專利名稱：：重組宿主細胞中的脫氧核糖核酸酶表達的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及重組宿主細胞，其能夠產生各種重組多肽，特別是酶，基本不含污染DNA，以及產生基本不含污染DNA的所述多肽的方法。
背景技術：
：很多芽孢桿菌屬生產菌抹都用于酶的重組生產，且常常有關于最終的酶產物中重組DNA存在的調節(jié)限制(regulatoryrestriction)。將來自金黃色葡萄球菌OStop/z_y/ococcwawrew)的核酸酶編碼基因整合入幾種聚(3-羥基烷酸(酯))(PHA)產生菌的基因組中并表達，以表達核酸酶并從而降低細胞裂解物(本來(otherwise))由于存在染色體DNA而導致的高粘度。葡萄球菌核酸酶易于在產生PHA的假單胞屬菌抹中表達，并且定位于細胞周質，偶爾定位于培養(yǎng)基中，而不影響PHA產生或菌抹穩(wěn)定性[Zhuang等ReductionofCellLysateViscosityduringProcessingofPoly(3-Hydroxyalkanoates)byChromosomalIntegrationoftheSto//zj/ococca/NucleaseGeneini^ez^/omowosApplEnvironMicrobiol.1999April;65(4):1524-1529]。已經在轉錄和翻譯水平對地衣芽孢桿菌的磷酸鹽-饑餓(phosphate-starvation)刺激子進行了分析。顯示地衣芽孢桿菌發(fā)展了自己的策略來應對這種營養(yǎng)限制。通過分泌蛋白質組分析，將肌醇六磷酸酶鑒定為磷酸鹽-饑餓條件下豐度最高的(mostabundant)蛋白質。這項研究的數(shù)據(jù)表明，不同于枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌中的磷酸鹽饑餓不會誘導通常的SigmaB依賴性應激響應(Hoi等Thephosphate-starvationresponseof_6a"7/i^//c/zemy^7m、.2006.Proteomics,Vol.6(12)pp.3582-3601》在磷酸鹽饑餓的過程中，枯草芽孢桿菌調節(jié)PhoP調節(jié)子中的基因，以降低細胞對這種必需底物的需要，并促進從有機來源如磷壁酸和核酸回收無機磷酸鹽(phosphate)。PstS是在這些條件下高度誘導的蛋白質之一，其為高親和性ABC-類磷酸鹽轉移子中與磷酸鹽結合的脂蛋白組分。PstS由戸f操縱子中的第一基因編碼，；W操縱子中其它四個成員編碼轉移子的整合蛋白和纟田月包質纟且分(Allenby等2004.Post-transcriptionalregulationofthe5acz7/t^sm6"http://51pstoperonencodingaphosphate-specificABCtransporter.Microbiol150(Pt8)pp.2619-2628)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供重組宿主細胞，所述細胞能夠產生各種產物，特別是酶，基本不含DNA，以及產生基本不含DNA的各種產物的方法，和構建所述重組宿主細胞的方法。成功地改造得到重組芽孢桿菌屬宿主細胞，在發(fā)酵過程中，特別是在發(fā)酵末期，所述細胞表達重組核酸酶(脫氧核糖核酸酶)。我們已經克隆并表達了來自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的胞外脫氧核糖核酸酶，所述酶能夠非常有效地降解DNA。將編碼來自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的這種胞外脫氧核糖核酸酶(核酸酶)的基因mwcS克隆至戸tf啟動子的下游。在發(fā)酵過程中，戸"啟動子受培養(yǎng)基中磷酸鹽水平的調節(jié)，調節(jié)方式為啟動子由低水平的磷酸鹽激活，由高水平的磷酸鹽阻斷。起初，將熒光蛋白GFP用作由p^S啟動子表達的標記物，并且發(fā)現(xiàn)這種特殊的啟動子在發(fā)酵過程中受到非常嚴格的控制。因為當磷酸鹽水平較低的時候，大多數(shù)芽孢桿菌屬發(fā)酵都正在進入末期，所以由戸W啟動子表達m^B基因的過程會在發(fā)酵末期被激活，并在需要清除發(fā)酵液中多余的DNA時表達核酸酶。我們在本文表明，由戸"啟動子和插入枯草芽孢桿菌染色體的m^S基因組成的表達盒在搖瓶和1升規(guī)模培養(yǎng)中受到磷酸鹽水平的調節(jié)。當生長培養(yǎng)基中存在磷酸鹽時，發(fā)酵上清液不能降解加入的DNA。然而，在通過發(fā)酵已經耗盡磷酸鹽的生長培養(yǎng)基中，觀察到上清液將加入的DNA非常有效地降解，？t人而證明上清液中存在核酸酶。用這種方法，我們成功地將酶表達階段和核酸酶的表達分開，避免給酶的生產力(productivity)帶來干擾。因此，本發(fā)明的第一方面涉及產生至少一種目的多肽并表達一種或更多重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞。在第二方面，本發(fā)明涉及產生基本不含污染DNA的目的多肽的方法，所述方法包含步驟(a)培養(yǎng)產生至少一種目的多肽并表達一種或多種重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞；和(b)分離目的多肽。附圖簡述圖1.Northern印跡，表示發(fā)酵過程中pW-操縱子的表達。地衣芽孢桿菌中的/^-操縱子由五個基因組成(與枯草芽孢桿菌相同)/^S/G^/R4/SS。調節(jié)似乎和枯草芽孢桿菌中的調節(jié)相同，其中pW-操縱子轉錄成為4.4kb的初級轉錄物，并迅速加工成為較小的產物，包括穩(wěn)定的0.9kb的戸6轉錄物。圖2.發(fā)酵中取樣的9個小時中在線發(fā)射光譜的變化，取樣從磷酸鹽饑餓誘導之前4小時開始(為了簡單起見，這張圖中顯示為每小時一張光譜，但在實驗過程中每10分鐘就收集一次數(shù)據(jù))。460至480nm處的峰表示激發(fā)光，而508nm處隨時間增加的峰是GFP發(fā)射信號。圖3.在九小時內從發(fā)酵中取樣得到的數(shù)據(jù)，表示在線和離線的GFP測定結果、生物質(biomass)生長、磷酸鹽濃度、FACS分析、堿性磷酸酶活性，以及天然(native)pASmRNA和戸"-GFP融合mRNA的mRNA水平。圖4.在磷酸鹽饑餓響應誘導前和誘導過程中對取出樣品的FACS分析和顯微鏡檢查，顯示全部群體中誘導GFP的表達情況(參見圖2中在線和離線GFP數(shù)據(jù)的比較)。A)列顯示FACS分析；FACS圖中的Y軸表示側向角散射光(反映在波長488+/-10nm處測量的激發(fā)光)，是細胞大小(或者培養(yǎng)基中存在的任何顆粒的大小)的量度；X軸表示530+/-30nm處的熒光強度(FL1)。光源為藍色激光(波長488nm)。B和C)列表示使用相差顯微鏡和熒光顯^l鏡觀察樣品的顯^f鼓圖片。圖5.在發(fā)酵BPN100中在線測量GFP發(fā)射(507-511nm處的數(shù)值)的結果。31h開始磷酸鹽饑餓，GFP信號增加(31-36h)，直至加入磷酸鹽后約一小時。加入的磷酸鹽可能在約42h耗盡，此時GFP信號再次開始增加。圖6.在發(fā)酵BPN101和BPN102中在線測量GFP發(fā)射(507-511nm處的數(shù)值)的結果。在BPNIOI中，10小時后檢測到磷酸鹽饑餓，而在高濃度磷酸鹽的發(fā)酵過程中沒有發(fā)現(xiàn)誘導產生，直至將一半的發(fā)酵液用缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基取代。這誘導了GFP發(fā)射的增加，通過加入0.5g磷酸鹽，誘導停止了三個小時。圖7.用于地衣芽孢桿菌的木糖誘導整合型克隆載體表達系統(tǒng)，命名為pAN238,SEQIDNO:1中給出了此質粒的全長DNA序列。圖8.名為pAN167的克隆載體表達系統(tǒng)，SEQIDNO:6中給出了此質粒的全長DNA序列。圖9.