專利名稱：：利用DnaJ基因的細(xì)菌檢測及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用DnaJ基因的細(xì)菌檢測及其利用，詳細(xì)來講，涉及利用DnaJ基因來檢測細(xì)菌的方法，及該方法中使用的核酸分子，以及該方法和該核酸分子在診斷和鑒定中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：一直以來，病原細(xì)菌等各種細(xì)菌的檢測和鑒定需要使用特殊的試劑及熟練的技術(shù)，并使用特殊的試劑及熟練的技術(shù)進(jìn)行靶細(xì)菌的培養(yǎng)。病原菌的生長伴隨有一定程度的危險，除此以外，設(shè)想具有多種可能性的病原菌時，需要在各種不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)。并且，為了鑒定細(xì)菌菌種，還需要詳細(xì)地調(diào)查例如生化特性。因此，細(xì)菌的檢測和鑒定，特別是病原細(xì)菌的檢測和鑒定不僅具有某些危險性，而且需要花費很多的精力和時間。另一方面，作為細(xì)菌的分類和鑒定的方法，已經(jīng)開始使用16SrDNA的堿基序列。如果利用這樣基因的堿基序列，則可以期待在較短的時間內(nèi)檢測和鑒定出細(xì)菌及細(xì)菌菌種。但是，在16SrDNA的堿基序列積累的同時，當(dāng)16SrDNA的堿基序列在獨立且近緣的細(xì)菌菌種間有至少98%的相似性時，往往不能識別菌種(非專利文獻(xiàn)l)。因此，如果不實施更復(fù)雜的測定全染色體基因的相似性水平的方法，則不能實現(xiàn)菌種的確定(非專利文獻(xiàn)2)。為此，需要變異水平更高的序列的數(shù)據(jù)積累，GyrB或ropB等基因的堿基序列數(shù)據(jù)的累積正在進(jìn)行(非專利文獻(xiàn)3、4和5)。一種這樣的管家基因為熱休克蛋白DnaJ。據(jù)報道，編碼DnaJ的9DnaJ基因可以用于對分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌的菌種進(jìn)行分類(非專利文獻(xiàn)6)。另外，據(jù)報道，在鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)的血清型中DnaJ基因多態(tài)性普遍(非專利文獻(xiàn)7)并且雖然僅僅是有200堿基的短序列，但在血清型之間DmJ基因非常保守，相同屬的菌種水平中序列的差別大(非專利文獻(xiàn)8)。另外，還據(jù)報道，在軍團(tuán)菌(Legionella)屬中，DnaJ基因在嗜肺軍團(tuán)菌(L.pneumophila)的血清型之間保守，但在菌種水平多態(tài)性水平較高(非專利文獻(xiàn)9)。另一方面，在預(yù)防或治療感染疾病，強(qiáng)烈地要求迅速且可靠地檢測和鑒定從食品或動物中采集的樣品中的病原微生物。為鑒定病原微生物，使用分別與多種病原微生物中的一種的特征性耙核酸相對應(yīng)的多種引物對，實施PCR的多重PCR法是有用的。在多重PCR中，在一個管內(nèi)使用多種引物來使靶核酸擴(kuò)增。對于這樣的多重PCR法，目前正在進(jìn)行各種研討(專利文獻(xiàn)14)。多重PCR在治療感染中鑒定病毒和細(xì)菌等病原微生物是很有用的。為了鑒定病原微生物，需要耙向病原微生物的基因組中的特異性序列。非專利文獻(xiàn)1:Fox、G.E.etal.1992.Int.J.Syst.Bacteriol.42:166-170非專利文獻(xiàn)2:Ezaki、T.etal.1989.Int.J.Syst.BacterioLAmano、M.etal.2005.MicrobioUmmunol.49:255-263非專禾U文獻(xiàn)3:Yamamoto、S.andS.Harayama.1995.Appl.Environ.Microbiol.61:1104-1109.、非專禾!j文獻(xiàn)4:Yamamoto、S.andS.Harayama.l996.Int丄Syst.Bacteriol.46:506-511非專利文獻(xiàn)5:Cheunoy、W.etal.2005.Diagn.Microbiol.Infect.Dis.51:165-171非專利文獻(xiàn)6:Takewaki、S.etal.1994.Int.J.Syst.Bacteriol.44:159-166非專利文獻(xiàn)7:Victor、TC.etal.1996.J.Med.Microbiol.44:332-339非專利文獻(xiàn)8:Morita、Y.etal.2004.J.Med.Microbiol.53:813-817非專利文獻(xiàn)9:Liu、H.etal.2003.Microbiol.Immunol.47:859-869
發(fā)明內(nèi)容通常，某一基因中的堿基序列相對于其它屬的相關(guān)微生物有特異性，而且在同一屬內(nèi)的菌種水平中也有特異性，并且堿基序列在菌種內(nèi)的菌株水平中在一定程度上保守，才可以僅使用此基因檢測或鑒定特定的菌種。即，確定特定的基因是否可以用于檢測和鑒定特定的微生物菌種，需要對包含在特定菌種中的多個菌株的該特定基因進(jìn)行廣泛的測序。但是，對于DnaJ基因，僅僅是對于特定的菌種，并在血清型水平進(jìn)行了測序，還未公開對這些菌種內(nèi)的菌株水平的序列信息。DnaJ基因還沒有進(jìn)行如上所述的廣泛的基因分析。因此，目前為止，還不清楚DnaJ基因是否具有可以單獨用于檢測或鑒定菌種的特定的堿基序列。并且，由于菌株之間的多態(tài)性的存在，要發(fā)現(xiàn)菌種之間保守的序列，需要對大量菌株進(jìn)行測序。另外，在鑒定細(xì)菌等病原微生物時，如果以與分別使用多種引物時相同的濃度(約0.2pM0.^M)使用多種(210種)引物，則產(chǎn)生引物間的相互競爭、擴(kuò)增效率降低、擴(kuò)增產(chǎn)物量減少，從而導(dǎo)致不能檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，如果降低引物濃度，則擴(kuò)增效率降低，這時，也同樣不能檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，可以一次性組合的實用的引物的種類基本上為6種左右。另外，為了利用多種引物來實施多重PCR，引物的特異性是很重要的。在對應(yīng)于多種病原微生物的多重PCR中，需要靶向菌種特異的序列。但是，對于多種病原微生物，設(shè)計可以同時使用且擴(kuò)增菌種特異的靶的引物是非常難的。11本發(fā)明的目的之一在于，提供能夠容易地檢測或鑒定細(xì)菌菌種的方法，及用于其中的核酸分子。另外，本發(fā)明的其它目的在于，提供高靈敏度地檢測或鑒定細(xì)菌菌種的方法，及用于其中的核酸分子。另夕卜，本發(fā)明的其它目的還在于，提供用于檢測或鑒定2種以上細(xì)菌菌種的方法，及用于其中的核酸分子。另外，本發(fā)明的目的之一在于，提供適于迅速檢測細(xì)菌等微生物的利用多重PCR的微生物的擴(kuò)增方法，及用于其的試劑盒等。本發(fā)明人對680個菌種和1250菌株進(jìn)行了DnaJ基因的測序，通過比較其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，16SrDNA基因的菌種間的序列相似性為95%以上，DnaJ基因在基本上所有屬中菌種間的相似性為7590%，并且，從同一菌種內(nèi)的菌株水平的序列信息出發(fā)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以提取出僅從DnaJ基因就能夠?qū)N進(jìn)行鑒定的特異的堿基序列，基于上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供了以下方法。根據(jù)本發(fā)明，提供一種檢測細(xì)菌的菌種的方法，其中，對選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)、f連球菌屬(Streptococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)、支原體屬(Mycoplasma)、利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌(Salmonella)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)的1禾中或2種以上的細(xì)菌菌種作為檢測對象，該方法包括一下步驟(a)使可能含有檢測對象細(xì)菌菌種的核酸的試驗樣品和與檢測對象細(xì)菌菌種的DnaJ基因的至少一部分雜交的核酸分子接觸的步驟、(b)檢測所述核酸分子和所述試驗樣品中的核酸是否雜交的步驟。在本發(fā)明中，所述(a)步驟優(yōu)選為使所述核酸樣品和與2種以上菌種的DnaJ基因各自的至少一部分雜交的2種以上的所述核酸分子同時接觸的步驟。另外，所述核酸分子可以包含通過將屬于同一菌種6勺菌株的DMJ基因的堿基序列比對提取出來的1種或多種菌種特異的堿基序列，或可以包含基本上與該堿基序列相同的1種或多種堿基序列。并且，所述作為檢測對象的細(xì)菌可以為選自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、月巿炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、月巿炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、大月g桿菌(Escherichiacoli)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、月市炎支原體(Mycoplasmapneumoniae).Mycoplasmagenitarium、霍舌L弓瓜菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)及空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejimi)中的1或多種菌種。在檢測相應(yīng)特定的細(xì)菌菌種時，可以使用特定的核酸分子。所述檢測對象細(xì)菌可以是選自鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、軍團(tuán)菌'屬(Legionella)、衣原體屬(Chlamydia)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)、奈瑟氏球菌屬(Ndsseria)和支原體屬(Mycoplasma)的1種或多種菌種。這些細(xì)菌是肺炎和/或咽炎的病原微生物。所述細(xì)菌可以是選自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無孚L鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、月市炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、嗜月市軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)、妙、目艮衣原體(Chlamydiatrachomatis),月市炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、Mf膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)及月市炎支原f本(Mycoplasmapneumoniae)中的任一菌禾中，這日寸，所述核酸分子可以包13含SEQIDNO:卜42、SEQIDNO:131~134及SEQIDNO:89~l16中的1種或多種堿基序列或與其基本上同一1種或多種堿基序列?；蛘撸黾?xì)菌可以是選自弧菌屬(Vibrio)、彎曲桿菌屬(Campylobacter^葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌(Salmonella)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)的l種或2種以上菌種。這些菌是腹瀉和/或食物中毒的病原菌。所述細(xì)菌可以為選自霍亂弧菌(Vibriocholerae)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolydcus)、f容藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、？可》充弧菌(Vibriofluvialis)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)及大腸桿菌(Escherichiacoli)中的任一菌種，在這種情況下所述核酸分子可以包含SEQIDNO:43~70、SEQIDNO:134、SEQIDNO:8788、SEQIDNO:9798、SEQIDNO:101~102及SEQIDNO:117130中的1種或多種堿基序列或與其基本上相同的1種或多種堿基序列。所述細(xì)菌為單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)時，所述核酸分子可以包含選自SEQIDNO:135~136或SEQIDNO:137138的堿基序列或與其基本上相同的堿基序列，所述細(xì)菌為腸炎沙門菌(Salmondlaenteritidis)時，所述核酸分子可以包含選自SEQIDNO:139-140的堿基序列或與其基本上相同的堿基序列，所述細(xì)菌為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)時，所述核酸分子可以包含SEQIDNO:143144的堿基序列或與其基本上相同的堿基序列。另外，所述細(xì)菌可以為選自奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、衣原體屬(Chlamydia)及支原體屬(MycopIasma)中的1或多個種。這些細(xì)菌是性病的病原菌。所述細(xì)菌為淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、沙、目艮衣原體(Chlamydiatrachomatis)或Mycoplasmagenitarium時，所述核酸分子可以包含選自SEQIDNO:7186、SEQIDNO:105~106及SEQIDNO:109114中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種鑒定細(xì)菌菌種的方法，其中，以選自鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、消化鏈球菌屬(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)菌、軍團(tuán)菌屬(LegionelIa)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、螺桿菌屬(Helicobacter)菌、棒桿菌屬(Corynebacterium)菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)菌、伯霍爾德桿菌屬OBurkholderia)菌、嗜血菌屬(Haemophilus)菌、擬桿菌屬OBacteroides)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、諾卡爾菌屬(Nocardia)菌、普氏菌屬(Prevotelia)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌屬(MoraxelIa)菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)屬菌、梭菌屬(Clostridium)菌、密螺旋體屬(Treponema)菌、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、禾(j斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的1種或2種以上細(xì)菌菌種做為鑒定對象的對象細(xì)菌，該方法包括以下步驟-(a)獲得可能含有對象細(xì)菌的核酸的試驗樣品中的DnaJ基因的至少一部分堿基序列。該鑒定方法優(yōu)選包括(b)步驟，即將從所述試驗樣品中獲得的DnaJ基因的至少一部分堿基序列和待鑒定細(xì)菌的DnaJ基因的堿基序列對比，鑒定所述試驗樣品中的細(xì)菌的菌種的步驟。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種細(xì)菌鑒定程序用于鑒定細(xì)菌，其中，以選自鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、消化鏈球菌屬(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、15芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、螺桿菌屬(Helicobacter)菌、棒桿菌屬(Corynebacterium)菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)菌、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)菌、嗜血菌屬(Haemophilus)菌、擬桿菌屬(Bacteroides)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、諾卡爾菌屬(Nocardia)菌、普氏菌屬(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)屬菌、梭菌屬(Clostridium)菌、密螺旋體屬(Treponema)菌、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira)菌及彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌中的1種或2種以上細(xì)菌菌種作為鑒定對象的細(xì)菌菌種，該程序在1或2臺以上計算機(jī)上執(zhí)行以下步驟，即將從可能含有待鑒定細(xì)菌的核酸的試驗樣品中得到的DnaJ基因的至少一部分堿基序列和待鑒定細(xì)菌的DnaJ基因的堿基序列對比，鑒定所述試驗樣品中的細(xì)菌的菌種的步驟。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種用于檢測和鑒定細(xì)菌的核酸分子，其中，以選自鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、月惑球菌'屬(Enterococcus)菌、，肖化牽連球菌屬(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)菌、軍團(tuán)菌屬(Legiondla)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、螺桿菌屬(Helicobacter)菌、棒桿菌屬(Corynebacterium)菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)菌、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)菌、嗜血菌屬(Haemophilus)菌、擬桿菌屬(Bacteroides)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、諾卡爾菌屬(Nocardia)菌、普氏菌屬(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)菌、梭菌屬(Clostridium)菌、密螺旋體屬(Treponema)菌、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的1種或2種以上的細(xì)菌菌種為檢測和鑒定的對象，并且所述核酸分子與待鑒定細(xì)菌的DnaJ基因的至少一部分雜交。所述核酸分子可以為基因擴(kuò)增用引物，也可以為探針。另外，選自以上的核酸分子的1種或2種以上可以為該核酸分子固定化于固相中的固化體的形態(tài)，也可以為包含選自這些核酸分子中的1種或2種以上核酸分子的細(xì)菌鑒定和檢測試劑盒的形態(tài)。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過將引物的功能分為2個，可以迅速且高靈敏度地檢測微生物。