專(zhuān)利名稱(chēng)::啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法、檢測(cè)用引物組及檢測(cè)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法、檢測(cè)用引物組及檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù):
:啤酒花潛隱病毒是屬于香石竹潛隱病毒(Carlavirus)屬的植物病原性病毒,主要感染啤酒花0^歷"7t/s7w/w7〃sL.)。啤酒花潛隱病毒一旦感染啤酒花,啤酒花的感染災(zāi)情就會(huì)通過(guò)蚜蟲(chóng)的傳播而擴(kuò)大。在德國(guó)、美國(guó)、英國(guó)和捷克等啤酒花的主要生產(chǎn)國(guó)以及日本,為了肪止啤酒花潛隱病毒引發(fā)的感染災(zāi)情,使用通過(guò)莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)的無(wú)病毒苗來(lái)進(jìn)行啤酒花的栽培。在栽培啤酒花的農(nóng)場(chǎng),定期地進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的感染調(diào)査,防止啤酒花潛隱病毒的二次感染。啤酒花潛隱病毒的感染調(diào)査中,一般通過(guò)ELISA法檢測(cè)感染了啤酒花的啤酒花潛隱病毒。采用ELISA法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法由以下的步驟構(gòu)成在固相化有特異性地識(shí)別啤酒花潛隱病毒的一級(jí)抗體的微孔板中,使檢查標(biāo)本中所含的啤酒花潛隱病毒粒子和一級(jí)抗體反應(yīng)的步驟;清洗未與一級(jí)抗體結(jié)合的檢査標(biāo)本中的成分的步驟;使與一級(jí)抗體結(jié)合的啤酒花潛隱病毒粒子和經(jīng)酶標(biāo)且特異性地識(shí)別啤酒花潛隱病毒的二級(jí)抗體反應(yīng)的步驟;清洗未與啤酒花潛隱病毒粒子結(jié)合的二級(jí)抗體的步驟;使酶標(biāo)于二級(jí)抗體的酶和化學(xué)顯色底物或化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行酶反應(yīng)的步驟;根據(jù)通過(guò)酶反應(yīng)得到的顯色或發(fā)光的強(qiáng)度,估計(jì)啤酒花潛隱病毒粒子的量的步驟。非專(zhuān)利文獻(xiàn)l:Adams等,1982年,Ann.Appl.Biol.,101巻,483-494頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Hataya等,2000年,Arch.Virol.,145巻,2503-2524頁(yè)發(fā)明的揭示然而,ELISA法中使用的識(shí)別啤酒花潛隱病毒的抗體的效價(jià)或特異性不足時(shí),由于受到存在于檢查標(biāo)本中的除啤酒花潛隱病毒以外的成分的影響,因此發(fā)生將表示啤酒花潛隱病毒的存在的信號(hào)評(píng)價(jià)為背景的信號(hào)或?qū)⒎翘禺愋缘慕Y(jié)合評(píng)價(jià)為表示啤酒花潛隱病毒的存在的信號(hào)等情況。此外,采用ELISA法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法如上所述由多個(gè)步驟構(gòu)成,各步驟必須在實(shí)驗(yàn)室中確定反應(yīng)時(shí)間和清洗次數(shù)等,于相同的條件下進(jìn)行操作,檢查標(biāo)本數(shù)量增加時(shí),各步驟中的操作變得煩雜,存在給正確的評(píng)價(jià)帶來(lái)障礙的傾向。另外,ELISA法是以病毒粒子本身作為目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的方法,因此無(wú)法檢出病毒基因組或整合于宿主基因組的原病毒,例如在已知啤酒花潛隱病毒粒子的含量因高溫而顯著下降的夏季,即使是感染了啤酒花潛隱病毒的啤酒花也可能被判斷為可疑陽(yáng)性或未檢出。于是,鑒于上述的問(wèn)題,本發(fā)明的目的在于提供不限定檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的抗體的性能(效價(jià)和特異性)、檢査標(biāo)本數(shù)和進(jìn)行評(píng)價(jià)的場(chǎng)所,在栽培時(shí)、收獲時(shí)、保存時(shí)等所有季節(jié),都可特異性且高靈敏度地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的方法。本發(fā)明的目的還在于提供用于該方法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用弓I物組及檢測(cè)用試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法包括從檢査標(biāo)本提取啤酒花潛隱病毒的RNA的提取步驟;使用包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reversetranscription-Loop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)法進(jìn)行c腿的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增步驟;在擴(kuò)增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA的擴(kuò)增的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒的判斷步驟。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),通過(guò)利用作為等溫的基因擴(kuò)增反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(以下記作RT-L雄P法)來(lái)擴(kuò)增啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的特定區(qū)域,可以簡(jiǎn)便且高靈敏度地進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)。