專利名稱：：生產(chǎn)雜交玉米種子的方法以及由此方法生產(chǎn)的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)方法以及所生產(chǎn)的組合物的領(lǐng)域。更具體而言，其涉及生產(chǎn)雜交玉米種子的方法以及通過(guò)所述方法生產(chǎn)的雜交玉米組合物。相關(guān)技術(shù)商業(yè)化雜交玉米種子生產(chǎn)包括在外來(lái)花粉污染可能性非常小的隔離田地的分開(kāi)的行或區(qū)塊中種植雄性和雌性近交系。雌性近交系通常在散粉之前去雄以確保由雄性近交系異花授粉。在授粉后銷毀雄性近交系以防止在收獲過(guò)程中混雜種子。收獲、加工來(lái)自于異花授粉雌性近交系的耳穗，并出售給農(nóng)民作為雜交種子用于種植。由于人工或機(jī)械去雄以及除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、養(yǎng)分以及灌溉的投入成本，因此雜交玉米種子生產(chǎn)是一個(gè)昂貴的過(guò)程。雜交種子產(chǎn)量趨于降低，結(jié)果導(dǎo)致收入降低。而降低的收入以及增加的生產(chǎn)成本又導(dǎo)致廠商贏利性降低。因此，雜交玉米種子廠商總是對(duì)提高雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)贏利性感興趣。在本領(lǐng)域中還知道生產(chǎn)用于產(chǎn)生雜種的具有多性狀的純合近交系的成本是相當(dāng)高的，并且由于育種人員需要確保性狀的恰當(dāng)組合、在基因組中這些性狀的合適位置以及將這些性狀整合入適當(dāng)?shù)姆N質(zhì)中，因此隨著每種附加性狀的導(dǎo)入而變得更高。在使用一種性狀產(chǎn)生近交系的情況下獲得合適的純合產(chǎn)品的概率為1:4,而在用8種性狀產(chǎn)生近交系的情況下則為1:65,536。這些概率指數(shù)式增加了鑒定具有多性狀的純合近交系的困難，從而相當(dāng)大地提高了育種成本。因此，對(duì)導(dǎo)致提高的玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)贏利性的適合性狀的筌定及組合是重要的。5將奇數(shù)性狀繁育到雜種中的成本類似于繁育偶數(shù)性狀的成本。同樣，在某些情況下，性狀可對(duì)親本產(chǎn)生不利影響。因此還需要平衡父本和母本近交系上的性狀數(shù)目以降低將這些性狀繁育入雜種本身中的成本，并將一個(gè)親本中導(dǎo)致農(nóng)學(xué)不利影響的性狀提供給另一親本。此外，由于發(fā)展的市場(chǎng)和環(huán)境條件，增加了最終用戶例如農(nóng)民和加工者對(duì)包含提高產(chǎn)量、提升脅迫抗性和提高谷粒品質(zhì)的性狀的良好適應(yīng)的種質(zhì)的需求。盡管已知在市場(chǎng)上具有多達(dá)三種性狀的雜交玉米種子并且還知道導(dǎo)入多性狀的不同方法，但就本領(lǐng)域目前狀況而言缺少用于將至少四種轉(zhuǎn)基因性狀送遞入雜交玉米種子中的系統(tǒng)方法，例如在此所描述的一種方法。更確切地說(shuō)，本領(lǐng)域缺少用于鑒定及選擇成本降低性狀、判定在哪一親本上的哪種或哪幾種性狀應(yīng)當(dāng)被提供以及隨后選擇來(lái)自各親本性狀的組合以提高雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)的贏利'性的系統(tǒng)方法。發(fā)明概述一種用于雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)的方法，包括鑒定至少一種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入母本的種質(zhì)中；鑒定至少三種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入父本和/或母本的種質(zhì)中；種植并雜交父本和母本；和收獲雜基因性狀而生產(chǎn)的雜交種子提高的贏利性。該方法進(jìn)一步包括平衡父本和母本上的轉(zhuǎn)基因性狀，其中雜交種子的生產(chǎn)導(dǎo)致與未通過(guò)平衡轉(zhuǎn)基因性狀而生產(chǎn)的雜交種子的贏利性相比提高的贏利性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括鑒定至少四種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入父本和/或母本的種質(zhì)中.在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法鑒定至少五種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低°在另二個(gè)實(shí)施方i中:對(duì)降低生產(chǎn)成本提供^影響的性狀選自除草劑耐受、雄性不育系統(tǒng)、提高的產(chǎn)量和養(yǎng)分利用效率以及它們的組合。對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的這些和其他性狀的例子還在表2A-9中的一個(gè)或多個(gè)中給出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)降低生產(chǎn)成本提供低影響的性狀選自冷耐受、干旱耐受、疾病抗性、昆蟲抗性以及它們的組合。