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將第1引物組和第2引物組組合，即使在使針對多種靶的多個引物組同時作用的情況下，也可以充分的靈敏度檢測靶序列，其中，第1引物組具有特異性退火到靶核酸的序列和不退火到靶核酸的標(biāo)記序列，第2引物組具有與第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，為了產(chǎn)生可以檢測多種微生物的引物混合物(以下也稱為混合引物(Cocktailprimer)，通過靶向各微生物種的DnaJ基因，可以容易地設(shè)計菌種特異性引物、從而可以基本上單一的PCR反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增效率良好地擴(kuò)增靶并能靈敏度良好地進(jìn)行檢測，由此最終完成本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，還提供了以下方法。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了擴(kuò)增至少一種靶核酸的方法，其中，包括以下步驟，即，使用具有標(biāo)記序列和對所述靶核酸有特異性的堿基序列的第1引物組、和至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組，實施聚合酶鏈反應(yīng)的步驟。所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟可以為實施利用所述第1引物組擴(kuò)增所述靶核酸和利用所述第2引物組擴(kuò)增利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。并且，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟可以為實施基本上單一的PCR反應(yīng)循環(huán)的步驟。所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟可以為實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)的步驟，其中，所述第1引物組的引物濃度為0.005pM以上O.lpM以下，所述第2引物組的引物濃度為所述第1引物組的引物濃度的10倍以上50倍以下，利用所述第2引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的的擴(kuò)增產(chǎn)物為250堿基以下的核酸。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種基于多重PCR診斷病原微生物的方法，所述病原微生物為選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、沙雷菌屬(Serratia)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibdo)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原4本屬(CWamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(SalmonelIa)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的1種或2種以上菌種，該方法包括使用至少一種第1引物組和至少一種第2引物組，對可能含有來自所述病原微生物的核酸的試驗樣品實施聚合酶鏈反應(yīng)的步驟、和檢測含有所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物所具有的靶核酸(優(yōu)選在DnaJ基因上)的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。在該方法中，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟優(yōu)選為實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)的步驟。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種試劑盒，其為包含用于通過多重PCR擴(kuò)增至少1種微生物的靶核酸的引物組的試劑盒，其中，所述試劑盒包含第1引物組和第2引物組，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物所具有的耙核酸(優(yōu)選在DnaJ基因上)的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。圖1A是比較16SrDNA序列的圖。兩細(xì)菌菌種間，只有12堿基(1.2%)有差別。圖1B是顯示DnaJ序列的多態(tài)性的圖。兩細(xì)菌菌種間，183堿基(20.6%)有差別。圖2是顯示金黃色葡萄球菌(S.aureus)的DnaJ引物序列的圖。圖3是顯示利用單獨的引物(引物溶液B)及多重引物(引物溶液A)進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果的圖。圖4是通過監(jiān)測CYBR綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)顯示在LightCycler(羅氏公司)毛細(xì)管中擴(kuò)增的DNA獲得的結(jié)果的圖。圖5是顯示用瓊脂電泳確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果的圖。圖6是用電泳法比較利用基因擴(kuò)增獲得的檢測靈敏度的圖。圖7是通過監(jiān)測CYBR綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，顯示在LightCycler(羅氏公司)的毛細(xì)管中擴(kuò)增的DNA的結(jié)果的圖。圖8顯示了DnaJ基因測序的分枝桿菌屬(Mycobacterium)的55菌種和3個亞種的標(biāo)準(zhǔn)株。圖9是比較DnaJ基因和RpoB基因的序列的圖。圖IO是比較各種基因的堿基序列的圖。圖11是比較16SrDNA基因的堿基序列及DnaJ基因的堿基序列的相似性的圖。圖12顯示了利用DnaJ基因?qū)Ω鞣N菌株進(jìn)行鑒定的結(jié)果和利用生化特性對各種菌株進(jìn)行鑒定的結(jié)果。圖13顯示了基于DnaJ基因的堿基序列對統(tǒng)稱為鳥分枝桿菌-細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(M.avmm-M.intracellulare)組(MAC組)的16株臨床分離株(圖中的KPM株)進(jìn)行鑒定的結(jié)果。圖14是顯示本發(fā)明的擴(kuò)增方法中使用的第1引物組和第2引物組和靶核酸之間的關(guān)系的圖。圖15顯示了設(shè)計用于嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNA作為靶核酸的引物序列。圖16是顯示實施例8中實施的PCR步驟中的擴(kuò)增監(jiān)測結(jié)果的圖。圖17是顯示實施例9中實施的PCR步驟中的擴(kuò)增監(jiān)測結(jié)果的圖。圖18顯示了用于檢測腹瀉的細(xì)菌性病原體的引物序列。圖19顯示了用于檢測腹瀉的病毒性病原體的引物序列。圖20顯示了實施例10中固定化在硅基體上的探針序列。圖21顯示了將實施例10中的PCR產(chǎn)物與硅基體的探針雜交時的熒光。圖22顯示了用于檢測STD病原微生物的引物序列。圖23顯示了用于檢測實施例11中的PCR產(chǎn)物中的擴(kuò)增產(chǎn)物的探針序列。圖24顯示了實施例11中獲得的雜交產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。圖25顯示了構(gòu)成實施例12中制備的4種混合引物的引物。圖26顯示了作為在實施例12中進(jìn)行PCR的結(jié)果的CTm值。具體實施例方式本發(fā)明公開的檢測方法，通過使所述試驗樣品和與待檢測的菌種的DnaJ基因的至少一部分雜交的核酸分子接觸，檢測是否存在雜交，由此能夠檢測特定的微生物菌種。DnaJ基因雖然在微生物菌種間相似性較低，但是在同一菌種的菌株間在一定水平或者一定水平以上保守。因此，可以容易地提取出菌種特異的堿基序列，并且通過使用該堿基序列而容易地檢測特定的菌種。特別是由于菌種間的相似性低，因此，即使為在近緣種之間，也可以靈敏度良好地檢測特定菌種。并且，由于菌種間相似性較低，因此，可以設(shè)計特異的引物等。其結(jié)果，即使使用多個引物組的混合物，也可以檢測特定的菌種。因此，可以用含有多種引物組的1種引物混合物檢測多個菌種。這里，因為DnaJ基因是維持生命不可或缺的管家基因且所有微生物株均具有DnaJ基因，所以DnaJ基因?qū)ξ⑸锞N的檢測和鑒定是有利的。另外，本發(fā)明的鑒定方法，鑒于DnaJ基因在細(xì)菌菌種間的相似性低，因此，通過例如測定待鑒定細(xì)菌中的DnaJ基因的堿基序列或與指定的探針雜交對DnaJ基因進(jìn)行分析，然后通過與既有的近緣菌種的DnaJ基因的堿基序列的分析結(jié)果進(jìn)行比較，可以檢測待鑒定的微生物菌種。以下對本發(fā)明的實施方式，針對例如本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法及鑒定方法以及這些方法中使用的核酸分子等進(jìn)行詳細(xì)描述。(細(xì)菌的檢測方法)(待檢測的細(xì)菌)本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法靶向選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的1種或2種以上的細(xì)菌菌菌種為檢測對象種以上的細(xì)菌菌菌種的檢測。在屬于這些屬的細(xì)菌菌種中，由于DnaJ基因的堿基序列的相似性比16SrDNA基因的堿基序列的相似性低，容易發(fā)現(xiàn)在同一菌種內(nèi)的菌株之間保守的菌種特異性堿基序列，因此使得DnaJ基因適于使用DnaJ基因來適用于檢測細(xì)菌菌種。例如，對于DnaJ基因，在葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌中，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為97.4%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為77.6%，在鏈球菌屬(Streptococcus)菌中，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為95.8%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為76.4%，在分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌中，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為93%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為83.7%，在軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌中，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為96.1%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為82.5%。對于弧菌屬(Vibrio)菌，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為97.4%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為82%,對于氣單胞菌屬(Aeromonas)菌，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為98.8%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為89.8%，對于腸桿菌科(FamilyEnterobacteriaceae)菌，16SrDNA基因在菌種間的堿基序列相似性平均為97.1%、DnaJ基因在菌種間的堿基序列相似性平均為87.6%。其中，待檢測的菌種優(yōu)選為克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、弧菌屬(Vibdo)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseda)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmone!la)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌的菌種。這是因為，利用基因工程技術(shù)難以檢測和鑒定這些屬的細(xì)菌菌種，但是利用DnaJ基因，可以通過基因工程學(xué)的方法迸行檢測和鑒定。甚至在16SrDNA基因相似性較高的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)內(nèi)，在單個屬中的菌種間檢測到差別時，克雷白氏桿菌屬(KIebsiella)的4個菌種中，16SrDNA基因只存在1.4n/。的差另ij，DnaJ基因存在7.8%的差別。在沙雷菌屬(Serratia)中，16SrDNA基因存在2.3°/。的差別，而DnaJ基因存在5.5%的差別。在沙門氏菌屬(Salmonella)中，16SrDNA基因存在1.4%的差別，而DnaJ基因存在6.3。/。的差別，顯示較高的多態(tài)性。由此，通過使用DnaJ基因，則可以更適當(dāng)?shù)貦z測細(xì)菌和鑒定菌種。在本發(fā)明的檢測方法中，通過使用分別檢測多種微生物菌種的核酸分子的混合物，還可以靶向2種以上用于檢測的菌種。這是因為，由于DnaJ基因的堿基序列在屬間及微生物菌種間的相似性低，在菌株間具有相似性水平較高的序列位點，因此，可以設(shè)計互不干涉地雜交DnaJ基因的核酸分子。(試驗樣品)本發(fā)明的檢測方法可以包括以下步驟(a)使可能含有待檢測細(xì)菌的核酸的試驗樣品、和與作為檢測對象的細(xì)菌菌種的DnaJ基因至少一部分雜交的核酸分子接觸。這里，試驗樣品可能含有待檢測細(xì)菌菌種的核酸即可，沒有特別限定。試驗樣品的示例性實例包括血液、血清、從包含人在內(nèi)的動物中收集的細(xì)胞或組織、糞便和尿等排泄物、痰、井水、食品等。試驗樣品可以為通過從這樣收集的材料中提取核酸而得到的核酸提取樣品，或者可以為包含DnaJ基因或其一部分(包含待檢測的區(qū)域)的擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品。(核酸分子)可以用于本發(fā)明方法的核酸分子，可以包含通過將屬于同一菌種的菌株的DnaJ基因的堿基序列進(jìn)行比對提取出來的1種或2種以上的細(xì)菌菌種特異性堿基序列。這樣的核酸分子是菌種特異的，并且能夠使得屬于同一細(xì)菌菌種的菌株被可靠地檢測出來。為了這樣的比對及特征性序列的提取，可以利用諸如DNASISpro版本(日立軟件)、Beacondesigner5.1版本(MolecularBeacon公司)及ClustalW(自由軟件)等軟件。核酸分子可以包含1個提取得到的菌種特異性堿基序列，也可以包含2個以上?；蛘撸怂岱肿涌梢园c如上操作提取得到的菌種特異性堿基序列基本上相同的堿基序列。這里，所謂基本相同的序列，可列舉出基于上述堿基序列并在能夠保持與DnaJ基因的雜交特異性的范圍內(nèi)進(jìn)行修飾的堿基序列。示例性的實例包括上述堿基序列，與之互補(bǔ)的堿基序列，在上述堿基序列中1或2個以上的堿基以選自置換、插入、缺失及添加中的1種或2種以上的方式進(jìn)行修飾而得到的堿基序列。另外，這樣的修飾也可以對應(yīng)于特定菌株的DnaJ基因的堿基序列的堿基序列來進(jìn)行。核酸分子具體而言是具有這樣的特異性堿基序列或包含這樣的堿基序列的引物和探針。核酸分子只要可以進(jìn)行基于堿基序列的雜交就沒有特別限定。核酸分子雖然典型情況下為DNA，也可以采用DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、含有修飾堿基的人工核酸、或肽核酸(PNA)。這樣的核酸分子還可以用多種熒光色素，熒光色素淬滅劑等進(jìn)行修飾。下面給出了各細(xì)菌菌種的優(yōu)選核酸分子的實例。細(xì)菌為化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:1~4(引物)及SEQIDNO:8990(探針)中的1禾中或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。所述細(xì)菌菌種為無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:5~8(引物)及SEQIDNO:91-92(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:9~12(引物)及SEQIDNO:93~94(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:13~16(引物)及SEQIDNO:9798(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:17~20(引物)及SEQIDNO:109-1IO(引物)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列的1種或2種以上核酸分子。細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:21~24(引物)及SEQIDNO:101~102(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:2528(引物)及SEQIDNO:103104(探針)中的1禾中或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)(其中，除結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)組以外)，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:29~30(引物)及SEQIDNO:131133(引物)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:3538(引物)及SEQIDNO:115~116(探針)中的1種或2禾中以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為霍亂弧菌(Vibriocholerae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43~46(引物)及SEQIDNO:127128(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:47~49(引物)及SEQIDNO:125126(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:5052(引物)及SEQIDNO:123124(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:53~55(引物)及SEQIDNO:119~120(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為河流弧菌(Vibriofluvialis)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:134、SEQIDNO:56~57(引物)及SEQIDNO:117~118(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:5860(引物)及SEQIDNO:121122(引物)中的l種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的l種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:61~66(引物)及SEQIDNO:87~88(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:67~70(引物)及SEQIDNO:129130(引物)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:83~86(引物)及SEQIDNO:111112(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:79~82(引物)及SEQIDNO:113~114(探針)中的1禾中或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:7578(引物)及SEQIDNO:109~1IO(探針)中的1種或2禾中以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為肺炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:39~42(引物)及SEQIDNO:107~108(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為Mycoplasmagenitarium時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:71~74(引物)及SEQIDNO:105~106(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。