在這里,4"RT-LAMP法"是指組合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和采用LAMP法的等溫基因擴(kuò)增反應(yīng),以RNA為模板擴(kuò)增與之互補(bǔ)的cDNA的方法。對(duì)于原理的詳細(xì)部分,記載于國(guó)際公開(kāi)第00/28082號(hào)文本。如果按照上述檢測(cè)方法,從欲調(diào)査是否感染啤酒花潛隱病毒的啤酒花的組織提取RNA,在其提取液中加入包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,進(jìn)行采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng),則可以簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的部分序列的cDNA,能夠判斷是否感染啤酒花潛隱病毒。此外,與序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列互補(bǔ)的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的堿基序列以及由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸分別退火結(jié)合的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的堿基序列為啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的部分序列,包含這些堿基序列的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的區(qū)域適合作為用于通過(guò)RT-LAMP法擴(kuò)增cDNA的靶區(qū)域。因此,通過(guò)確認(rèn)是否有被擴(kuò)增的cDNA,可以特異性地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的有無(wú)。上述擴(kuò)增步驟較好是使用包含由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)法進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)的步驟。如果在由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的基礎(chǔ)上增加由序列表的序列編號(hào)5和6中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸作為環(huán)引物來(lái)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng),則可以增加DNA合成的起點(diǎn),因此能夠縮短擴(kuò)增時(shí)間,可實(shí)現(xiàn)更高效的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)。此外,本發(fā)明提供包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組。如果從欲調(diào)查是否感染啤酒花潛隱病毒的啤酒花的組織提取RNA,在其提取液中加入上述引物組,進(jìn)行采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng),則可以簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的部分序列的cDNA,能夠判斷是否感染啤酒花潛隱病毒。此外,本發(fā)明提供啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用試劑盒,所述試劑盒包括包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。如果有上述檢測(cè)用試劑盒,則可以同時(shí)獲得采用RT-LAMP法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)所需的試劑,例如在野外進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)時(shí),也不需要試劑的濃度調(diào)整等煩雜的操作,可以簡(jiǎn)便地進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)。如果采用本發(fā)明,則不限定檢査標(biāo)本數(shù)和進(jìn)行評(píng)價(jià)的場(chǎng)所,在栽培時(shí)、收獲時(shí)、保存時(shí)等所有季節(jié),都可特異性且高靈敏度地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒。此外,本發(fā)明的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組和檢測(cè)用試劑盒可良好地用于RT-L層P法,能夠?qū)崿F(xiàn)啤酒花潛隱病毒的簡(jiǎn)便且高靈敏度的檢測(cè)。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是表示包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組和啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的位置關(guān)系的圖。圖2是表示將使用啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的RNA稀釋試樣通過(guò)RT-LAMP法擴(kuò)增而得的cDNA用限制性酶Nael消化,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后的條帶圖案的凝膠照片。實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下,對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法的特征在于,包括從檢査標(biāo)本提取啤酒花潛隱病毒的RNA的提取步驟;使用包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增步驟;在擴(kuò)增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA的擴(kuò)增的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒的判斷步驟。"