顯示對上清液中脫氧核糖核酸酶的分析，上清液來自包含m^S的不同的淀粉酶產生菌抹MOL2716，MOL2717,MOL2718;發(fā)酵在TY-培養(yǎng)基中進行泳道1:DNA標i己DNA標記+MOL2716菌抹(+磷酸鹽)DNA標記+MOL2717菌抹(+碌酉艾鹽)DNA標記+MOL2718菌抹(+磷酸鹽)DNA標記+MOL2684菌抹(+磷酸鹽)泳道2:泳道3:泳道4:泳道5:泳道6:泳道7:泳道8:泳道9:泳道10DNA標記+Sm-30菌抹(+錄鹽DNA標記+MOL2716菌抹(-磷酸鹽DNA標記+MOL2717菌抹(-DNA標記+MOL2718菌抹(-:i卜-貝隨^DNA標記+MOL2684菌抹(-磷酸鹽)泳道11:DNA標記+Sm-30菌抹(-碌酉文鹽)泳道12:DNA才示i己圖10.表示對上清液中脫氧核糖核酸酶的分析，上清液來自包含"wcB的不同的淀粉酶產生菌抹MOL2717;發(fā)酵以1升規(guī)模進行，磷酸鹽限制。泳道1泳道2泳道3泳道4泳道5泳道6泳道7泳道8DNA標記DNA標記+MOL2717菌林，1升發(fā)酵(-磷酸鹽)，第1天(l.day)DNA標記+MOL2717菌林，1升發(fā)酵(-磷酸鹽)，第2天DNA標記+MOL2717菌林，1升發(fā)酵(-磷酸鹽)，第3天DNA標記+MOL2717菌抹，1升發(fā)酵(-磷酸鹽)，第4天DNA標記+MOL2717菌抹，1升發(fā)酵(-磷酸鹽)，第5天DNA標記+MOL2717菌抹，TY培養(yǎng)基(-磷酸鹽)，過夜DNA標記+MOL2684菌抹，TY培養(yǎng)基(-磷酸鹽)，過夜7泳道9:DNA標記+Sm-30菌林，TY培養(yǎng)基(-磷酸鹽)，過夜泳道10:DNA標記+MOL2717菌4朱，PS1培養(yǎng)基，7天泳道ll:DNA標記+MOL2684菌林，PS1培養(yǎng)基，7天泳道12:DNA標記+Sm-30茵抹，PS1培養(yǎng)基，7天泳道13:DNA標記發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及產生至少一種目的多肽和表達一種或更多重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞。宿主細胞如本文中所使用的術語"宿主細胞"或"細胞"包括4壬何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發(fā)明的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復制的染色體外載體。術語"宿主細胞'，包含親本細胞的任何子代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例如，真核生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括但不限于，芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜堿芽孢桿菌(^^7/^"/^/0;/7//^)、解淀粉芽孢桿菌C8ac〃/MSaw7/o/^we々c/e"力、短芽孑包桿菌(5ac/〃us6rev&)、環(huán)狀芽孑包桿菌(5acZ〃wc^cw/am1)、克勞氏芽孑包4干菌(5ac/〃i^c/aww7)、凝結芽孑包4干菌(Bacz'〃wcoagw/(3m1)、；l:山;l:蘭芽孑包^干菌(萬acz'〃uy/awftw)、遲緩芽孑包4干菌(5acZ〃itf/e"fw"、J也衣芽孑包才干菌(Sa"7/iw//c/zemybnm》、巨大芽孑包4干菌(丑"cz7/z^megvafen'wm)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5a",〃wWeara^2ermop/z//i)、枯草芽孑包桿菌(5a"7/^蘇云金芽孑包4干菌(5aci!'〃1^f/mn-"g7'em7、)；或《連霉菌屬(5^e/tom;yces)纟田月包，例如，淺青紫鏈霉菌OSreptomyc"http://Wd(ms)和鼠灰鏈霉菌(5^eptom;;c&ywmW"w》，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(￡co")和假單胞菌屬(尸化Mcfomomwsp)菌種。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另外優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿的芽孢桿菌屬?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將載體引入到細菌宿主細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mo/ecw/wGe"era/168:111-115)，4吏用感受態(tài)纟田月包(參見，例如，Young和Spizizin,1961,JoMr"a/o/Bacfen'o/o"81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971，Jowma/o/Mo/ecw/ar56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,所0&c/7m々wes6:742-75l)或接合(參見，例如，Koehler和Thome,1987，/ow"a/o/Sac/en'o/o^169:5771-5278)。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口才妻合菌門(Zygomycota)(^口由Hawksworth等,爿/"swoW/z5z'5^y》Z)/criowao^q/"T7zeFm—,第8版,1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995,見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicflmgi)(Hawksworth等，1995,見上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內孑包霉目(Endomycetales))、產4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半^口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如5z'o/og7(3"J爿c"vz'"aso/I^os(Skinner,RA.,Passmore,S.M，和Davenport,R.R.編,iSoc.5acten'o/.Sympos/wmNo.9,1980)中所述。在甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬(Ow&^)、漢遜酵母屬(Fa""""/a)、克魯維酵母屬(X7Myveramyce"、畢赤酵母屬(P/c/n'a)、酵母屬(5"acc/wramyces)、裂殖酵母屬(5b/zizosacc/zaramyce力或耶氏酵母屬(K37TOw/a)細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母GSacc/wram;/c^cor/s6ergem^)、酉良酒酵母(5"acc/7aramjv"cescerev/w'ae)、4唐4b酵母0Sacc/zaramycesc/z'g虛/7'cz^)、道格拉氏酵母(Sacc/2"ra，cey(iowg/as〃)、克魯弗酵母(iSaccWww_ycas&/w_yvm〕、諾地酵母(&cc/20/"omyc&s"or厶e服'力或卵形酵母CSacc/zarom;;cesow/om^)細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(K/wyvewm;;ces/acfe)細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂耶氏酵母(&mwz'a/^0/;^'cfl)細胞。