對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的這些和其他性狀的例子還在表2A-9中的一個(gè)或多個(gè)中給出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)增加雜交玉米種子產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)提高的贏利性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在母本和/或父本上提供最終用戶轉(zhuǎn)基因性狀。該最終用戶性狀選自提高的氨基酸含量、提高的蛋白質(zhì)含量、改良或提高的脂肪酸組成、提高的含油量、提高的碳水化物含量以及它們的組合。這些和其他最終用戶性狀的例子也在表IOA和10B中給出。本發(fā)明還披露了通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的雜交玉米種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀和三種或更多種昆蟲抗性性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀和干旱耐受性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、干旱耐受性狀和雄性不育系統(tǒng)性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀和固有產(chǎn)量性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀和養(yǎng)分利用效率性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀和冷耐受性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、三種或更多種昆蟲抗性性狀和提高的氨基酸含量組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀和干旱耐受性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀和雄性不育系統(tǒng)性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、一兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀和固有產(chǎn)量性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀和提高的含油量性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、一兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種提高的氨基酸含量性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀、提高的含油量性狀、提高的蛋白質(zhì)含量性狀和冷耐受性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種提高的氨基酸含量性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀、提高的含油量性狀、提高的蛋白質(zhì)含量性狀和冷耐受性狀組成。附圖簡(jiǎn)述圖1圖解說(shuō)明了從對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響到對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響，各種成本降低性狀按刻度從右到左的排列。HT:除草劑耐受，MSS:雄性不育系統(tǒng)，IY:固有產(chǎn)量，NUE:養(yǎng)分利用效率，CT:冷耐受，DR:疾病抗性，DT:干旱耐受和IR:昆蟲抗性。一般而言，在母本上提供對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的性狀，而在父本和/或母本上提供對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的性狀。發(fā)明詳述以下是提供來(lái)幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的本發(fā)明詳細(xì)描述。本領(lǐng)域4支術(shù)人員可對(duì)在此描述的實(shí)施方案進(jìn)行修改和改變，而不背離本8發(fā)明的精神和范圍。除非另有規(guī)定，所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。在本發(fā)明說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定的實(shí)施方案，并不意在限制本發(fā)明。當(dāng)在本發(fā)明的說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中使用時(shí)，除非上下文另有明示，單數(shù)表示法"一個(gè)，，、"一種，，和"該，，也意在包括復(fù)數(shù)表示法。所有在此提及的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)皆以其全文明確并入作為參考。詞語(yǔ)"包含"意思是包括但不限于。