啤酒花潛隱病毒"是指H叩Latentvirus,是屬于香石竹潛隱病毒屬的RNA病毒。已知啤酒花潛隱病毒的宿主是啤酒花,感染了啤酒花潛隱病毒的啤酒花的球花產(chǎn)量減少。作為上述檢測(cè)方法中使用的"檢査標(biāo)本",可以例舉例如植物的葉、莖、根和果實(shí)等,因采樣容易而優(yōu)選葉和果實(shí),更優(yōu)選葉。作為采集檢查標(biāo)本的時(shí)間,可以例舉例如栽培時(shí)、收獲時(shí)和保存時(shí)等。上述提取步驟中,提取存在于被細(xì)胞壁包圍的植物細(xì)胞中的啤酒花潛隱病毒的RNA,例如可以通過(guò)在蒸餾水或具有弱堿性附近的pH的緩沖液中將檢查標(biāo)本以物理方式勻漿,從而提取啤酒花潛隱病毒的RNA。使用的緩沖液的pH較好是例如pH8.0pH9.5附近,作為使用的緩沖液,可以例舉例如Tris/鹽酸緩沖液、Tris/醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、硼酸緩沖液等。此外,為了更高效地從檢査標(biāo)本提取啤酒花潛隱病毒的RNA,適合采用從植物提取RNA的方法和提取基因組DNA的方法,這些方法記載于例如《分子克隆(Molecularcloning)》(Maniatis等,1989年,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)等基因工程實(shí)驗(yàn)方案中。提取RNA的方法中更優(yōu)選使用含異硫氰酸胍的緩沖液,提取基因組DNA的方法中更優(yōu)選使用含十六烷基三甲基溴化銨(以下記作CTAB)的提取緩沖液。勻槳只要可以破壞檢查標(biāo)本的細(xì)胞壁而提取存在于植物細(xì)胞中的啤酒花潛隱病毒的RNA即可,可以使用例如寶創(chuàng)(Polytron)勻漿器、特富龍(Teflon)勻漿器、研缽等進(jìn)行。此外,如果在凍結(jié)的狀態(tài)下對(duì)檢查標(biāo)本進(jìn)行勻漿,則可以更高效地破壞檢査標(biāo)本的細(xì)胞壁,容易地提取存在于細(xì)胞中的啤酒花潛隱病毒的RNA。此外,使用上述的含異硫氰酸胍的RNA提取緩沖液或含CTAB的基因組DNA提取緩沖液時(shí),僅通過(guò)用旋渦攪拌器等反復(fù)進(jìn)行攪拌,就可以提取存在于細(xì)胞中的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA。提取步驟中所提取的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA可以通過(guò)進(jìn)行醇沉淀而作為沉淀回收,置換為適合于RT-LAMP法的緩沖液,在蒸餾水或具有弱堿性附近的PH的緩沖液中提取啤酒花潛隱病毒的RNA時(shí),也可以直接在以下的擴(kuò)增步驟中使用。擴(kuò)增步驟中,使用由序列表的序列編號(hào)2和4中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸作為引物,以提取步驟中所提取的啤酒花潛隱病毒的RNA為模板,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),緊接著使用包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中所得的cDNA為模板,反復(fù)進(jìn)行采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(以下記作LAMP法)的等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增步驟中所實(shí)施的cDNA的擴(kuò)增方法被稱(chēng)為RT-LAMP法,通過(guò)同時(shí)在等溫條件下進(jìn)行由RNA合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和采用LAMP法的等溫基因擴(kuò)增反應(yīng),可以擴(kuò)增啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的部分序列的cDNA。圖1是表示包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組和啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的位置關(guān)系的圖。序列表的序列編號(hào)7表示啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的cDNA的堿基序列。由序列表的序列編號(hào)l中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-FIP引物)為FIP引物,可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)在3'末端側(cè)具有作為與F2c區(qū)域互補(bǔ)的序列的F2區(qū)域,在5'末端側(cè)具有與Flc區(qū)域相同的序列。由序列表的序列編號(hào)2中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-BIP引物)為BIP引物,可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)在3'末端側(cè)具有作為與B2c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B2區(qū)域,在5'末端側(cè)具有與Blc區(qū)域相同的序列。由序列表的序列編號(hào)3中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-F3引物)為F3引物,可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)具有作為與F3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的F3區(qū)域。