細(xì)菌為肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:31~34(引物)及SEQIDNO:95~96(探針)中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。在檢測肺炎或咽炎的病原菌時，待檢測生物體可以為來自鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌及支原體屬(Mycoplasma)菌中的1種或2種以上細(xì)菌。這時，細(xì)菌選自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無學(xué)L鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、月巿炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、■嗜月巿軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)、沙、目艮衣原"f本(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonon'hoae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)及月巿炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:I~42、SEQIDNO:13卜133及SEQIDNO:89~116(探針)中的1種或2種以上堿基序列或含有與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。其中，優(yōu)選將對應(yīng)于2種以上或3種以上細(xì)菌菌種的各DnaJ基因的引物組組合。另外，在檢測腹瀉或食物中毒的病原菌時，待檢測生物體可以是來自弧菌屬(Vibrio)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、利斯特氏菌屬(Listeda)菌、沙門氏菌屬(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的1種或2種以上細(xì)菌。這時，細(xì)菌為選自霍亂弧菌(Vibriocholerae)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)、副溶血弧菌(Vibdoparahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、可流弓瓜菌(Vibriofluvialis)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)及大腸桿菌(Escherichiacoli)中的一種時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:43~70、SEQIDNO:134、SEQIDNO:87~88、SEQIDNO:97~98、SEQIDNO:101~102及SEQIDNO:117~130中的1種或2種以上堿基序列或含有與其基本上相同的1種或2種以上堿基序列的核酸分子。另外，細(xì)菌為單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)時，示例性核酸分子可以包括含有SEQIDNO:135和136或SEQIDNO:137和138中堿基序列或含有與其基本上相同的堿基序列的核酸分子，所述細(xì)菌為腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)時，示例性核酸分子包括含有SEQIDNO:139和140中堿基序列或含有與其基本上相同的堿基序列的核酸分子，所述細(xì)菌為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolkica)時，示例性核酸分子包括含有SEQIDNO:143和144中堿基序列或含有與其基本上相同的堿基序列的核酸分子。其中，優(yōu)選將對應(yīng)于2種或3種或以上細(xì)菌菌種的各DnaJ基因的引物組組合。在檢測性病的病原菌時，待檢測的生物體可以是來自奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌或者支原體屬(Mycoplasma)菌中的1種或2種以上細(xì)菌。在這種情況下，所述細(xì)菌為淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、月囟膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、沙、目艮衣原"(本(Chlamydiatrachomatis)及Mycoplasmagenitarium時，示例性核酸分子包括含有選自SEQIDNO:71~86、SEQIDNO:105106及SEQIDNO:109~U4中的1種或2種以上堿基序列或含有與其基本上相同的堿基序列的核酸分子。其中，優(yōu)選將對應(yīng)于2種或3種以上細(xì)菌菌種的各DnaJ基因的引物組組合。將優(yōu)選適用于核酸分子的堿基序列與待檢測細(xì)菌的菌名一同列舉于以下。另外，記載了用作引物的核酸分子基本按照由正向引物和反向引物的順序組成的引物組。(優(yōu)選用作引物的核酸分子的堿基序列)(呼吸道感染的病原菌的引物)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)SEQIDNO:01:5-ATAAGGATGTTCAAGAAGCTTACGSEQIDNO:02:5-CACCAAAGCCGCCTTGAGSEQIDNO:03:5-TTTTGAAGAGGCTGTATTTGGSEQIDNO:04:5-GAGCGGTACCAGGTTTTG無孚L鏈球菌(Streptococcusagalactiae)SEQIDNO:05:5-GCTTATGAAACCTTGAGTGATACSEQIDNO:06:5-AAACCGCCACCATCGAAGSEQIDNO:07:5-GGAGATGACCTACAATATCGSEQIDNO:08:5-GGCTAGTACCTGGCTTAG月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)SEQIDNO:09SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:125-GCCTATGAGACTTTGAGTGAC5-ACCAGCTCCACCAAAACC"GCAATCCAAACGCTCCTC;-TGTACGACAGCCAGCTTC金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SEQIDNO:13:5-GGACAAGGATTCAATGGCTCTSEQIDNO:14:5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCTSEQIDNO:15:5-GAAGCGGTATTTGGTACAACSEQIDNO:16:5-GCCATTACAGTAACTACAAGTC月巿炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)SEQIDNO:17:5-CCCTGTCGGTTAAAATTCCSEQIDNO:18:5誦CTCAAAGATAGCGTGCTGSEQIDNO:19:5-GCGTAGAAAAGACCAAAACCSEQIDNO:20:5-CAGGTTCAGGTGAAGCAG大腸桿菌(Escherichiacoli)SEQIDNO:21:5-TGTTGAGCGCAGCAAAACSEQIDNO:22:5-CAAGACGGATGCGGTCTCSEQIDNO:23:5-CTCGAAGAAGCTGTACGTGSEQIDNO:24:5-CTGTGTACCTGGTTTTGC結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)SEQIDNO:25:5-GTTCGACAGCGGCTTTGGSEQIDNO:26:5-GAACAAGTCGTTGAGGTTGAACSEQIDNO:27:5-AAGACTTCTACCAGGAGCTGSEQIDNO:28:5-ACTTCCGATAGGCACGTTT分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)(除結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)以外)SEQIDNO:29:5-CGIGARTGGGTYGARAARGSEQIDNO:30:5-GGIGAYYTITTCGGIGGIYTSEQIDNO:131:5-GTGARTGGGTCGARAARGACTSEQIDNO:132:5-CGIGTYTCGTCGTAYTCCTTSEQIDNO:133:5-CAGCGRTTACCYGCCCA肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)SEQIDNO:31:5-AGCTTGCTATGCAGTACCSEQIDNO:32:5-CTCTTTAAACTTCTCTTCGTTTTGSEQIDNO:33:5-TTGAGATGACTAATGGTTGTACTCSEQIDNO:34:5-CCCTTCAGCCCCAAAACC嗜月巿軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)SEQIDNO:35:5-ACTGTTTGTGAGGGATCGSEQIDNO:36:5-AAAACCTTGTTGAATTCTGACSEQIDNO:37:5-TTGAAGAAGCGGCTATAGGSEQIDNO:38:5-CTCACAAACAGTACAAGTACC月市炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)SEQIDNO:39:5-TCTCAGTGATCCTCAGAASEQIDNO:40:5-CCAAAGGCTCCCATGAAAGSEQIDNO:41:5-TTTGGAATGCGCTCAGATCSEQIDNO:42:5-GCTTCTTCAAAAGTCAAATTAATATG(引起腹瀉或食物中毒的微生物的引物)霍舌L弧菌(Vibriocholerae)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:44;5-AGCAGCTTATGACCAATACGCCSEQIDNO:45:5-AAACACGTCACCGAAAATATCSEQIDNO:46:5誦TTATGACCAATACGGCCATG擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:47:5-YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCASEQIDNO:48:5-ATATCGCCAAAGTCAGSEQIDNO:49:5-GCATCGGTCAGAATTTCATAC畐'j溶血弓瓜菌(Vibrioparahaemolyticus)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:50.-5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAGSEQIDNO:51:5-CCAAAGATGTCGCCGAAGSEQIDNO:52:5-CGAAGTTCTAACCGACTCTC創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:53:5-GTACGAAATTCTGACCGATCAASEQIDNO:54:5-CCACCGCCTTGTTCAAAAGSEQIDNO:55:5-ACGAAATTCTGACCGATCC河流弧菌(Vibriofluvialis)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:134:5-GTACGAAATTCTGACCGATCAASEQIDNO:56:5-CAATCTCTTTCGAGCAACCACSEQIDNO:57:5-CAACGTGGTGCGGATCTG溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:58:5-GATCGAAGTRCCRACACTMGGASEQIDNO:59:5-CCGAATACATCGCCAAAGSEQIDNO:60:5-ATGCTGCTTTTGAACAAGG蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)SEQIDNO:6h5-GATCAATTTGGTCATGCTGGT5-GAAGCCACCACCGAAGTC5-AAAGCGTATCGTCGTTTGG5-ATCATCACTTAACACTTCATATGC5-CGCAGTACGATCAATTTGG5國CAAAGAAAGAACTAAATATATCTTCSEQIDNO:62SEQIDNO:63SEQIDNO:64SEQIDNO:65SEQIDNO:66空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)SEQIDNO:67:5-TACTTATAAA丁GCTCTTGTAAAACSEQIDNO:68:5-CTTTGGACAAGTTTGAAGSEQIDNO:69:5-TAGACTTTACTTATAAATGCTCTTGSEQIDNO:70:5-GACACTTTGGACAAGTTTG(性病的病原菌的引物)MycoplasmagenitariumSEQIDNO:71:5-GAAGGGTTAAATGCTTCTGGSEQIDNO:72:5-CACCATCCATTCCAAAGGSEQIDNO:73:5-AAGGGATTATTATGAAGTTCTAGGGSEQIDNO:74:5-CATTTTCTGCTTTATGACGATC沙目艮衣原體(Chlamydophilatrachomatis)SEQIDNO:75:5-GGGATTTCCTTCTTGATCCSEQIDNO:76:5-CATGGGGATGATTTAGTTTTAGSEQIDNO:77:5-AAAGAAACCGCCTCCATTASEQIDNO:78:5-GCATGGGGAATATGGAAGAC淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)SEQIDNO:79:5-GGCGGGGAGTTAGAAGTGSEQIDNO:80:5-GACACCCTTACCTTTCACGSEQIDNO:81:5-CGGGCAAACATATTAAAGAACCSEQIDNO:82:5-CGGGAATATTGACTTCCAC腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)SEQIDNO:83:5-TTGGAAGTGCCGACCTTGSEQIDNO:84:5-GATTTGACACCCTTACCCTTCGSEQIDNO:85:5-GGGCAAACACATTAAAGAACCSEQIDNO:86:5-GCGGGAATATTGACTTCCA(優(yōu)選用作探針的核酸分子的堿基序列)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)SEQIDNO:87:TTACCATCCAGACGTAAGTAAAGAAGAASEQIDNO:88:TTAGCCACCGCCGAAGTCTCCTCC化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)SEQIDNO:89:TTCGCCGTATTGATCATAAGCAGCASEQIDNO:90:TTCCTGAGCCTAAACAAGTGCCG無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)SEQIDNO:91:丁TAAAACCGCCATTTGCCCCAGSEQIDNO:92:TCTTCCTGAACAAGTATGACATGATGAC月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)SEQIDNO:93:TTCGTGCTGCCTATGACCAGTATGSEQIDNO:94:TCGATGATACTTAACTTCCTTCTCAGT月巿炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)SEQIDNO:95:TACAGTCTCACCCTCACCCTTATGSEQIDNO:96:TTCACAGGCACTACAGGTCACC金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SEQIDNO:97:TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCGSEQIDNO:98:TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCGAA月^炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)SEQIDNO:99:TTCGTACAGATCGCCTGCCGSEQIDNO:100:CGCGCCGGCAGGCGATCTGTACGT大腸桿菌(Escherichiacoli)SEQIDNO:101:AAGAGATCCGCATTCCGACTCTGGAAGSEQIDNO:102:TTAAGAGATCCGCATTCCGACT結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)SEQIDNO:103:TCGGGGTCGGTGGAGACGGCGSEQIDNO:跳TTCTCCTCTGATGCCAGTCCTGAAGAMycoplasmagenitariumSEQIDNO:105:TAGCAGGGTTTAATCCTTTTGACATCTSEQIDNO:106:TAAACGCTAGTTCTCAAGACATAAA肺炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)SEQIDNO:107:TTCGCAAGGCATCTTCCATGTTCCSEQIDNO:108:TTTCTTACTGGCTCCTTGACGA沙目艮衣原體(Chlamydiatrachomatis)SEQIDNO:109:TTAGCCGCATCAACAAATCCAATAGGSEQIDNO:110:TTACCGAAATCGCCGCCAAA34腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)SEQIDNO:111:TTCTTGACCGCCTTATTCCGCCSEQIDNO:112:TGCCGTGGCGCGGGGCGGAATA淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)SEQIDNO:113:TTCTTGACCGCCTTATTCCGCCSEQIDNO:114:TGCCGTGGCGTGGGGCGGAATA嗜月巿軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)SEQIDNO:115:TAAGAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGACSEQIDNO:116:AAAGAAGTTGAAATTACCGTTCC河流弧菌(Vibriofluvialis)SEQIDNO:117:TTCCAGCGTCAGTTCCATGTTGSEQIDNO:118:TCGAGCAGCCGCGTACCGCTTCT創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)SE(5IDNO:119:TCCATATTGATCGTAAGCCGCTSEQIDNO:120:TCGAGACACCACGAACGGCCTCT溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)SEQIDNO:121:TTAATCAGCACCGCCGCCACSEQIDNO:122:TCGTTACACCACGAACCGCTTCT畐Ui容血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)SEQIDNO:123:TTCAGCACCGCCTCCACCAASEQIDNO:124:TAGTTACACCACGAACGGCTTCT擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)SEQIDNO:125:TTCGAAGCCGCCGCCACCAASEQIDNO:126:TCGAACATCCACGAACCGCTTCT霍亂3瓜菌一(Vibriocholerae)SEQIDNO:127:TTAATCAGCACCGCCACCGCSEQIDNO:128:TCGAGCAGCCGCGAACCGCTTCT空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)SEQIDNO:129:TGTAATGGAACAGGGGCTASEQIDNO:130:TCCATCTTTAGCCCCTGTTCCAT為了使試驗樣品和核酸分子接觸，使試驗樣品中可能含有的待檢測微生物的DnaJ基因與核酸分子應(yīng)處于可進(jìn)行雜交的狀態(tài)。