專利名稱：：用于連續(xù)快速熱循環(huán)系統(tǒng)的方法用于連續(xù)快速熱循環(huán)系統(tǒng)的方法本申請要求享有2006年10月6日提交的、標題為"UseofPluronicF-127blockcopolymersurfactant,PluronicF-68，andPluronicF-108NFinanon-staticDNAamplificationsolution(普朗尼克F-127嵌段聚合物表面活性劑、普朗尼克F-68和普朗尼克F-108NF在非靜態(tài)DNA擴增溶液中的用途)"的美國臨時專利申請?zhí)?0/850,103的優(yōu)先權。簡介聚合酶鏈式反應(PCR)是一種三步方法，通常被設計用于診斷、鑒定或法醫(yī)目的。第一步，DNA或類似分子在約94-96攝氏度(C)的溫度下被變性，也被稱為裂解、分離或解開。第二步，第一步中產生的鏈在約55-60。C的溫度下與聚合酶起始子即引物反應物退火，也被稱為引發(fā)或雜交。第三步，在大約70-73。C下，隨著單個核苷酸石威基的添加，使上述引發(fā)的單鏈DNA通過引物延伸來合成復制本DNA。更新的PCR方法也可以使用兩個溫度帶的操作。PCR裝置通常通過批量方法工作，其中將含有單獨等分量的反應物的多孔板從一個溫度環(huán)境物理轉移到另一個溫度環(huán)境以完成循環(huán)。可選擇地，一組盒、微瓶、管或其他容器通過固定的一系列恒溫箱?？蛇x擇地，將管置于一個模塊中，該模塊可以被加熱和冷卻以改變所述模塊內的盒、微瓶、管或其他容器包含的液體反應物的溫度。更詳細地來說，在世界范圍內專業(yè)研究人員廣泛使用PCR作為擴增小鏈DNA的手段，所擴增的量足以用于檢測和鑒定。通常，PCR是利用自動熱循環(huán)儀實施的，所述自動熱循環(huán)儀交替加熱和冷卻眾多包含PCR反應混合物的小管。這類過程利用具有不連續(xù)的受限空間的靜態(tài)反應器，在該空間中當按照重復順序暴露于不同的溫度時，反應發(fā)生。所述過程是時間密集型、勞動密集型和低效的，因為必須分別給管子填裝反應物，密閉，通過自動循環(huán)儀處理，打開，并最終倒出含有所需擴增DNA的反應產物。因此，開發(fā)出連續(xù)的熱循環(huán)儀，通過利用動態(tài)反應器以避免需要利用許多小管通過PCR擴增DNA。連續(xù)的熱循環(huán)儀不是利用小管，而是利用恒量或連續(xù)流的流體，所述液體重復通過不同的溫度帶以擴增DNA。連續(xù)熱循環(huán)-f義的一個實例^^開于1993年12月14日i受^l的Corbett等的美國專利號5，270，183。Corbett等人公開了用于DNA擴增的裝置和方法，其中將PCR反應混合物注入載液(PCR反應混合物與其不混溶)，然后載液穿過多個溫度帶以促進PCR反應混合物內的DNA擴增。因此，各個反應混合物被大量載液分離。該裝置的功能是加速處理不連續(xù)的槽或塞中含有的多種不同DNA鏈，因此需要與PCR反應混合物不混溶的載液，其可以用作分離不同的DNA鏈。該裝置未被設計用于產生大量DNA。此外，Corbett等的裝置未被設計成容易和快速地適應不同的PCR反應要求。例如，載液穿過溫度帶的優(yōu)選布置是將傳輸載液的管道纏繞在單獨的圓柱(維持在不同溫度)周圍。因此，將該裝置改造用于不同的反應條件需要將管道圍繞一個或多個圓柱不同的次數(shù)，解開圍繞一個或多個圓柱的管道，從而用不同的圓柱替換一個或多個圓柱，按照不同的順序重新設置圍繞圓柱的管道的路徑，或另一種這樣的勞動密集型過程。此外，當反應混合物槽從一個圓柱穿到下一個圓柱時效率和精細的溫度控制被減弱，并且在這類"缺口"中熱能被無意丟失或獲得。連續(xù)熱循環(huán)4義的另一個實例7>開于Curico，M.和Roeraade,J.(2003,于2002年網(wǎng)纟各7〉開)ContinuousSegmentedFlowPolymeraseChainReactionforHigh-ThroughputMiniaturizedDNAAmplification(用于高通量小型化DNA擴增的連續(xù)分段流動聚合酶鏈式反應)，Anal.Chem.75，1-7。