顯示納米偶聯(lián)物的凝膠電泳。其中(1)不同膦/金比例的金-膦(Au-ph)納米偶聯(lián)物。通過(guò)與雙(對(duì)磺酰苯基)苯基膦(Bis(p-sulfonatophenyl)22phenylphosphine,膦(phosphine))進(jìn)行表面交換來(lái)穩(wěn)定金納米顆粒以防止聚集。左側(cè)泳道為沒(méi)有膦表面活性劑的金納米顆粒對(duì)照。為簡(jiǎn)化起見(jiàn)，金-膦在實(shí)施例1中被稱作金，因?yàn)橛糜谠撗芯康娜拷鸺{米顆粒都包^皮有膦表面活性劑。圖8圖片l-4顯示確認(rèn)核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)物。與圖3A進(jìn)行一樣的反應(yīng)，用熒光圖像成像。其中用酶XhoI進(jìn)行切割反應(yīng)之前(圖片l)、反應(yīng)l小時(shí)(圖片2)和16小時(shí)(圖片3)的金-DNA納米偶聯(lián)物焚光圖像。測(cè)量每種情況下四個(gè)不同區(qū)域(正方形)的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)數(shù)值顯示于(圖片4),其中有上述三種情況下的單個(gè)金納米偶聯(lián)物的平均熒光強(qiáng)度。注意完整雙鏈DNA的全長(zhǎng)(~20nm)比有效Forster傳遞距離(〈10nm)長(zhǎng)得多，因此DNA遠(yuǎn)端的FITC熒光團(tuán)沒(méi)有猝滅。在DNA切割之后，F(xiàn)ITC焚光團(tuán)與金納米顆粒脫離，擴(kuò)散入緩沖溶液中，因此在平面圖中(金納米顆粒所處位置處)總熒光強(qiáng)度顯著減少。圖9顯示用不同的核酸內(nèi)切酶切割之后金-DNA納米偶聯(lián)物的模擬散射譜。金的波長(zhǎng)依賴性介電常數(shù)內(nèi)插自Johnson和Christy(1972)Phys.Rev.B6,4370-4379的表報(bào)數(shù)據(jù)。模擬碼改編自Bohren和Huffman，(1983)Absorptionandscatteringoflightbysmallparticles(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)的BHCOAT。圖10A和IOB顯示在納米等離子標(biāo)尺上進(jìn)行足跡法以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子(例如E2F1)的結(jié)合的示意圖。沒(méi)有E2F1(或其他結(jié)合蛋白)結(jié)合時(shí)，BAL31核酸外切酶實(shí)質(zhì)上完全消化核酸(圖10A)。當(dāng)該轉(zhuǎn)錄因子存在時(shí)，BAL31核酸外切酶對(duì)分子標(biāo)尺核酸的消化被妨礙，從而提供指示所述轉(zhuǎn)錄因子存在和結(jié)合位置的信號(hào)(圖10B)。圖11A和11B說(shuō)明使用曱基結(jié)合蛋白例如MeCP2(圖llA)或錯(cuò)配結(jié)合蛋白例如MutS(圖IIB)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。當(dāng)甲基結(jié)合蛋白或錯(cuò)配結(jié)合蛋白存在時(shí)，核酸外切酶(例如Sv4/31)對(duì)分子標(biāo)尺核酸的消化被妨礙，從而提供了指示SNP存在和位置的信號(hào)。圖12說(shuō)明使用納米等離子標(biāo)尺足跡法來(lái)鑒定DNA上外遺傳改變。圖13說(shuō)明足跡法，其使用納米等離子標(biāo)尺以檢測(cè)特異性結(jié)合核酸結(jié)構(gòu)(例如由XPG蛋白結(jié)合的DNA鼓泡結(jié)構(gòu))的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行足跡分析。在此實(shí)例中，XPG不與5個(gè)堿基對(duì)的鼓泡結(jié)合，而與10-15bp的鼓泡結(jié)合。因此，如圖片A所示，XPG不與標(biāo)尺結(jié)合，核酸被完全消化。在圖片B中，存在較大鼓泡。當(dāng)結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白(例如XPG)存在時(shí)，核酸外切酶(例如Bv4丄31)對(duì)分子標(biāo)尺核酸的消化被妨礙，從而提供信號(hào)，指示所述結(jié)構(gòu)的存在和位置。圖14說(shuō)明不利用結(jié)合蛋白時(shí)對(duì)錯(cuò)配突變的檢測(cè)。包含移碼突變的基因組DNA、mRNA、或cDNA(例如RTcDNA)與包含野生型核酸探針的納米等離子標(biāo)尺雜交。由于有錯(cuò)配，雜交產(chǎn)生Y形(分裂的)DNA,終止于兩條單鏈。使用單鏈特異的核酸外切酶消化單鏈，在移碼位置核酸外切酶的消化停止。當(dāng)靶核酸不包含移碼時(shí)，整個(gè)探針都能雜交上，導(dǎo)致沒(méi)有單鏈生成，也沒(méi)有酶導(dǎo)致的消化。對(duì)雜交的核酸單鏈部分的消化(例如使用S1核酸酶)提供信號(hào)，指示錯(cuò)配的存在和位置。圖15A-15D說(shuō)明針對(duì)在此所描述的各種應(yīng)用而設(shè)計(jì)的DNA序列的實(shí)例，例如用于檢測(cè)和識(shí)別(圖15A)轉(zhuǎn)錄因子(SEQIDNO:7上方鏈、SEQIDNO:8下方鏈)、(圖15B)SNP(SEQIDNO:9上方鏈，SEQIDNO:10下方鏈)、(圖15D)錯(cuò)配DNA(SEQIDNO:11上方鏈、SEQIDNO:12下方鏈)、(圖15E)與CYCD1基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F1(SEQIDNO:13上方鏈、SEQIDNO:14下方鏈)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供新的組合物和方法，用于研究/表征核酸和其它與核酸結(jié)合的分子之間的相互作用。尤其是，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種納米等離子分子標(biāo)尺，其能對(duì)核酸(例如DNA)長(zhǎng)度變化進(jìn)行無(wú)標(biāo)記地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且進(jìn)行核酸足跡分析。所述標(biāo)尺是通過(guò)將單或雙鏈核酸系于單個(gè)納米顆粒(例如金納米顆粒)以形成核酸納米偶聯(lián)物來(lái)形成的。納米偶聯(lián)物散射語(yǔ)顯示出依賴于核酸長(zhǎng)度的、紅移的等離子共振波長(zhǎng)峰值，其可以通過(guò)亞納米級(jí)(sub-nanometer)軸向分辨率來(lái)測(cè)量，該分辨率就DNA來(lái)說(shuō)為每個(gè)DNA堿基對(duì)平均峰值波長(zhǎng)移動(dòng)1.24nm。單個(gè)納米偶聯(lián)物的波譜在有核酸酶的情況下顯示出隨時(shí)間推移而依賴于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分辨的特征，從而能進(jìn)行核酸酶活性的定量、動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)測(cè)量。所述標(biāo)尺提供一種定量測(cè)量長(zhǎng)度的方法，以在長(zhǎng)度變化和等離子共振峰移動(dòng)之間建立關(guān)聯(lián)性。此種測(cè)量長(zhǎng)度的方法可以被用于提供納米偶聯(lián)物核酸長(zhǎng)度和/或長(zhǎng)度變化(例如響應(yīng)核酸酶切割)的精確實(shí)時(shí)測(cè)量。在一些使用這種長(zhǎng)度測(cè)量方法的實(shí)施方式中，所述納米等離子標(biāo)尺可用于檢測(cè)和表征另一種分子(例如蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、酶等等)對(duì)納米偶聯(lián)物核酸的結(jié)合(例如鑒定結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。所述體系可以類似地用于4企測(cè)和/或定位核酸雜交反應(yīng)中的錯(cuò)配，從而鑒定核酸性質(zhì)，包括但不限于多態(tài)性、突變等等。本發(fā)明因此提供非?？焖俸捅憷钠脚_(tái)，用于對(duì)核酸-蛋白質(zhì)相互作用作圖、用于監(jiān)測(cè)核酸酶活性、和用于其它基于核酸大小的方法。在各種實(shí)施方式中，提供了利用例如在此所描述的納米等離子分子標(biāo)尺，通過(guò)表面等離子共振(SPR)，檢測(cè)樣品DNA的特定序列、堿基對(duì)改變、突變、大小、結(jié)構(gòu)、或特4正。I,納米等離子標(biāo)尺以及其用途。A)檢測(cè)和定量核酸大小以及大小變化。本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺(核酸納米偶聯(lián)物)提供一種等離子共振信號(hào)(例如納米等離子共振峰)信號(hào)，其對(duì)核酸長(zhǎng)度的改變高度敏感。因此,在一些實(shí)施方式中，提供了標(biāo)定(calibrate)信號(hào)和核酸長(zhǎng)度變化之間關(guān)系的方法和組合物。在一些實(shí)施方式中，這通過(guò)提供附著于納米顆粒的雙鏈核酸而實(shí)現(xiàn)，所述雙鏈核酸被設(shè)計(jì)成包含多個(gè)核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)，因此對(duì)納米偶聯(lián)物進(jìn)行DNA消化后，利用相應(yīng)核酸內(nèi)切酶，可通過(guò)在不同時(shí)間測(cè)量納米等離子共振信號(hào)檢測(cè)出納米偶聯(lián)物的尺寸。不同的核酸內(nèi)切酶消化位點(diǎn)可以通過(guò)所導(dǎo)致的等離子共振波長(zhǎng)變化彼此區(qū)分開來(lái)，所述變化對(duì)應(yīng)于在消化之后尚附著于納米顆粒上的DNA的不同的長(zhǎng)度。在各種實(shí)施方式中，在利分辨率。用圖1A和1B舉例說(shuō)明，在一些實(shí)施方式中，酶切割位點(diǎn)被設(shè)計(jì)/選擇，使得它們位于雙鏈DNA的不同位置，來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，限制性位點(diǎn)通常位于使核酸內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生不同的可區(qū)分的信號(hào)的位置，并且提供足夠多的限制性位點(diǎn)以產(chǎn)生具有所需分辨率和/或準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用納米等離子共振標(biāo)尺生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在實(shí)施例中描述。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)寡核苷酸長(zhǎng)54bp時(shí)，雙《連DNA包含核酸內(nèi)切酶///"^11、屈ol、和^W7l的限制性位點(diǎn)，它們的中央切割位置距離金納米顆粒所系的一端分別為12、24、36、和48bp。因此，所述寡核苦酸用四種核酸內(nèi)切酶、例如《pwl、Sa/1、J^oI和歷"c/III消化時(shí)，其在納米偶聯(lián)物上產(chǎn)生多個(gè)具有不同切割長(zhǎng)度的寡核普酸。而在一些實(shí)施方式中，可以加上熒光標(biāo)記(FITC)，用于進(jìn)一步證實(shí)核酸酶反應(yīng)。不需要進(jìn)行等離子共振測(cè)量。核酸內(nèi)切酶對(duì)合成的雙鏈DNA的消化可以通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)。只要在包含于納米偶聯(lián)物中的核酸中存在作為靶的限制性序列，在本發(fā)明的方法中適合使用任何核酸(例如DNA)限制性位點(diǎn)和相應(yīng)的酶。用于進(jìn)行核酸內(nèi)切酶消化反應(yīng)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，例如，在實(shí)施例中，按照廠家的說(shuō)明書(NewEnglandBiolab)用限制性核酸內(nèi)切酶///m/m、X/wI、^/70i和fe/I限制性消化DNA，對(duì)廠家方案進(jìn)行改進(jìn)的目的只是為從反應(yīng)緩沖液和酶中除去還原劑，以免硫醇化DNA從金納米顆粒上脫離。雖然在實(shí)施例中使用雙鏈DNA來(lái)舉例說(shuō)明標(biāo)定方法，類似的標(biāo)定可以使用雙鏈RNA、DNA/RNA雜交體等等進(jìn)行。此外，所述方法不限于利用限制性核酸內(nèi)切酶?？梢岳萌魏伪憷姆椒▽位螂p鏈核酸消化(水解)成具體的(例如預(yù)先確定的)長(zhǎng)度。因此，例如，在一些實(shí)施方式中，將單鏈核酸附著于納米偶聯(lián)物。單鏈與不同長(zhǎng)度的互補(bǔ)鏈雜交，從而形成納米偶聯(lián)物，該納米偶聯(lián)物包含終止于不同的長(zhǎng)度的單鏈核酸的雙鏈核酸。納米偶聯(lián)物用特異于單鏈核酸的核酸外切酶(例如核酸外切酶I)消化，反應(yīng)到達(dá)雙鏈部分時(shí)反應(yīng)停止?？梢源_定等離子共振信號(hào)方面的變化，并計(jì)算標(biāo)定曲線。反之，可以使用特異于雙鏈核酸的核酸外切酶進(jìn)行所述反應(yīng)?；蛘撸鰡位螂p鏈核酸可以用任何適當(dāng)試劑或酶水解、測(cè)定等離子共振信號(hào)的變化，隨后測(cè)定(例如通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法、電泳、測(cè)序，等等)所產(chǎn)生的核酸的長(zhǎng)度。這些方法是說(shuō)明性的而非限制性的。