例如，可以使DnaJ基因與核酸分子共存于液相內(nèi)，也可以使其中之一結(jié)合在固相中、另一個包含在與固相接觸的液相中。如后所述，實現(xiàn)這樣的接觸的步驟可以基于諸如PCR、RT-PCR法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TMA法)、分支DNA法(bDNA法)、實時PCR法、連接酶鏈反應(yīng)法(LCR法)的基因擴(kuò)增法，或者基于諸如southern印跡法、微陣列法、微珠法、核酸(DNA)色譜法的核酸雜交的堿基測序法的一部分來實施。在該步驟中采用的技術(shù)也可以根據(jù)例如所使用的核酸分子被設(shè)計為引物還是被設(shè)計為探針來進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。本發(fā)明方法可以包括檢測核酸分子與試驗樣品中的核酸是否雜交的步驟。為了檢測是否發(fā)生這樣的雜交，例如，可以通過以下方法來進(jìn)行(l)直接檢測核酸分子和試驗樣品中的核酸有無特異性雜交，(2)基于核酸分子和試驗樣品中的核酸之間有無特異性雜交，檢測基因擴(kuò)增反應(yīng)是否存在，以及(3)檢測基因擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中有無特定堿基序列。上述(l)的情況下，例如，通過向核酸分子和/或從試驗樣品中提取的核酸中添加產(chǎn)生可以檢測信號的標(biāo)記化合物或者添加產(chǎn)生信號的變化的信號形成化合物，可以檢測雜交，其中，所述產(chǎn)生信號的變化是通過借由雜交的插入等而產(chǎn)生的。為了有效地檢測雜交產(chǎn)物，優(yōu)選將核酸分子或試驗樣品中的核酸結(jié)合于固相。這樣的檢測可以基于諸如southern印跡法、微陣列法、微珠法(流式細(xì)胞術(shù))或核酸(DNA)色譜法的核酸雜交，作為堿基測序技術(shù)來實施。核酸分子可以采用探針的形式。上述(2)的情況下，例如，可以使核酸分子作為引物發(fā)揮作用，并將DnaJ基因作為模板，誘導(dǎo)使與DnaJ基因特異性雜交的核酸分子延伸，通過電泳等檢測是否獲得指定的擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣的基因擴(kuò)增及檢測可以通過諸如PCR、RT-PCR法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TMA法)、分支DNA法(bDNA法)、實時PCR法或連接酶鏈反應(yīng)法(LCR法)的基因擴(kuò)增法或擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測法來實施。使用PCR的方法將在后面說明書中詳細(xì)敘述。上述(3)的方法，可以通過組合上述(2)和上述(1)來實施。例如，可以通過使用對一定范圍的屬或者菌種有特異性的引物作為核酸分子，得到基因擴(kuò)增產(chǎn)物，并也可以使用對特定菌種有特異性的探針作為核酸分子，對所產(chǎn)生的基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測有無雜交。(細(xì)菌的鑒定方法)本發(fā)明的細(xì)菌的鑒定方法可以包括以下步驟獲得諸如可能含有待鑒定細(xì)菌或者其核酸的臨床樣品的試驗樣品中的DnaJ基因的至少一部分堿基序列。通過獲得DnaJ基因的至少一部分堿基序列，可能鑒定待鑒定細(xì)菌的菌種。另外，可以制作其系統(tǒng)發(fā)生樹。本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法中，優(yōu)選作為檢測靶的細(xì)菌菌種包括鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、消化鏈球菌屬(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、螺桿菌屬(Helicobacter)菌、棒桿菌屬(Corynebacterium)菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)菌、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)菌、嗜血菌屬(Haemophilus)菌、擬桿菌屬(Bactei.oides)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、諾卡爾菌屬(Nocardia)菌、普氏菌屬(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)菌、梭菌屬(Clostridium)菌、密螺旋體屬(Treponema)菌、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、利斯特氏菌屬(Listeda)菌、沙門氏菌屬(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)細(xì)菌。由于DnaJ基因在這些細(xì)菌中為多樣性的基因，因此其對于鑒定細(xì)菌菌種是有用的。得到DnaJ基因的堿基序列時，也可以得到將上述核酸分子作為引物使用而得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列或?qū)⑸鲜龊怂岱肿幼鳛樘结樖褂枚玫降碾s交產(chǎn)物的堿基序列?？赏ㄟ^得到堿基序列，對由PCR法等得到的基因的至少一部分，利用釆用公知的方法進(jìn)行定序的定序器來測定堿基序列的方法或與具有指定的堿基序列的探針雜交的方法(利用微陣列法等)?；趶脑囼灅悠分蝎@得的DnaJ基因的至少一部分堿基序列來鑒定菌種時，優(yōu)選將得到的堿基序列和預(yù)先得到的鑒定對象細(xì)菌的DnaJ基因的堿基序列進(jìn)行對比。即，鑒定細(xì)菌菌種時，優(yōu)選首先制備各細(xì)菌菌種的DnaJ基因的全部或一部分堿基序列的數(shù)據(jù)庫。預(yù)先制備這樣的數(shù)據(jù)庫，可以迅速地鑒定細(xì)菌菌種。另外，優(yōu)選預(yù)先制備包含涉及細(xì)菌菌種內(nèi)的各種菌株的DnaJ基因的堿基序列的信息的數(shù)據(jù)庫。利用這樣的數(shù)據(jù)庫，可以容易地提取出菌株通用的菌種特異性的堿基序列。通過使用如上操作提取得到的堿基序列，可以容易且準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌菌種。另外，同時也適合于制作系統(tǒng)發(fā)生樹。尤其是，在利用DnaJ基因鑒定細(xì)菌菌種時，首先進(jìn)行獲得試驗樣品的16SrDNA基因的堿基序列的步驟是有用的。這是因為，即使16SrDNA基因的堿基序列與近緣菌種的相似性高，DnaJ基因的相似性也38低。例如，通過首先測定16SrDNA基因的相似性最高的候選菌種(這樣的菌種可以為l種，也可以為2種以上)，然后測定試驗樣品中候選菌種的DnaJ基因的堿基序列和分離株等的DnaJ基因的堿基序列，可以容易且迅速地鑒定分離株的菌種。另外，可通過16SrDNA基因進(jìn)行鑒定時，就不需要通過DnaJ基因進(jìn)行鑒定。采用這樣的方法時，雖然與既有菌種的16SrDNA基因的相似性沒有特別限定，在分離株與既有細(xì)菌菌種的16SrDNA基因的堿基序列至少98%的相似性時，優(yōu)選對該既有的細(xì)菌菌株和分離株的DnaJ基因的堿基序列進(jìn)行對比。在得到16SrDNA基因的堿基序列時，與得到DnaJ基因的堿基序列同樣，可以適當(dāng)使用公知的方法。另外，優(yōu)選通過將試驗樣品中的16SrDNA基因的至少一部分堿基序列與既有細(xì)菌菌株的16SrDNA基因的堿基序列進(jìn)行對比，得到這些堿基序列之間的相似性水平。需要預(yù)先制備各種細(xì)菌菌種或菌株的16SrDNA基因的堿基序列的數(shù)據(jù)庫。在分析試驗樣品中的DnaJ基因等的堿基序列時，雖然待鑒定細(xì)菌的取樣源沒有特別限定，可以使用如上所述的包含例如臨床樣品的試驗樣品。另外，與以上描述的細(xì)菌的檢測方法同樣，可以將細(xì)菌的核酸提取物或者細(xì)菌基因的指定區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物作為試驗樣品。另外，從以上所述出發(fā)，根據(jù)本發(fā)明，還可以提供一種用于獲得DnaJ基因的至少一部分堿基序列的細(xì)菌鑒定程序，其中，以與上述鑒定方法中的細(xì)菌相似的細(xì)菌作為待鑒定細(xì)菌，在1或2臺以上的計算機(jī)上執(zhí)行以下步驟，即通過將從可能含有待鑒定細(xì)菌的核酸的試驗樣品中得到的DnaJ基因的至少一部分堿基序列和待鑒定細(xì)菌的DnaJ基因的堿基序列對比，鑒定所述試驗樣品中的細(xì)菌的菌種的步驟。根據(jù)該程序，可以通過從DnaJ基因的序列數(shù)據(jù)庫中檢索可以從試驗樣品中得到的DnaJ基因的序列與堿基序列一致的序列，從而鑒定試驗樣品的細(xì)菌的種。在該程序中，在上述步驟之前，還可以進(jìn)行以下步驟，即將從上述試驗樣品中得到的16SfDNA基因的至少一部分堿基序列與39待鑒定細(xì)菌的16SrDNA基因的堿基序列進(jìn)行對比，確定具有與所得的堿基序列相似性最高的16SrDNA基因的堿基序列的候選菌種，并將這些候選菌種的DnaJ基因的堿基序列與來自試驗樣品的DnaJ基因的堿基序列相對比。這里，程序的形式?jīng)]有特別的考慮。程序可以為借由因特網(wǎng)下載的形式，也可以為存儲于適當(dāng)?shù)拇鎯橘|(zhì)中的形式?；蛘撸龀绦蜻€可以存儲于計算機(jī)或其他合適裝置的ROM等中。而且，根據(jù)本發(fā)明，還可以提供以能夠執(zhí)行的方式存儲這樣的程序的裝置。該裝置的控制器可具有能夠執(zhí)行這樣的程序的CPU、存儲該程序的諸如ROM或硬盤的存儲裝置及適當(dāng)?shù)妮斎胄蛄械难b置。另外，還可以在裝置內(nèi)的硬盤等存儲裝置中裝備DnaJ基因的序列數(shù)據(jù)庫，并且，如果為可連接因特網(wǎng)的環(huán)境，則還可以通過訪問存儲有這樣的序列數(shù)據(jù)庫的服務(wù)器進(jìn)行必要的處理。并且，對比序列的步驟即測定序列間的相似性水平、或進(jìn)行比對的步驟可以使用DNASISpro版本(日立軟件)、Beacondesigner版本5.1(MolecularBeacon公司)及ClustalW(自由軟件)等軟件的全部或一部分。(核酸分子及包含核酸分子的細(xì)菌的檢測和鑒定試劑盒)本發(fā)明的核酸分子可以包含上述各種類型的核酸分子。另外，還可以作為用于檢測或鑒定包含1種或2種以上上述各種核酸分子的細(xì)菌的檢測和鑒定試劑盒制備這樣的核酸分子。所選的用于這樣的檢測和鑒定試劑盒中所含的核酸分子可以為作為探針和/或引物起作用的核酸分子。檢測和鑒定試劑盒中的核酸分子的組合沒有特別限定，雖然試劑盒優(yōu)選為組合有可以檢測或鑒定優(yōu)選3種以上、更優(yōu)選4種以上、進(jìn)一步優(yōu)選5種以上的細(xì)菌菌種的核酸分子的試劑盒。優(yōu)選的靶菌種的組合的實例為包含2種嗜衣原體屬(CMamydophila)菌、1種衣原體屬(Chlamydia)菌、1種柯克斯體屬(Coxiella)菌、1種嗜血菌屬(Haemophilus)菌、4種軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、2種鏈球菌屬(Streptococcus)菌、3禾中分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、1種假單胞菌屬(Pseudomonas)菌、1禾中支原體屬(Mycoplasma)、1種葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、1種博德特菌屬(Bordetella)菌、1種棒桿菌屬(Corynebacterium)菌、1種博德特菌屬(Bordetella)菌、1種克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、1種沙雷菌屬(Serratia)菌及1種埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌的組合。這樣的核酸分子的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定肺炎及咽炎的病原菌。另一種優(yōu)選組合的實例為包含1種衣原體屬(Chlamydia)菌、2種奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、2種支原體屬(Mycoplasma)菌、2種尿素支原體(Ureaplasma)菌、1種念珠菌屬(Candida)菌、1種密螺旋體屬(Treponema)菌、1種毛滴蟲屬(Trichomonasa)菌及2種嗜血菌屬(Haemophilus)菌的組合。這樣的核酸分子的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定性病和尿道感染的病原菌。優(yōu)選組合的其他實例為包含2種耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌、4種埃希氏桿菌屬(Eschedchia)-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)菌、1種彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、1種沙門菌屬(Salmonella)菌、4種弧菌屬(Vibrio)菌、3種氣單胞菌屬(Aeromonas)菌、1種鄰單胞菌屬(Plesiomonas)菌、1種賈第蟲屬(Giardia)菌、1種內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)菌及4種梭菌屬(CIostridium)菌的組合物。這樣的核酸分子的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定食物中毒和腹瀉的病原菌。以上優(yōu)選的組合也可以與特別是將16SrDNA作為靶、通過PCR等對試驗樣品中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物鑒定細(xì)菌菌種的方法組合使用。例如，可以利用包含能夠擴(kuò)增16SrDNA基因的引物組的引物混合物(組合物)，也可以首先嘗試通過16SrDNA的方式鑒定菌種，在不能這樣鑒定的情況下，再嘗試通過DnaJ進(jìn)行鑒定。由此，可以同時檢測或鑒定多個細(xì)菌菌種，或有效地進(jìn)行檢測或鑒定細(xì)菌菌種。這樣的檢測和鑒定試劑盒可以僅僅制備為例如包含核酸分子作為引物的基因擴(kuò)增的形式的1種或2種以上核酸分子的試劑盒，也可以制備為其中l(wèi)種或2種以上核酸分子作為探針可固定于諸如微珠或基體的固相上的試劑盒。(固定化體)本發(fā)明的固定化體可以通過將上述核酸分子的1種或2種以上固定于諸如微珠或基體的固相而獲得。固定于固相上的核酸分子通過基體等中其序列的位置信息或通過微珠中其顏色而被識別。已固定于固相上的核酸分子也可以結(jié)合其上雜交后發(fā)射信號的化合物。另外，核酸分子可固定于固相表面上能夠進(jìn)行引物延長反應(yīng)。固相的形式?jīng)]有特別限定，并且其材質(zhì)也沒有特別限定，例如，可以使用玻璃、塑料或陶瓷。另外，本發(fā)明的固定化體可以為用過將作為探針的核酸分子固定于諸如過濾器的色譜基材上獲得的核酸色譜裝置。本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增或檢測至少1種耙核酸的擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。這些發(fā)明除了可用于擴(kuò)增和檢測非特異性的耙核酸以外，還可用于將上述DnaJ基因或其一部分作為靶核酸，利用DnaJ基因的堿基序列的細(xì)菌檢測和鑒定。即，通過使用基于DnaJ基因的堿基序列的細(xì)菌菌種特異性引物，可以進(jìn)一步地提高本發(fā)明在對l種或2種以上(優(yōu)選2種以上)細(xì)菌菌種的檢測及鑒定的有用性。本發(fā)明的靶核酸的擴(kuò)增方法為擴(kuò)增至少1種靶核酸的方法，該方法可以包括以下步驟，即，使用至少1種分別具有標(biāo)記序列和對所述耙核酸有特異性的堿基序列的第1引物組，和使用至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組，實施聚合酶鏈反應(yīng)的步驟。利用本發(fā)明的靶核酸擴(kuò)增方法，通過第1引物組擴(kuò)增靶核酸，通過第2引物組擴(kuò)增包含靶核酸序列的第1引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。艮P，即使利用第1引物組擴(kuò)增靶核酸的效率低，利用第2引物組進(jìn)行擴(kuò)增，能夠容易地獲得包含檢測所需要的量的靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，即使多種第1引物組為低濃度，也可以通過彌補(bǔ)利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增的低效率，而利用第1引物組可以擴(kuò)增一個以上靶核酸。另外，由于主要利用第2引物組來擴(kuò)增靶核酸，因此，可以使擴(kuò)增效率容易均可以使上述聚合酶鏈反應(yīng)步驟為同時實施利用上述第1引物組擴(kuò)增所述靶核酸和利用所述第2引物組擴(kuò)增利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。這樣的聚合酶鏈反應(yīng)步驟可以容易地檢測靶核酸。本發(fā)明中，可以將第1引物組設(shè)計為具有對微生物的DnaJ基因上的靶核酸有特異性的堿基序列。通過使用DnaJ基因，即使存在不同屬以及相同屬不同種的微生物，也可以容易地在菌種水平檢測微生物。本發(fā)明人明確了，DnaJ基因具有在菌種間相似性低，但在同一菌種保守的堿基序列。因此，DnaJ基因?qū)σ蚓N不同而毒性或惡性度水平不同的病原微生物的檢測是有利的。另外，通過使用DnaJ基因，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物容易地設(shè)計在能夠有效避免擴(kuò)增產(chǎn)物的競爭的250堿基以下的長度。以下參照適當(dāng)?shù)膱D的本發(fā)明的實施方式，對本發(fā)明的靶核酸的擴(kuò)增方法及用于這種擴(kuò)增的試劑盒進(jìn)行詳細(xì)說明。圖14顯示了本發(fā)明的擴(kuò)增方法中使用的第1引物組和第2引物組與耙核酸的關(guān)系。(聚合酶鏈反應(yīng))本發(fā)明中，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是在試管內(nèi)通過酶反應(yīng)而將特定的DNA序列擴(kuò)增的反應(yīng)。