該裝置類似地被設計用于多種被不混溶流體分離的小樣品混合物。但是，該裝置使用分離的熱控水浴作為溫度帶；而不是如Corbett等的裝置利^]分離的圓柱作為不同的溫度帶。該裝置未被設計成容易改造用于提供大量不同的反應條件，因為對于這種改造必須準備和添加額外的水浴。該裝置的使用還需要周期性的為水浴添水、檢查和排水，以及清理水浴容器。Hansen的于1996年4月16日出版的美國專利5,508，197教導了一種PCR裝置，其具有96、192和384孔形式的多孔板及4反夾臺。Hayes的于1998年12月15日出版的美國專利5，849，208描述多種反應室和多種分析室，其中使用盒來保存用于PCR和后續(xù)分析的生物材料。Astle的于2003年10月14日出版的美國專利6，632，653教導了一種PCR裝置，其用指標化步驟在連續(xù)基礎上以獨特的溫度變化順利指示試劑多孔板的模式。Sudor的于2004年3月23日出版的美國專利6,709,692描述了一種利用表面處理聚合物對表面的處理，以及在這類表面上進行流體l喿作(包括PCR)的方法。表面包括諸如試管、多孔板、移液管和毛細管的裝置的表面。Atwood的于2006年11月7日出版的美國專利7,133,726教導了一種裝置(其將樣品循環(huán)通過一系列溫度偏移)、蓋子和控制該過程的計算機。發(fā)明概述進行聚合酶鏈式反應的方法，包括將含有聚合酶鏈式反應的反應物的液體運輸通過聚合管道，所述聚合管道被設置為通過第一反應循環(huán)區(qū)域和至少第二反應循環(huán)區(qū)域，所述每個區(qū)域包括第一和第二，或第一、第二和第三溫度帶，所述第二區(qū)域中每個帶的溫度與所述第一區(qū)域中相應帶的溫度基本相同，其中所述液體是含有聚合酶鏈式反應的反應物和表面吸附聚合物的水溶液。需要連續(xù)熱循環(huán)儀，其被設計成能大量產生DNA鏈，能容易地適應不同的PCR反應要求，并且能夠有效運轉。本發(fā)明提供用于能夠批量產生DNA鏈的連續(xù)熱循環(huán)系統(tǒng)的方法，所述熱循環(huán)系統(tǒng)是有效的、可擴展的、容易適應不同的PCR反應要求并且相對便宜的產生。本發(fā)明的實施方案在溫度控制體內具有多種溫度控制扇區(qū)，從而產生多種溫度帶。流體優(yōu)選的通過路徑流過裝置或沿著裝置流動，從而流過不同的溫度帶或沿著不同的溫度帶流動。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案特別地適合于快速、容易和大量地擴增DNA片段。因此利用本發(fā)明可以有效使大量產生DNA的速率大大高于常規(guī)的DNA產生率。本發(fā)明的低制造成本和增強的可擴展性允許大量DNA的相對廉價的連續(xù)擴增。特別地，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括具有12個餅狀或楔形扇區(qū)的單個圓柱狀溫度控制體，每個扇區(qū)具有用于獲得所需溫度的裝置，并且每個扇區(qū)與其他扇區(qū)通過熱障分隔。具溝通道沿著所述溫度控制體的外表面環(huán)繞或盤旋，并且置于所述通道內或所述通道上的一段的管道將DNA擴增反應物循環(huán)地從一個扇區(qū)輸送到后續(xù)扇區(qū)。因此反應物以循環(huán)方式暴露于不同的溫度帶，最終引起DNA的擴增。用于移動反應物的裝置確定反應物通過一段管道的流速，從而基于特定反應物的特性優(yōu)化經(jīng)由PCR的擴增?？梢詫⑷我鈹?shù)目的扇區(qū)并入溫度控制體，這只需簡單的將其分成增加的扇區(qū)或減少所述扇區(qū)的數(shù)目。此外，通過添加分層扇區(qū)和/或利用具有非圓柱形(諸如具有橢圓形橫截面)的溫度控制體，可以在溫度控制體中并入進一步的適應性。