使用在此描述的方法，生成標(biāo)定B)例證性應(yīng)用。26通過(guò)用所述納米等離子共振標(biāo)尺生成標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定曲線，該標(biāo)尺然后提供一種核酸足跡法平臺(tái)，其分辨率比得上傳統(tǒng)的放射性方法。然后可以使用納米等離子共振標(biāo)尺檢測(cè)核酸樣品中特定特征(即序列、突變、結(jié)構(gòu)或特征)或與靶序列或特征結(jié)合的蛋白質(zhì)的存在。此外，使用陣列格式的核酸-納米顆粒偶聯(lián)物提供允許同時(shí)檢測(cè)樣品中多個(gè)特征的平臺(tái)。因此，在一些實(shí)施方式中，納米偶聯(lián)物中的核酸包含蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在各種實(shí)施方式中，寡核苷酸包含待檢測(cè)的特異性序列。1)結(jié)合蛋白的檢測(cè)和/或足跡分析。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺可用于DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)和/或足跡分析。這種DNA結(jié)合蛋白包括但是不限于轉(zhuǎn)錄因子、核酸酶、組蛋白等等。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，顯示切割缺陷型EcoRI(Qlll)突變體在DNA上的足跡。實(shí)施例l描述了核酸外切酶的DNA足跡分析被EcoRI(Qlll)蛋白妨礙的情形。切割缺陷型EcoRI(Ql1l)與DNA上的GAATTC(SEQIDNO:16)位點(diǎn)結(jié)合，并阻礙BAL31在單個(gè)金DNA納米偶聯(lián)物上除去核苷酸。沒(méi)有切割缺陷型EcoRI(Qlll)突變體存在時(shí)，雙鏈DNA,t5^^/酶完全消化。然而，在EcoRI(Qlll)突變體結(jié)合后，核酸外切酶消化在結(jié)合位置一皮阻止，產(chǎn)生圖5C，這是有EcoRI(Qlll)突變體時(shí)單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物在核酸外切酶BAL31消化期間隨時(shí)間推移的散射波譜，而圖5B是在無(wú)EcoRI(Ql11)突變體時(shí)單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物在核酸外切酶BAL31消化期間隨時(shí)間推移的散射波譜。在消化反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)這兩個(gè)樣品各自的單個(gè)納米偶Jf關(guān)物等離子共振波長(zhǎng)。金-DNA納米偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)作為核酸外切酶反應(yīng)中時(shí)間的函數(shù)來(lái)測(cè)出，波長(zhǎng)移動(dòng)顯示在右側(cè)Y軸上。左側(cè)Y軸上顯示在核酸外切酶反應(yīng)中被消化的雙鏈DNA堿基對(duì)作為時(shí)間的函數(shù)。Bal31將DNA足跡的遠(yuǎn)端邊界定位于距離該DNA的遠(yuǎn)端25bp之處?？梢允褂闷渌哂须p鏈DNA消化活性的核酸外切酶以代替BAL31。概念，但實(shí)際上本發(fā)明對(duì)可以被偶聯(lián)的核酸底物的序列或結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制。括但不限于莖-環(huán)、切口、單鏈DNA-雙鏈DNA轉(zhuǎn)換(transition)、瓣、Y形叉、雙鏈RNA等等。能夠快速分辨單個(gè)納米顆粒的能力使得能夠在微陣列格式或在微流體裝置中進(jìn)行高通量篩選。2)轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)和/或足跡分析。圖10顯示轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)以及足跡法。類似于EcoRI(Qlll)的例子，轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合DNA。結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子在該點(diǎn)阻礙BAL31核酸外切酶消化反應(yīng)。相反，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，雙鏈DNA被^4L31酶完全消化。將核酸外切酶BAL31消化期間有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物的隨時(shí)間推移的散射波語(yǔ)，與沒(méi)有所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合時(shí)單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物隨時(shí)間推移的散射波語(yǔ)進(jìn)行比較。這樣，納米等離子標(biāo)尺可用于檢測(cè)和定量序列特異性結(jié)合至DNA的轉(zhuǎn)錄因子的活性。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)未知時(shí)，可使用帶有不同核酸序列的一組納米等離子標(biāo)尺(核酸納米偶聯(lián)物))。那些具有結(jié)合位點(diǎn)的納米偶聯(lián)物將妨礙^4ZJ7的消化，而那些缺乏結(jié)合位點(diǎn)的納米偶聯(lián)物將要被完全消化。這樣就可以4企測(cè)和鑒定結(jié)合位點(diǎn)。3)檢測(cè)和/或定量DNA堿基修飾。圖11A和l1B示意地說(shuō)明使用本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺進(jìn)4亍足跡法，以檢測(cè)和定量存在于DNA上的DNA堿基修飾和單核苷酸多態(tài)性(SNP)，或當(dāng)一個(gè)以上核苦酸被突變時(shí)DNA中的錯(cuò)配位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，如圖11A所示，曱基結(jié)合蛋白，例如MeCP2，與DNA上的曱基化DNA核苷酸堿基結(jié)合，阻礙例如BAL31在單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物上除去核苷酸，從而妨礙核酸外切酶在所述結(jié)合位置的消化。比較在核酸外切酶BAL31消化期間有曱基結(jié)合蛋白結(jié)合的單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物的隨時(shí)間推移的散射波語(yǔ)，和沒(méi)有曱基結(jié)合蛋白時(shí)所述單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物隨時(shí)間推移的散射波譜，以鑒定曱基化的存在和/或位點(diǎn)，從而鑒定堿基修飾(例如曱基化)。4、檢測(cè)和/或鑒定/定位錯(cuò)配或SNP。28在另一個(gè)實(shí)施方式中，如圖11B所舉例說(shuō)明的，錯(cuò)配結(jié)合蛋白，例如MutS，與DNA上的錯(cuò)配位點(diǎn)(例如因單核苷酸多態(tài)性(SNP)致使互補(bǔ)被破壞的核苷酸。相反，沒(méi)有錯(cuò)配的納米偶聯(lián)物不被MutS結(jié)合，于是被完全消化。因此，納米等離子標(biāo)尺可以利用對(duì)DNA的序列特異性結(jié)合來(lái)^r測(cè)和定量單核普酸多態(tài)性。在一些實(shí)施方式中，納米偶聯(lián)物包含互補(bǔ)于野生型序列的核酸。它們與樣品中的基因組DNA、mRNA、或cDNA雜交。雜交條件充分放寬，以允許單堿基錯(cuò)配。所雜交的納米偶聯(lián)物與MutS接觸。如果存在4普配，例如由于樣品中SNP的存在所致錯(cuò)配，則MutS與錯(cuò)配位點(diǎn)結(jié)合。在這些包含錯(cuò)配的納米偶聯(lián)物上，用例如BAL31進(jìn)行的消化將被妨礙，從而指示錯(cuò)配的存在和位置。在一些實(shí)施方式中，在此描述的方法可用于檢測(cè)例如來(lái)自病人的DNA樣品中SNP和/或外遺傳曱基化堿基，如例如在圖11B和12中所示的。此外也涉及通過(guò)將例如病人的DNA與一組或一個(gè)陣列的納米偶聯(lián)物雜交而一次檢驗(yàn)多種SNP，在該組或該陣列的納米偶聯(lián)物中，具有多種SNP的野生型序列的寡核苷酸被系于納米顆粒上。雜交后，加入錯(cuò)配結(jié)合蛋白(例如MutS、或其它錯(cuò)配結(jié)合蛋白)以鑒定任何SNP和與其結(jié)合。在添加單鏈DNA核酸外切酶消化DNA之后，進(jìn)行等離子共振，通過(guò)觀察SNP位點(diǎn)處的峰來(lái)檢測(cè)突變。5)對(duì)疾病及其他狀態(tài)中的外遺傳改變進(jìn)行足跡分析參照?qǐng)D12，其示意性地顯示使用納米等離子標(biāo)尺對(duì)基因組DNA的外遺傳變化進(jìn)行足跡法。在癌癥及其他疾病中，許多調(diào)節(jié)基因，例如p53和BRCA1/BRCA2,都被外遺傳地(epigenetically)改變。這類可被本發(fā)明納米偶聯(lián)物檢測(cè)和定量的外遺傳改變包括但不限于曱基化、乙酰化、泛素化(ubiquitylation)等等。在一些實(shí)施方式中，提供來(lái)自病人樣品的基因組單鏈DNA，并將其雜交到納米等離子標(biāo)尺上。然后提供特異性結(jié)合蛋白，將其與DNA上的被修飾位點(diǎn)結(jié)合，阻礙BAL31對(duì)單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物上核苷酸的去除。在沒(méi)有蛋白質(zhì)與外遺傳變化結(jié)合的情況下，雙鏈DNA被BAL31酶完全消化。然而在該蛋白質(zhì)結(jié)合后，核酸外切酶消化在結(jié)合位置被停頓。在核酸外切酶BAL31消化期間有該蛋白質(zhì)結(jié)合的單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物的隨時(shí)間推移的散射波譜與沒(méi)有蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物隨時(shí)間推移的散射波譜作比較。因此，所述納米等離子標(biāo)尺可以利用對(duì)DNA的序列特異性結(jié)合檢測(cè)和定量外遺傳的改變。6)檢測(cè)和/或定位核酸結(jié)構(gòu)圖13顯示示意圖，舉例說(shuō)明使用本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺進(jìn)行足跡法，來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合(而不是序列特異性結(jié)合)于DNA的結(jié)構(gòu)(例如被XPG蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA鼓泡結(jié)構(gòu))的那些蛋白質(zhì)，并對(duì)這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行足跡分析?？梢员蛔R(shí)別的DNA結(jié)構(gòu)包括但不限于5bp鼓泡、10bp鼓泡、莖環(huán)和突出(ovehang)。在一個(gè)實(shí)施方式中，如圖13所示，DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白，例如XPG，與DNA上被識(shí)別的結(jié)構(gòu)結(jié)合，阻礙核酸酶例如BAL31在單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物上除去核苦酸。在XPG不存在的情況下，雙鏈DNA被BAL31酶完全消化。然而，在該結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白結(jié)合之后，核酸外切酶消化在結(jié)合位置被停頓。比較核酸外切酶BAL31消化期間有DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白結(jié)合的單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物隨時(shí)間推移的散射波譜，和沒(méi)有所述結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白結(jié)合時(shí)單個(gè)DNA-納米顆粒納米偶聯(lián)物隨時(shí)間推移的散射波譜。7)不使用結(jié)合蛋白時(shí)檢測(cè)和/或定位核酸結(jié)構(gòu)在各種實(shí)施方式中，一些核酸結(jié)構(gòu)可以不使用結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白就加以檢測(cè)和/或定位。這例如在圖14中加以舉例說(shuō)明，其中顯示不利用結(jié)合蛋白就能檢測(cè)移碼突變。包含移碼突變的基因組DNA、mRNA、或cDNA(例如RTcDNA)與包含野生型核酸探針的納米等離子標(biāo)尺雜交。由于有錯(cuò)配，雜交產(chǎn)生Y形(裂開的)DNA，終止于兩個(gè)單鏈。使用單鏈特異性核酸外切酶消化所述單鏈，核酸外切酶的消化在移碼位置停止。當(dāng)靶核酸不包含移碼時(shí)，整個(gè)探針都被雜交，不產(chǎn)生單鏈，不被所述酶消化。對(duì)雜交的核酸單鏈部分的消化(例如使用Sl核酸酶)提供信號(hào)，指示錯(cuò)配的存在和位置。雖然上述實(shí)例參照特定核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶(例如Ba131)、單鏈特異的核酸外切酶(例如S1)、結(jié)構(gòu)特異的結(jié)合蛋白(例如XPG)、^"配特異的結(jié)合蛋白(例如MutS)、和修飾特異的結(jié)合蛋白(例如MeCP"加以描述，其它種類的這類蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且可用于在此描述的方法。