由序列表的序列編號(hào)4中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-B3引物)為B3引物,可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)具有作為與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3區(qū)域。采用RT-L認(rèn)P法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行即可將含有提取步驟中所提取的啤酒花潛隱病毒的RNA、包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)和緩沖液的反應(yīng)液在等溫條件下靜置一定時(shí)間。溫度較好是5(TC75。C,更好是60。C65。C,進(jìn)一步更好為65r。靜置時(shí)間在15分鐘以上就可檢出cDNA的擴(kuò)增,但較好是15分鐘1小時(shí),更好是20分鐘40分鐘。作為反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液,可以使用例如LoopampRNA擴(kuò)增試劑盒(榮研化學(xué)株式會(huì)社(栄研化學(xué)社)制)中所包括的各試劑。此外,擴(kuò)增步驟中,較好是使用增加了由序列表的序列編號(hào)5和6中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸所構(gòu)成的引物的由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組來(lái)代替包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組。由序列表的序列編號(hào)5中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-環(huán)F引物)和由序列表的序列編號(hào)6中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作HLV-環(huán)B引物)是具有與成為擴(kuò)增反應(yīng)的起點(diǎn)的啞鈴結(jié)構(gòu)的5,末端側(cè)的環(huán)的單鏈部分互補(bǔ)的序列的環(huán)引物。HLV-環(huán)F可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)具有與圖中的F1區(qū)域和F2區(qū)域之間的序列互補(bǔ)的序列;HLV-環(huán)B可以如下進(jìn)行設(shè)計(jì)具有與圖中的B1區(qū)域和B2區(qū)域之間的序列互補(bǔ)的序列。通過(guò)使用HLV-環(huán)F和HLV-環(huán)B,可以增加DNA合成的起點(diǎn),擴(kuò)增效率提高,能夠?qū)U(kuò)增所需的時(shí)間縮短至1/31/2。判斷步驟中,在上述擴(kuò)增步驟中發(fā)現(xiàn)重復(fù)包含序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA的擴(kuò)增的情況下,可以判斷為存在啤酒花潛隱病毒。序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列是啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的耙區(qū)域的部分序列的cDNA,是通過(guò)采用上述引物組的RT-LAMP法被反復(fù)擴(kuò)增的核心序列。與該核心序列互補(bǔ)的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的堿基序列以及由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸分別退火結(jié)合的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的堿基序列為啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的部分序列,包含這些堿基序列的啤酒花潛隱病毒的基因組RNA的區(qū)域適合作為用于通過(guò)RT-L認(rèn)P法擴(kuò)增cDNA的耙區(qū)域。因此,通過(guò)確認(rèn)是否有被擴(kuò)增的cDNA,可以特異性地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒的有無(wú)。啤酒花潛隱病毒的有無(wú)的判斷例如可如下進(jìn)行通過(guò)肉眼觀察進(jìn)行采用RT-L認(rèn)P法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)液,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液產(chǎn)生白濁的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒。此外,可如下進(jìn)行在該反應(yīng)液中加入熒光嵌入劑,在UV照射下發(fā)現(xiàn)表示cDNA擴(kuò)增的發(fā)光的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒。更細(xì)致地判斷啤酒花潛隱病毒的有無(wú)時(shí),例如可如下進(jìn)行將所擴(kuò)增的cDNA用存在于序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列中的限制性酶NaeI消化并進(jìn)行電泳,在發(fā)現(xiàn)285bp的DNA片段的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒。本發(fā)明的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組的特征在于,包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸,或包含由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸。上述的引物組可以基于序列表的序列編號(hào)16各自的堿基序列信息通過(guò)DNA合成機(jī)合成。此外,使用本發(fā)明的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法所需的各種試劑類(lèi)可以預(yù)先封裝而試劑盒化。