附圖簡述參照附圖描述本發(fā)明。在附圖中，類似的附圖標號表示相同或功能類似的元件。圖1是本發(fā)明熱循環(huán)系統(tǒng)的一個實施方案的正視圖。圖2是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的平面圖。圖3A是本發(fā)明熱循環(huán)系統(tǒng)的可選擇實施方案的正視圖。圖3B是圖3A的熱循環(huán)系統(tǒng)的外表面一部分的展開圖。圖3C是圖3A的熱循環(huán)系統(tǒng)的通道一部分的展開圖。圖4是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的正視圖，顯示絕緣層基本上環(huán)繞溫度控制體。圖5是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的俯視圖。圖6是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的溫度控制體的透^L圖，顯示絕緣層的一部分。圖7是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的溫度控制體的俯-見圖。圖8是圖1的熱循環(huán)系統(tǒng)的溫度控制體的底視圖。圖9是本發(fā)明熱循環(huán)系統(tǒng)的可選擇實施方案的正視圖。圖10是圖9的熱循環(huán)系統(tǒng)的俯視圖。圖11是圖9的熱循環(huán)系統(tǒng)的底視圖。圖12是圖9的熱循環(huán)系統(tǒng)的頂蓋的平面圖。圖13是圖9的熱循環(huán)系統(tǒng)的底蓋的平面圖。圖14是電泳凝膠照片，顯示與常規(guī)系統(tǒng)的效率進行比較的本發(fā)明熱循環(huán)系統(tǒng)的一個實施方案的效率。圖15是冷卻組件的分解透視圖。圖16是冷卻纟且4牛的近t聶透3見圖(closedperspectiveview)。圖17是與熱循環(huán)儀連接的冷卻組件的透視圖。發(fā)明詳述用于本發(fā)明的聚合管特別地包括合成的樹脂含氟聚合物管，諸如柔性聚四氟乙烯(PTFE)或TEFLON牌管。對于圓橫截面來說，合適的大小可以是外徑為約1/8英寸，以便適合通道104，如果該通道寬大約l/8英寸。管道壁可以是約5/1000英寸，內徑為約1/32英寸或更大。對于任選的熱傳導，內徑應當?shù)陀诩s1/8英寸。管道的橫截面還可以是橢圓、正方形或矩形的。供應商包括Orangeburg,SC的ZeusIndustrialProducts和FallRiverMA的OxidationSystemsInc。用于本發(fā)明的表面吸附聚合物包括美國專利6,709,692中描述的那些，特別地，氧化乙烯和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，諸如FlorhamPark,NJ的BASF用PLURONIC(普朗尼克)商標4是供的那些。實例包括PLURONICF108、F108NF、F68和F127。表面吸附聚合物(諸如聚環(huán)氧乙烷/聚環(huán)氧丙烯嵌<^殳共聚物)的量可以在約1.5毫克每毫升到100亳克每毫升的范圍。普遍認為相對于未經(jīng)處理的管道，所述聚合物使管道表面對反應物更加惰性，并且防止Taq酶失活。該結論基于以下觀察，在無表面吸附聚合物的情況下PCR試劑流過20英寸或更厚的PFTE管道后擴增被有效抑制。但是，當從該管道收集PCR試劑時，通過向試劑回添新的Taq聚合酶，所述試劑可以:故再活化用于常規(guī)模塊熱循環(huán)儀中的DNA擴增。這表明因為接觸管道而損失或失活的單一關鍵組分是TaqDNA聚合酶。當混合物中包含表面吸附聚合物時，DNA擴增進行的水平與傳統(tǒng)模塊熱循環(huán)儀相同或比其更高。