圖15A-15D舉例說(shuō)明各種用于本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺的核酸序列。8)其它示例性應(yīng)用。在各種研究和應(yīng)用領(lǐng)域都有許許多多潛在的核酸酶靶標(biāo)，例如HIV整合酶(Caumontetal.(1999)FEBSLett455:154-158;Rumbaughetal.(1988)JBiolChem273:28740-28745;Nair(2002)RevMedVirol12:179-193)(HIV藥物)，凋亡活化的DNases(CounisandTorriglia(2000)BiochemCellBiol78:405-414;Fan(2003)Cell112(5):659-672)(抗凋亡藥物)、和加工微小RNA/siRNA的RNases(Moss(2001)CurrBiol11:R772-775;TijstermanandPlasterk(2004)Cell117:1-3)(siRNA穩(wěn)定性)或WRN(Kamath-Loebetal.(1998)JBiolChem273:34145-34150;Shenetal.(1998)JBiolChem273:34139-34144)和V(D)J-再連接酶RAG重組酶(Roth(2003)NatRevImmunol3:656-666;ShockettandSchatz(1999)MolCellBiol19:4159-4166)(放射致敏劑藥物)。還可以體內(nèi)追蹤納米顆粒偶聯(lián)物，并且可以實(shí)時(shí)原位跟蹤反義寡核脊酸和siRNA的結(jié)局。因?yàn)榭梢詫⒍鄠€(gè)納米顆粒排成陣列以較好地將信號(hào)值平均化和擴(kuò)展不斷變化的范圍，可以從所述足跡法數(shù)據(jù)得出與DNA序列特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。這隨后可以允許測(cè)量轉(zhuǎn)錄組圖諳和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性，所有測(cè)量都以高通量和多路方式進(jìn)行。還可以擴(kuò)展這里的這個(gè)平臺(tái)，以研究不同的DNA結(jié)構(gòu)和監(jiān)測(cè)DNA結(jié)構(gòu)變化動(dòng)力學(xué)(Sonnichsenetal.(2005)NatBiotechnol23:741-745(2005).)。在此開發(fā)和描述的新技術(shù)能被用于其它水解酶，例如蛋白酶或糖基化酶的檢測(cè)；或其它改變生物分子長(zhǎng)度或電荷的那些酶，例如連接酶或激酶的檢測(cè)。此外它還提供一種高靈敏度、高特異性的酶學(xué)研究方法，而不需要放射性或熒光標(biāo)記。單個(gè)納米偶聯(lián)物無(wú)限小的尺寸也暗示一種潛在的大規(guī)模檢測(cè)器陣列，用于高通量核酸酶檢測(cè)，其中可在小于毫微微升的體積中檢測(cè)每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)。上述應(yīng)用只是說(shuō)明性而非限制性的。利用在此提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到許多用于"足跡法"用途的實(shí)施方式。C)等離子共振標(biāo)尺組。在各種的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一組納米等離子標(biāo)尺，其能被用于，例如，高通量測(cè)定、寬范圍的篩選系統(tǒng)、微流體應(yīng)用等等。所述組通常包含多個(gè)納米偶聯(lián)物，其中不同偶聯(lián)物帶有不同的核酸。不同的納米偶聯(lián)物被標(biāo)注位置，因此它們可以在如本文描述的等離子共振測(cè)量之前和/或期間和/或之后#皮區(qū)別開。在一些實(shí)施方式中，例如，不同的納米偶聯(lián)物附著于或定位在底層的不同區(qū)域，因此它們被"標(biāo)注空間位置"?；蛘?，納米等離子偶聯(lián)物可攜帶不同的標(biāo)簽，以鑒別或區(qū)別不同種類。標(biāo)簽可以包含不同的納米顆粒形狀和/或材料，或不同的共振信號(hào)，或可以通過(guò)附著的標(biāo)記來(lái)提供標(biāo)簽等等。為由許多部分組成的集合加標(biāo)簽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在不同的實(shí)施方式中，這種集合包含至少3個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、更加優(yōu)選至少IO、20、25、或50、和最優(yōu)選至少100、500、1000、5,000、或IO,OOO個(gè)不同種類。用舉例說(shuō)明的方法，在一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)期提供一個(gè)平臺(tái)，其包含本發(fā)明的納米偶聯(lián)物的陣列，用于平行和多重檢測(cè)和定量。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供陣列格式的靶序列文庫(kù)，使用戶能同時(shí)作圖和定量多個(gè)靶序列。例如，單鏈DNA形式的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的寡核苷酸文庫(kù)可以與納米顆粒結(jié)合以包含納米偶聯(lián)物文庫(kù)，其中結(jié)合相同轉(zhuǎn)錄因子的序列存在內(nèi)在冗余。提供一種轉(zhuǎn)錄因子，讓其結(jié)合于納米偶聯(lián)物文庫(kù)中的靶序列，借此可以利用本文的SPRi全測(cè)方法測(cè)量上游轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA序列對(duì)其的調(diào)節(jié)。這對(duì)于研究人員而言通常比觀察下游mRNA表達(dá)的終點(diǎn)讀數(shù)更有意義。II.等離子共振標(biāo)尺(納米偶聯(lián)物)組成和構(gòu)建。在各種實(shí)施方式中，等離子共振標(biāo)尺(納米顆粒偶聯(lián)物)包含偶聯(lián)于納米顆粒的單或雙鏈核酸。在各種實(shí)施方式中，核酸直接附著于納米顆粒(例如通過(guò)共價(jià)鍵)，而在其它實(shí)施方式中，核酸通過(guò)接頭附著于納米顆粒。在各個(gè)實(shí)施方式中，納米顆粒由金屬或半導(dǎo)體材料組成。對(duì)本發(fā)明的實(shí)施有用的納米顆粒包括，但是不限于包含下列的納米顆粒金屬(例如金、銀、銅、4烏、鉑、鈦、鐵、錳等等，或其氧化物或合金)、半導(dǎo)體材料(例如，CdSe、CdS、和包被有ZnS的CdS或CdSe等等)、多層金屬和/或金屬合金、和/或金屬氧化物或氮化物、聚合物、碳納米材料、磁性的(例如鐵磁體)膠體材料等等。在一些實(shí)施方式中，納米顆粒包含下列中的一種或多種鎢、鉭、鈮、Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、32Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo、和其氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。其它對(duì)本發(fā)明的實(shí)施有用的納米顆粒包括但是不限于ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GaAs。在一些實(shí)施方式中，納米顆粒的尺寸優(yōu)選從大約5nm至大約300nm(平均直徑)，優(yōu)選從大約5至150nm(平均直徑)，更加優(yōu)選從大約10至50nm，最優(yōu)選從大約20至大約30nm。納米顆粒的尺寸可以按照它們的具體用途或應(yīng)用的需要而變化。適當(dāng)?shù)募{米顆粒包括但是不限于納米球(nanosphere)、納米棒(nanorod)、纟內(nèi)米月牙體(nanoscrescent)、纟內(nèi)米管(nanotube)、纟內(nèi)米才菱《偉(nanopyramid)、纟內(nèi)米線(nanowire)、纟內(nèi)米角狀物(nanohorn)、納米管、纟內(nèi)米棱錐、纟內(nèi)米四腳錐體、單或多層納米盤(nanodisk)、納米角狀物等等。實(shí)質(zhì)上任何形狀的納米顆粒都可被用于一些實(shí)施方式。納米顆?？梢允枪腆w、單層、或多層、或芯-殼結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒是金和/或銀納米顆粒，因?yàn)榈入x子共振波長(zhǎng)移動(dòng)響應(yīng)于緊鄰這些納米顆粒的周圍環(huán)境的變化而發(fā)生移動(dòng)，從而有利于利用散射或吸收光譜法檢測(cè)它們。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及利用多聚體納米顆粒(例如金和/或銀納米顆粒二聚體)。這種多聚體納米顆粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參見(jiàn)例如Sonnichsenetal.(2005)NatBiotechnol23,741-745,其通過(guò)參考被并入本文)。制造納米顆粒的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這種方法包括但不限于燃燒合成(例如在氧化還原反應(yīng)中使用氧化劑(例如金屬鹽)和燃料(例如有機(jī)化合物))、蒸發(fā)/凝聚(evaporation/condensation，EC)發(fā)生器、噴霧熱解作用(例如等離子處理和粉末噴霧)、利用溶液化學(xué)例如超臨界流體進(jìn)行的液相方法、化學(xué)還原、或化學(xué)氧化、機(jī)械混合(mechanicallyalloying)、模板法(例如在模板材料(例如沸石、柱狀粘土、納米多孔膜、反向膠束等等)的小空間或區(qū)域內(nèi)形成納米顆粒)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)7,212,284、7,204,999、7,147,712、7,128,891、6,972,046、6,688,494、5,665,277，其通過(guò)參考全文引入，和PCT專利申請(qǐng)?zhí)朩O/2007/024323，其通過(guò)參考全文引入)。納米角狀物的生產(chǎn)由例如Berberetal.2000)PhysicalReviewB，62(4):R2291-2294描述，而納米纖維的生產(chǎn)由例如美國(guó)專利6,706,248、6,485,858描述，其通過(guò)參考被并入本文。也參見(jiàn)FedlheimandColby(2001)MetalNanoparticle:SynthesisCharacterization&Applications,MarcelDekker，Inc.,N.Y.;Baraton(2002)Synthesis,FunctionalizationandSurfaceTreatmentofNanoparticle,AmericanScientificPublishers;Fendler(1998)NanoparticleandnanostructuredFilms:Preparation,CharacterizationandApplications,Wiley-VCH,N.Y,等等。在一些實(shí)施方式中，納米顆粒在表面活性劑體系中合成。這種基于表面活性劑的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。更一般地說(shuō)，在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)用有機(jī)溶劑(例如乙醇)還原金屬鹽類以形成金屬膠體來(lái)形成納米顆粒(參見(jiàn)例如Hiraietal.(1979)J.Macromol.Sci.Chem.,A13:727)Hiraietal.(1976)Chem.Lett"905;ToshimaandYonezawa(1992)Makromol.Chem.，Macromol.Symp.,59:281;WangandToshima(1997)J.Phys.Chem.，97:11542等等)。一個(gè)示例性的方法由Pastoriza-SantosandLiz-Marzan(2000)PureAppl.Chem.，72(1-2):83-90描述。在它們的方法中，在穩(wěn)定劑存在或不存在的情況下，Ag+離子^皮N,N-二曱基曱酰胺(DMF)還原。所述反應(yīng)導(dǎo)致形成靜電附著在表面上的銀納米顆粒薄膜，或者銀納米顆粒的穩(wěn)定分散體。在另一個(gè)示例性的方法中，通過(guò)在有機(jī)溶劑中將鐵鹽與醇、羧酸和胺混合，并且加熱所述混合物至200-360。C制備^茲性納米顆粒。顆粒尺寸可以通過(guò)改變鐵鹽與酸/胺比例或者通過(guò)用更多氧化鐵包被小納米顆粒加以控制?？梢匀菀椎孬@得具有窄粒徑分布的尺寸2nm到20nm的磁性納米顆粒。所述方法可以容易地延至其他基于氧化鐵的納米顆粒材料，包括MFe2(34(其中M為例如Co、Ni、Cu、Zn、Cr、Ti、Ba、Mg等等)納米材料，和延伸至氧化鐵包被的納米顆粒材料。通過(guò)在反應(yīng)混合物中用硫醇代替乙醇，所述方法也導(dǎo)致合成基于硫化鐵的納米顆粒材料。磁性納米顆?？梢匝趸蒠-Fe203或-Fe203,或可以被還原為bcc-Fe納米顆粒，而基于氧化鐵的材料可用于制備基于二價(jià)鐵的金屬納米顆粒，例如CoFe、NiFe、和FeCoSmx納米顆粒(參見(jiàn)例如美國(guó)專利7,128,891，其通過(guò)參考在此并入)。一種產(chǎn)生金納米顆粒的方法涉及混合金鹽溶液與吸附劑。復(fù)合物形式的金被吸附到該吸收劑的表面。負(fù)荷了金的吸附劑，在通過(guò)篩選、過(guò)濾、靜置(settling)或其它方法與所述溶液分離之后，被灰化以形成灰?