本發(fā)明提供了一種用于提高雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)贏利性的方法。通過(guò)鑒定并提供對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響或?qū)档蜕a(chǎn)成本具有低影響的性狀實(shí)現(xiàn)了該方法。某些成本降低性狀還直接或間接影響產(chǎn)量，由此提高了收入和贏利性。例如，固有產(chǎn)量性狀可通過(guò)提高產(chǎn)量降低與生產(chǎn)土地相關(guān)的成本，即在更小的土地上能生產(chǎn)更多單位的雜交玉米種子。盡管已知在市場(chǎng)上具有多達(dá)三種性狀的雜交玉米種子，但似乎并不存在一種系統(tǒng)方法例如在此描述的可用于鑒定、選擇在哪一親本上應(yīng)當(dāng)提供哪些成本降低性狀以及隨后選擇各親本上性狀的組合以提高雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)的贏利性的方法。如圖1中所示，從對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響到對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響，例證性的成本降低性狀按刻度從左到右以下列順序排序除草劑耐受、雄性不育系統(tǒng)、固有產(chǎn)量、養(yǎng)分利用效率、冷耐受、疾病抗性、干旱耐受和昆蟲抗性。任何其他性狀基于它們對(duì)降低生產(chǎn)成本的高或低影響也可在該梯度上排序。一般而言，在母本上提供對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的性狀，而在父本或母本上提供對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的性狀?？赏ㄟ^(guò)從性狀梯度上選擇某些具有高影響的性狀和某些具有低影^成本具有高影響的性狀,從而提高雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)的贏利性。例如，如果目的是在雜種中組合7種性狀，則可例如從表l中選擇除草劑抗性、雄性不育系統(tǒng)、固有產(chǎn)量性狀和氮利用效率作為高影響性狀并將它們導(dǎo)入母本中。還可選擇冷耐受、疾病抗性和干旱耐受性狀作為低影響性狀并將它們導(dǎo)入母本或父本中。在某些實(shí)施方案中，性狀可平衡為在母本或父本上土一種或兩種或三種性狀，以提高贏利性。在其他實(shí)施方案中，性狀可平衡為在母本或父本上±—種或兩種或三種性狀，以提高贏利性。在某些情況下，在母本上提供性狀可能導(dǎo)致產(chǎn)量損失，例如由于其插入到重要的內(nèi)源基因中。在這樣的情況下，可在父本上提供該性狀。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種生產(chǎn)雜交玉米種子的方法，包括鑒定至少一種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入母本的種質(zhì)中；筌定至少三種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入父本和/或母本的種質(zhì)中；種植并雜交父本和母本；和收獲雜交種子，其中雜交種子的產(chǎn)生導(dǎo)致相對(duì)于不是通過(guò)在母本和父本上提供轉(zhuǎn)基因性狀而生產(chǎn)的雜交種子提高的贏利性。該方法利于作物育種決策，例如通過(guò)容許父本和母本上轉(zhuǎn)基因性狀性狀而生;的雜交種子提高的贏利:。''''^a^性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入父本和/或母本的種質(zhì)中。或者，該方法容許鑒定至少五種對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響轉(zhuǎn)基因性狀，其中將所述性狀導(dǎo)入父本和/或母本的種質(zhì)中。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)降低生產(chǎn)成本提供高影響的一種性狀或多種性狀可選自除草劑耐受、雄性不育系統(tǒng)、提高的產(chǎn)量和養(yǎng)分利用效率以及它們的組合。對(duì)降低生產(chǎn)成本具有高影響的性狀的例子也在表2A-9的一個(gè)或多個(gè)中給出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)降低生產(chǎn)成本提供低影響的性狀可選自冷耐受、干旱耐受、疾病抗性、昆蟲抗性以及它們的組合。對(duì)降低生產(chǎn)成本具有低影響的性狀的例子也在表2A-9的一個(gè)或多個(gè)中給出。還可通過(guò)增加雜交玉米種子生產(chǎn)系統(tǒng)的產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)提高的贏利性。本發(fā)明還公開(kāi)了通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的雜交玉米種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀和三種或更多種昆蟲抗性性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀和干旱耐受性狀組成。