具體來(lái)說(shuō),能夠以試劑盒的形式提供包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組、作為核酸合成的底物的4種dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、由RNA合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶、具有鏈置換活性的鏈置換型DNA聚合酶、提供適于酶反應(yīng)的條件的緩沖液、作為輔助因子的鹽類(lèi)(鎂鹽或錳鹽等)、使酶和模板穩(wěn)定的保護(hù)劑以及根據(jù)需要采用的反應(yīng)生成物的檢測(cè)所需的試劑類(lèi)。試劑盒中可以包含用于確認(rèn)RT-LAMP反應(yīng)通過(guò)本發(fā)明的引物正常地進(jìn)行的陽(yáng)性對(duì)照。作為陽(yáng)性對(duì)照,可以例舉例如包含被本發(fā)明的引物擴(kuò)增的區(qū)域的DNA。實(shí)施例以下,例舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明,但本發(fā)明并不受到這些實(shí)施例的限定。(實(shí)施例l)采用RT-LAMP法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)101)啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)中使用的啤酒花組織樣品的制備將從來(lái)源于感染了啤酒花潛隱病毒的啤酒花的腋芽的啤酒花試管苗除去根而得的樣品作為啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本,將從無(wú)病毒的啤酒花試管苗除去根而得的樣品作為對(duì)照檢査標(biāo)本,由這些檢査標(biāo)本分別制備啤酒花組織樣品。啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本和對(duì)照檢査標(biāo)本分別用液氮冷凍,用研缽粉碎至組織形成粉末狀,向其中加入相對(duì)于檢査標(biāo)本重量5倍量的蒸餾水而懸浮。這樣得到的啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本和對(duì)照檢查標(biāo)本的懸浮液分別作為啤酒花組織樣品用于以下的實(shí)驗(yàn)。2)RNA試樣的制備向各啤酒花組織樣品(各40uL)分別加入160uL的2XCTAB溶液(2X十六烷基三甲基溴化銨、20mMEDTA、1.4MNaCl、5%0-巰基乙醇、0.lMTris,pH9.5),在65。C保溫20分鐘。然后,以15000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,將殘?jiān)鳛槌恋沓?,將其上清移至新的微量離心管。向其中加入200uL的異丙醇混合,以15000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,從而將RNA作為沉淀回收,用70%乙醇清洗后風(fēng)干,用40uL滅菌水溶解而制成RNA試樣。這樣得到的啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的RNA試樣和對(duì)照檢査標(biāo)本的RNA試樣分別用滅菌水梯度稀釋至103倍、104倍、105倍、106倍和107倍,將其中的2"L作為RNA稀釋試樣供于采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)。RNA稀釋試樣分別相當(dāng)于啤酒花組織樣品的2X1(T分之一、2X105分之一、2X106分之一、2X1(T分之一和2X1()8分之一。3)RT-LAMP法中使用的引物引物采用作為FIP引物的HLV-FIP引物(序列編號(hào)1)、作為BIP引物的HLV-BIP引物(序列編號(hào)2)、作為F3引物的HLV-F3引物(序列編號(hào)3)、作為B3引物的HLV-B3引物(序列編號(hào)4)、作為環(huán)引物的HLV-環(huán)F(序列編號(hào)5)和HLV-環(huán)B(序列編號(hào)6)。通過(guò)使用這6種引物進(jìn)行采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng),可以擴(kuò)增重復(fù)包含作為啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的cDNA的部分序列的序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA。4)采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增使用LoopampRNA擴(kuò)增試劑盒(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō),按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案,向反應(yīng)液中分別加入經(jīng)梯度稀釋的上述RNA稀釋試樣(2P1),向其中加入上述的6種引物、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液,在65匸靜置50分鐘。5)經(jīng)擴(kuò)增的cDNA的檢測(cè)確認(rèn)采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增的情況下,游離的焦磷酸與鎂離子反應(yīng)而形成焦磷酸鎂,因此反應(yīng)液產(chǎn)生白濁時(shí)可判定為發(fā)現(xiàn)cDNA的擴(kuò)增。通過(guò)上述的采用RT-L認(rèn)P法的cDNA的擴(kuò)增所擴(kuò)增的cDNA是相當(dāng)于啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的cDNA的部分序列的序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列,因此反應(yīng)液產(chǎn)生白濁時(shí)判斷為存在啤酒花潛隱病毒。表1為使用啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的RNA稀釋試樣和對(duì)照檢査標(biāo)本的RNA稀釋試樣通過(guò)RT-LAMP法進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)的結(jié)果。