；野鸺{米顆粒以及雜質(zhì)，例如鈉、鉀和4丐的氧化物。雜質(zhì)可以通過(guò)用稀酸溶解來(lái)除去。在雜質(zhì)被除去之后，獲得相對(duì)純的金納米顆粒?；钚蕴蓟蚪鹞叫詷渲材鼙挥米魑絼Ｍㄟ^(guò)這種方法還可以容易地產(chǎn)生銀或鉑族金屬納米顆粒(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)7，060，121，其通過(guò)參考合并在此)。在另一方法中，可以使用激光熱解形成納米顆粒。傳統(tǒng)的激光熱解工藝，常常被稱為光熱工藝，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,958,348、3,941,567、6,254,928，其通過(guò)參考并入本文，等等)。在此工藝中，輻射吸收劑或其它前體氣態(tài)物質(zhì)吸收能量(例如激光)，導(dǎo)致反應(yīng)區(qū)中材料的加熱，引起反應(yīng)區(qū)中化學(xué)成分之間熱驅(qū)動(dòng)的化學(xué)反應(yīng)。典型地，激光熱解工藝使用例如由穿過(guò)化學(xué)蒸汽帶的激光束生成的精確確定的高溫帶(典型地為1000~1500。C)，其中氣體在高溫發(fā)生反應(yīng)，以形成所需的納米級(jí)微粒材料。由于沒(méi)有壁與所述高溫帶接觸，因此消除了任何污染。熱解反應(yīng)過(guò)程中形成的材料通常在重力或氣流推動(dòng)下離開高溫帶。材料被迅速地冷卻/淬火(quench)，從而形成具有非常均勻分布的大小和形狀的納米顆粒。典型的實(shí)施方式中，用二氧化碳(C02)激光來(lái)直接通過(guò)光吸收加熱氣體分子。使用激光的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的譜寬較窄，能使光和具有正確吸收波長(zhǎng)的分子前體之間進(jìn)行有效偶聯(lián)(超過(guò)15%的激光能量被消耗)。所述技術(shù)已經(jīng)被用于從金屬、金屬碳化物、金屬氮化物和金屬氧化物中生產(chǎn)各種納米大小的材料(參見(jiàn)例如Haggertyetal.(1981)ppl65-241在LaserInducedChemicalProcesses,editedby丄J.Steinfeld中；Bietal.(1993)J.Mater.Res.，8(7):1666-1674;Bietal.(1995)J.Mater.Res.10(11):2875—2884;Curcioetal.(1990)AppliedSurfaceScience、46:225-229;Danenetal.(1984)SPIE，458:124-130;Guptaetal.(1984)SPIE,458:131-139;美國(guó)專利5,958,348、6,225,007、6,200,674、6,080,337等等)。具有各種粒度范圍的多種納米顆粒也是市場(chǎng)上可買到的(參見(jiàn)例如SunNano，F(xiàn)reemont,CA;Northernnanotechnologies,Toronto,Canada等等)。在一些實(shí)施方式中，納米顆粒被修飾以改進(jìn)在例如水溶液中的溶解度、分散性。因此，例如，在一些實(shí)施方式中，納米顆粒用膦層或其它層修飾。在各種的實(shí)施方式中，納米顆?；蚝怂?，或這兩者，可被功能化以促進(jìn)核酸附著至納米顆粒。這種方法在本領(lǐng)域已知。例如，在其3，端或5'35端用烷烴硫醇功能(alkanethiol)化的核酸(例如寡核苷酸)能輕易地附著于金納米顆粒上(參見(jiàn)例如Whitesides(1995)ProceedingsoftheRobertA.WelchFoundation39thConferenceOnChemicalResearchnanophaseChemistry,Houston,Tex.，109-121頁(yè))。Mucicetal.(1996)Chem.Commun.555-557描述了一種將3，硫醇DNA附著至平坦的金表面的方法，此方法可以容易地用來(lái)將核酸附著至納米顆粒。在一些實(shí)施方式中，可以使用以下描述的功能化納米顆粒的方法以功能化納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，用氨基硅烷(amino-silane)分子對(duì)涂敷了二氧化硅(silica)的顆粒進(jìn)行功能化，以用胺使二氧化硅表面功能化。在一些實(shí)施方式中，納米顆粒是如本文實(shí)施例所描述的用膦功能化的。在另一實(shí)施方式中，利用基于硫的官能基團(tuán)將核酸結(jié)合于納米顆粒上。美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09〃60，500和09/820,279和國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US01/01190和PCT/US01/10071描述了用環(huán)二硫化物功能化的寡核苷酸，其可用于實(shí)施本發(fā)明，在此通過(guò)參考并入。所述環(huán)二硫化物優(yōu)選在它們的環(huán)中具有5或6個(gè)原子，包括兩個(gè)硫原子。適當(dāng)?shù)沫h(huán)二硫化物商業(yè)上可得到，或可通過(guò)已知方法合成。也可使用還原形式的環(huán)二硫化物。在一個(gè)實(shí)施方式中，寡核苷酸共價(jià)結(jié)合至包含官能團(tuán)的部分(moiety)，所述部分可以與納米顆粒結(jié)合。所述部分和官能團(tuán)是那些能使核酸結(jié)合至納米顆粒(例如通過(guò)化學(xué)吸附、共價(jià)或離子鍵合)的部分和官能團(tuán)。例如，有烷烴硫醇、烷烴二硫化物或環(huán)二硫化物共價(jià)結(jié)合于其5，或3'末端的寡核苷酸可用于將所述寡核苷酸結(jié)合至多種的納米顆粒，包括但不限于金納米顆粒。將寡核苷酸附著至納米顆粒的方法進(jìn)一步地在美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/877,750、公布號(hào)US20050037397中描述，其也通過(guò)參考并入本文。所述烷烴硫醇方法還可以用來(lái)將核酸附著至金屬、半導(dǎo)體和磁性膠體以及上面所列的其它納米顆粒上。用于將寡核普酸附著到固體表面的其它官能團(tuán)包括但不局限于硫代磷酸基團(tuán)(phosphorothioategroup)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,472，881,用于將寡核苷酸-硫代磷酸根結(jié)合至金表面)，取代的烷基珪氧烷(參見(jiàn)例如Burwell(1974)ChemicalTechnology,4:370377以及Matteucci和Camthers(1981)J.Am.Chem.Soc.，103:3185-3191，用于將寡核苷酸結(jié)合至二氧化硅和玻璃表面，以及Grabaretal.(1995)Anal.Chem"67:735-743,用于結(jié)合氨基烷基硅氧烷和用于類似結(jié)合巰基烷基硅氧烷)。終止于5，硫代核苷或3，硫代核苷的核酸(例如寡核香酸)也可以附著于固體表面。下列參考文獻(xiàn)描述了其它可用來(lái)將寡核普酸附著至納米顆粒的方法Nuzzoetal.,(1987)J.Am.Chem.Soc.,109:2358(在金上的二硫化物)；AllaraandNuzzo,(1985)Langmuir,1:45(在紹上的叛酸)；Allara和Tompkins(1974)J.ColloidInterfaceSci.,49:410-421(在銅上的羧酸)；Iler(1979)TheChemistryOfSilica,第6章(Wiley)(在二氧化硅上的羧酸)；TimmonsandZisman(1965)J.Phys.Chem.，69:984-990(在鉑上的羧酸);SoriagaandHubbard(1982)J.Am.Chem.Soc.,104:3937(在鉑上的芳環(huán)化合物)；Hubbard(1980)Acc.Chem.Res.,13:177(在鉑上的環(huán)丁砜、亞砜及其他功能化的溶劑)；Hickmanetal.(1989)J.Am.Chem.Soc.，111:7271(在鉑上的異腈);MaozandSagiv(1987)Langmuir,3:1045(在二氧化硅上的硅烷)；MaozandSagiv(1987)Langmuir,3:1034(在二氧化硅上的硅烷)；Wassermanetal.(1989)Langmuir,5:1074(在二氧化硅上的硅烷)；EltekovaandEltekov(1987)Langmuir,3:951(在二氧化鈦和二氧化硅上的芳香族羧酸、醛、醇和曱氣基)；Lecetal.(1988)J.Phys.Chem.,92:2597(在金屬上的硬質(zhì)磷酸酯)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用Alivisatosetal.(1996)Nature382:609-611(1996);Zanchetetal.(2001)納米Lett1:32-35(2001);Tatonetal.(2000)Science289:1757-1760和Storhoffetal.(1998)J,Am.Chem.Soc.120:1959-1964描述的方法將反應(yīng)基團(tuán)系于所述納米顆粒，上述所有文件通過(guò)參考并入本文。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)是硫醇基。在一些實(shí)施方式中，納米偶聯(lián)物包含系于納米顆粒的l、10、100、1000、10,000、最多ioo,ooo個(gè)寡核苷酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，納米偶聯(lián)物在每個(gè)顆粒上包含大約100個(gè)寡核苷酸。實(shí)質(zhì)上任何核酸(單或雙鏈)可被用于本發(fā)明的納米偶聯(lián)物。在各種實(shí)施方式中，所述核酸的長(zhǎng)度范圍從5個(gè)到大約500個(gè)核苷酸(對(duì)于雙鏈分子而言是石咸基對(duì))，優(yōu)選大約從5個(gè)到大約400、300、或200個(gè)核苷酸(或堿基對(duì))，更加優(yōu)選從大約10、5、20、25、30、或40個(gè)核苷酸(或堿基對(duì))到大約150、100、80、或60個(gè)核苷酸(或》威基對(duì))。核酸可以是天然存在的(例如分離的片段)、擴(kuò)增的(例如PCR擴(kuò)增的)、重組表達(dá)的、或化學(xué)合成的。在一些實(shí)施方式中，核酸包含合成寡核苷酸，長(zhǎng)度從大約20至大約200個(gè)核苷酸(bp)，優(yōu)選長(zhǎng)度大約40至大約100個(gè)核苷酸(bp),更優(yōu)選長(zhǎng)度大約50至大約60bp,任選在一端具有活性基團(tuán)，以將寡核香酸系到納米顆粒上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸序列可以是任何序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述序列是硫醇-AAAGGATCCAAGCTTGAATTCCTCG-X陽(yáng)AGAGATCTGTCGACGATATCGGTACCAAA(SEQIDNO:15),其中X是插入的任何耙DNA序列或特征。所述寡核香酸在大約IO、20、25、30、40、和/或50bp處有限制性位點(diǎn)，因而能夠每隔IObp的距離設(shè)立插入和消化位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶結(jié)合序列從寡核苷酸長(zhǎng)度的大約一半處開始。例如，在圖15B中，在54bp寡核苷酸中，轉(zhuǎn)錄因子序列從25bp處開始。具有指定序列的核酸(例如寡核苷酸)可在本發(fā)明實(shí)踐中用于多種用途，例如上述用途。制備具有預(yù)先確定的序列的核酸(例如寡核苷酸)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)例如Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2nded.)和Eckstein(ed.)(1991)OligonucleotidesandAnalogues,1stEd.(OxfordUniversityPress,NewYork)。在一些實(shí)施方式中，固相合成法對(duì)于寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸來(lái)說(shuō)都是優(yōu)選的(眾所周知的合成DNA的方法也用于合成RNA)。在一些實(shí)施方式中，寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸還可以用酶法制備(例如在體外、在重組表達(dá)體系中，在擴(kuò)增系統(tǒng)中，等等)。核酸可以是雙鏈(ds)或單鏈(ss)DNA、RNA、或DNA簡(jiǎn)A雜合體。III.檢測(cè)在各種實(shí)施方式中，納米偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)使用表面等離子共振(SPR)方法檢測(cè)。典型地，所述核酸納米偶聯(lián)物物固定在(例如，以磁性固定、靜電固定、化學(xué)方法固定、吸附等等)適合于進(jìn)行SPR的底層上。一種示例性的底層是超潔凈薄載玻片，但是底層不必因此受限。在一些實(shí)施方式中，使用帶有真彩色成像照相機(jī)和光語(yǔ)儀的暗視野顯微鏡系統(tǒng)獲得納米偶聯(lián)物的散射圖像和波譜。在一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)施方式中，顯微鏡系統(tǒng)由下列組成裝備暗視野聚光鏡(1.2〈NA〈1.4)的CarlZeissAxiovert200倒置顯微鏡(CarlZeiss,德國(guó))、真彩色數(shù)碼相機(jī)(CoolSNAPcf,RoperScientific,NJ)、和帶有1024x256像素冷型光譜儀CCD照相機(jī)(RoperScientific,NJ)的300mm焦距、300個(gè)凹槽/毫米的單色器(ActonResearch,38MA)。