在另外更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬04cremw2/wm)、曲霉屬(^sperg7'〃w"、少豆才更霉屬(^42#^0^/￡//"附)、》因管霉屬(S7,erA:a"(ie廠a)、4以蠟菌屬(Cerz;pon'ofw力、鬼傘屬(Co;n7my)、革蓋菌屬(Con'o/w》、隱球菌屬(Oy/tococcw"、Fz7z'6as/(iz'wm、鐮孑包屬(FwsaWwm)、腐質霉屬(/7wmZco/a)、梨孢屬(Mag"a/oW/ze)、毛霉屬(Mwcw)、毀絲霉屬(#;^^0//^0陽)、新考瑪脂霉屬(^/Veoc(3〃z,most/x)、月永孑包菌屬(jVewra5pora)、擬、青霉屬(尸ae"7omyces)、青霉屬(戶em'c/〃/wm)、平革菌屬(尸/2aweroc/zaee)、射月永菌屬(P/2/^/a)、瘤胃壺菌屬(尸/,"wyce》、側耳屬(尸/ewroft^)、裂褶菌屬(5"c/z/zop/^〃ww)、踝節(jié)菌屬(ra/aramyces)、嗜熱子嚢菌屬(772e，oascw5)、梭孑包殼屬(77z/e/謂'a)、彎頸霉屬(7b/_y/oc/ac//zw7)、才全菌屬(7><3附^&9)或木霉屬(7>^/2<%^/7^")細月包。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉04^ag/〃^awamon')、煙曲霉(^pergi〃ws^w/ga加)、臭曲霉(^/e-g7'〃ws々W(i—、日本曲霉(/^erg/〃ws7'a;x"/c—、構巢曲霉(^5/ergZ〃z^"zWw/am1)、黑曲霉(/45perg77/w51"扭r)或米曲霉(Apergz7/wsw7加e)細胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孑包(Fwsan'wm&<3"nWo/<ias)、禾谷鐮孑包(Fwsan'wmcere"/z》、庫威鐮孑包(FusaWwmcraoAwe/Zerae)、大刀嫌孑包(^Fks(3n'wmCM/morwm)、禾本考牛嫌孑包(i^wsar/wmgTGmz'"gflrwm)、禾赤鐮孑包(尸wsan'wwgrflw/"w附)、異孑包鐮孑包(Fws"n'w附/zefera^/onw7)、合7欠木鐮孑包(Fws"n'w附"egw7W)、尖鐮孑包(Fwsa;n'wwra^s/orww2)、多枝鐮孑包(Fz^san'wmr幼.cw/afwm)、粉紅鐮孑包(Fz^an'wwmsewm)、4妻骨木鐮孑包10(i^san'M柳sa附6wcZ"Mw)、月夫色鐮孑包(尸wsan'wmsarc0c/2rawm)、#以分4支孑包鐮孑包sporafr/c/z/o/fife力、石克色鐮孑包(Fusorz'w附sw/p/wrewm)、圓鐮孑包(Fwranw附tora/oswm)、擬絲孑包鐮孑包(Fwran'wwr/c/20決ec,o/(ias)或鑲片鐮孑包(Fwsan'wwven^a^m)。在另外最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(^/er&a/7cfen3(3(iMWa)、干"l以蠟菌(Ceri^on'c!ps/sawez'n'"a)、干4以蠟菌、Cen)on'o;2S7、careg7'ea、淺黃擬、蠟菌(Cer^on.c;pw、g7,/vascem1)、Cen^cWo/w》pa""oc/wto、Cen^on'o/w7^n'vw/asa、淺纟工4以錯菌(Cen^onbpwisw6rwy^)、彎孑包4以錯菌(Ce咖on'o戸Xsw6vmm'5pora)、灰蓋鬼傘(Co戸'"ws"力e/^y)、毛革蓋菌(C。"'o/ws/zzV^Mfz^)、凈爭異腐質霉(Z/w附/co/a/rao/era)、JH才帛狀腐質霉(7/w附z'co/a/a"wg/wosa)、米黑毛霉(Mwcorw/e/ze/)、嗜熱毀絲霉(聊ce/zbp/zf/70raAem7o;/H7a)、粗糙脈孢菌(iVewrosporacrowa)、產紫青霉(尸e"z.c/〃/wm/^rpwragewww)、黃孑包平革菌(尸/7a"eroc/7aetec/z^os/or/wm)、輻射射月永菌(尸/z/e6z'ara^ato)、刺芽側耳(尸/ewra/wse/"7"gz7)、土生才炎孑包霉(77n'eAjv7'a/errasr&)、長纟戎毛4全菌(rra7netesv///oya)、變色4全菌(7h3metesvera/co/or)、口合茨木審(7Hc/zocferma/zarz/a"Mm)、康寧木零(7h.c/z。(iermaAo"—")、長枝木霉(7h'c/zcxim7"/?！猌rac/zZ(^Mm)、里氏木霉(Zh.c/zofife，(3reaseO或綠色木霉(7Hc/zocfe削avzWofe)?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,尸raceW"g^o/Atoiowa/Jca<ie，0/5WmcmOSL481:1470-1474中描述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989,G認78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M丄，Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,Tow"a/o/153:163;和Hinnen等,1978,iVoceW"gs0/f/zeNa"ona//4cacfem;vo/iSWewcey75:1920。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，細胞是革蘭氏陽性細胞，優(yōu)選芽孢桿菌屬細胞；和最優(yōu)選嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。分離的多肽術語"分離的多肽"用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20°/。純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%,優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96°/。純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然結合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經典純化方法制備多肽。在本文沖，術語"基本上純的多肽，，與術語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。在第一和第二方面的優(yōu)選實施方案中，所述至少一種目的多肽包含酶，優(yōu)選酶為裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶，或異構酶。等位變體(allelicvariant):術語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致群體內的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪讼闼嵝g語"基本上純的多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核香酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核著酸按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結合的其它多核香酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5，和3'非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98°/。純，最優(yōu)選至少99%,并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結合的其它多核苷酸材料。