此外，通過用含有約1.5-3.5%(w/v)的表面嵌段聚合物(諸如普朗尼克F108)的水溶液預沖洗管道，可以使用不含表面嵌段聚合物作為試劑的擴增混合物進行成功擴增，這樣的話最后對純化的要求更低，但是這不如包含所述聚合物作為PCR試劑之一時那么有效。本發(fā)明的另一部分是進4亍聚合酶鏈式反應的方法，其包括以下步驟(a)將含有表面吸附聚合物的水溶液輸送通過聚合管道，繼之以；(b)在足以引起所述聚合酶鏈式反應的溫度將含有聚合酶鏈反應物的第二水溶液運輸通過所述管道。在所述裝置從產生一種特定DNA轉換為產生另一種之前，通常用10%漂白劑清洗再用去離子水充分洗滌來清潔本發(fā)明方法中使用的管道。在所述裝置用于進一步的DNA合成之前，可以用表面吸附聚合物(諸如普朗尼克)洗涂來預處理清潔的管道，本發(fā)明的一個優(yōu)點是在反應合成操作期間對管道的連續(xù)處理和條件化，從而減少了關閉模式下耗費的時間。因此，添加的聚合物的量是足以維持管道條件化并防止DNA合成期間反應酶諸如Taq失活的量。這可以通過觀察添加到反應物溶液中的聚合物的量"吏溶液稍微渾濁)來確定。認為這是在Taq周圍產生微膠粒(即聚合物的外層)的點。這與使用油類和油/水乳液反應物系統(tǒng)完全不同。當根據(jù)本發(fā)明實施時，用于PCR三個步驟的溫度分別為大約95°C、57。C和72。C。但是，為了增加反應的特異性和產量，溫度可以變化。本發(fā)明涉及用于在單個物理結構內同時維持多個溫度區(qū)域的方法和組成。因此本發(fā)明特別地適合于在物質的自動熱循環(huán)中使用，諸如用于核酸序列的擴增。參照附圖，特別地參照圖1-13，本發(fā)明的熱循環(huán)系統(tǒng)IOO優(yōu)選的包括具有至少兩個扇區(qū)118和路徑104的溫度控制體102，所述路徑104循環(huán)地從一個起始扇區(qū)118依次通到每個后續(xù)的扇區(qū)118,然后返回所述的起始扇區(qū)118，并按照需要的次數(shù)循環(huán)重復從一個扇區(qū)118通到下一個扇區(qū)118。路徑104跨過扇區(qū)118,其沿著溫度控制體102的外表面132從一個扇區(qū)118通到各后續(xù)扇區(qū)118，通過內部地鉆過扇區(qū)118/人一個扇區(qū)118到各后續(xù)的扇區(qū)118，或通過這類外部或內部行進的組合。每個扇區(qū)118都包含至少一個改變或獲得溫度的裝置120。所述變溫裝置120能夠實現(xiàn)并維持特定的所需溫度。因此變溫裝置120優(yōu)選的是加熱器，冷卻器，Peltier裝置，熱泵，恒溫箱，火室，熱反應室，或類似裝置。每個扇區(qū)118優(yōu)選的基本上由鋁、鋁合金、金屬、金屬合金、熱導體、不對稱熱導體或其組合制成。變溫裝置120從而加熱、冷卻或維持扇區(qū)118的溫度，以致位于每一扇區(qū)118內或扇區(qū)118上的3各徑104部分被類似地加熱、冷卻或維持在該扇區(qū)118的特定溫度。各個扇區(qū)118還優(yōu)選的與其他扇區(qū)118被位于所述扇區(qū)118之間的熱障122分隔。熱障122可以是被動的，可以包括熱絕緣體、空氣、氣體、液體、固體和/或其組合?？蛇x擇地或此外，熱障122可以是主動裝置或物質(諸如Peltier裝置)，其能夠維持明顯的溫度差異。因此每個扇區(qū)118作為獨立的溫度槽，其中該扇區(qū)118的變溫裝置120實現(xiàn)并維持整個扇區(qū)118的所需溫度，而熱障122將每個扇區(qū)118與其他扇區(qū)118熱分離。從而有效地在單體內實現(xiàn)并維持多個溫度區(qū)域。絕緣層124可以任選的基本上環(huán)繞溫度控制體102，從而將扇區(qū)118和周圍環(huán)境之間的熱轉移降到最低。溫度控制體102可以具有任何需要的形狀，諸如圓柱形，圓錐形，三角形，矩形，金字塔形，多角形，塊形或立方形。扇區(qū)118可以具有任何符合溫度控制體102的剖面、部分或小塊的所需形狀。