2jim寬的開口被置于單色器入口狹縫的前面，以使得目標(biāo)區(qū)域中只有單個(gè)納米顆粒。光學(xué)漂白熒光后，用100W囟素?zé)暨M(jìn)行白光照明，使用60X物鏡(NAK).8)和真彩色照相機(jī)獲得金-DNA納米偶聯(lián)物的真彩色散射圖像。金DNA納米偶聯(lián)物的散射波譜使用同樣的光學(xué)裝置獲得，但是它們被發(fā)送至單色器和光譜儀CCD?？鄢镜字?，將原始波鐠中非共振納米顆粒(即聚苯乙烯)的波譜歸一化。在實(shí)時(shí)波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)中，固定有納米顆粒的載玻片被裝配在帶有外部恒溫器的透明ITO加熱器上。被固定的納米顆粒浸于緩沖液滴中，所述緩沖液也充當(dāng)暗視野聚光鏡的接觸液體。冷凝器和納米顆粒之間的距離為1~2mm。通過(guò)移液管將核酸內(nèi)切酶和緩沖溶液加入接觸液體中，同時(shí)開始獲得連續(xù)光譜。顯微鏡系統(tǒng)完全用暗色護(hù)罩遮蔽，以防止環(huán)境光干擾和緩沖溶液的嚴(yán)重蒸發(fā)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，如本文實(shí)施例中描述的進(jìn)行DNA納米顆粒納米偶聯(lián)物核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的實(shí)時(shí)等離子共振傳感。IV.試劑盒在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含容器，所述容器包含本發(fā)明的納米等離子標(biāo)尺。所述標(biāo)尺包含許多限制性位點(diǎn)，可用于對(duì)測(cè)量核酸長(zhǎng)度變化的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含包括納米等離子標(biāo)尺的容器，所述標(biāo)尺包含核酸，所述核酸設(shè)計(jì)有位點(diǎn)，所述位點(diǎn)用于插入例如在此描述的具體核酸序列、或用于探測(cè)核酸樣品的具體性質(zhì)(例如多態(tài)性、插入、缺失等等)和/或用于檢測(cè)一種或多種核酸結(jié)合蛋白(例如轉(zhuǎn)錄因子、酶等等)的存在和/或?qū)λ龅鞍锥ㄎ?。在一些?shí)施方式中，所述納米偶聯(lián)物包含一組納米偶聯(lián)物，這些納米偶聯(lián)物或者在底層上被化學(xué)標(biāo)注或從空間上被標(biāo)注，或者將不同的種類分隔在不同的容器中。試劑盒任選包括在此描述的核酸結(jié)合蛋白、和/或核酸內(nèi)切酶和/或核酸外切酶。另外，所述試劑盒任選包括標(biāo)記和/或?yàn)閷?shí)施在此描述的方法提供指導(dǎo)的指導(dǎo)材料。優(yōu)選的指導(dǎo)材料描述了在此描述的一種或多種納米偶聯(lián)物用于標(biāo)定SPR系統(tǒng)以測(cè)量核酸長(zhǎng)度變化和/或進(jìn)行在此描述的任何方法的用途。盡管指導(dǎo)材料典型地包含書面的或印刷的材料，它們不局限于此。任介包括但不局限于電子存儲(chǔ)媒體(例如磁盤、信息帶(tape)、盒式磁盤(cartridge)、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如CDROM)等等。這種媒介可以包括提供這種指導(dǎo)材料的因特網(wǎng)站點(diǎn)網(wǎng)址。實(shí)施例下列實(shí)施例用來(lái)舉例說(shuō)明、但并非限制所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例l用于測(cè)量核酸酶活性和DNA足跡法的納米等離子分子標(biāo)尺在本實(shí)施例中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種納米等離子分子標(biāo)尺，其帶有連接至20-nm金納米顆粒的、作為酶底物和標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)的54bp雙鏈DNA(dsDNA)(圖1A、1B，圖2A的圖a-c)。雙鏈DNA包括核酸內(nèi)切酶///"^111、屈ol、&/1和尺p"I的切割位點(diǎn)，這些切割位點(diǎn)的中心分別在核香酸位點(diǎn)12、24、36和48位上(圖1B)。雙鏈DNA在所述金納米顆粒上的表面密度通過(guò)在固定期間它們的濃度比來(lái)控制。我們發(fā)現(xiàn)，DNA/金比例為100:l時(shí)最好地兼顧了保留雙鏈DNA的自然延伸的要求(圖2A),和允許核酸酶接近的要求(Paraketal.(2003)NanoLett.3:33-36)(圖2B)。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)(圖2A)和電泳(圖2B,圖片a)確認(rèn)帶有雙鏈DNA的金納米顆粒的表面修飾。使用暗視野顯微鏡系統(tǒng)獲得單個(gè)納米偶聯(lián)物的散射圖像和波鐠，該暗視野顯微鏡系統(tǒng)帶有真彩色成像(truecolorimaging)的電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)和光譜儀(圖2C,圖片a)。有趣的是，不攜帶DNA而攜帶膦表面活性劑(參見(jiàn)圖7)的金(圖2C、圖片b)與金-DNA(圖2C,圖片c)呈現(xiàn)不同的顏色，分別為黃色和紅色。DNA的附著看來(lái)將金納米顆粒的等離子共振波長(zhǎng)峰紅移(red-shift)67nm(圖2C，圖片d)。該標(biāo)尺提供了研究核酸酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的一種新手段(means)。一種模式核酸內(nèi)切酶一屈ol—的核酸內(nèi)切酶活性和動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)測(cè)量得到證實(shí)，^2oI核酸內(nèi)切酶反應(yīng)后，由于損失30bp的雙鏈DNA，平均等離子共振波長(zhǎng)下降(圖3A,3B，和8)。還可以觀察到EDTA誘導(dǎo)的對(duì)J^oI反應(yīng)的抑制(圖3B)。鹽濃度變化可以被忽略，因?yàn)樗谐煞钟孟嗤姆磻?yīng)緩沖液溫育(圖3B)。我們?nèi)缓蠹杏诟街腄NA的大小所帶來(lái)的影響。為了研究金DNA納米偶聯(lián)物的納米等離子共振頻率移動(dòng)是否可以精確地反映DNA大小的變化，我們通過(guò)核酸內(nèi)切酶切割人工地產(chǎn)生DNA大小的標(biāo)準(zhǔn)品。在暗視野下用光語(yǔ)學(xué)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)樣品的大約IO個(gè)納米偶聯(lián)物，平均納米等離子共振波長(zhǎng)顯示于圖4A和4B。金-DNA納米偶聯(lián)物與X/"I、屈ol和歷mmi反應(yīng)，它們分別切割從全長(zhǎng)雙鏈DNA遠(yuǎn)端起算的前6、18、30和42bp。圖4A顯示了1小時(shí)切割反應(yīng)后，金DNA納米偶聯(lián)物的典型散射波譜和等離子共振波長(zhǎng)。圖4B顯示了系有0、12、24、36、48和54bp雙鏈DNA的單個(gè)金納米顆粒的等離子共振諳。平均波長(zhǎng)從金-DNA分別藍(lán)移大約67nm、62nm、45nm、28nm、10nm和0nm。納米顆粒等離子共振的移動(dòng)對(duì)應(yīng)于納米顆粒周圍介電層的變化，與被消化的雙鏈DNA的長(zhǎng)度有關(guān)。對(duì)被涂覆的金納米顆粒進(jìn)4亍米氏散射(Miescattering)i十算(BohrenandHuffman(1983)AbsorptionandScatteringofLightbySmallParticles(Wiley,NewYork),獲得生物聚合物殼(雙鏈DNA+膦)的等效介電常數(shù)(the叫uivalentdielectricconstant)或折射率(refractiveindex)(參見(jiàn)圖4B、圖9和下面的表1)。表1.基于SPR波長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果，反算(back-calculate)金-DNA納米偶聯(lián)物的生物聚合物殼的介電常數(shù)和折射率。對(duì)于第一組人和n計(jì)算值，金的介電常數(shù)由Johnson和Christy(1972)Phys.Rev.B6:4370-4379提供，Mulvaney(1996)Langmuir12:788-800的逼近方禾呈(approximationequation)*被用于計(jì)算。對(duì)于第二組人和n計(jì)算值，金的介電常數(shù)也由JohnsonandChristy提供(見(jiàn)上)，使用來(lái)源于BHCOAT(BohrenandHuffman(1983)Absorptionandscatteringoflightbysmallparticles.(JohnWiley&Sons，Inc.,NewYork)的模擬程序(simulationcode)。對(duì)于第三組人和n計(jì)算值，介電常數(shù)由Weaveretal.(1981)Opticalpropertiesofmetals(Fachinformationszentrum,Karlsruhe,Germany)提供，Mulvaney(見(jiàn)上)的逼近方程被用于計(jì)算。1=入p2+2sm),其中入是波長(zhǎng)，是金的主等離子體(bulkplasma)波長(zhǎng)，￡°°是超高頻率時(shí)金的介電常數(shù)，Sm是殼層的介電常數(shù)。41<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>雙鏈DNA長(zhǎng)度和等效折射率之間的關(guān)系顯示與二次Langevin模型很好地?cái)M合(MazurandJernigan，(1991)Biopolymers31:1615-1629)(圖4B中的擬合曲線)。觀察到平均波長(zhǎng)移動(dòng)為1.24nm/bp(Paraketal.(2003)NanoLett.3:33-36)。請(qǐng)注意，完整雙鏈DNA的全長(zhǎng)(~20nm)比有效F6rster傳遞距離(effectiveF6rstertransferdistance)(<10nm)長(zhǎng)得多，因此所述標(biāo)尺比F6rster共振能量傳遞的檢測(cè)范圍長(zhǎng)。根據(jù)在等離子波長(zhǎng)移動(dòng)和DNA大小之間建立的關(guān)聯(lián)曲線(圖4B),可以確定核酸酶反應(yīng)中DNA的長(zhǎng)度，這允許我們測(cè)量DNA-結(jié)合蛋白的足跡。五coRI(Qlll)蛋白質(zhì)被用作基于核酸外切酶的DNA足跡法中的模式蛋白。五coRI(Q111)為EcoRI蛋白質(zhì)的切割缺陷型變體，氨基酸殘基111突變成谷氨酰胺(Q)。五coRI(Qlll)仍然保持對(duì)雙鏈DNA上的序列GAATTC(SEQIDNO:16)的特異結(jié)合活性，但是不切割DNA(Kingetal.(1989)Biol.Chem.264:11807-11815;PavcoandSteege(1990)Biol.Chem.265:9960-9969)?！阠oRI(Qlll)先前被用來(lái)阻斷轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)復(fù)合物(Jettetal.(1994)Pro"Natl.Acad.Sci.，USA，91:6870-6874)。如圖5A所描繪的，￡coRI(Ql1l)與金-DNA納米偶聯(lián)物上的GAATTC(SEQIDNO:16)序列結(jié)合。隨后，引入核酸外切酶/fl/31，以便從沒(méi)有系著納米顆粒的那一端非特異性降解雙鏈DNA。核酸外切酶對(duì)雙鏈DNA的3'和5'末端都降解(Legerskietal.(1978)NucleicAcidsRes.5:1445-1464)。圖5B和5C分別顯示在沒(méi)有五coRI(Ql1l)結(jié)合和有五coRI(Qlll)結(jié)合的情況下，5a/31消化金-DNA納米偶聯(lián)物的散射波譜。對(duì)于未被結(jié)合的DNA，1使納米偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)在20分鐘內(nèi)藍(lán)移52nm，之后穩(wěn)定(圖5D中的正方形)；然而，對(duì)于有&oRI(Ql1l)結(jié)合的DNA，納米偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)在穩(wěn)定之前最多移動(dòng)25nm(圖5D，圓圏)。根據(jù)擬合的二次Langevin模型，計(jì)算被降解的雙鏈DNA的相應(yīng)堿基對(duì)長(zhǎng)度(參見(jiàn)下面的方法)。i5a/3l核酸外切酶消化掉54bp雙鏈DNA的幾乎全部(90%),但是有五coRI(Qlll)阻斷Sa/31核酸外切酶的行進(jìn)時(shí)，Sa/31只消化掉25bp。核酸外切酶的受阻點(diǎn)距離該DNA的遠(yuǎn)端大約25士3bp，距離GAATTC(SEQIDNO:16)位點(diǎn)大約7bp,與早先使用傳統(tǒng)放射性同位素標(biāo)記所進(jìn)行的測(cè)量(7土3bp)(PavcoandSteege(1990)Biol.Chem.265:9960-9969)完全符合。早先的作圖指示五coRI(Qlll)結(jié)合位于GAATTC(SEQIDNO:16)序列3'邊界側(cè)翼的3bp雙鏈DNA，另外的4bp由五coRI(Q111)和核酸外切酶間空間排斥造成。不切割雙鏈DNA的對(duì)照核酸外切酶fico-l顯示對(duì)標(biāo)尺波譜沒(méi)有影響(圖5D)。我們實(shí)驗(yàn)中的等離子共振位移的程度大于早先對(duì)其它生化反應(yīng)例如蛋白結(jié)合的報(bào)告。