在又一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、干旱耐受性狀和雄性不育系10統(tǒng)性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀和固有產(chǎn)量性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀和養(yǎng)分利用效率性狀組成。在又一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀和冷耐受性狀組成。上述性狀的例子可見(jiàn)于表2A-9的一個(gè)或多個(gè)中。指定表型的性狀(如農(nóng)學(xué)性狀例如除草劑耐受)可由指定相同或不同作用方式或機(jī)制的一種基因或超過(guò)一種的基因編碼。編碼指定非生物脅迫抗性例如干旱、冷、鹽或養(yǎng)分脅迫抗性的一種性狀或多種性狀的核酸還可提供對(duì)超過(guò)一種脅迫的耐受。成本降低性狀可包括提供增強(qiáng)的除草劑耐受、雄性不育系統(tǒng)、增加的固有產(chǎn)量、增加的養(yǎng)分利用效率如氮利用效率、增強(qiáng)的冷耐受、增強(qiáng)的疾病抗性、增強(qiáng)的干旱耐受和增強(qiáng)的昆蟲抗性的性狀。這些性狀可使生產(chǎn)成本降低14.2%-0.1%或更多(參見(jiàn)表1)。表l.在利用86個(gè)可用單位/英畝生產(chǎn)6,000,000個(gè)單位中，通過(guò)利用成本降低性狀可實(shí)現(xiàn)的估計(jì)的成本降低<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在親本中提供除草劑耐受性狀并組合使用相應(yīng)的除草劑可用于控制雜草，由此減少雜草的資源利用并降低對(duì)諸如養(yǎng)分和水的投入需要。由于雜交親本生長(zhǎng)可以利用更多資源，該性狀還可增加產(chǎn)量。此外，發(fā)現(xiàn)在母本上提供除草劑耐受性狀(例如草甘膦耐受性狀)可使生產(chǎn)失敗率(即估計(jì)的不產(chǎn)生純種子的概率)降低到0.06%-10%，這是通過(guò)一批種子中的性狀純度而測(cè)量的，例如通過(guò)測(cè)量到的草甘膦敏感率等于或大于2%。與之相比較，如果在父本上提供草甘膦耐受性狀，則可能的失敗率達(dá)36.1%。生產(chǎn)失敗率的增加意味著在生產(chǎn)田地中不符合敏感性耐受標(biāo)準(zhǔn)的繁殖單位增加，由此增加了雜交種子的生產(chǎn)成本。通過(guò)在母本上提供除草劑耐受性狀例如草甘膦耐受，可實(shí)現(xiàn)約14.2%的成本降低，從而提高贏利性(表1)。可提供一種或多種除草劑耐受性狀以更有效地控制雜草，并減少田地中發(fā)展除草劑抗性雜草的危險(xiǎn)。例如，提供對(duì)草甘膦、草銨膦、麥草畏或2,4-D的耐受性的除草劑耐受性狀可被提供。當(dāng)提供多于一種的除草劑耐受性狀時(shí)，則其可在父本和/或母本上提供。當(dāng)除草劑耐受性狀被提供作為雄性不育系統(tǒng)的一部分時(shí)(以下所描述的)，除草劑耐受性狀還可在父本上提供，因?yàn)槭┯贸輨┛墒鼓副旧系幕ǚ凼Щ睢榱颂峁﹣?lái)自父本的有活力的花粉，父本優(yōu)選具有相應(yīng)的除草劑耐受性狀以在生產(chǎn)系統(tǒng)施用除草劑時(shí)能夠存活。負(fù)責(zé)除草劑耐受的蛋白的例子示于表2A和2B中。多種方法可用于阻止母本自花傳粉。在常規(guī)植物育種方案中，在開(kāi)花時(shí)通常除去所有母本的雄花穗。可手工或機(jī)器去雄。該技術(shù)當(dāng)起效時(shí)，是非常勞動(dòng)密集的且大大增加了雜交種子生產(chǎn)的總成本。或者，可使用常用的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)。本發(fā)明使用生物技術(shù)和化學(xué)雄性不育系統(tǒng)(MSS)作為成本降低性狀。通過(guò)使用這種方法，可實(shí)現(xiàn)約10.8%的成本降低，從而提高贏利性(表l)。這種方法的例子可見(jiàn)于列于表2A和2B的文獻(xiàn)中，所述文獻(xiàn)也在此并入作為參考。通過(guò)在母本上提供產(chǎn)量性狀，能增加每英畝收獲的可用單位的數(shù)量?？捎脝挝?英畝的增加意味著實(shí)現(xiàn)給定單位產(chǎn)量目標(biāo)所需的英畝數(shù)成比例的減少。例如，固有產(chǎn)量增加10%可使生產(chǎn)雜交玉米所需的英畝數(shù)減少10%。通過(guò)在母本上提供固有產(chǎn)量性狀，可實(shí)現(xiàn)約3.7%的成本降低，從而提高贏利性(表1)。產(chǎn)量性狀可通過(guò)提高的植物的生物量、谷粒產(chǎn)量、種子數(shù)、發(fā)芽以及高密度生長(zhǎng)來(lái)增加產(chǎn)量。負(fù)責(zé)產(chǎn)量性狀的蛋12白的例子示于表2A和2B-9中。對(duì)于某些能提供針對(duì)非生物脅迫(例如養(yǎng)分缺乏)的耐受的性狀，當(dāng)施用給定量的養(yǎng)分輸入(如肥料)時(shí)，通過(guò)讓養(yǎng)分輸入(例如氮)的使用減少或增加產(chǎn)量，所述性狀從而也成為成本降低性狀。其接著還可減少所需的生產(chǎn)面積。通過(guò)在母本上提供氮利用效率性狀，可實(shí)現(xiàn)約3.7%的成本降低，從而提高贏利性(表1)。負(fù)責(zé)養(yǎng)分利用效率性狀的蛋白的例子列于表2A和2B-9中。其他脅迫耐受性狀例如冷耐受性狀如冷萌芽耐受性狀可產(chǎn)生冷耐受。