自啤酒花組織樣品的稀釋倍數(shù)2X1042X1052X1062X1072X108啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本白濁白濁白濁白濁ND對(duì)照檢查標(biāo)本NDNDNDNDNDND:表示未發(fā)現(xiàn)白濁其結(jié)果為,對(duì)照檢査標(biāo)本的RNA稀釋試樣都未檢出啤酒花潛隱病毒,但對(duì)于啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本的RNA稀釋試樣,即使將啤酒花組織樣品稀釋2X107倍也可以檢出啤酒花潛隱病毒。根據(jù)以上的結(jié)果,明確采用RT-LAMP法的檢測(cè)中,僅感染了啤酒花潛隱病毒的啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本檢出了啤酒花潛隱病毒,示意檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后述的采用ELISA法的檢測(cè)。然而,RT-LAMP法中,即使在cDNA被非特異性地?cái)U(kuò)增的情況下也發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液的白濁,因此通過(guò)以下的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。具體來(lái)說(shuō),使用啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本的RNA稀釋試樣的采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)中,將luL發(fā)現(xiàn)了cDNA的擴(kuò)增的各反應(yīng)液用限制性酶NaeI消化,用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,確認(rèn)是否檢出285bp的DNA片段。Nael存在于序列表12的序列編號(hào)8中所示的堿基序列中,因此通過(guò)用限制性酶NaeI消化,可以將通過(guò)RT-LAMP法擴(kuò)增了的cDNA作為285bp的DNA片段檢出。電泳后的凝膠通過(guò)在溴化乙啶中浸漬10分鐘而將被分離的DNA片段染色,通過(guò)照射紫外線(xiàn),可以觀察到DNA條帶。圖2是表示將使用啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本的RNA稀釋試樣通過(guò)RT-LAMP法擴(kuò)增而得的cDNA用限制性酶NaeI消化,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后的條帶圖案的凝膠照片。其結(jié)果為,采用RT-LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)白濁,表l中檢出了啤酒花潛隱病毒的各反應(yīng)液中的cDNA通過(guò)用限制性酶NaeI消化都檢出285bp的麗A片段的條帶。凝膠中,除了285bp的主條帶之外,還發(fā)現(xiàn)186bp、142bp的次條帶,由于采用LAMP法的cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)中,靶區(qū)域的部分序列的cDNA在相連的狀態(tài)下被擴(kuò)增,因此除了285bp的主條帶之外還發(fā)現(xiàn)186bp、142bp的次條帶的結(jié)果可以說(shuō)是正確的結(jié)果。根據(jù)以上的結(jié)果,上述的實(shí)施例l中,證明通過(guò)RT-LAMP法發(fā)現(xiàn)了表示cDNA的擴(kuò)增的白濁的情況下,并不是發(fā)生了非特異性的cDNA的擴(kuò)增,而是啤酒花潛隱病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的一部分特異性地?cái)U(kuò)增,明確啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)是取決于啤酒花潛隱病毒的存在的結(jié)果。因此,示意實(shí)施例1中所示的采用RT-LAMP法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法是靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后述的采用ELISA法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)的方法,是僅通過(guò)視覺(jué)上判斷反應(yīng)液的白濁就可以容易地判定啤酒花潛隱病毒的有無(wú)的方法。(比較例1)采用ELISA法的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)l)啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用ELISA用板的制作將特異性地識(shí)別啤酒花潛隱病毒的抗啤酒花潛隱病毒抗體(從北海道大學(xué)農(nóng)學(xué)系植物病毒學(xué)研究室分得)用0.05MSCB緩沖液(1.59g/LNa2C03、2.93g/LNaHC03,pH9.6)稀釋至lug/mL,以每孔O.2mL注入96孔微孔板,在37。C靜置4小時(shí)。然后,用O.02MPBS-T(8.Og/LNaCl、0.2g/LKH2P04、2.9g/LNa2HP0412H20、0.2g/LKC1、0.5mL/L吐溫-20,pH7.4)以5分鐘的間隔清洗5次,將這樣得到的抗體固相板作為啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用ELISA用板用于以下的試驗(yàn)。2)采用ELISA法的檢測(cè)向?qū)嵤├齦中記載的由啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本和對(duì)照檢査標(biāo)本的懸浮液制成的各啤酒花組織樣品(各40yL)加入160uL蒸餾水,再加入200liL的PBS-T/PVP溶液(16.Og/LNaCl、0.4g/LKH2P04、5.8g/LNa2HP04'12H20、0.4g/LKC1、1.OmL/L吐溫-20、40g/L聚乙烯吡咯烷酮,pH7.4)混合,以15000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘,回收其上清作為蛋白質(zhì)試樣(200wL)。