我們把相對(duì)較大的波長(zhǎng)移動(dòng)歸因于雙鏈DNA的軸向剛性、和其介電常數(shù)對(duì)其長(zhǎng)度的獨(dú)特依賴。加之，蛋白質(zhì)與DNA有不同的電子密度，看來(lái)DNA散射能力比蛋白質(zhì)高一個(gè)數(shù)量級(jí)。所以，與由盤繞的蛋白質(zhì)結(jié)合或分離事件所誘導(dǎo)的變化相比，雙鏈DNA的部分縮短或加長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致金表面周圍相應(yīng)較大的變化。此外，DNA長(zhǎng)度的縮短也伴隨著DNA折射率的大大減少(表l，見(jiàn)上)。由Doron-Mor和同事們所進(jìn)行的一項(xiàng)獨(dú)立研究顯示，基于配位作用的自我組裝的多層可以在l-15nm范圍內(nèi)為金納米顆粒SPR波譜提供厚度微調(diào)(thicknesstuning)(Doron-Moretal.(2005)Chem.Eur.1.11:5555-5562;Wanunuetal.(2005)Am.Chem.Soc.127:17877-17887)，進(jìn)一步地證實(shí)了我們的觀察，即納米等離子波譜移動(dòng)可以與DNA長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)。金納米顆粒在大小和形狀上的不規(guī)則性也許是導(dǎo)致波譜變寬、以及由此引起的標(biāo)準(zhǔn)差的一個(gè)因素。通過(guò)使用具有更好形狀和大小控制的納米顆粒，可以進(jìn)一步改進(jìn)我們測(cè)量的準(zhǔn)確度和光譜分辨率。通過(guò)利用瑞利散射(Rayleighscattering)相比于熒光或拉曼散射(Ramanscattering)的高量子效率(highquantumefficientcy)，纟內(nèi)米等離子分子標(biāo)尺的時(shí)間分辨率可以高達(dá)每秒一個(gè)波i普(onespectrum);因此，以秒為時(shí)間等級(jí)的生物分子反應(yīng)也可以被測(cè)量。雖然這里僅使用簡(jiǎn)單的雙鏈DNA底物，對(duì)寡核苷酸底物的序列或結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制。不需要放射性或熒光標(biāo)記就能夠分辯單個(gè)納米顆粒的能力也使得在高密度微陣列或在微流體裝置中進(jìn)行高通43量篩選成為可能。所述技術(shù)還可以用于檢測(cè)誘導(dǎo)長(zhǎng)度變化的其它酶。方法合成DNA寡核苷酸和制備硫醇化的、FITC標(biāo)記的雙鏈DNA。合成兩條互補(bǔ)DNA鏈，每條長(zhǎng)54個(gè)核苦酸(Operon，Alameda,CA)。它們是(1)在寡核苷酸5'端帶有雙^JH奮飾的寡核苷酸SprAuFor(二^L醇-5，-AAAGGATCCAAGCTTGAATTCCTCGAGAGATCTGTCGACGATCTCGGTACCAAA-3',SEQIDNO:17)，和(2)反向互補(bǔ)鏈，稱為SprAuRev(FITC-5'TTTCCTAGGTTCGAACTTAAGGA-GCTCTCTAGACAGCTGCTATAGCCATGGTTT-3'，SEQIDNO:18)。為了制備雙鏈DNA,在100nL終體積中以摩爾比1:1混合5'-硫醇化8口『八1^01"和5'-FITC-標(biāo)記的SprAuRev?；旌衔锸紫韧ㄟ^(guò)加熱至95。CIO分鐘而變性，然后DNA鏈通過(guò)緩慢冷卻至室溫來(lái)再退火。通過(guò)凝膠電泳檢查DNA的質(zhì)量。根據(jù)廠家說(shuō)明書(NewEnglandBiolab,Beverly,MA)用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII、Kpnl、Xhol、和SalI對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)試性消化(圖6)。顯示了各個(gè)酶的切割位點(diǎn)(圖1B)。l(A的每一種酶各與適當(dāng)量的緩沖液和水混合，終反應(yīng)體積10(VL。反應(yīng)37。C過(guò)夜保溫。消化然后在5o/。NuSieve瓊脂糖凝膠、1XTBE中加以證實(shí)，用10bp序列梯作為分子量標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen，Carlsbad,CA)(圖6)。膦表面活性劑對(duì)金納米顆粒的增溶作用為了增加金納米顆粒的穩(wěn)定性以適合于進(jìn)一步操作，如先前所描述的(Paraketal.(2003)NanoLett.3:33-36)略加改變,將20nm金膠體的表面結(jié)構(gòu)(surfacecapping)用膦(雙(對(duì)石黃酰苯基)苯基膦(Bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine)，STREMChemicals,Newburyport,MA)修飾，以增溶20nm金納米晶體(TedPdla,Inc,Redding,CA)。超速離心(14,000RPM，20分鐘)使納米顆粒沉淀，10mL的20nm納米顆粒溶液(2.32nM)濃縮200倍。沉淀重懸在50的膦緩沖液中(DEPC處理過(guò)的水中的0.3fiM-4mM膦)?；旌衔镌趽u床上室溫過(guò)夜，以有足夠的時(shí)間使表面活性劑交換。膦涂覆的金顆粒的最終濃度為~0.46pM。我們?cè)?%瓊脂糖凝膠上對(duì)金納米顆粒進(jìn)行電泳，觀察到成功的表面活性劑交換。可以看出1^L濃縮的膦涂覆的金顆粒就足以在凝膠上顯示金納米顆粒。44制備雙鏈DNA偶聯(lián)的金納米顆粒雙鏈DNA(圖1B)以摩爾比200:1、100:1、50:1和20:1在室溫與濃縮的膦涂覆的金納米顆粒(參見(jiàn)圖7)混合大約12小時(shí)，然后存儲(chǔ)在-20。C。用電泳來(lái)證實(shí)DNA附著(圖2B，圖片a)。清楚地觀察到DNA偶聯(lián)的金顆粒遷移率降低，指示DNA成功附著至金納米顆粒。DNA的存在可以在有或者沒(méi)有醋酸雙氧鈾染色的情況下通過(guò)透射電子顯微鏡成像證實(shí)，額外的著色劑進(jìn)一步增加整個(gè)復(fù)合物的有效直徑(圖2A)。單個(gè)金-DNA納米偶聯(lián)物的散射成像和波語(yǔ)學(xué)顯微鏡系統(tǒng)由下列組成裝備暗視野聚光鏡(1.2,(數(shù)值孔徑)，1.4)的CarlZeissAxiovert200倒置顯微鏡(CarlZeiss,德國(guó))，真彩色數(shù)碼相才幾(CoolSNAPcf，RoperScientific),和焦距300mm、每毫米300個(gè)凹槽的單色儀(ActonResearch,MA)，其配有1024x256像素的冷型光譜儀CCD照相機(jī)(RoperScientific,NJ)。單色儀入口狹縫的前面置有2pm寬的開口，以-使得目標(biāo)區(qū)域中只有單個(gè)納米顆粒。在光學(xué)漂白熒光之后，使用60X物鏡(數(shù)值孔徑-0.8)和真彩色照相機(jī)，用100W鹵素?zé)暨M(jìn)行白光照明，獲得金DNA納米偶聯(lián)物的真彩色散射圖像。金DNA納米偶聯(lián)物的散射波譜傳送至單色儀和光譜儀CCD?？鄢镜字?，原始波譜相對(duì)于非共振納米顆粒(聚苯乙烯)的波譜歸一化。在實(shí)時(shí)波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)中，固定有納米顆粒的載玻片被裝配在帶有外部恒溫器的透明氧化銦錫(ITO)加熱器上，被加熱到37。C或25。C。被固定的納米顆粒浸于緩沖液滴中，所述緩沖液也充當(dāng)暗視野聚光鏡的接觸液體。用移液管向接觸液體中加入核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶和緩沖溶液，于此同時(shí)開始連續(xù)獲得光語(yǔ)。顯微鏡系統(tǒng)用暗色護(hù)罩完全覆蓋，以防止環(huán)境光干擾和過(guò)度蒸發(fā)。金-DNA納米顆粒偶聯(lián)物上雙鏈DNA的切割反應(yīng)我們將金-DNA納米偶聯(lián)物靜電固定在超凈的薄玻璃載玻片上。如上所述(圖6)，在100pl終體積中用內(nèi)切核酸酶歷^ffll、/^"1、屈oI和Sa/I(圖2B，圖片b)和lplAu-DNA顆粒進(jìn)行DNA切割反應(yīng)，改變之處僅在于從反應(yīng)緩沖液和酶中除去還原劑，以防止硫醇化DNA從金納米顆粒上脫離。通過(guò)熒光成像證實(shí)核酸內(nèi)切酶切割為了證實(shí)金DNA納米偶聯(lián)物等離子共振頻率移動(dòng)是由于核酸內(nèi)切酶的作用，而且納米等離子移動(dòng)可以精確地反映DNA切割誘導(dǎo)的大小改變，我們將有核酸酶時(shí)的金DNA納米偶聯(lián)物的暗視野圖像(圖3A，圖片b-c)和FITC焚光圖像(圖8，圖片2和3)與無(wú)核酸酶時(shí)的金DNA納米偶聯(lián)物(圖3A,圖片1，和圖8，圖片1)比較。XhoI核酸內(nèi)切酶反應(yīng)l小時(shí)(圖3A,圖片b和圖8，圖片2)和16小時(shí)(圖3A，圖片c和圖8，圖片3)。切割前，金DNA納米偶聯(lián)物中的熒光強(qiáng)。注意完整雙鏈DNA的全長(zhǎng)(20nm)比有效F6rster傳遞距離(〈10nm)長(zhǎng)很多，因而FITC熒光團(tuán)不被淬滅。DNA切割之后，F(xiàn)ITC熒光團(tuán)與金納米顆粒脫離，擴(kuò)散入緩沖溶液中，因此在圖象平面處(金納米顆粒所處的位置)總茇光強(qiáng)度顯著減少。FITC標(biāo)記去除實(shí)驗(yàn)的目的完全是為了證實(shí)酶切割。熒光標(biāo)記對(duì)等離子共振測(cè)量沒(méi)有影響。光學(xué)漂白熒光后測(cè)量納米偶聯(lián)物的散射波譜。在最初3分鐘內(nèi)，等離子共振波長(zhǎng)暫時(shí)紅移、散射強(qiáng)度增加、波譜變平。短暫的波動(dòng)很可能是由于切割前一開始將酶分子加載到雙鏈DNA上所致。核酸內(nèi)切酶活性的實(shí)時(shí)測(cè)量、核酸內(nèi)切酶活性的動(dòng)力學(xué)和核酸內(nèi)切酶活性的抑制使用Iol作為模式酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量。也通過(guò)FITC熒光成像證實(shí)切割(參見(jiàn)例如圖8)。FITC標(biāo)記去除實(shí)驗(yàn)的目的完全是為了證實(shí)酶切割。金DNA納米偶聯(lián)物用白光源照射20分鐘，以在光i普測(cè)定之前使熒光被徹底地光學(xué)漂白。熒光標(biāo)記對(duì)等離子共振測(cè)量沒(méi)有影響。引入狄ol后，立即同步開始連續(xù)獲得所選擇的納米顆粒的散射波譜。對(duì)于實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)測(cè)量，每分鐘獲得積分時(shí)間(integrationtime)為10秒的一個(gè)波i普。前10分鐘內(nèi)X!l察到等離子共振波長(zhǎng)顯著藍(lán)移(blueshift)，并與強(qiáng)度降低相關(guān)聯(lián)(圖3B)。Au-DNA納米偶聯(lián)物上的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)速率顯示出濃度依賴，并確定為遵從米-曼氏酶動(dòng)力學(xué)(Mizuetal.(2004)Biomaterials25:31093116)(圖3B)。速率常數(shù)為5.8xl(T3s-1(3.5nM)和1.5x10-3s-1(350pM)。同時(shí)添加IOmMEDTA和3.5-nMXhoI酶使得金-DNA納米偶聯(lián)物上的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)被抑制；EDTA可以螯合XhoI活性所需的反應(yīng)緩沖液中的Mg2+。與雙鏈DNA-金結(jié)合的EcoRI(0111)的gfl,-31足跡分析根據(jù)早先的描述(Kingetal.(1989)J.Biol.Chem.264:11807-11815;Pavcoetal.(1990)J.Biol.Chem.265:9960-9969;JettandBear(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:6870-6874)純化切割缺陷型EcoRI(Ql11)，并以分，使得核酸外切酶切割不會(huì)被影響)一起37。C在80iil反應(yīng)緩沖液中保溫10分鐘。然后，將20fi1^z/31酶(Clontech)添加入包含固定化金-DNA納米偶聯(lián)物的反應(yīng)緩沖液中，最終容積100pl，5a/31終濃度為100nM。結(jié)合緩沖液包含50mMNaCl、10mMMgCl2、0.025%TritonX陽(yáng)100和100mMTris-HCl25。CpH7.5。擴(kuò)散速率的評(píng)估我們所觀察到的DNA切割不是受擴(kuò)散限制的過(guò)程。核酸內(nèi)切酶的擴(kuò)散速率(每單位時(shí)間擴(kuò)散到單個(gè)納米偶聯(lián)物上的酶分子的數(shù)目)可以評(píng)估為Zl7V/zlf=^rZ>C,其中》5xl(T、mV秒是水中酶的擴(kuò)散常數(shù)，r二28nm是單個(gè)納米偶聯(lián)物的半徑，C二3.5nM是酶的摩爾濃度。擴(kuò)散速率被評(píng)估為37個(gè)分子/秒。因此我們觀察到的DNA消化不是受擴(kuò)散限制的過(guò)程(否則單個(gè)納米偶聯(lián)物上100個(gè)雙鏈DNA的消化在數(shù)秒內(nèi)便會(huì)結(jié)束)。另一方面，納米偶聯(lián)物上核酸酶反應(yīng)的速率常數(shù)(對(duì)于較高濃度的屈oI而言為5.8xl()-Y')與游離溶液中的速率常數(shù)(FryeandRoyer(1997)Biophys.J.72:Th399-Th399)相當(dāng)。這意味著金納米顆粒對(duì)酶活性僅有極小影響，僅僅起高度敏感的傳感器的作用。計(jì)算不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA的折射率可以使用米氏散射理論計(jì)算金-DNA納米偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)。