假定在母本的最終群叢中種子間距的標(biāo)準(zhǔn)差有l(wèi)"改善，則會(huì)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量增加7%,由此能減少所需要的生產(chǎn)面積并使成本降低約2.6%,從而提高贏利性(表1)?？稍诟副?或母本上提供冷耐受性狀以優(yōu)化生產(chǎn)成本降低。負(fù)責(zé)冷脅迫耐受的蛋白的例子列于表2A和2B-9中?？稍诟副旧咸峁┘膊】剐孕誀?，因?yàn)榧膊】剐孕誀顚?duì)降低生產(chǎn)成本的影響通常為低。假定對(duì)99%的總土地噴灑殺真菌劑，每年每英畝施用一次的費(fèi)用為15.10美元，則提供疾病抗性性狀可使成本降低約0.7%,從而提高贏利性(表1)。在某些情況下，例如如果母本通過(guò)去雄被制成雄性不育，則可在母本上提供疾病抗性性狀。去雄可進(jìn)一步引起創(chuàng)傷。因此，通過(guò)提供針對(duì)例如可嚴(yán)重?fù)p害玉米植物的真菌病如灰色葉斑病或銹病的抗性性狀，可利于保護(hù)雌性免于任何去雄后遺留創(chuàng)傷所引起的感染。在生產(chǎn)系統(tǒng)中，疾病抗性性狀例如那些有效地抗炭色長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporiumcarbonum)或常見(jiàn)銹病的性狀可進(jìn)一步有助于降4氐成本。負(fù)責(zé)疾病抗性的蛋白的例子列于表2A和2B-9中。提供另一種抗非生物脅迫(例如缺水)的性狀，通過(guò)讓灌溉地用水減少或增加干燥地產(chǎn)量也可降低生產(chǎn)雜交種子的成本。例如，在86個(gè)可用單位/英畝的6,000,000個(gè)單位的生產(chǎn)計(jì)劃中，假定使用70%灌溉的土地，灌溉成本為8.00美元/英畝/英寸以及需水量為23"/年，在干燥地上灌溉成本降低10%以及產(chǎn)量增加5%，則在雜交種子生產(chǎn)中生產(chǎn)者能實(shí)現(xiàn)0.5%的成本降低。已知這種性狀對(duì)降低生產(chǎn)成本具低影響，因此可在父本或母本或兩者上提供這種性狀(參見(jiàn)表1)。負(fù)責(zé)干旱耐受的蛋白的例子列于表2A和2B-9中。借助于親本中的昆蟲抗性性狀，就可以不需要葉或土壤殺蟲處理。例如，在86株可用單位/英畝的6,000,000個(gè)單位的生產(chǎn)計(jì)劃中，假定26.4%的土地噴灑第一代歐洲玉米螟，其中母本占77.3%的總土地，則常，見(jiàn)施藥成本為5.35美元/英畝，化學(xué)藥品成本為6.56美元/英畝且施藥量為4盎司/英畝，因此提供抗歐洲玉米螟性狀能減少80-90%的化學(xué)施藥，從而使總生產(chǎn)成本降低約0.1%(參見(jiàn)表1),同時(shí)取得環(huán)境效益。提供抗幾種昆蟲例如根蟲、葉螨、蝗蟲、西方豆白緣切根蟲或其他豆白緣切根蟲或棉鈴蟲(earworms)的性狀，可使降低0.75%的生產(chǎn)成本?？赏ㄟ^(guò)將新基因和嵌合基因進(jìn)行組合和/或RNAi法獲得這樣的對(duì)幾種昆蟲的抗性?？稍谀副净蚋副净騼烧呱咸峁┮环N或多種昆蟲抗性性狀。負(fù)責(zé)昆蟲抗性的蛋白的例子列于表2A和2B-9中。編碼賦予昆蟲抗性的蛋白的核酸可來(lái)源于多種生物體，包括^f旦不限于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、致病桿菌種(Xenorhabdussp.)或發(fā)光桿菌種(Photorhabdussp.)。例如，可產(chǎn)生表達(dá)對(duì)同一昆蟲物種或多個(gè)昆蟲物種具有毒性的一種或多種蘇云金芽孢桿菌蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，使得能夠控制抗性，其可延遲原本對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的一種或多種殺蟲核酸易感的昆蟲物種中抗性的產(chǎn)生。或者，合意的是同時(shí)表達(dá)對(duì)特定目標(biāo)害蟲具有毒性的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白以及對(duì)同一害蟲具有毒性但通過(guò)不同于蘇云金芽孢桿菌毒素的方式賦予毒性的不同的蛋白劑。這樣的其他不同的蛋白劑可包括Cry殺蟲蛋白、Cyt殺蟲蛋白、來(lái)自致病桿菌種或發(fā)光桿菌種的殺蟲蛋白、蘇云金芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白等等中的任何一種。上述昆蟲毒素基因編碼蛋白的例子包括但不限于ET29、TIC809、TIC810、TIC127、TIC128、TIC812和ET37(WO07/027776),TIC807、AXMI國(guó)027、AXMI陽(yáng)036和AXMI-038(WO06/107761),AXMI誦018、AXMI-020和AXMI-021(WO06/083891),AXMI-010(WO05/038032),AXMI-003(WO05/021585),AXMI-008(US2004/0250311),AXMI-006(US2004/0216186),AXMI-007(US2004/0210965),AXMI-009(US2004/0210964),AXMI誦014(US2004/0197917),AXMI-004(US2004/0197916),AXMI-028和AXMI-029(WO06/119457)以及AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004(WO04/074462)。