既有的PCR方法包括RT-PCR法、實時PCR法，及其多樣改良法及其與其它的分析技術(shù)的組合，本發(fā)明使用的PCR中可以包含所有的這些方法。(靶核酸)本發(fā)明中，術(shù)語"耙核酸"是指通過聚合酶鏈反應(yīng)而擴(kuò)增的堿基序列的全部或其一部分的核酸。耙核酸只要是可以通過聚合酶鏈反應(yīng)而擴(kuò)增的靶核酸就沒有特別限定，實例包括除了作為基因組，生物體遺傳信息媒介物的DNA或RNA，還有mRNA、cDNA和cRNA。另夕卜，靶核酸可以為單鏈或雙鏈的。靶核酸可以從生物體或其一部分組織中提取而得到并且可以為多種形式，諸如通過在對表達(dá)分析而得到的mRNA、cDNA及基因組上進(jìn)行PCR反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述形式?jīng)]有特別的限定。作為其來源的生物體或組織也沒有特別限定，除包括人類及非人類哺乳類動物的動物之外，諸如細(xì)菌、真菌和病毒的微生物也可作為來源。從感染癥的預(yù)防和治療以及衛(wèi)生的觀點考慮，靶核酸的來源生物體優(yōu)選為微生物，更優(yōu)選為由于衛(wèi)生或治療的原因，被檢測或鑒定的微生物，進(jìn)一步優(yōu)選為病原微生物。靶核酸所來源的微生物的實例包括葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、沙雷菌屬(Serratia)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Myc叩lasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌屬(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌。1種或2種以上的細(xì)菌菌種的微生物選自屬于這些屬的菌。屬于這些屬的菌種具有在DnaJ基因上的優(yōu)選的靶核酸。這是因為，在屬于這些屬的微生物中，菌種間的DnaJ基因的堿基序列的相似性比16SrDNA基因的堿基序列的相似性低，因此容易發(fā)現(xiàn)在同一菌種的菌株之間保守的菌種特異性堿基序列。其中，優(yōu)選為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)及弧菌屬(Vibrio)的細(xì)菌菌種。這是因為，屬于這些屬的細(xì)菌在屬間及同44一屬內(nèi)的菌種間DnaJ基因的相似性低，因此適于通過DnaJ基因的方式檢測細(xì)菌菌種。例如，對于DnaJ基因，在葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌中，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為97.4%，DnaJ基因在菌種間的相似性平均為77.6%，在鏈球菌屬(Streptococcus)的菌中，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為95.8%，DnaJ基因在菌種間的相似性平均為76.4%，在分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌中，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為93%、DnaJ基因在菌種間的相似性平均為83.7%，在軍團(tuán)菌屬(Legionella)的菌中，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為96.1%、DnaJ基因在菌種間的相似性平均為82.5%，對于弧菌屬(Vibrio)的菌，16SrDNA基因在菌種間的相似性平均為97.4°/。、DnaJ基因在菌種間的相似性平均為82%。這樣的靶核酸以例如血液、血清、從包含人在內(nèi)的動物收集的細(xì)胞或組織、諸如糞便和尿的排泄物、痰、井水、食品等試驗樣品的方式提供。試驗樣品可以為通過從這樣收集的材料提取核酸獲得的核酸提取樣品，或者可以為包含DnaJ基因或其一部分(包含待檢測的區(qū)域)的擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品。(第1引物組)本發(fā)明的擴(kuò)增方法中使用具有標(biāo)記序列和選擇性退火到靶核酸的堿基序列的第1引物組。第1引物組由正向引物和反向引物構(gòu)成。如圖1所示，正向引物及反向引物均在其5'側(cè)具有標(biāo)記序列，在3'側(cè)具有退火到耙核酸的序列。第1引物組(引物對)根據(jù)靶核酸的種類進(jìn)行選擇。通常，相對于單個靶核酸選擇單個第1引物組。然而，有時也可以對兩個以上靶核酸選擇單個第1引物組。選擇性退火到與第1引物組(對)各自的引物所具有的靶核酸的堿基序列(以下也稱為退火序列)優(yōu)選選擇僅與靶核酸雜交、可退火特異性高的序列。這里，將為同一基因設(shè)計作為靶核酸的引物時，不同的引物組之間，退火序列可以部分或全部匹配。退火序列可以根據(jù)對靶核酸的特異性以及避免引物二聚體的形成、PCR步驟中的反應(yīng)溫度來確定。優(yōu)選該堿基序列和靶核酸之間的反應(yīng)溫度Tm為50'C以上7(TC以下，更優(yōu)選為55T:以上65X:以下。在以微生物的檢測或鑒定為目的而實施擴(kuò)增方法時，這樣的退火序列可以選擇對待檢測或鑒定的微生物有特異性的序列，雖然，優(yōu)選如上所述使用DnaJ基因上的堿基序列作為耙核酸。對于多個微生物，將同一基因的堿基序列用作靶核酸時，可以通過比對多個微生物的DnaJ基因的堿基序列，選擇微生物特異性堿基序列。這樣的退火序列是菌種特異性的，并可以可靠地檢測屬于該菌種的菌株。為了這樣的比對及特征性序列的提取，可以利用諸如DNASISpro版本(日立軟件)、Beacondesigner5.1版本(MolecularBeacon公司)及ClustalW(自由軟件)的軟件。標(biāo)記序列可以選自不與待擴(kuò)增的耙核酸雜交的序列。標(biāo)記序列的長度優(yōu)選為12堿基以上40堿基以下，更優(yōu)選為18堿基以上30堿基以下。構(gòu)成第1引物組的正向引物和反向引物可以分別具有在標(biāo)記序列和退火序列之間的接頭序列，雖然優(yōu)選僅由2種序列構(gòu)成。另外，正向引物和反向引物序列均優(yōu)選整體為30堿基以上80堿基以下，更優(yōu)選為35堿基以上。另外，利用這樣的第1引物組而擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選為80以上280以下的堿基。這是因為，在該范圍內(nèi)時，病原微生物等的基因中包含的通用保守序列的可能性減少，檢測靈敏度提高。更優(yōu)選擴(kuò)增產(chǎn)物為250堿基以下。這是因為，為250堿基以下時，擴(kuò)增區(qū)域包括的不同細(xì)菌菌種的通用保守序列的可能性減少，擴(kuò)增效率和靈敏度提高。進(jìn)一步優(yōu)選擴(kuò)增產(chǎn)物為200堿基以下。這是因為，為200堿基以下時，容易設(shè)計菌種特異性引物及探針。特別是將微生物的DnaJ基因作為靶核酸時，DnaJ基因的結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度超過200堿基時，菌種特異性引物和探針的設(shè)計變難，為200堿基以下時，菌種特異性引物的設(shè)計變?nèi)菀?。另外，為DnaJ基因時，基因的結(jié)構(gòu)，即使擴(kuò)增產(chǎn)物為該長度，特異性探針的設(shè)計也比16SrDNA容易。即，通過在DnaJ基因上配置靶核酸，可以在多個微生物中設(shè)計可以得到優(yōu)選250堿基以下、更優(yōu)選200堿基以下的擴(kuò)增產(chǎn)物的第i引物組。在本發(fā)明中，由于可以這樣的一定范圍的堿基長度得到利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物，因此，可以將用于利用第2引物組進(jìn)一步擴(kuò)增該擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR循環(huán)和利用第1引物組的PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)定為同一循環(huán)。使用至少一種第1引物組，本發(fā)明的擴(kuò)增方法在利用多重PCR實施的擴(kuò)增步驟時等，可以使用多種第1引物組。優(yōu)選使用6種以上第1引物組，更優(yōu)選使用IO種以上第1引物組。甚至更優(yōu)選使用15種以上第1引物組。然而，優(yōu)選使用50種以下第1引物組。在擴(kuò)增微生物的靶核酸時，特別優(yōu)選將DnaJ基因上的序列作為靶核酸。通過使用該基因，可以設(shè)計菌種特異且擴(kuò)增產(chǎn)物間難以產(chǎn)生競爭的引物，從而可以通過多重PCR而容易地檢測多種微生物的靶核酸。(第2引物組)本擴(kuò)增方法中，可以使用至少1種具有與第1引物組中使用的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組。第2引物組通過借由標(biāo)記序列與第1引物組和靶核酸退火而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物退火，可以進(jìn)一步將擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增。構(gòu)成第2引物組的第2正向引物及第2反向引物分別具有與第I正向引物的標(biāo)記序列及第1反向引物的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。第2正向引物及第2反向引物優(yōu)選包含分別與第1正向引物及第1反向引物的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。這里，與標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列，例如為與第1正向引物的標(biāo)記序列相同的標(biāo)記序列，在可以維持第1標(biāo)記序列與互補(bǔ)的堿基序列的雜交特異性的范圍內(nèi)進(jìn)行修飾的堿基序列。示例性實例包括與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列，或在該堿基序列中，以選自置換、插入、缺失及添加1或2以上的堿基中的1種或2種以上的方式進(jìn)行修飾而得到的堿基序列。優(yōu)選使用與分別添加在第1引物組上的標(biāo)記序列相同的標(biāo)記序列。第2引物組不是對應(yīng)特定的第1引物組而使用的，而是對應(yīng)于可在第1引物組中使用的標(biāo)記序列而使用的。因此，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用的2種以上的第1引物組使用1種標(biāo)記序列對時，第2引物組為1種?；蛘?，2種以上的第1引物組使用2種以上的標(biāo)記序列時，使用2種以上的第2引物組。這樣的第1引物組和第2引物組優(yōu)選以使第1引物組的各引物濃度低、使第2引物組的各引物濃度比第1引物組的每個引物濃度高的方式來使用。這是因為，由于使用第2引物組，因此，第1引物組只要可以產(chǎn)生能夠作為第2引物組的模板的程度的擴(kuò)增產(chǎn)物即可。PCR反應(yīng)溶液中的第2引物組的每個引物的濃度優(yōu)選為PCR反應(yīng)溶液中的每個第1引物組的每個引物的濃度的10倍以上50倍以下。在該范圍內(nèi)時，即使使用多種第1引物組，也可以得到與用單獨的引物組進(jìn)行擴(kuò)增時同樣的檢測靈敏度。這里，第1引物組的引物濃度和第2引物組的引物濃度的比率優(yōu)選根據(jù)所使用的第1引物組的種類數(shù)來決定。例如，所使用的第1引物組的種類為IO種時，優(yōu)選將第2引物組的每個引物的濃度設(shè)為每個第1引物組的引物濃度的IO倍以上。同樣，所使用的第1引物組的種類為20種時，優(yōu)選將第2引物組的每個引物的濃度設(shè)為每個第1引物組的引物濃度的20倍以上。第1引物組的每個引物的濃度優(yōu)選為0.005pM以上0.2pM以下。在該范圍內(nèi)時，可以利用第2引物組以可擴(kuò)增的水平產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。更優(yōu)選引物濃度為O.lpM以下。另一方面，第2引物組的引物濃度優(yōu)選為0.1pM以上，更優(yōu)選為0.25^M以上。本發(fā)明中使用的第1引物組和第2引物組優(yōu)選具備以下特征中的任一種(a):利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物為具有250以下個堿基的核酸(b):所述第I引物組的引物使用時的濃度為0.005pM以上0.2pM以下(優(yōu)選0.1pM以下)；或者(C):所述第2引物組的引物使用時的濃度為所述第1引物組的引物使用時的濃度的10倍以上50倍以下。通過具備這些特征，即使使用多種第1引物組，也可以維持特異性并擴(kuò)增所需量的靶序列。另外，還可以如后所述通過簡單的PCR步驟實施使用多種第1引物組的擴(kuò)增步驟。這里，構(gòu)成這些第1引物組和第2引物組的核酸分子只要是可以進(jìn)行基于堿基序列的雜交的核酸分子就沒有特別限定。雖然典型的核酸分子為DNA，可以采用DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、含有修飾堿基的人工核酸或肽核酸(PNA)中的任一種形態(tài)。另外，這樣的核酸分子還可以用多種熒光染料，熒光染料的淬滅劑等進(jìn)行修飾。(PCR步驟)使用第1引物組和第2引物組的PCR步驟中的反應(yīng)條件等沒有特別限定，只要可以利用第2引物組擴(kuò)增利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增的耙核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物即可。利用第1引物組的耙核酸的擴(kuò)增步驟和利用第2引物組對第1引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增的步驟可以分別以不同的"變性一退火一延伸"的循環(huán)來實施。例如，利用第1引物組的擴(kuò)增步驟可以在卯T以上97'C以下10秒60秒，在55。C以上65。C以下10秒~60秒，在7(TC以上75"C以下1秒~30秒的順序?qū)嵤Ａ硗?，例如，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為1個循環(huán)以上數(shù)個循環(huán)以下。這是因為，超過10個循環(huán)，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的增加程度停止變大。優(yōu)選為l或2個循環(huán)，更優(yōu)選為1個循環(huán)。另外，例如，利用第2引物組的擴(kuò)增步驟可以在90°C以上97'C以下實施0.5秒~5秒，在55。C以上65。C以下實施0.5秒5秒，在7(TC以上75X:以下實施l秒20秒。另外，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為20循環(huán)以上70循環(huán)以下。更優(yōu)選為30循環(huán)以上，進(jìn)一步優(yōu)選為40循環(huán)以上60循環(huán)以下。另外，利用第1引物組的擴(kuò)增步驟和利用第2引物組的擴(kuò)增步驟可以單一的"變性一退火一延伸"的PCR循環(huán)來實施。在將利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度設(shè)定為優(yōu)選250堿基以下、更優(yōu)選200堿基以下時，特別優(yōu)選將利用第2引物組的PCR反應(yīng)循環(huán)的條件設(shè)定為與利用第1引物組的PCR循環(huán)相同的條件。在這樣的情況下，可以通過同一條件的PCR循環(huán)使第1引物組和第2引物組分別有效地發(fā)揮作用，其結(jié)果，可以有效地得到利用第2引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，沒有必要另外實施用于第1引物組的PCR循環(huán)。如以上所述，通過將靶核酸置于DnaJ基因上，當(dāng)將利用多個第l引物組對多個靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為250堿基以下、優(yōu)選200堿基以下時，實施單一的PCR循環(huán)時，特別優(yōu)選實施多重PCR。通過將第1引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計在這樣的堿基長度上，不僅可以在利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增時抑制競爭，而且由于可以對所有的耙核酸賦予均等的擴(kuò)增條件，因此任一核酸均可以相同的檢測靈敏度進(jìn)行檢測。另外，通過在單一的PCR循環(huán)中使第1引物組和第2弓l物組都發(fā)揮作用，也適于諸如實時PCR的定量分析。使用單一的PCR循環(huán)，利用第1引物組及第2引物組實施擴(kuò)增步驟時，可以在90。C以上97。C以下0.5秒~5秒，在55°C以上65°C以下0.5秒5秒，在70'C以上75°。以下I秒~20秒的順序?qū)嵤?。另外，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為20循環(huán)以上70循環(huán)以下。更優(yōu)選為30循環(huán)以上60循環(huán)以下。另外，在這樣的PCR步驟中，第1引物組的引物濃度優(yōu)選為0.005pM以上0.2pM以下，所述第2引物組的引物濃度優(yōu)選為所述第1引物組的引物濃度的10倍以上50倍以下。在這樣的濃度范圍內(nèi)時，可以有效地擴(kuò)增耙核酸。另外，利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為250堿基以下的核酸時，包含具有相似序列的區(qū)域的可能性減少，并且可以在不引起擴(kuò)增的競爭的情況下增大靈敏度。將本發(fā)明適用于先前說明的細(xì)菌菌種的檢測方法時，優(yōu)選將所述(a)步驟設(shè)定為如下步驟，目卩，使用至少1種具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述DnaJ基因的一部分的堿基序列的第1引物組、和至少l種具有與第i引物組的所述標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組，進(jìn)行利用所述第1引物組擴(kuò)增所述DnaJ基因的至少一部分和利用第2引物組擴(kuò)增利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟實施聚合酶鏈反應(yīng)。由此，即使在有存在多個細(xì)菌菌種的可能性時，也可以少數(shù)實驗廣泛地檢測多個菌種是否存在。該情況下，通過將PCR步驟設(shè)定為實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)的步驟，可以將實驗進(jìn)一步簡略化。(利用多重PCR診斷病原微生物的方法)本發(fā)明的基于多重PCR診斷病原微生物的方法以選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)細(xì)、鏈球菌屬(Str印tococcus)細(xì)、沙雷菌屬(Serratia)細(xì)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)細(xì)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)細(xì)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)細(xì)、弧菌屬(Vibrio)細(xì)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)細(xì)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)、衣原體屬(Chlamydia)細(xì)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)細(xì)、支原體屬(Mycoplasma)細(xì)、利斯特氏菌屬(Listeria)細(xì)、沙門氏菌51(Salmonella)細(xì)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)細(xì)中的2種以上病原微生物為對象，該方法具備使用至少一種第1引物組和至少一種第2引物組對可能含有來自所述病原微生物的核酸的試驗樣品實施聚合酶鏈反應(yīng)的步驟，和檢測含有所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物所具有的DnaJ基因上的耙核酸的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。