在本文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的〗壬何組合。cDNA:術語"cDNA，，在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪4妄的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語"核酸構建體'，用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當所述核酸構建體含有本發(fā)明的編碼序列表達所需的調節(jié)序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒"同義。調節(jié)序列(controls叫uence):術語"調節(jié)序列"在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各種調節(jié)序列對于編碼所述多肽的核苦酸序列可以是天然的或外源的。這些調節(jié)序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調節(jié)序列包括啟動子和轉錄和翻"^的終止信號。調節(jié)序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調節(jié)序列與編碼多肽的核苷S吏序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術語"可操作地連接"在本文表示這樣的構型，其中將調節(jié)序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調節(jié)序列指導多肽編碼序列的表達。編碼序列當用于本文時術語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術語"表達"包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括^f旦不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語"表達載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苦酸可纟乘作地連接。本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬多肽，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽；或鏈霉菌屬多肽，例如，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽，例如，大腸桿菌或假單胞菌屬菌種多肽。本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽例如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或耶氏酵母屬多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽例如枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球菌屬、尸/船awWww、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、瘤胃壺菌屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬多肽。在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是棘孢曲霉(^ype/^7/wacM/e^m^)、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。14這些菌種的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的才支術是本領域內公知的。隨后可通過相似i也篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核香酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核香酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合閱讀框(inframe),并且使融合多肽的表#相同啟動子和終止子的控制下。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合^€式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來^^測具有共有結構特征的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990,PC7:toMef/zo^sj/7p/〖c加'0"，AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。修飾編碼本發(fā)明多肽的核香酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:l的多肽編碼區(qū)存在的核普酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苦酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見,侈'H口,Ford等,1991,/Vofe/wExpres57'0"oT7(ii^nyC(^/o"2:95-107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells,1989,5We"ce244:1081-1085)來筌定。在后一種4支術中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子的活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，Sc/e"ce255:306-312;Smith等,1992，J。翻a/。/Mo/織/ar腸/ogy224:899-904;Wlodaver等，1992,309:59-64)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行搡作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核香酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍色鏈霉菌(S&印tomycMco^co/o。瓊脂糖酶基因(&g^)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0acS)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am少丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am;^)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(/e^P)、枯草芽孢桿菌；cj"和x少W基因和原核p-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，尸raceg(if"gsq/"7V加'o""/ylcacfem少o/iSc/e"c^y6^475:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoer等，1983,尸racee^'"^o/AejVaz'cwa/爿c^femyo/iSWewcest75！/480:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于！5We油yc」men'ca",1980,242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文中有所描述。