所有上述文獻(xiàn)均在此以其全文并入作為參考。賦予昆蟲抗性的蛋白優(yōu)選對(duì)鞘翅目害蟲具有毒性，所述鞘翅目害蟲包括由葉曱科、扁曱科、金龜子科、谷盜科、擬步曱科、象蟲科、叩頭蟲科和豆象科組成的鞘翅科。例證性的葉甲科鞘翅目昆蟲可包括來(lái)自葉曱屬的那些昆蟲，包括西方玉米根蟲(D.virgifera)(WCR)、南方玉米根蟲(D.undedmpunctata)(SCR)、北方玉米根蟲(D.barberi)(NCR)、墨西哥玉米根蟲(D.virgiferazeae)(MCR)、巴西玉米根蟲(D.balteata)(BZR)以及由D.vindula和南美葉曱(D.speciosa)組成的巴西玉米根蟲復(fù)合群(BCR)。賦予昆蟲抗性的蛋白還可以對(duì)半翅目害蟲具有毒性，所述半翅目害蟲可選自由頭喙亞目(如蟬、沫蟬、跳蚤)、胸味亞目(如蚜蟲、粉虱、介殼蟲)、異翅亞目(如包括草盲蝽的蝽類昆蟲)和鞘。彖亞目組成的半翅亞目昆蟲。半翅目昆蟲可來(lái)自異翅亞目。例證性的異翅亞目半翅目昆蟲可包括來(lái)自草盲蝽屬的那些昆蟲，包括豆莢盲蝽(Lygushesperus)(西方無(wú)澤盲棒(westerntarnishedplantbug))、美國(guó)牧草盲蜂(Lyguslineoloris)(無(wú)澤盲椿(tarnishedplantbug))和豆莢灰盲棒(Lyguselisus)(淺色西方豆莢盲棒(palewesternlegumebug》。賦予昆蟲抗性的蛋白還可對(duì)鱗翅目害蟲具有毒性，例如歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、巨腐玉米蟲冥(Diatraeagrandiosella)、蔗螟(Diatraeasaccharalis)、玉米穗夜蛾(Helicoverpazea)、草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)、小i也老虎(Agrotisipsilon)禾口豆白纟彖士刀才艮蟲(Loxagrotisalbiocosta》賦予昆蟲抗性的蛋白可為一種或多種基因所編碼，所述基因編碼抗攻擊玉米的線蟲類的毒素。某些例證性的影響玉米的線蟲物種是玉米胞嚢線蟲(Heteroderazeae)、根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)和刺線蟲(Belonolaimuslongicaudatus)。對(duì)于一些性狀(其中在減少物質(zhì)投入例如養(yǎng)分、殺真菌劑、水和殺蟲劑的情況下還將導(dǎo)致與設(shè)備、人工、燃料和人身安全有關(guān)的成本降除降:i本的轉(zhuǎn)基因性狀之外，最終用戶轉(zhuǎn)基因';狀可添加到母本和/或父本中。對(duì)于生產(chǎn)者而言，在提高雜交玉米生產(chǎn)系統(tǒng)贏利性方面這些性狀被認(rèn)為是中性的。然而，這些性狀會(huì)有利于雜交種子的最終用戶，例如農(nóng)民和加工者。這樣的最終用戶性狀包括飼料品質(zhì)，食物品質(zhì)，加工、制藥和工業(yè)性狀。負(fù)責(zé)最終用戶性狀的蛋白的例子列于表10A和簡(jiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含在母本和/或父本上提15供最終用戶轉(zhuǎn)基因性狀。為了該目的，最終用戶性狀可定義為最終用戶要求保留相同性的性狀。這些性狀的例子也在表IOA和10B中給出。最終用戶性狀可選自提高的氨基酸含量、提高的蛋白質(zhì)含量、改良或提高的脂肪酸組成、提高的含油量、提高的碳水化物含量以及它們的組合。這些和其他最終用戶性狀的例子也在表10A和10B中給出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、三種或更多種昆蟲抗性性狀和提高的氨基酸含量性狀組成。雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀和干旱耐受性狀組成。雜交種子中的性狀還可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀和雄性不育系統(tǒng)性狀組成?；蛘?，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、一兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀和固有產(chǎn)量性狀組成。將編碼賦予成本降低性狀或最終用戶性狀的蛋白的核酸序列可操作地連接于各種表達(dá)元件以創(chuàng)建一種或多種表達(dá)單位。這些表達(dá)單位通常在5，到3，方向上包含啟動(dòng)子(通常具有一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子)、編碼目的性狀的核酸和3'非翻譯區(qū)?？商砑悠渌磉_(dá)元件例如5'UTRs、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列和內(nèi)含子，以利于性狀表達(dá)。同樣，替代使用編碼性狀的核酸，可備選地才是供用于RNA分子轉(zhuǎn)錄的核酸序列，例如通過(guò)RNAi-介導(dǎo)的方法，以便操縱內(nèi)源或異源基因表達(dá)。