PCR步驟可以與上述類似操作來實施。特別優(yōu)選將PCR步驟為實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)的步驟。由此，可以迅速地診斷病原微生物。檢測步驟中，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法沒有特別限定。例如，可以通過使用諸如電泳的技術(shù)基于分子量進(jìn)行分離而檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，也可以使第2引物連接標(biāo)記化合物，然后利用Southern印跡法、微陣列法、微珠法(流式細(xì)胞術(shù))、核酸(DNA)色譜法基于雜交檢測靶核酸。根據(jù)本發(fā)明的診斷方法，通過具有所述PCR步驟，即使僅存在少量的靶核酸，也可以特異且檢測靈敏度良好地檢測耙核酸。即使使用多種引物組，利用多重PCR檢測靶核酸時，可以特異性良好，靈敏度良好且容易地檢測靶核酸。另外，由于靶核酸在DnaJ基因上，因此，在將盡可能地在不同的微生物的DnaJ基因上保守的序列選作退火序列，設(shè)計第l引物組時，第1引物組均勻地擴(kuò)增不同的DnaJ基因上的靶核酸，第2引物組均勻地擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以定量地擴(kuò)增耙核酸，因此可以定量靶核酸即微生物的量。該種定量分析也可以適用于其它靶核酸。例如，也適用于作為表達(dá)分析的產(chǎn)物的諸如mDNA或cDNA的耙核酸。(包含用于通過多重PCR擴(kuò)增至少1種病原微生物的靶核酸的引物組的試劑盒)本發(fā)明的試劑盒可以包括第1引物組和第2引物組，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物中的耙核酸的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。該檢測試劑盒中的第1引物組和第2引物組均可以適用已說明的本發(fā)明的擴(kuò)增方法中的第1引物組和第2引物組的實施方式。并且，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選具備以下特征中的任一種，所述特征為(a):利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物為250堿基以下的核酸(b):所述第1引物組的引物使用時的濃度為0.005pM以上0.2(LiM以下(優(yōu)選O.ULM以下)；或者(C):所述第2引物組的引物使用時的濃度為所述第1引物組的引物使用時的濃度的IO倍以上50倍以下。通過具備這些特征，不僅可以容易地擴(kuò)增或檢測少量的靶核酸，而且即使同時使用多種引物對，也可以可靠且高靈敏度地檢測靶核酸。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選在DnaJ基因上具有靶核酸。通過在DnaJ基因上具有靶核酸，即使利用第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物為200堿基以下的核酸，也可以設(shè)計不與其它擴(kuò)增產(chǎn)物競爭的擴(kuò)增產(chǎn)物。本檢測試劑盒優(yōu)選用于微生物的DnaJ基因上的靶核酸。如前面的解釋，這些微生物具有以下的表中所示的任一種微生物的DnaJ基因上的靶核酸時，優(yōu)選使用同一表中所示的正向引物和反向引物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>DnaJ基因的一部分序列是公知的。為了將DnaJ基因用作本發(fā)明中的靶核酸，需要得到高多態(tài)性的DnaJ基因中在菌種水平保守的序列和SNP多態(tài)性位點，但是這些序列和位點是未知的。本發(fā)明人等通過測定大量野生株的DnaJ基因的序列，以及鑒定菌種特異性保守的區(qū)域和SNP的位點，由此可以首先確定用于第1引物組的特異性探針的序列。另外，可以確定用于擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性探針的序列。本發(fā)明人從上述的內(nèi)容知曉了對于DnaJ基因，在分枝桿菌屬(Mycobacterium)中的菌種的菌株之間的多態(tài)性小于1%，在腸內(nèi)細(xì)菌科的菌種之間或鏈球菌屬(Streptococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的菌種之間的多態(tài)性為1~3%，另一方面，獨立的近緣菌種間存在5%以上的序列差異。本發(fā)明的試劑盒可以為用于檢測選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、沙雷菌屬(Serratia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)、支原體屬(Mycoplasma)、利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌(Salmonella)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)的1種或2種細(xì)菌菌種的引物對的試劑盒。優(yōu)選以將這些微生物的DnaJ基因上的一部分序列作為靶核酸的方式設(shè)計引物。引物的設(shè)計可以利用擴(kuò)增屬于上述這些屬的各種細(xì)菌菌種的菌種特異性部分的引物序列。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選組合對應(yīng)于這些待檢測對象中2種以上或3種以上細(xì)菌菌種的各DnaJ基因的引物對。本發(fā)明的試劑盒可以制備為用于檢測選自上述肺炎或咽炎的各種病原菌中的1種或2種以上細(xì)菌菌種的試劑盒。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以制備為用于檢測選自上述腹瀉和食物中毒的各種病原菌中的1種或2種以上細(xì)菌菌種的試劑盒。另夕卜，本發(fā)明的試劑盒還可以制備為用于檢測選自上述性病的各種病原菌中的1種或2種以上細(xì)菌菌種的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選使用這些待檢測的微生物中的部分DnaJ基因作為靶核酸。引物的設(shè)計可以利用屬于上述這些屬的各種病原菌的特定的引物序列。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選組合對應(yīng)于這些待檢測微生物中2種以上或3種以上菌種的各DnaJ基因的引物組。本發(fā)明的試劑盒可以能夠同時擴(kuò)增優(yōu)選3種以上、更優(yōu)選4種以上、進(jìn)一步優(yōu)選5種以上的微生物的靶核酸的方式構(gòu)成。例如，這樣的檢測試劑盒中優(yōu)選的靶菌種的組合，可以包含嗜衣原體屬(Chlamydophila)、衣原體屬(Chlamydia)、Coxiella屬、嗜血菌屬(Haemophilus)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、支原體屬(Mycoplasma)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、Bordetella屬、棒桿菌屬(Corynebacterium)、Bordetella屬、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、沙雷菌屬(Serratia)及埃希氏桿菌屬(Escherichia)的細(xì)菌。這樣的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定肺炎及咽炎的病原菌。另外，這樣的檢測試劑盒可以包含衣原體屬(Chlamydia)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、支原體屬(Mycoplasma)、尿素支原體(Ureaplasma)、念珠菌屬(Candida)、密螺旋體屬(Treponema)、毛滴蟲屬(Trichomonasa)及嗜血菌屬(Haemophilus)的細(xì)菌。這樣的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定性病和尿道感染的病原菌。進(jìn)一步，這樣的檢測試劑盒可以包含耶爾森氏菌屬(Yersinia)、埃希氏桿菌屬-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、沙門氏菌(Salmonella)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、賈第蟲屬(Giardia)、內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)、梭菌屬(Clostridium)及利斯特氏菌屬(Listeria)的細(xì)菌。這樣的試劑盒優(yōu)選用于檢測和鑒定食物中毒和腹瀉的病原菌。從以上所述出發(fā)，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種方法，該方法用于檢測選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)、支原體屬(Mycoplasma)、利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌(Salmondla)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細(xì)菌中的2種以上的細(xì)菌菌種，該檢測方法包括以下步驟(a)使可能含有待檢測細(xì)菌的核酸的試驗樣品和與待檢測的2種以上細(xì)菌菌種的DnaJ基因的至少一部分雜交的2種以上核酸分子接觸；以及b)檢測所述核酸分子是否與所述試驗樣品中的核酸雜交，其中，所述(a)步驟為如下步驟，即，使用至少1種具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述DnaJ基因的一部分的堿基序列的第1引物組、和至少1種具有與所述第l引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組，實施聚合酶鏈反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)，以及實施利用所述第1引物組擴(kuò)增所述DnaJ基因的至少一部分和利用所述第2引物組擴(kuò)增所述第1引物組獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟可以實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)。本發(fā)明還提供了一種用于檢測和鑒定2種以上細(xì)菌菌種的核酸分子試劑盒，其中所述2種以上細(xì)菌菌種選自鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、消化鏈球菌屬(PeptoSti-eptococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、軍團(tuán)菌屬(LegionelIa)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、螺桿菌屬(Helicobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)、嗜血菌屬(Haemophilus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌屬(Enterococcus)、諾卡爾菌屬(Nocardia)、普氏菌屬(Prevotella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Treponema)、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、利斯特氏菌屬(Listeria)、沙門氏菌(SalmonelIa)及耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細(xì)菌，所述試劑盒包含與所述待鑒定細(xì)菌的DnaJ基因的至少一部分雜交的核酸分子。另外，在該試劑盒中，所述核酸分子包含至少1種具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述DnaJ基因的一部分的堿基序列的第1引物組、和至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組。并且，本發(fā)明還可以采用構(gòu)成這樣的核酸分子試劑盒的2種以上核酸分子被固定的固相體的形式。實施例1葡萄球菌屬(Staphylococcus)的金黃色葡萄球菌(S.aureus)是導(dǎo)致食物中毒的重要菌種，已知對于16SrDNA而言，與近緣菌表皮葡萄球菌(S.epidermides)的相似性為99.5%(圖1A)，從而不可能設(shè)計菌種特異性的引物，但是對于DnaJ基因而言，這兩個菌種的相似性僅有81.1%(圖1B)。因此，可以容易地針對DnaJ基因設(shè)計引物。并且，該引物序列在已經(jīng)確定序列的11株金黃色葡萄球菌(S.aureus)間較保守(圖2)。在本實施例中，以引起食物中毒的9種病原菌種的已測定的DnaJ序列為基礎(chǔ)，制備這些病原體的引物。各病原體的引物序列如下。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)用引物SEGIDNO:13:5-GGACAAGGATTCAATGGCTCTSEQIDNO:14:5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)用引物SEQIDNO:67:5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAACSEQIDNO:68:5-CTTTGGACAAGTTTGAAG霍亂弧菌(Vibriocholerae)用引物SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:44:5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)用引物SEQIDNO:43:5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGASEQIDNO:50:5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG大腸桿菌(Eschedchiacoli)用引物SEQIDNO:21:5-TGTTGAGCGCAGCAAAACSEQIDNO:22:5-CAAGACGGATGCGGTCTC單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)用弓|物SEQIDNO:135:GTACAAGCTACATTAGGTGACSEQIDNO:136:GTTCGTTTGAAAATTCCAAGT(或者SEQIDNO:137:GGACAACACCTGAAAAATGTSEQIDNO:138:AATGGGGTATTTTGTTCCACGT;)腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)用引物SEQIDNO:139:AAATCAAAAAGGCGTACAAGSEQIDNO:140:GAGATTAAAGCAGCCTACGA耶爾森氏菌(Yersiniaspp)用引物SEqIDNO:141:CGTTCAGGTACAAGTCAAGGSEQIDNO:142:GTGAGGTTCCTATTAACTTTGC(或者小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)用弓I物SEQIDNO:143:TACGCGGTGTGACTAAAGAASEQIDNO:144:TATGTACCTGACCTGCACCA)58產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)用引物(其中，以16SrDNA作為靶核酸)SEQIDNO:145:GGTGCTTCAGATGATGAGSEQIDNO:146.'GGAGATAAGGAAGCGGAA將上述各種引物按以下方式混合，制備包含這9種個菌種的所有引物組的引物溶液A，再制備以下的PCR反應(yīng)溶液。引物溶液A(各引物l^M):2^12XCYBER預(yù)混合HotstartExTaq(Takara):10pi金黃色葡萄球菌(S.aureus)DNA(GTC250株)5ng加蒸餾水使總量為20^1。這里，作為對照，僅使用金黃色葡萄球菌(S.aureus)的引物，制備引物溶液B，再制備以下的PCR反應(yīng)溶液。引物溶液B(各引物lpM):2pl2XCYBER預(yù)混合HotstartExT叫(Takara):lOpl金黃色葡萄球菌(S.aureus)DNA(GTC250株)5ng加蒸餾水使總量為20pl。在各個LightCycler(羅氏公司)的毛細(xì)管中加入上述各PCR反應(yīng)溶液連同試劑，用LightCycler對上述基因進(jìn)行擴(kuò)增(95t::l秒鐘，55°C:l秒鐘，72°C:10秒鐘，進(jìn)行50個循環(huán))。結(jié)果示于圖3。以引物溶液A進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和以引物溶液B進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物確認(rèn)最終以幾乎相同的擴(kuò)增效率擴(kuò)增。即，利用包含9種引物組的引物混合物和單獨的引物組進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增效率的水平相同，表明各個引物組可以分別不相互干涉地擴(kuò)增目的菌的DnaJ基因的特定序列。實施例2代替實施例1中使用的金黃色葡萄球菌(S.aureus)的DNA，使用下述菌株的DNA，在同樣的條件下使用混合的引物組。用CYBR綠色熒光強(qiáng)度的增加監(jiān)測用LightCycler(羅氏公司)的毛細(xì)管進(jìn)行擴(kuò)增的DNA。結(jié)果示于圖4。1.空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)GTC0259型株2.霍亂弧菌(Vibriochoierae)GTC003701ElTol型3.副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)GTC0056(=CDCA3308)4.大腸桿菌(Escherichiacoli)GTC10610157(VT1和VT2陽性)5.單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)GTC0149(-ATCC15313)型株6.Salmonellaentericavar.TyphimuriumGIFU11566ST-17.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)GTC0127型株8.產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)GTC0785(=ATCC13124)如圖4所示，確認(rèn)，各菌的DNA利用混合引物溶液A中的菌種特異性引物組進(jìn)行擴(kuò)增。證實了這各個引物組可以分別不相互干涉地擴(kuò)增目的菌的DnaJ基因的特定序列。實施例3(弧菌屬(Vibrio)菌的DnaJ基因的擴(kuò)增)弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌的通用正向引物(SEQIDNO:43)和同一屬內(nèi)的下述以外的菌種特異性反向引物混合而得到的引物溶液按以下方式制備?