用于指導本發(fā)明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(W/^omwcorm/e/^/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/a4)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(3-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶n、里氏木霉內切葡聚糖酶ni、里氏木霉內切葡聚糖酶iv、里氏木霉內切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶n、里氏木霉p-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲^f尋釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、S良酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬碌^蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,1feaW8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺香酸化序列，其是與核苷酸序列的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺香殘基添加至轉錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苦酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苦酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995,Mo/ecw/arCe〃w/arAo/ogy15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片,殳一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5，端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼區(qū)。外源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌(3-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶07^r，WF局和枯草芽孢桿菌；^丄另外的信號18肽由Simonen和Palva,1993,Af/cra&'o/og/ca/iev/ews57:109-1374苗述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶和疏棉狀腐質霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos等，1992,見上文，描述。調控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化成成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶0/r￡)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶("/^T)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當信號肽和前肽區(qū)二者均存在于多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節(jié)多肽的表達。調節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括he、tac和f^操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀4分酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調節(jié)序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苦酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在合適的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苦酸序列或核酸構建體來表達本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與合適的表達調節(jié)序列可才喿作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以-使用轉座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。條件必需基因(conditionallyessentialgene)可以作為非抗生素選擇性標記。細菌的條件必需的非抗生素選擇性標記的非限制性實例是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或其它芽孢桿菌的&/基因，其僅當在缺乏D-丙氨酸的條件下培養(yǎng)細胞時是必需的。當細胞在存在半乳糖的條件下生長，或者在會產生半乳糖的培養(yǎng)基中生長時，編碼UDP-半乳糖的轉換(tumover)中相關酶的基因也可以在細胞中作為條件必需的標記。這些基因的非限制性實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌編碼UTP-依賴型磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依賴型脲苷酰轉移酶(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向異構酶(EC5丄3.2)的那些基因。在以木糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長的細胞中，還可將芽孢桿菌屬的木糖異構酶基因，如xylA,用作選擇性標記。在以葡糖酸作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長的細胞中，還可以將利用葡糖酸所必需的基因gntK和gntP用作選擇性標記。條件必需基因的其它實例是本領域公知的。抗生素選擇性標記賦予對抗生素的抗性，所述抗生素如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、新霉素、潮霉素或氨曱喋呤。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括，但不限于，aw必(乙酰胺酶)、"^丑(鳥氨酸氨曱酰基轉移酶)、6w(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、/^/z(潮霉素磷酸轉移酶)、w'aD(硝酸還原酶)(nitratereductase),/7>rG(享L清酉菱^t苦-5，-石岸酸脫羧酶)(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、(硫酸腺香酰轉移酶)和&;C(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的flw必，和/^rG基因禾口吸7J^4連霉菌(5^e;tomycay/z^xgrosco/Zciw)的6<ar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苦酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10,000堿基對，優(yōu)選400至10,000堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核芬酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質粒復制基因(replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術語"復制起點"或"質粒復制子"在本文定義為能夠使質?