這樣的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、提高的氨基酸含量性狀、干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀和提高的含油量性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀由一種或多種除草劑耐受性狀、一兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種提高的氨基酸含量性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀、提高的含油量性狀、提高的蛋白質(zhì)含量性狀和冷耐受性狀組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交種子中的性狀可由一種或多種除草劑耐16受性狀、兩種或更多種昆蟲抗性性狀、一種或多種提高的氨基酸含量性狀、一種或多種干旱耐受性狀、雄性不育系統(tǒng)性狀、固有產(chǎn)量性狀、養(yǎng)分利用效率性狀、提高的含油量性狀、提高的蛋白質(zhì)含量性狀和冷耐受性狀組成。可通過(guò)將編碼本發(fā)明中所披露的蛋白的核酸與在植物中(優(yōu)選在單子葉植物例如玉米中)起作用的啟動(dòng)子可操作地連接，從而在植物細(xì)胞中表達(dá)它們。組織特異性和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用來(lái)在特定組織中或在特定條件下適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)負(fù)責(zé)特定性狀的核酸。描述上述啟動(dòng)子的例子包括美國(guó)專利6,437,217(玉米R(shí)S81啟動(dòng)子)、美國(guó)專利5,641,876(稻激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,426,446(玉米R(shí)S324啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,429,362(玉米PR-1啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,232,526(玉米A3啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,177,611(組成型玉米啟動(dòng)子)、美國(guó)專利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,433,252(玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,429,357(稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子以及稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)、美國(guó)專利5,837,848(根特異性啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,294，714(光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,140,078(鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,252,138(病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,175,060(缺磷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專利6,635,806(Y-coixin啟動(dòng)子)和美國(guó)專利申誚-^>開(kāi)US2004-0216189(玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)?？梢允褂玫念~外的啟動(dòng)子是胭脂堿合酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert,等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5745-5749)、章魚堿合酶(ocs)啟動(dòng)子(其包含于根癌土壤桿菌的根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒中)、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動(dòng)子(Lawton，等，1987PlantMol.Biol.9:315-324)、CaMV35S啟動(dòng)子(Odell,等，1985,Nature,313:810-812)、玄參花葉病毒35S-啟動(dòng)子(Walker,等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6624)、蔗糖合酶啟動(dòng)子(Yang，等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4144-4148)、R基因復(fù)合體啟動(dòng)子(Chandler,等，1989PlantCell,1:1175-1183)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子等。