；【鷮?Vibrio)通用的引物(SEQIDNO:43)2jiM60霍亂弧菌(Vibriocholerae)(SEQIDNO:44)l(iM擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)(SEQIDNO:47)ljuM創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)(SEQIDNO:53)lpM河流弧菌(Vibriofluvialis)(SEQIDNO:134)ljiM副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)(SEQIDNO:50)lpM溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)(SEQIDNO:58)lpM此外，將該引物溶液按以下方式制備PCR反應(yīng)溶液。引物混合溶液(正向2pM、反向各ljuM):2jxl2XCYBER預(yù)混合HotstartExTaq(Takara):10|iil各弧菌的DNA(単獨)5ng加水使總量為20^1?；魜y弧菌(Vibriocholerae)GTC003701E1Tol型擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)GTC0334型株創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)GTC0116型株河流弧菌(Vibriofluvialis)GTC0315型株副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)GTC0056(=CDCA3308)溶藻弧菌(Vibrioaginolyticus)GTC0057(=ATCC17449)型株在各個LightCycler(羅氏公司)用的毛細(xì)管中加入上述PCR反應(yīng)溶液連同試劑，用LightCycler對基因進(jìn)行擴(kuò)增(95'C:1秒鐘，55°C:1秒鐘，72°C:10秒鐘，進(jìn)行50循環(huán))。用瓊脂電泳確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果示于圖5。如圖5所示，可以得到各個菌種所預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。即，這證實各個引物可以不相互干涉地擴(kuò)增目的菌的DnaJ基因的特定序列。61實施例4(弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌中的DnaJ基因擴(kuò)增的檢測靈敏度和特異性擴(kuò)增)使用實施例3中制備的引物溶液，與使用用糞便稀釋的樣品比較霍亂弧菌(Vibriocholerae)GTC0037株的檢測靈敏度。將霍亂弧菌(Vibriocholerae)GTC0037株的菌液與生理鹽水及10。/。的糞便混懸液混合，用酚-氯仿法提取DNA。連續(xù)稀釋提取的核酸，代替實施例3的PCR反應(yīng)溶液中的DNA，使用該核酸實施PCR反應(yīng)，用電泳法比較基因擴(kuò)增的靈敏度。結(jié)果示于圖6。如圖6所示，定量稀釋DNA，測定檢測靈敏度，在圖中所示的檢測水平檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，將霍亂弧菌的DNA與從正常人的糞便中提取得到的DNA混合，測定檢測靈敏度，其結(jié)果證實檢測靈敏度達(dá)到與用蒸餾水進(jìn)行稀釋時相同的水平。由以上可知，該引物溶液中的各引物組即使在來自糞便的夾雜物的存在下，也可以特異性地擴(kuò)增各目的菌種的DnaJ基因的特定區(qū)域，并且可以高靈敏度檢測菌種。實施例5(性病的病原菌種的DnaJ基因的擴(kuò)增及鑒定)混合基于性病診斷中使用的菌種的DnaJ基因的特定區(qū)域而設(shè)計的引物，制備引物溶液。Mycoplasmagenitarium用引物(SEQIDNO:71、72)沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)用引物(SEQIDNO:75、76)淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)用引物(SEQIDNO:79、80)這里，對于以下菌種，基于不是DnaJ基因的基因的特定區(qū)域設(shè)計引物。尿素支原體(Ureaplasmaspp.)用引物(Tuf基因)62SEQIDNO:147:GGATGGTGCAATCTTAGTTATTSEQIDNO:148:ACTTGACGCGCTAATAGG蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)用引物(16SrDNA基因)SEQIDNO:149:TGGGGATAGCCTCTAGAAATAGSEQIDNO:150:CCCTTTCCTCTCAAAGACCT單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus)用弓l物(糖蛋白(Glycoprotein^蛋白基因)SEQIDNO:151:CTGGTCAGCTTTCGGTACGSEQIDNO:152:CCGCAGCTCGTTGTTCTC乳頭瘤病毒(Papillomavirus)用引物(蛋白E6基因)SEQIDNO:153:TCAAAAGCCACTGTGTCCTSEQIDNO:154:CGACCCCTTATATTATGGAATCTT白色念珠菌(Candidaabicans)用引物(26SrDNA基因)SEQIDNO:155:TCAGTAGCGGCGAGTGAASEQIDNO:156:GCCCAAAGATACCTTCTTCAAAT陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)用引物(18SrDNA基因)SEQIDNO:157:GAAATCATAGTTCTTGGGCTCTGSEQIDNO:158:CCTTCCGTCAATTCCTTCAAG將上述各引物按下述要點進(jìn)行混合，制備PCR反應(yīng)溶液。引物溶液(各引物lpM):2^12XCYBER預(yù)混合HotstartExTaq(Takara):10|il各菌株的DNA:5ng加水使總量為2(Hil。在各個LightCycler(羅氏公司)用的毛細(xì)管中加入上述PCR溶液連同試劑，用LightCycler進(jìn)行基因擴(kuò)增(95'C:1秒鐘，55°C:1秒鐘，72°C:10秒鐘，進(jìn)行50個循環(huán))。該實驗中使用下述菌株。通過CYBR綠色熒光強(qiáng)度的增加監(jiān)測LightCyder(羅氏公司)的毛細(xì)管中擴(kuò)增的DNA，結(jié)果示于圖7。[所使用的菌株]1MycoplasmagenitariumGGS2289(來自臨床樣品的克隆)2沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)GGS922(來自臨床樣品的克隆)3淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)GTC02085(-ATCC49226)4,尿素支原體(Ureaplasmaspp.)GGS1699(來自臨床樣品的克隆)5蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)GGS745(來自臨床樣品的克隆)6單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus)GGS1943(來自臨床樣品的克隆)7乳頭瘤病毒(Papillomavirus)GGS1944(來自臨床樣品的克隆)8白色念珠菌(Candidaalbicans)GTC00654(=IFM5801)9陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)GGS1941(來自臨床樣品的克隆)GTC:岐阜典型培養(yǎng)物保藏中心GGS:岐阜重組株保藏中心ATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國NCTC:英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，英國IFM:致病真菌與微生物毒素癥研究中心，千葉大學(xué))如圖7所示，擴(kuò)增了各菌株的DNA。即，可知這各個引物可以不相互干涉地擴(kuò)增目的菌的DnaJ基因的特定序列。實施例6(肺炎和咽炎的病原體菌種的DnaJ基因的擴(kuò)增及鑒定)將基于引起肺炎和咽炎的病原體菌種的DnaJ基因的特定區(qū)域而設(shè)計的引物混合在一起，制備引物溶液。肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)用引物(SEQIDNO:9、10)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)用引物(SEQIDNO:1、2)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)用引物(SEQIDNO:13、14)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)用引物(SEQIDNO:17、18)大腸桿菌(Escherichiacoli)用引物(SEQIDNO:21、22)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)用引物(SEQIDNO:25、26)月巿炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)用引物(SEQIDNO:39、40)嗜肺軍團(tuán)菌(LegioneIlapneumophila)用引物(SEQIDNO:35、36)肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)用引物(SEQIDNO:31、32)分枝桿菌屬(Mycobacterium)組用引物(SEQIDNO:29、30)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)GTC01147(=NCTC7465)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)GTC01839金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)GTC02805肺炎克雷白氏桿菌(KlebsielIapneumoniae)GTC00107(=NCTC9633)大腸桿菌(Escherichiacoli)GTC09975(=ATCC25868)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)GTC12850(=ATCC27294)月巿炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)ATCCVR145嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC00702(=ATCC33737)月巿炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)GTC00666(-ATCC15531)鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)GTC00603(=ATCC25291)GTC:岐阜典型培養(yǎng)物保藏中心GGS:岐阜重組株保藏中心ATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國NCTC:英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，英國IFM:致病真菌與微生物毒素癥研究中心，千葉大學(xué))將上述各引物按下述要點進(jìn)行混合，制備PCR反應(yīng)溶液。引物溶液(各引物lpM):2|ul2XCYBER預(yù)混合HotstartExTaq(Takara):10|nl各菌株的DNA:5ng加水使總量為20pl。在各個LightCycler(羅氏公司)用的毛細(xì)管中加入試劑，用LightCycler對上述PCR反應(yīng)溶液進(jìn)行基因擴(kuò)增(95。C:1秒鐘、55°C:l秒鐘、72°C:IO秒鐘，進(jìn)行50循環(huán))。該實驗中使用上述菌株DNA。用瓊脂電泳確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其結(jié)果，可知，這些引物對可以分別特異性地擴(kuò)增目的菌種的DnaJ基因的特定區(qū)域，并且可以高靈敏度地檢測菌種。實施例7(分枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌的菌種的DnaJ基因的擴(kuò)增及通過測序進(jìn)行的鑒定)用Primerworking法對分枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌55個菌種3個亞種的標(biāo)準(zhǔn)株的DnaJ基因的幾乎整個區(qū)域進(jìn)行測序(示于圖8)，并且將利用SEQIDNO:29、30、131、132及133獲得的386bp的擴(kuò)增序列和幾乎整個區(qū)域的188bp二者來比較序列。將其結(jié)果與已分析了的既有基因RpoB進(jìn)行比較。結(jié)果示于圖9和10。如圖9和IO所示，對于16SrDNA序列平均相似性為96.6%的，dnaJ基因序列平均相似性為80.7%，相比rpoB、hsp65的相應(yīng)值90.0~90.7%的相似性，多態(tài)性最高。另外，堪薩斯氏分枝桿菌-胃分枝桿菌(M.kansasii-M.gastri)的16SrDNA序列的相似性為100%，不能區(qū)別開來(圖11)，比較DnaJ基因時，堪薩斯氏分枝桿菌-胃分枝桿菌(M.kansasii-M.gastri)具有95.5%的相似性。因此，基于生化特性，用上述SEQIDNO:29、30、131、132及133擴(kuò)增23個堪薩斯氏分枝桿菌(M.kansasii)(20株)和胃分枝桿菌(M.gastri)(2株)的臨床分離株(KPM號株)，使用已經(jīng)測序的所有標(biāo)準(zhǔn)株的序列，制作系統(tǒng)發(fā)生樹。其結(jié)果，如圖12所示，所有的株與用生化特性進(jìn)行鑒定的結(jié)果相同。另外，由于鳥分枝桿菌(M.avium)與胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracelluIare)的生化特性相似，難以識別，因此，與統(tǒng)稱為鳥分枝桿菌-胞內(nèi)分枝桿菌(M.avium-M.intracellulae)組(MAC組)的16株臨床分離株(圖中的KPM株)進(jìn)行類似的測定序列并進(jìn)行比較。其結(jié)果示于圖13。如圖13所示，9株為鳥分枝桿菌(M.avium)，3株為胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)，3株被鑒定為新分類的M.chimaera、1株被鑒定為淋巴結(jié)核分枝桿菌(M.scrofulaceum)。由以上可知，以該全部堿基序列及部分序列進(jìn)行鑒定的方法對于以生化特性不能識別的菌群的正確鑒定是有效的。實施例8本實施例中，以嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNA作為耙核酸，實施多重PCR。作為引物，準(zhǔn)備18組帶有標(biāo)記的退火引物的混合物(正向引物(SEQIDNO:118)及反向引物(SEQIDNO:1936)(均帶有標(biāo)記)各最終濃度為O.lpM)和具有與這些退火引物帶有的各個標(biāo)記相同的序列的擴(kuò)增引物組的混合物(含有正向引物(SEQIDNO:37)及反向引物(SEQIDNO:38)(均僅為標(biāo)簽)各最終濃度為0.1|lM)。這些引物的序列示于圖15。使用這些引物混合液及DNA溶液(嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNAlpg/ml)，按照以下組成制備PCR反應(yīng)溶液，使用LightCycler(羅氏公司)，按照以下條件實施PCR反應(yīng)。作為比較例，制備含有將從上述18種引物組的正向引物中5'末端除去18堿基的標(biāo)記序列的退火引物、和從反向引物的5'末端除去了27堿基的標(biāo)記序列的退火引物的沒有標(biāo)簽的退火引物的混合液(正向引物及反向引物(均沒有標(biāo)簽)各最終濃度為O.lpM)，按照以下組成制備PCR反應(yīng)溶液，與實施例同樣操作進(jìn)行PCR。擴(kuò)增監(jiān)測結(jié)果示于圖16。(實施例8的PCR反應(yīng)溶液的組成)2XSYBR預(yù)混合ExTaq(Takara):lO)iil引物混合液(正向引物、反向引物各l)iM):2pl擴(kuò)增引物混合液(正向引物、反向引物各10^M):2|Lll嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNA(lng/ml):dH20:5fi1總量20|ll(比較例的PCR反應(yīng)溶液的組成)2XSYBR預(yù)混合ExTaq(Takara):lOpl引物混合液(正向引物、反向引物各lpM):2^1嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNA(lng/ml):l^ildH20:7)Lil總量20^1(反應(yīng)條件)95°C:l秒鐘，60°C:l秒鐘，72°C:5秒鐘60個循環(huán)如圖16所示，利用實施例8的帶標(biāo)簽的引物組和擴(kuò)增引物組，對嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)GTC1279DNA而言，在大約3568循環(huán)后擴(kuò)增信號開始增加，在40大約循環(huán)后表現(xiàn)出良好的檢測靈敏度。相對于此，在未使用擴(kuò)增引物的比較例中，即使50循環(huán)后，靶核酸也完全不擴(kuò)增。由以上可知，通過使用具有選擇性退火到靶核酸的退火序列的退火引物和標(biāo)記序列和具有與該退火引物的標(biāo)記序列相同的標(biāo)記序列的擴(kuò)增用引物，即使使用多種引物組，也可以充分地擴(kuò)增特定的靶核酸。實施例9本實施例中，使實施例8中制作的帶標(biāo)記的退火引物與擴(kuò)增引物的配合比率如表2所示在1:11:50內(nèi)進(jìn)行變化，在如以下所示制備PCR反應(yīng)溶液的同時按照以下條件實施PCR。這里，作為靶核酸，使用肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)GTC2987DNA。作為比較例，使用現(xiàn)有技術(shù)的單獨的引物溶液(4pm、8pM)，按照以下組成制備PCR反應(yīng)溶液，在與實施例相同的條件下實施PCR。結(jié)果示于圖17。這里，單獨的引物是從肺炎支原體(Myc叩lasmapneumoniae)16SrDNA的正向引物及反向引物中除去標(biāo)記序列后的序列。表2引物混合物混合比率No.l退火0.5|iM:2|il擴(kuò)增標(biāo)記(0.5nM)2|d1:1No.2退火0.5pM:2^1擴(kuò)增標(biāo)記(2.5iiM)2|il1:5No.3退火0.5pM:2^1擴(kuò)增標(biāo)記(5pM)2|il1:10No.4退火0.5pM:2ji1擴(kuò)增標(biāo)記(10MM)2pl1:20No,5退火0.5pM:2^1擴(kuò)增標(biāo)記(20^iM)2|lU1:40No.6退火0.5jiM:2|til擴(kuò)增標(biāo)記(25pM)2pl1:50(實施例9的PCR反應(yīng)溶液的組成)2XSYBR預(yù)混合HotStart(Takara):lOpl肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)GTC2987DNA(lng/ml):l|til引物混合液4pl69dH20:5^1總量2(^1(比較例的PCR反應(yīng)溶液的組成)2XSYBR預(yù)混合HotStart(Takara):10pl肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)GTC2987DNA(lng/ml):單獨引物^4^M、8pM)混合液4^1dH20:5pi總量20^11(反應(yīng)條件)95'C:l秒鐘，60°C:l秒鐘，72°C:5秒鐘60個循環(huán)如圖17所示，伴隨著擴(kuò)增引物與退火引物的比率的上升，擴(kuò)增效率增大，當(dāng)該比率為IO倍以上時，表現(xiàn)出與使用0.4pM濃度的單獨的引物進(jìn)行擴(kuò)增時相同的擴(kuò)增效率。