；蜉d體體內復制的核苦酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pA感1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMA1和ANSI(Gems等，1991,Ge"e98:61-67;Cullen等，1987,A^c/eZcy4"AAwearc/z15:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質?；蜉d體能夠根據(jù)乂^開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增的拷貝的細胞，并由此得到多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將一種或多種重組核酸酶編碼基因整合入所述細胞的基因組中。這可以如本文所述或者如WO2002/000907中所公開而實現(xiàn)。在本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案中，將一種或多種重組核酸酶編碼基因由經調節(jié)的啟動子轉錄，所述啟動子在所述細胞的標準補料分批發(fā)酵過程中上調至少10%,優(yōu)選上調至少20°/。、30%、40%、50%、60°/。、70°/。、80%、90%、100%或更多，甚至更優(yōu)選所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的物質限制而上調，最優(yōu)選所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的磷酸鹽限制而上調。在本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案中，將一種或多種重組核酸酶編碼基因由地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的戸"啟動子轉錄。生產方法在本發(fā)明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于所述多肽是特異性的方法來^^測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常^L方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀?？梢酝ㄟ^多種本領域已知的方法純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，尸rate/"Pwnyc加'o",J.-C.Janson和LarsRyden,編，VCHPublishers,NewYork，1989)。實施例當使用DNA微陣列以實驗室規(guī)模進行基因調節(jié)時，多種細胞響應都可以看作是改變發(fā)酵培養(yǎng)基的結果。實施例1.地衣芽孢桿菌中磷酸鹽饑餓響應在我們的第一個微陣列實驗中，已經使用包含約200個感興趣的基因的部分地衣芽孢桿菌微陣列片，檢測了發(fā)酵后期樣品的磷酸鹽饑餓。細胞并未"真正，，限制磷酸鹽，因為細胞壁中的磷壁酸中通常并入了大量的磷酸鹽。當細胞感應到培養(yǎng)基中低濃度的磷酸鹽時，響應之一是用不含磷酸鹽的磷壁酸代替這些磷壁酸，從而釋放磷酸鹽。因此如果只計劃制作一個生物傳感器的話，為磷酸鹽限制制作生物傳感器會被質疑。然而，將用于不同的痕量金屬的生物傳感器組合，如上所述，磷酸鹽饑餓生物傳感器是必需的。很多其它事實也表明磷酸鹽生物傳感器是一個非常有吸引力的選^^來開始進行研究1)/7W-操縱子(與磷酸鹽的高親和性攝取有關)受到非常嚴格的調節(jié)，即，在磷酸鹽不饑餓的細胞中轉錄的背景水平最低，而當細胞經受磷酸鹽饑餓時轉錄水平非常高(參見圖1)。2)在磷酸鹽饑餓過程中受到誘導的另一個基因是編碼堿性磷酸酶/磷酸二脂酶的-oD基因。這種堿性磷酸酶的活性容易測量(將無色的對硝基苯酚水解成游離的對硝基苯酚，顏色變?yōu)辄S色)，并由此可能確認以pstS-GFP融合觀察到的結果。3)無才幾磷酸鹽濃度可以用商業(yè)試劑盒或通過HPCE容易地確定。這是因為磷酸鹽是一種主要的生物要素，而且在約0.5g/L時就已經誘導了磷酸鹽饑餓。23實施例2.構建芽孢桿菌屬菌抹檢測磷酸鹽饑餓當磷酸鹽水平較低時，某些基因的轉錄發(fā)生強烈的響應。在芽孢桿菌屬的戸f操縱子中發(fā)現(xiàn)了一組這樣的基因。在我們的實驗中，編碼綠色熒光蛋白變體的基因，命名為BioST(突變F64L、S65T)，來自水母A叫uoreavictoria，已纟至與p"車爭錄4勿壽爭錄鬲蟲合[NewUnstableVariantsofGreenFluorescentProteinforstudiesofTransientgeneexpressioninbacteria.App.Env.Mic.1998p2240-2246,通過提述并入本文]。制備構建體，其中將WoSr基因插入1)緊鄰pW啟動子區(qū)的下游和；W操縱子的上游"PpstbioST";或2)轉錄物中操縱子中最后一個基因Ora^B)的下游"pstBB。使用標準方法，將Ppst&oST融合體插入枯草芽孢桿菌染色體的a，必基因座中(PP2203-1)，并將融合基因插入地衣芽孢桿菌的6g/C基因中(PP2244)。使用標準方法，將戸^SWo5T轉錄融合體插入另一抹枯草芽孢桿菌菌抹染色體的pW操縱子中(PP2216-1)?？莶菅挎邨U菌戸f構建體中使用的DNA序列來自公開的枯草芽孢桿菌168基因組。地衣芽孢桿菌戸f構建體中使用的DNA序列分離自享有專利的(proprietary)地衣芽孑包桿菌Si3菌抹。PP2203-1和PP2244-1中后面的終止子都是來自克勞氏芽孢桿菌的a/^7/終止子。在PP2216-1中6Zo5T的C-端插入序列中，終止子是p"操縱子的原始終止子。在上述菌抹中，對于要了解在當前時刻發(fā)酵中發(fā)生了什么情況，GFP的積累可能是個缺點-因為我們第一步先產生帶不穩(wěn)定性標簽OM標簽)的BioST變體，這將細胞質肽導向clpXclpP降解復合物。來自枯草芽孢桿菌的標簽已知為GKTNSFNQNVALLA。而來自地衣芽孢桿菌Si3的同源物為VKTHLNITGKSNQNLALAA。制備了BioST上帶有C-端枯草芽孢桿菌s^4標簽的枯草芽孢桿菌菌抹?？莶菅挎邨U菌PP2239-1中的GFP積累遠遠低于在同樣條件下操作的平行的PP2203-1菌林。得到的菌抹:PP2203-1:枯草芽孢桿菌168a/7r￡,"/v￡，Z)/o6T。PP2216-1:枯草芽孢桿菌765apr五，"pr￡，::&o5T。PP2244-1:地衣芽孢桿菌Si3opW:》g/C:,尸;^^o5T。PP2239-1:枯草芽孑包桿菌168a尸r五，wp"五，am少五.fcfli^尸;^Z7/o5Tjw丄實施例3.磷酸鹽饑餓的在線測量設備1)分光光度計，可檢測329-1100nm之間所有的發(fā)射波長(AVANTESTMAVASPECTM-2048FT-SPU),通過光纜(AVANTESTMFC-UV600-2)連接至位于防光照盒(見下文)中的準直透鏡。BioST最大發(fā)射在大約508nm。2)光源，在約470nm發(fā)出強烈的激發(fā)光，而且沒有波長大于500nm的光，因為激發(fā)光反射進分光光度計會干擾對GFP蛋白(BioST最大激發(fā)在大約470nm處)發(fā)射光的檢測。我們測試了AVANTESAVALIGHTTM-LED-470nm，使用了光通帶濾波器(470十/-10nm,來自KNIGHTOPTICAL(UK)Ltd),但是發(fā)現(xiàn)光強度過低。我們取而代之使用了自制光源，其由5mm高亮度藍色LED(2000mcd,峰值波長為470nm)組成，與上述光濾波器組合。