在本發(fā)明中，帶有增強(qiáng)子序列的CaMV35S(美國(guó)專利號(hào)5,322,938;5,352,605;5,359,142和5,530,196)、FMV35S(美國(guó)專利6,051,753;5,378,619)、PC1SV(美國(guó)專利5,850,019)、Os.Actl(美國(guó)專利5641876)、玉米球蛋白1啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)6,329,574;US20050132437)、玉米泛素啟動(dòng)子(US20060037095)、稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(OsTPI;美國(guó)專利號(hào)177,132,528)、稻肌動(dòng)蛋白15基因啟動(dòng)子(OsActl5;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)20060162010)、小麥過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子(US2006007013)、玉米B-32蛋白啟動(dòng)子(Hartings等1990,PlantMol.Biol.14:1031-1040)、小麥過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)X53675S54871)和AGRtu.nos啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)V00087;Depicker,等，1982;Bevan,等，1983)可能是特別有益的。在某些情況下，例如OsTPI和OsAct15，啟動(dòng)子可包含5'UTR和/或第一內(nèi)含子。在某些情況下，嵌合啟動(dòng)子可能是有用的，例如肌動(dòng)蛋白與35S增強(qiáng)子以及啟動(dòng)子的嵌合體(例如參見(jiàn)US2005-0283856)。應(yīng)當(dāng)理解3，非翻譯序列/區(qū)(3，UTR)、3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或聚腺苷酸化區(qū)指連接負(fù)責(zé)性狀的結(jié)構(gòu)性多核苷酸分子并位于其轉(zhuǎn)錄方向下游的DNA分子，并包括提供聚腺苷酸化信號(hào)和能影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)信號(hào)的多核苷酸。聚腺苷酸化信號(hào)在植物中起作用，導(dǎo)致將聚腺苷酸化核普酸添加到mRNA前體的3'末端。聚腺苷酸化序列可來(lái)源于天然基因、各種植物基因或T-DNA基因。這些聚腺苷酸化序列的實(shí)例包括來(lái)自豌豆(Pisumsativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9;Coruzzi,等，1984，EMBOJ.,3:1671-1679)和AGRtu.nos(Rojiyaa,等，1987,GenBank登錄號(hào)E01312)的聚腺苷酸化分子。在本發(fā)明中，來(lái)自下列基因的3，UTR:AGRtu.nos(Rojiyaa,等，1987,GenBank登錄號(hào)E01312)、玉米球蛋白l(Belanger和Kriz,genetics,129:863-872,1991;US20050132437)、E6(登錄號(hào)#U30508)、來(lái)自才艮癌土》裏桿菌的ORF25(Barker等，1983,PlantMol.Biol.2:335-350;US20050039226)和TaHspl7(小麥低分子量熱休克蛋白基因；GenBank登錄號(hào)#X13431),以及CaMV.35S可能是特別有益的。起翻i奪前導(dǎo)序列作用的5'UTR是位于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的遺傳元件。翻譯前導(dǎo)序列位于翻譯起始序列上游的經(jīng)完全加工的mRNA中。翻i奪前導(dǎo)序列可影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)序歹'J(美國(guó)專利號(hào)5,362,865)、植物病毒包膜蛋白前導(dǎo)序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶前導(dǎo)序列、GmHsp前導(dǎo)序歹'j(美國(guó)專利5,659,122)、PhDnaK前導(dǎo)序歹iJ(美國(guó)專利5,362,865)、AtAntl前導(dǎo)序列、TEV前導(dǎo)序列(Carrmgton和Freed,JournalofVirology,64:1590-1597,1990)以及AGRtunos前導(dǎo)序列(GenBank登錄號(hào)V00087;Bevan,等，1983,Nature,304:184-187)等。在本發(fā)明中，可一皮認(rèn)為是特別有益的5，UTRs來(lái)自于下列基因GmHsp(美國(guó)專利5,659,122)、PhDnaK(美國(guó)專利5,362,865)、AtAntl、TEV(Camngton和Freed,1990,J.Virology64:1590-1597)、小麥主要葉綠素a/b-結(jié)合蛋白(Lamppa等，1985,Mol.Cell.Biol.5,1370;GenBank登錄號(hào)M10144)、AtAntl(美國(guó)專利申請(qǐng)20060236420)、OsActl(美國(guó)專利5641876)、OsTPI(美國(guó)專利號(hào)7,132,528)、OsActl5(美國(guó)發(fā)明者J·C·佩爾興,M·A·斯蒂芬斯,R·D·克特卡申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司