實施例10本實施例中，以將圖18及圖19所示的腹瀉的細(xì)菌性病原微生物及病毒性病原體所具有的基因的指定區(qū)域作為靶核酸的退火引物和擴(kuò)增引物的混合比率設(shè)定為1:50的方式，按照以下組成制備PCR反應(yīng)溶液，同時在以下反應(yīng)條件下實施PCR。實施PCR后，使PCR產(chǎn)物與裝載有圖20所示的探針的硅片(東洋鋼板制)在55'C下雜交30分鐘。雜交后，洗滌硅片，用激光掃描ScanArray4000(GSILumonics社制)測定Cye5的熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖21。這里，圖21還表示出了點化的探針的位置信息。(實施例10的PCR反應(yīng)溶液的組成)2XSYBR預(yù)混合HotStart(Takara):10^1霍亂弧菌(Vibriocholerae)DNA(1ng/ml):腺病毒(Adenovirus)DNA(lng/ml):lfil退火引物混合液(各0.2)iM):2^1擴(kuò)增引物混合液(各IOhM):2^1dH20:4|lU總量20^1(反應(yīng)條件)95°C:l秒鐘，60°C:1秒鐘，72°C:5秒鐘60個循環(huán)如圖21所示，即使包含49種退火引物組，也可以分別特異性良好且靈敏度良好地檢測2種靶核酸。實施例11本實施例中，制備圖22所示的16種性病(STD)用退火引物組的混合物(各引物最終濃度0.02pM)及擴(kuò)增引物組混合液(各10pM)，如以下所示，以擴(kuò)增引物與退火引物的比率為20的方式，按以下組成制備PCR反應(yīng)溶液，按照以下條件實施PCR。擴(kuò)增反應(yīng)后，向PCR產(chǎn)物加入結(jié)合有圖23所示的探針的Luminax公司的熒光珠及抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(Streptavidin-phycoerythrin)，并在室、溫下反應(yīng)30分鐘，用Luminax公司的Luminax100熒光測定系統(tǒng)測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖24。如圖24所示，PCR反應(yīng)溶液中所含的唯一的靶核酸與Chlamydiatoracomatis的探針以高特異性結(jié)合。由以上可知，PCR產(chǎn)物中，該靶核酸特異性地擴(kuò)增。實施例12本實施例中，制備圖25所示的4種引物混合物。圖25所示并在本實施例中使用的各引物為具有已提及的序列的引物。使引物PCR反應(yīng)溶液中包含圖25所示的各菌種的DNA各200pg/ml、各退火引物0.075pM、各擴(kuò)增引物0.8nM、16SrDNA通用引物0.2pM。這里，DNA聚合酶使用SYBR預(yù)混合HotStart(TaKaRa)。對于該P(yáng)CR反應(yīng)溶液，每個循環(huán)在95'C下加熱1分鐘后，進(jìn)行95"C:l秒鐘，55°C:1秒鐘，72'C:10秒鐘的循環(huán)50次。結(jié)果(CTm值)示于圖26。這里，CTm值是達(dá)到進(jìn)行一次微分時變?yōu)閿U(kuò)增曲線的一半峰值的熒光強(qiáng)度等信號時的PCR循環(huán)數(shù)?？梢哉fCTm值越小，擴(kuò)增效率越好。如圖26所示，相對于以16SrDNA基因作為耙核酸、用包含退火引物和擴(kuò)增引物的引物混合物A實施PCR時CTm值為約40~46，用以16SrRNA的通用序列作為反向引物的引物混合物B實施PCR時，觀察到CTm值有降低的傾向。即，以16SrRNA作為靶核酸來設(shè)計退火引物時，即使混合8種系統(tǒng)發(fā)生不同的菌種的引物，擴(kuò)增效率與對照例相比反而也具有降低的傾向。因此，可知16SrRNA是不適合作為本發(fā)明的多重PCR的靶核酸的。相對于此，由混合引物C及D的結(jié)果可以明確，在以DnaJ基因為靶核酸、使用退火引物和擴(kuò)增引物時，即使存在多個其它的引物(共18種)，也可以特異性地將引物退火到靶序列而有效地擴(kuò)增。因此，可知DnaJ基因作為這樣的多重PCR的耙核酸是有用的。序列表SEQIDNO:1~86、131、132、133、135158、159~294及326357:引物SEQIDNO:87~130、134、295~325及358-367:探針權(quán)利要求1.一種檢測細(xì)菌的菌種的方法，其中以選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的2種以上細(xì)菌菌種為檢測對象，包括以下步驟(a)使可能含有檢測對象細(xì)菌的核酸的試驗樣品和與待檢測的2種以上菌種的DnaJ基因的至少一部分雜交的2種以上核酸分子接觸，以及(b)檢測所述核酸分子是否與所述試驗樣品中的核酸雜交。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中細(xì)菌的菌種是選自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、月巿炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、月市炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、月巿炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)、Mycoplasmagenitarium、霍舌L弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae),蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、沙目艮衣原體(Chlamydiatrachomatis)、月巿炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)及空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)的2種以上細(xì)菌菌種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中的檢測對象為選自克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的2種以上細(xì)菌菌種。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的檢測方法，其中所述核酸分子包含通過將屬于同一菌種的菌株的DnaJ基因的堿基序列比對提取出來的1種或2種以上的菌種特異的堿基序列或與該堿基序列基本上相同的堿基序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的檢測方法，其中，所述(a)步驟使用至少1種具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述DnaJ基因的一部分的堿基序列的第1引物組，和至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組實施聚合酶鏈反應(yīng)，并利用所述第1引物組擴(kuò)增所述DnaJ基因的至少一部分以及利用第2引物組擴(kuò)增利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增方法，其中，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)。7.根據(jù)權(quán)利要求16任一項所述的檢測方法，其中，所述細(xì)菌包含化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:1~4及SEQIDNO:89~90中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相詞的堿基序列；所述所述細(xì)菌包含無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:58及SEQIDNO:91-92中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:9~12及SEQIDNO:93~94中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:13~I6及SEQIDNO:97~98中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:17-19及SEQIDNO:109和110中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含大腸桿菌(Escherichiacoli)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:2124及SEQIDNO:101和102中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)時'，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:25~28及SEQIDNO:103104中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含除結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)組以外的分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:29~30及SEQIDNO:131~133中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:35~38及SEQIDNO:115~116中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含霍亂弧菌(Vibriocholerae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:4346及SEQIDNO:127~128中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:4749及SEQIDNO:125~126中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:50-52及SEQIDNO:123-124中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)時，所述核酸分子包含SEQIDNO:43、SEQIDNO:5355及SEQIDNO:119~120中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含河流弧菌(Vibriofluvialis)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:134、SEQIDNO:5657及SEQIDNO:117~118中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:43、SEQIDNO:5860及SEQIDNO:121~122中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:6166及SEQIDNO:87~88中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:67~70及SEQIDNO:129130中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:83~86及SEQIDNO:111~112中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:79~82及SEQIDNO:113~114中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:75~78及SEQIDNO:109~110中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含肺炎嗜衣原體(Chlamydophilapneumoniae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:3942及SEQIDNO:107108中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含Mycoplasmagenitarium時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:71~74及SEQIDNO:105~106中的l種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列；所述細(xì)菌包含肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)時，所述核酸分子包含選自SEQIDNO:31~34及SEQIDNO:9596中的1種或2種以上堿基序列或與其基本上相同的堿基序列。8.—種用于檢測和鑒定細(xì)菌的核酸分子試劑盒，其中，選自鏈球菌屬(Streptococcus)菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、消化鏈球菌屬(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、螺桿菌屬(Helicobacter)菌、棒桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌、伯霍爾德桿菌屬OBurkholderia)菌、嗜血菌屬(Haemophilus)菌、擬桿菌屬(Bacteroides)菌、腸球菌屬(Enterococcus)菌、諾卡爾菌屬(Nocardia)菌、普氏菌屬(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌屬(Moraxdla)菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)菌、梭菌屬(Clostridium)菌、密螺旋體屬(Treponema)菌、鞘氨醇桿菌(Sphingob'acterium)菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的2種以上細(xì)菌菌種為檢測和鑒定對象，其中該試劑盒包含與所述鑒定對象細(xì)菌的DnaJ基因的至少一部分雜交的核酸分子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述核酸分子包含至少1種具有標(biāo)記序列和與所述DnaJ基因的一部分選擇性雜交的堿基序列的第1引物組，和至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組。10.—種固相體，其中，固定化有選自構(gòu)成權(quán)利要求8或9所述的核酸分子試劑盒的核酸分子的2種以上的核酸分子。11.一種擴(kuò)增至少1種靶核酸的方法，該方法包括以下步驟使用至少1種具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述靶核酸的一部分的堿基序列的第1引物組，和至少1種具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列的第2引物組實施聚合酶鏈反應(yīng)，所述聚合酶鏈反應(yīng)歩驟實施利用所述第1引物組擴(kuò)增所述耙核酸和利用所述第2引物組擴(kuò)增利用所述第1引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述第1引物組以微生物的DnaJ基因的一部分作為耙核酸。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的擴(kuò)增方法，其中，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的擴(kuò)增方法，其中，所述第2引物組的引物濃度為所述第1引物組的引物濃度的10倍以上50倍以下。14.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的擴(kuò)增方法，其中，所述第l引物組的引物濃度為0.005|iM以上O.lpM以下，所述第2引物組的引物濃度為所述第I引物組的引物濃度的IO倍以上50倍以下，利用所述第2引物組進(jìn)行擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為250個以下堿基的核酸，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)。15.根據(jù)權(quán)利要求1114任一項所述的擴(kuò)增方法，其中，所述第1引物組將選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、沙雷菌屬(Serratia)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)"、分豐支豐干菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的2種以上細(xì)菌菌種的DnaJ基因的一部分作為耙核酸。16.—種利用多重PCR診斷病原微生物的方法，所述病原微生物為選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、沙雷菌屬(Serratia)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的2種以上，該方法包括使用至少一種第1引物組和至少一種第2引物組對可能含有來自所述病原微生物的核酸的試驗樣品實施聚合酶鏈反應(yīng)，和檢測含有所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物所具有的DnaJ基因上的靶核酸的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述聚合酶鏈反應(yīng)步驟實施單一的PCR反應(yīng)循環(huán)。18.—種試劑盒，包含用于通過多重PCR擴(kuò)增至少1種病原微生物的靶核酸的引物組，該試劑盒含有第1引物組和第2引物組，所述第1引物組具有標(biāo)記序列和選擇性退火到所述病原微生物所具有的DnaJ基因上的靶核酸的堿基序列，所述第2引物組具有與所述第1引物組的標(biāo)記序列基本上相同的標(biāo)記序列。全文摘要本發(fā)明公開了一種以簡單方式檢測細(xì)菌的菌種的方法。具體來說，本發(fā)明公開了檢測細(xì)菌的菌種的方法，該方法可以檢測出選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌、鏈球菌屬(Streptococcus)菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)菌、埃希氏桿菌屬(Escherichia)菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌、軍團(tuán)菌屬(Legionella)菌、弧菌屬(Vibrio)菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)菌、衣原體屬(Chlamydia)菌、嗜衣原體屬(Chlamydophila)菌、支原體屬(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌屬(Listeria)菌、沙門氏菌屬(Salmonella)菌及耶爾森氏菌屬(Yersinia)菌中的至少一種細(xì)菌菌種，并且該方法包括以下步驟(a)使可能含有被檢測細(xì)菌菌種的核酸的試驗樣品和能夠與被檢測的細(xì)菌菌種的DnaJ基因的至少一部分雜交的核酸分子接觸；和(b)檢測所述核酸分子和所述試驗樣品中所含的核酸是否存在雜交。文檔編號C12Q1/68GK101558168SQ20078004474公開日2009年10月14日申請日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月3日發(fā)明者吉田滋,大楠清文,江崎孝行申請人:國立大學(xué)法人岐阜大學(xué);Amr株式會社