然后,啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本和對(duì)照檢查標(biāo)本的蛋白質(zhì)試樣分別用PBS-T/PVP溶液梯度稀釋至10倍、102倍、103倍,分別取200nL作為蛋白質(zhì)稀釋試樣供于ELISA。未稀釋的蛋白質(zhì)試樣相當(dāng)于啤酒花組織樣品的二分之一,梯度稀釋至10倍、102倍、103倍的蛋白質(zhì)稀釋試樣分別相當(dāng)于啤酒花組織樣品的20分之一、2乂102分之一、2Xl(f分之一。接著,將蛋白質(zhì)試樣和各蛋白質(zhì)稀釋試樣(各200uL)分別添加至上述的ELISA用板,靜置一晚。用0.02MPBS-T以5分鐘的間隔清洗5次,以每孔200uL加入將堿性磷酸酶標(biāo)記的上述抗啤酒花潛隱病毒抗體用0.02MPBS-T稀釋1000倍而得的試劑,在37。C靜置3小時(shí)。然后,將ELISA用板的各孔用O.02MPBS-T以5分鐘的間隔清洗5次,加入200"L的底物溶液(10%二乙醇胺、lg/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉),在室溫下使其反應(yīng)一定時(shí)間,測(cè)定405nm的吸光度。表2為使用啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀釋試樣以及對(duì)照檢查標(biāo)本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀釋試樣通過(guò)ELISA法進(jìn)行啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ND:表示未發(fā)現(xiàn)白濁其結(jié)果為,對(duì)照檢查標(biāo)本的RNA稀釋試樣都未檢出啤酒花潛隱病毒,但對(duì)于啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀釋試樣,至將啤酒花組織樣品稀釋20倍而得的試樣為止,都可以檢出啤酒花潛隱病毒。根據(jù)以上的結(jié)果,可以確認(rèn)釆用ELISA法的檢測(cè)中,僅感染了啤酒花潛隱病毒的啤酒花潛隱病毒檢測(cè)用檢査標(biāo)本檢出了啤酒花潛隱病毒,正常地檢出了啤酒花潛隱病毒,但明確與上述的采用RT-LAMP法的檢測(cè)相比,檢測(cè)靈敏度至少低106倍(IOO萬(wàn)倍)。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如果采用本發(fā)明,則不限定檢查標(biāo)本數(shù)和進(jìn)行評(píng)價(jià)的場(chǎng)所,在栽培時(shí)、收獲時(shí)、保存時(shí)等所有季節(jié),都可特異性且高靈敏度地檢測(cè)啤酒花潛隱病毒。此外,本發(fā)明的啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組及檢測(cè)用試劑盒可良好地用于RT-LAMP法,能夠?qū)崿F(xiàn)啤酒花潛隱病毒的簡(jiǎn)便且高靈敏度的檢測(cè)。權(quán)利要求1.啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法,其特征在于,包括從檢查標(biāo)本提取啤酒花潛隱病毒的RNA的提取步驟;使用包含由序列表的序列編號(hào)1~4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增步驟;在所述擴(kuò)增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA的擴(kuò)增的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒的判斷步驟。2.如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟是使用包含由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)的步驟。3.啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組,其特征在于,包含由序列表的序列編號(hào)14中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸。4.啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用引物組,其特征在于,包含由序列表的序列編號(hào)16中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸。5.啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)用試劑盒,其特征在于,包括權(quán)利要求3或4所述的引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。全文摘要本發(fā)明提供啤酒花潛隱病毒的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法包括從檢查標(biāo)本提取啤酒花潛隱病毒的RNA的提取步驟;使用包含由序列表的序列編號(hào)1~4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組,以所述RNA為模板,通過(guò)RT-LAMP法進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增步驟;在擴(kuò)增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號(hào)8中所示的堿基序列的cDNA的擴(kuò)增的情況下,判斷為存在啤酒花潛隱病毒的判斷步驟。文檔編號(hào)C12N15/09GK101553566SQ200780044239公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2007年11月26日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者岡田行夫,糸賀裕申請(qǐng)人:札幌啤酒株式會(huì)社