相關(guān)變量包括金的介電常數(shù)、生物聚合物殼(膦+雙鏈DNA)的有效厚度和折射率。我們使用了由JohnsonandChristy(1972)Phys.Rev.B6:4370-4379提供的在各種波長(zhǎng)下金的介電常數(shù)，盡管他們的結(jié)果被認(rèn)為更適合于大塊金或多晶金。我們?cè)u(píng)估膦層厚度為2nm。雙鏈DNA長(zhǎng)度計(jì)算為0.34nm/bp。雙鏈DNA在切割前和KpnI、Sall、Xhol、HindIII切割之后的長(zhǎng)度分別為54、48、4736、24、12和0bp，因此生物聚合物殼厚度分別為18.36、16.32、12.24、8.16、4.08、,口2nm。<吏用由BohrenandHuffman(1983)Absorptionandscatteringoflightbysmallparticles.(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)才是供的4十對(duì)涂覆顆粒的計(jì)算程序，不同厚度的生物聚合物殼的介電常數(shù)在多次試驗(yàn)和錯(cuò)誤之后被找到。等效折射率可以被認(rèn)為只不過(guò)是介電常數(shù)的平方才艮。雙鏈DNA的介電常數(shù)對(duì)雙鏈DNA長(zhǎng)度的依賴性已經(jīng)被研究，描述其關(guān)系的二次Langevin模型也已經(jīng)建立(MazurandJemigan(1991)Biopolymers31:1615-1629)。我們根據(jù)下列經(jīng)驗(yàn)公式=n2(1)=a[Coth(bl2)-1/112]+0擬合所計(jì)算的折射率，其中a、b和c是三個(gè)擬合變量(Bohren肌dHuffman,(1983)AbsorptionandScatteringofLightbySmallParticles(Wiley,NewYork)。我們的計(jì)算結(jié)果與Mulvaney(1996)Langmuir12:788-800提供的結(jié)果非常一致。應(yīng)理解，在此描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說(shuō)明性，受其教導(dǎo)可為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
專業(yè)人員提示各種改變或變化，應(yīng)該被包括本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)以及包括在隨附的權(quán)利要求書范圍之內(nèi)。在此所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過(guò)針對(duì)所有用途全文參考而并入本文。權(quán)利要求1.一種用于在等離子共振系統(tǒng)中測(cè)量核酸長(zhǎng)度變化的納米等離子共振標(biāo)尺，所述標(biāo)尺包含納米顆粒，所述納米顆粒上附有核酸，以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，其中所述核酸包含至少兩個(gè)限制性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的位置使得所述偶聯(lián)物在其中一個(gè)限制性位點(diǎn)處被切割所產(chǎn)生的等離子共振信號(hào)能與所述核酸偶聯(lián)物在其它限制性位點(diǎn)處被切割所產(chǎn)生的等離子共振信號(hào)區(qū)別開，和/或與完整偶聯(lián)物所產(chǎn)生的等離子共振信號(hào)區(qū)別開。2.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸是雙鏈DNA或雙鏈RNA。3.權(quán)利要求2的納米等離子標(biāo)尺，其中所述核酸是雙鏈核酸，其包含附著于所述納米顆粒的第一鏈，以及與所述第一鏈雜交、但不附著于所述納米顆粒的第二鏈。4.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含至少三個(gè)不同的限制性位點(diǎn)。5.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸進(jìn)一步包含蛋白結(jié)合位點(diǎn)。6.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含至少兩個(gè)或更多不同的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。7.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度范圍從3個(gè)核苷酸到大約500個(gè)核苷酸。8.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度范圍從大約5個(gè)核苦酸到大約200個(gè)核苷酸。9.權(quán)利要求1的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸的長(zhǎng)度范圍從大約IO個(gè)核苦酸到大約IOO個(gè)核苷酸。10.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。11.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。12.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。13.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、鉑、賴合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、■InAs、和GaAs。14.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含金和/或銀。15.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中納米顆粒粒度范圍從大約5腿到大約150歸。16.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中納米顆粒粒度范圍從大約〗Onm到大約50nm。17.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面被功能化，以用于附著核酸。18.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面用膦層功能化。19.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面用二氧化硅涂覆，并使用氨基硅烷分子進(jìn)行功能化。20.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約IO到大約IO,OOO個(gè)核酸分子。21.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約IOO個(gè)核酸分子。22.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp,在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。23.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含選自下組的識(shí)別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)、和酶結(jié)合位點(diǎn)。24.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物被固定在適于進(jìn)行表面等離子共振的底層上。25.權(quán)利要求l的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物被靜電固定在玻璃、石英、或陶瓷表面上。26.用于鑒定與核酸結(jié)合的分子的結(jié)合位點(diǎn)的底層，所述底層包含適合于進(jìn)行表面等離子共振測(cè)量的底層，所述底層攜帶有一組附著于其上的納米等離子共振標(biāo)尺，每個(gè)標(biāo)尺包含納米顆粒，核酸附著于納米顆粒上形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，從而所述核酸尺寸的變化能通過(guò)所述偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化檢測(cè)出來(lái)，并且其中所述標(biāo)尺各自包含不同種類的納米偶聯(lián)物，并且所述標(biāo)尺都被標(biāo)注。27.權(quán)利要求26的底層，其中所述偶聯(lián)物從空間上被標(biāo)注。28.權(quán)利要求26的底層，其中所述底層攜帶至少三個(gè)不同的納米偶聯(lián)物種類。29.權(quán)利要求26的底層，其中所述底層攜帶至少十種不同的偶聯(lián)物。30，權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸選自下組單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、和雙鏈RNA。31.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸是雙鏈核酸，其包含附著于所述納米顆粒的第一鏈，以及與所述第一鏈雜交、但不附著于所述納米顆粒的第二鏈。32.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸包含蛋白結(jié)合位點(diǎn)和/或至少一個(gè)限制性位點(diǎn)。33.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸包含蛋白結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)限制性位點(diǎn)。34.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸長(zhǎng)度為3個(gè)核苷酸至500個(gè)核苷酸。35.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸至200個(gè)核苷酸。36.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸至100個(gè)核苷酸。37.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。38.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。39.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒包含包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。40.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒包含包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、柏、鉑合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GsAs。41.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒包含金和/或銀。42.權(quán)利要求26的底層，其中納米顆粒粒度范圍從大約5nm到大約150nm。43.權(quán)利要求26的底層，其中納米顆粒粒度范圍從大約10nm到大約50nm。44.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒的表面被功能化，以用于附著核酸。45.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒的表面用膦層功能化。46.權(quán)利要求26的底層，其中所述納米顆粒的表面用二氧化硅涂覆，并使用氨基硅烷分子進(jìn)行功能化。47.權(quán)利要求26的底層，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約IO到大約10,000個(gè)核酸分子。48.權(quán)利要求26的底層，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約IOO個(gè)核酸分子。49.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp，在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。50.權(quán)利要求26的底層，其中所述核酸包含SEQIDNO:15的雙鏈DNA寡核普酸，其中SEQID15中的X是插入的長(zhǎng)度范圍從大約3到大約50個(gè)核苷酸的4壬^可DNA序列或部件。51.權(quán)利要求50的納米等離子共振標(biāo)尺，其中X包含選自下組的序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、錯(cuò)配序列、單核苷酸多態(tài)性、外遺傳改變的序列、蛋白結(jié)合位點(diǎn)和酶結(jié)合位點(diǎn)。52.—種納米等離子共振標(biāo)尺，所述標(biāo)尺包含納米顆粒，所述納米顆粒上附著有核酸，從而形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，因此核酸尺寸的變化能通過(guò)所述偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化檢測(cè)出來(lái)。53.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸選自下組單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、和雙鏈RNA。