將LED置于防光照盒中，位置非常接近流通管。3)流通管，發(fā)酵液可以從中通過，然后重新循環(huán)回發(fā)酵罐中。循環(huán)由蠕動泵驅動。4)防光照盒(自制)，其中流通管、準直透鏡和光源的安裝角度能夠產生發(fā)射信號的最大檢測值。使用枯草芽孢桿菌菌株PP2203-1^wn^基因座中的w"-GFP融合體)的結果為了能夠使用用于發(fā)酵調節(jié)的生物傳感器，必須滿足多個重要的標準1)必須有可能在細胞第一次感應到饑餓之后很快檢測細胞對饑餓條件的響應的信號。2)整個群體應該以同樣的方式反應，使得調節(jié)不基于細胞亞群體中發(fā)生的反應。3)在通過加入限制營養(yǎng)物質而終止々幾餓條件后信號的增加應立刻停止。為了確定是否滿足了這些標準，我們以低磷酸鹽濃度開始發(fā)酵，并在九小時中每小時取樣，用于不同的分析1)使用Northern印跡的pstS和pstS-GFP的mRNA水平測定，2)離線GFP濃度測定，3)堿性磷酸酶活性測定，4)FACS分析，5)無機磷酸鹽濃度測定。在檢測到磷酸鹽饑餓信號之前四小時開始取樣。圖1顯示在這九小時中，光譜如何發(fā)生變化。圖2顯示在這九小時中收集的數(shù)據(jù)，以及GFP信號(在線與離線)和堿性磷酸酶活性同時增加。對樣品的FACS分析和顯微鏡觀察顯示，在同一時間點對GFP生產的誘導，并且非常重要的是，還顯示細胞全部群體都以同樣的方式反應(參見圖3)。最重要的是，Northern印跡結果顯示，戸"和戸"-GFP全體受到共同調節(jié)(totallyco-regulated)，我們首次檢測到在mRNA水平的誘導之后，很快觀察到了GFP，而且最后，磷酸鹽的加入迅速關閉了啟動子的轉錄。用磷酸鹽關閉啟動子還導致加入磷酸鹽后約一小時停止產生GFP。這種延遲可能是相當穩(wěn)定的戸"-GFPmRNA的作用(在加入磷酸鹽之后52分鐘中，p"-GFP水平降低了5至10倍)。圖4顯示在取樣開始后的20個小時中，GFP發(fā)射變化的在線數(shù)據(jù)。在這里，我們看到加入磷酸鹽約一小時后，信號強度停止增加，而且強度緩慢下降。加入的磷酸鹽可能在約42h耗盡，此時GFP信號再次開始增加。為了保證高生物質濃度不會干擾GFP信號，又進行了兩次發(fā)酵，其中一次以低磷酸鹽濃度開始發(fā)酵(BPN102),—次以高磷酸鹽濃度開始發(fā)酵(BPN101)。結果示于圖6中。BPN101中沒有發(fā)生GFP誘導，而BPN102中觀察到了快速的GFP誘導。為了測試我們是否能在BPN101中誘導磷酸鹽饑餓，在發(fā)酵47小時，用缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基交換約一半罐體積。4艮快，觀察到GFP信號的增力口，并加入0.5g磷酸鹽。這使GFP的產生停止了3小時，然后，當加入的磷酸鹽耗盡時，GFP信號再次開始增加。實施例4.用于地衣芽孢桿菌的木糖誘導的表達系統(tǒng)枯草芽孢桿菌中的木糖利用需要產生木糖異構酶(XylA)和木酮糖激酶(Xy舊)，而且在轉錄水平上受到由矽/i編碼的木糖響應抑制蛋白的調節(jié)，并受到分解代謝物抑制的調節(jié)。x_y/i和；^MS基因各自由常見的基因間區(qū)(intergenicregion)轉錄，所述基因間區(qū)包含操縱基因序列，該序列在缺乏誘導物時與x_yW結合?？莶菅挎邨U菌的木糖操縱子是受到嚴格轉錄調節(jié)、經過充分表征的調節(jié)系統(tǒng)。Bhavsar等(2001)開發(fā)了木糖依賴型系統(tǒng)，用于表達來自枯草芽孢桿菌中"w少五基因座的克隆基因。我們已經構建了相似的系統(tǒng)，用于表達來自地衣芽孢桿菌Si3菌抹中xy/基因座的克隆基因。從地衣芽孢桿菌Si3的染色體擴增木糖基因座并測序。選擇兩個區(qū)作為輩巴物用于通過乂又同源重纟且事4牛(doublehomologousrecombinationevents)在染色體上整合。上游區(qū)(xyl-us)包括編碼木糖抑制子(xylR)的基因的5，-末端、基因間的xyl操縱基因序列、xylA啟動子，和編碼21aa的xylA的5'-末端，之后是人工終止子。下游區(qū)(xyl-ds)包括xy舊基因間區(qū)。表達盒包含四個唯一的限制性位點，但是不含用于翻譯克隆基因的Shine-Dalgarno序歹寸。因此，選擇用于克隆和進行木糖依賴型表達的基因需要帶有其自己的Shine-Dalgarno序列。這可以通過仔細的引物設計和PCR擴增而容易地實現(xiàn)，上游引物應具有含克隆用識別位點的額外序列、SD-序列、用于待表達基因的起始密碼子。下游引物應該包含終止密碼子，但是不包含終止子序列，因為終止子序列將阻止構建體中與GFP-編碼BioST-表達報告物-基因的共表達。將得到的克隆表達栽體命名為pAN238(圖7)，在pAN238中克隆擴增的"基因X"可以確保其與BioST共表達。通過雙交換事件將表達盒整合入地衣芽孢桿菌的染色體，這樣來恢復xy/7，但是會由于嚴重的截短而使xy"5失活。克隆基因將在存在木糖的情況下與BioST—起表達。SEQIDNO:1中提供了pAN238的完整DNA序列。實施例4.地衣芽孢桿菌中木糖誘導的核酸酶表達在第一種克隆策略中，我們將兩種m^B基因各自插入到pAN238載體中，這一載體設計用于整合入地衣芽孢桿菌的；qy/基因座。這樣的整合使得可以通過向培養(yǎng)基中加入木糖而誘導肌cB表達，因為做aS基因是在w/啟動子的控制之下。然而，作為地衣芽孢桿菌中的游離質27粒，xy/啟動子具有組成性活性，因為^;W抑制子可被滴定出來(becausetheXylRrepressorisout-titrated),可以期望的是，在這些條件下，"wc5會充分表達。通過PCR分別擴增這兩個m/c^基因并克隆入質粒中。地衣芽孢桿菌柳c^的PCR:1物480596(SEQIDNO:2):TTTATTATCGATCAAGAGGAGGTTGTTTTTGTCATGATC引物480597(SEQIDNO:3):TTTATTACGCGTATCCCCCACAACGATTTTCCTGTC枯草芽孢桿菌wwcS的PCR:引物480598(SEQIDNO:4):TTATTTATCGATAAGGTATGGGGGGATGGGGATGAAAAAATGG引物480599(SEQIDNO:5):TTATTTACGCGTCAGCTCGGCGAAGGATTGTAACAAC將這些質粒分別轉入枯草芽孢桿菌中并制備質粒制備物。質粒的限制性消化顯示了DNA的主要分解(情況)，說明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的簡W基因受到充分的誘導，而且編碼的核酸酶均可以表達到培養(yǎng)基中。將兩個菌抹保存為MOL2676(地衣芽孢桿菌薩B)pMOL2676MOL2677(枯草芽孢桿菌nucB)pMOL2677將供體菌林保存為MOL2680(地衣芽孢桿菌nucB)pMOL2676MOL2681(枯草芽孢桿菌nucB)pMOL2677在更嚴格控制的實驗中，我們將菌抹接種于TY中，在37。C過夜培養(yǎng)，并將不含細胞的10ml上清液與DNA標記(lKb階梯標記物(ladder))混合。將樣品在37。C溫育不同的時間間隔。將含有克隆m^S基因的菌抹的DNA標記的主要降解(條帶)與對照菌林相比較。結論為兩種做cS基因均能在枯草芽孢桿菌中表達成為具有功能的核酸酶。實施例5.Ppst誘導的m/c5表達的結果第二種克隆策略是在磷酸鹽限制的條件下，如趨于發(fā)酵末期，用來自地衣芽孢桿菌的嚴格受控的；^S啟動子表達核酸酶。再一次，通過PCR擴增兩個ra^B基因并與戸"啟動子一起克隆入另一個質粒pAN167中，所述質粒pAN167設計用于整合入枯草芽孢桿菌染色體中的pe/基因座。SEQIDNO:6中提供了pAN167的DNA序列，限制性圖譜示于圖8中。