54.權(quán)利要求53的納米等離子標(biāo)尺，其中所述核酸是雙鏈核酸，其包含附著于所述納米顆粒的第一鏈，以及與所述第一鏈雜交、但不附著于所述納米顆粒的第二鏈。55.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸是雙鏈的RNA或DNA或DNA/RNA嵌合體。56.權(quán)利要求55的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含蛋白結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)限制性位點(diǎn)。57.權(quán)利要求55的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含蛋白結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)限制性位點(diǎn)。58.權(quán)利要求55的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸包含兩個(gè)或更多不同的蛋白結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)限制性位點(diǎn)。59.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度范圍為從3個(gè)核苷酸到大約500個(gè)核苷酸。60.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度范圍為從大約5個(gè)核苷酸到大約200個(gè)核苷酸。61.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸的長(zhǎng)度范圍從大約IO個(gè)核苦酸到大約IOO個(gè)核苷酸。62.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層納米盤、和納米角狀物。63.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸長(zhǎng)度大約50-60bp,在一端上具有反應(yīng)基團(tuán)，以將核酸系到所述納米顆粒上。64.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述核酸是SEQIDNO:15的雙鏈DNA寡核苷酸，其中SEQID15中的X是任何插入的長(zhǎng)度范圍從大約3到大約50個(gè)核苷酸的DNA序列或部件。65.權(quán)利要求64的納米等離子共振標(biāo)尺，其中X選自下組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、錯(cuò)配序列、單核苷酸多態(tài)性、外遺傳改變的序列、蛋白結(jié)合位點(diǎn)和酶結(jié)合位點(diǎn)。66.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物被固定在適合于進(jìn)行表面等離子共振的底層上。67.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物被靜電固定在玻璃、石英、或陶瓷表面上。68.權(quán)利要求52的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物^U茲性地固定在表面上。69.—種鑒定是否存在與核酸結(jié)合的分子的結(jié)合位點(diǎn)和/或確定所述結(jié)合位點(diǎn)位置的方法，所述方法包含提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含附著于核酸上的納米顆粒，所述核酸包含所述分子的結(jié)合位點(diǎn)；述核酸結(jié)合、以形成結(jié)合的偶聯(lián)物的條件下接觸；用非特異性核酸外切酶消化所述核酸，并檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振的變化，其中納米等離子共振的變化指示所述分子的存在和所述分子結(jié)合所述核酸的結(jié)合位點(diǎn)的位置。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述分子是蛋白質(zhì)。71.權(quán)利要求69的方法，其中所述分子是轉(zhuǎn)錄因子。72.權(quán)利要求69的方法，其中所述分子是酶。73.—種鑒定分子的結(jié)合位點(diǎn)的存在和/或表征所述結(jié)合位點(diǎn)的方法，所述方法包含提供一組納米等離子共振標(biāo)尺，其中每個(gè)標(biāo)尺包含納米顆粒，所述納米顆粒上附著有核酸以形成納米顆粒-核酸偶聯(lián)物，從而能通過(guò)所述偶聯(lián)物等離子共振信號(hào)的變化檢測(cè)所述核酸尺寸的變化，并且其中所述標(biāo)尺各自包含不同的核酸，并且所述標(biāo)尺被標(biāo)注位置；在使得所述分子與所述標(biāo)尺的一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合以形成結(jié)合偶聯(lián)物的條件下，將所述一組標(biāo)尺與所述分子接觸；用非特異性核酸外切酶消化所述核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振的變化，其中納米等離子共振的變化指示在所述標(biāo)尺中被所述分子結(jié)合的納米偶聯(lián)物、以及指示所述分子在所述核酸上的結(jié)合位點(diǎn)的位置。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述納米偶聯(lián)物附著于適于進(jìn)行等離子共振檢測(cè)的底層。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述偶聯(lián)物從空間上標(biāo)注位置。76.權(quán)利要求73的方法，其中所述組包含至少三種不同的偶聯(lián)物。77.權(quán)利要求73的方法，其中所述組包含至少十種不同的偶聯(lián)物。78.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是蛋白質(zhì)。79.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是轉(zhuǎn)錄因子。80.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是酶。81.檢測(cè)核酸雜交中錯(cuò)配的方法，所述方法包含提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含納米顆粒，所述納米顆粒上附著有單鏈核酸探針；在盡管存在錯(cuò)配、但被試核酸仍能雜交到所述探針核酸上、并且形成雙鏈核酸的條件下，將所述核酸探針與被試核酸接觸；將所述核酸探針與結(jié)合所述錯(cuò)配的分子相接觸；用非特異性核酸外切酶消化所述雙鏈核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振的變化，其中納米等離子共振的變化指示所述錯(cuò)配的存在和位置。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述結(jié)合錯(cuò)配的分子選自下組結(jié)合單個(gè)堿基錯(cuò)配的蛋白質(zhì)、結(jié)合鼓泡的蛋白質(zhì)、結(jié)合環(huán)的蛋白質(zhì)、結(jié)合切口的蛋白質(zhì)、結(jié)合單鏈DNA-雙鏈DNA轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)、結(jié)合瓣的蛋白質(zhì)、結(jié)合Y形叉的蛋白質(zhì)。83.權(quán)利要求81的方法，其中所述錯(cuò)配是多態(tài)性或突變的結(jié)果。84.權(quán)利要求81的方法，其中所述錯(cuò)配是對(duì)應(yīng)于SNP的單堿基錯(cuò)配。85.權(quán)利要求81的方法，其中所述錯(cuò)配與野生型序列相比是插入的結(jié)果。86.權(quán)利要求81的方法，其中所述錯(cuò)配與野生型序列相比是缺失的結(jié)果。87.權(quán)利要求81的方法，其中所述錯(cuò)配指示被試核酸的來(lái)源生物的物種或品系。88.權(quán)利要求81的方法，其中所述被試核酸包含基因組DNA。89.權(quán)利要求81的方法，其中所述被試核酸包含cDNA。90.權(quán)利要求81的方法，其中所述被試核酸包含mRNA。91.檢測(cè)核酸雜交中錯(cuò)配的方法，所述方法包含提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含納米顆粒，所述納米顆粒上附著有單鏈核酸探針；在盡管存在錯(cuò)配并且所述錯(cuò)配導(dǎo)致部分鏈遠(yuǎn)離有納米顆粒的單鏈、但被試核酸仍與探針核酸雜交的情況下，將所述核酸探針與被試核酸接觸；并且用單鏈特異性核酸外切酶消化所述末端單鏈核酸，并且檢測(cè)由所述消化引起的納米等離子共振的變化，其中納米等離子共振的變化指示所述錯(cuò)配的存在和位置。92.權(quán)利要求91的方法，其中所述錯(cuò)配是移碼突變。93.權(quán)利要求69、73、81或91任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸長(zhǎng)度范圍從3個(gè)核香酸到大約5OO個(gè)核苷酸。94.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒選自下組納米球、納米月牙體、納米線、納米角狀物、納米管、納米棱錐、納米棒、納米四腳錐體、單層或多層的納米盤、和納米角狀物。95.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含金屬或半導(dǎo)體材料。96.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含選自下組的材料貴金屬、貴金屬合金、貴金屬?gòu)?fù)合物。97.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含選自下組的材料金、金合金、銀、銀合金、銅、銅合金、柏、鉑合金、CdSe半導(dǎo)體、CdS半導(dǎo)體、涂布有ZnS的CdSe、磁性膠體材料、ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、和GaAs。98.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒包含金和/或銀。99.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中納米顆粒粒度范圍從大約5腿到大約150應(yīng)。100.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面被功能化，以用于附著核酸。101.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面用膦層功能化。102.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述納米顆粒的表面用二氧化硅涂覆，并使用氨基硅烷分子進(jìn)行功能化。103.權(quán)利要求93的納米進(jìn)行離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約10到大約10,000個(gè)核酸分子。104.權(quán)利要求93的納米等離子共振標(biāo)尺，其中所述偶聯(lián)物在每個(gè)納米顆粒上包含大約100個(gè)核酸分子。105.—種使用納米等離子共振標(biāo)尺檢測(cè)靶特征或定量結(jié)合事件的方法，包含提供金-DNA納米顆粒偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含納米顆粒，所述納米顆粒具有系于其上的單鏈DNA寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含限制性位點(diǎn)；將互補(bǔ)的寡核苷酸與所述單鏈DNA寡核苷酸雜交，其中所述互補(bǔ)寡核苷酸包含靶特征，或者待檢測(cè)序列被插入到所述限制性位點(diǎn)中；讓蛋白質(zhì)結(jié)合到所述靶特征或序列；利用核酸外切酶在所述納米偶聯(lián)物上進(jìn)行DNA消化；觀察表面等離子共振隨時(shí)間推移的散射譜，其中金-DNA納米顆粒偶聯(lián)物的等離子共振波長(zhǎng)作為核酸外切酶反應(yīng)中時(shí)間的函數(shù)被測(cè)量，借此通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間的納米等離子共振語(yǔ)，檢測(cè)出納米偶聯(lián)物的尺寸和結(jié)合事件。全文摘要本發(fā)明提供納米等離子分子標(biāo)尺，其可無(wú)標(biāo)記地實(shí)時(shí)監(jiān)控核酸(例如DNA)長(zhǎng)度變化，并進(jìn)行核酸足跡法。在各種實(shí)施方式中，所述標(biāo)尺包含附著于納米顆粒的核酸，使得核酸長(zhǎng)度變化可利用表面等離子共振檢測(cè)出來(lái)。所述納米等離子標(biāo)尺提供快速和便利的平臺(tái)，用于核酸-蛋白質(zhì)相互作用作圖、用于核酸酶活性監(jiān)測(cè)和用于其它與足跡法有關(guān)的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101679473SQ200780042357公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年9月14日優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日發(fā)明者剛劉,盧克·P·李,陳帆青申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)