來自菌抹PP2201-l-Ppst-GFP的Ppst的PCR引物Cat,aa49,正向(SEQIDNO:7):CCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTG引物GFP,aal7,反向(SEQIDNO:8):CAACAAGAATTGGGACAACTCCAGTG地衣芽孢桿菌冊cS的PCR引物491264(SEQIDNO:9):TTTATTACGCGTCAAGAGGAGGTTGTTTTTGTCATGATC引物492902(SEQIDNO:10):TTTATTAAGCTTATCCCCCACAACGATTTTCCTGTC枯草芽孢桿菌wwcS的PCR引物491266(SEQIDNO:11):TTATTTACGCGTAAGGTATGGGGGGATGGGGATGAAAAAATGG引物492903(SEQIDNO:12):TTATTTAAGCTTCAGCTCGGCGAAGGATTGTAACAAC將連接產物轉化入枯草芽孢桿菌中，并制備質粒制備物。限制性消化顯示已經發(fā)生了正確的克隆。將含有戸f啟動子的m/cS表達盒通過雙交換重組整合入；7e/基因座，并通過PCR證實整合正確。保存下述菌抹MOL2684,MOL2685:整合含有來自地衣芽孢桿菌的rn/c^的構建體MOL2686,MOL2687:整合含有來自枯草芽孢桿菌的"wcB的構建體為了研究pW啟動子是否能在低磷酸鹽濃度激活"WCB基因，建立了一系列樣品。將兩個菌林MOL2684和MOL2686接種于含有或不含有添加的磷酸鹽的TY培養(yǎng)基中。在37。C過夜生長后，將細胞沉淀(pelleted)，才艮據(jù)圖9通過將上清液與DNA標記混合來考察上清液的核酸酶活性。取10pl不含細胞的上清液與DNA標記(lKb階梯標記物)一起上樣。將樣品在37。C溫育不同的時間間隔。如圖9所示，將含有克隆地衣芽孢桿菌"wcS基因的DNA標記的主要降解(條帶)與對照菌抹相比較，但只比較了未加入磷酸鹽的發(fā)酵(情況)。在加入磷酸鹽的發(fā)酵中，沒有降解的跡象(thereisnotraceofdegradation)。結論是來自地衣芽孢桿菌的"mcB基因能夠由尸pW啟動子表達，而且受到培養(yǎng)基中磷酸鹽水平的嚴格控制。實施例6.商業(yè)上相關的條件下尸戸f誘導的"wcS表達我們想要在商業(yè)上相關發(fā)酵條件下，測試用于表達食品酶的相關淀粉酶生產菌4朱中的Ppst-"wcS構建體。使用來自菌抹MOL2684和MOL2685的染色體DNA轉化生產菌抹，根據(jù)氯霉素抗性進行篩選。通過PCR確認聽cS表達盒的存在。將得到的由整合入;e/基因座的尸j9W啟動子表達，cS的菌林保存為MOL2716、MOL2717、MOL2718(整合含有來自地衣芽孢桿菌的"mcS的構建體)。然后將得到的菌抹之一，即MOL2717，以l升的規(guī)模發(fā)酵，研究M^g核酸酶的初始表達和活性是否足以消4bDNA(toinvestigateiftheinitiationofexpressionandactivityoftheNucBnucleasewassufficienttodigestDNA)。發(fā)酵以磷酸鹽限制過程進行了四天，每天取樣。將樣品通過離心清除細胞，并與DNA標記混合以才企驗脫氧核糖核酸酶活性。此次實驗的結果示于圖10中。與較早的實驗相比，來自1升規(guī)模發(fā)酵的樣品所在泳道顯示DNA的緩慢降解，但是240分鐘后，DNA發(fā)生了顯著的降解，得到彌散的條帶。對照顯示出期望的活性。權利要求1.一種細胞，其產生至少一種目的多肽并表達一種或更多重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶。2.根據(jù)權利要求l的細胞，其為革蘭氏陽性細胞。3.根據(jù)權利要求2的細胞，其為芽孢桿菌屬細胞。4.根據(jù)權利要求3的細胞，其為嗜堿芽孢桿菌C5a"7/wa汰a/c^/2z7w)、角罕5定4分芽孑包4干菌(5acZ〃ws"mj/o/Z《w咖c/e"力、4豆芽孑包才干菌(S(3cz'〃ms6revz.力、環(huán)一犬芽孑包4干菌(5ac〃/"5c/zrw/a/w)、克勞氏芽孑包才干菌(5"c〃/wc/aww7)、)疑結芽孑包桿菌(5ac/〃wscoagM/ara)、丈山爛芽孑包才干菌(5acz'〃iw/aw/w)、遲纟爰芽孑包4干菌(5(3cz7/ms/e"&力、；也衣芽孑包牙干菌(^6o!Cz7/ms//c/zemybrm/"、巨大芽孑包4干菌(5ac/〃ztfwegaferZwm)、嗜熱月旨肪芽孑包4干菌(Sac/〃wsWeara/2erwo//z〃iw)、枯草芽孑包#干菌(5acz'〃ussw6fz7z'力或蘇云金芽孑包4干菌(Bacz'〃wsf/zwn'wg/era^)纟田月包。5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的細胞，其中所述至少一種目的多肽包含酶。6.根據(jù)權利要求5的細胞，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。7.根據(jù)權利要求1-6中任一項的細胞，其中將所述一種或多種重組核酸酶編碼基因整合入所述細胞的基因組中。8.根據(jù)權利要求1-7中任一項的細胞，其中所述一種或多種重組核酸酶編碼基因由經調節(jié)的啟動子轉錄，該啟動子在所述細胞的標準補料分批發(fā)酵過程中上調至少10%，優(yōu)選所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的物質限制而上調。9.根據(jù)權利要求8的細胞，其中所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的磷酸鹽限制而上調。10.根據(jù)權利要求8或9的細胞，其中所述一種或多種重組核酸酶編碼基因由地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的pC啟動子轉錄。11.產生基本不含污染DNA的目的多肽的方法，所述方法包含步驟(a)培養(yǎng)產生至少一種目的多肽并表達一種或多種重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞；和(b)分離目的多肽。12.權利要求ll的方法，其中所述細胞是革蘭氏陽性細胞。13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述細胞是芽孢桿菌屬細胞。14.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述細胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。15.根據(jù)權利要求11-14中任一項的方法，其中所述至少一種目的多肽包含酶。16.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。17.根據(jù)權利要求11-16中任一項的方法，其中將所述一種或多種重組核酸酶編碼基因整合入所述細胞的基因組中。18.根據(jù)權利要求11-17中任一項的方法，其中所述一種或多種重組核酸酶編碼基因由經調節(jié)的啟動子轉錄，所述啟動子在所述細胞的標準補料分批發(fā)酵過程中上調至少10%,優(yōu)選所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的物質限制而上調。19.根據(jù)權利要求18的細胞，其中所述啟動子響應生長培養(yǎng)基中的磷酸鹽限制而上調。20.根據(jù)一又利要求18或19的細胞，其中所述一種或多種重組核酸酶編碼基因由地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的p"啟動子轉錄。全文摘要本發(fā)明涉及產生至少一種目的多肽并表達一種或多種重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞，和產生目的多肽的方法，所述多肽基本不含污染的DNA，所述方法包含如下步驟(a)培養(yǎng)產生至少一種目的多肽并表達一種或多種重組核酸酶編碼基因從而產生核酸酶的細胞；和(b)分離目的多肽。文檔編號C12N15/74GK101541968SQ200780044260公開日2009年9月23日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權日2006年11月30日發(fā)明者喬恩·M·珀森,邁克爾·D·拉斯馬森申請人:諾維信公司