例如，扇區(qū)118可以是楔形、弧形或扇形，或具有圓柱形、圓錐形、三角形、矩形、金字塔形、多角形、塊形或立方形的扇形部分的形狀。扇區(qū)118也可以是分層的，一個在另一個的頂上。所需扇區(qū)118可以以任意數(shù)目存在。所有扇區(qū)118可以是相同大小，或一個或多個扇區(qū)118可以是不同大小。熱循環(huán)系統(tǒng)100還優(yōu)選的包括多個溫度傳感器130。每個扇區(qū)118優(yōu)選的具有一個或多個溫度傳感器130,其位于該扇區(qū)118內或附近，以測量該扇區(qū)118或扇區(qū)118的一部分的溫度。每個溫度傳感器130產生溫度輸出值，其直接或間接代表該扇區(qū)118的溫度。這類溫度傳感器130可以是任意測定溫度的常規(guī)裝置?？梢匀芜x的將這類溫度傳感器130置于絕緣層124內或絕緣層124上。熱循環(huán)系統(tǒng)IOO還優(yōu)選的包括調溫裝置134。調溫裝置134調節(jié)各個變溫裝置120，以致在各個扇區(qū)118內實現(xiàn)所需溫度?？梢允褂萌我鈹?shù)目的調溫裝置134來調節(jié)變溫裝置120。調溫裝置134優(yōu)選的包《^舌恒溫器。10在一個實施方案中，執(zhí)行軟件程序的計算機系統(tǒng)與變溫裝置120和溫度傳感器130聯(lián)通，其中所述軟件使用為每個扇區(qū)118預設的目標溫度來控制和調節(jié)變溫裝置120。所述目標溫度由預期應用和使用的熱循環(huán)系統(tǒng)100確定，在一個優(yōu)選的實施方案中該系統(tǒng)是PCR。所述軟件接收來自溫度傳感器130的溫度值輸出。每個所述溫度值直接或間接代表扇區(qū)118的溫度。所述軟件將各扇區(qū)118的溫度值輸出與該扇區(qū)118預i殳的目標溫度進行比較。然后，如果從溫度傳感器130接收的溫度輸出值超過或低于最小預定值，所述軟件將啟動該扇區(qū)118的一個或多個變溫裝置120以增加或減少該扇區(qū)118或該扇區(qū)118適當部分的熱量。也就是i兌，根據(jù)溫度傳感器130的值和位置，該系統(tǒng)可以啟動扇區(qū)118中變溫裝置的全部或一部分。可選的，可以使用調溫裝置134,諸如4壬-f可常規(guī)恒溫系統(tǒng)。熱循環(huán)系統(tǒng)100還優(yōu)選的包括使流體128沿著路徑104移動的裝置106。因此流體128循環(huán)地/人一個扇區(qū)118流到另一個扇區(qū)118,并且流體128的溫度與其穿過或于其上流動的扇區(qū)118的溫度平衡。因此當流體128沿著路徑104流動時，其溫度循環(huán)變化。流體128優(yōu)選的包括任何熱依賴性反應混合物、反應物或試劑。流體移動裝置106優(yōu)選的包括泵，諸如蠕動泵、壓縮氣體系統(tǒng)或類似裝置。例如，可以使用加壓氦氣系統(tǒng)沿著路徑104推動流體128。用于移動反應混合物通過所述系統(tǒng)的泵包括以下類型的泵蠕動泵、腔式泵、離心泵、活塞泵、羅茨增壓泵、旋轉葉片泵、隔膜泵、注射泵和齒4侖泵。注射泵由Holliston，Massachusetts的KDScientific提供，其通常被設置提供從供應管通過管道而進入反應區(qū)的脈動性連續(xù)液流，其不接觸推動液體運動的注射器，該注射器只接觸作為液壓流體的水。例如，2個注射器可以是180。異相，以致當一個充滿水時，另一個傾空其水以推動反應物液體進入并通過DNA合成裝置?？梢越佑|反應物液體的可選擇泵是旋轉活塞泵，其使用對反應物沒有影響的陶瓷活塞和圓柱。實例包括由NorthSpringfield,Vermont的IVEKCorporation供應的那些。在熱循環(huán)系統(tǒng)100的特定實施方案中，溫度控制體102是單個基本上為圓柱的體，其具有多個基本上扇形或楔形的扇區(qū)118。路徑104包括在溫度控制體102的外表面132周圍環(huán)繞或盤旋的具溝通道。在該具溝通道內或沿著該具溝通道放置一段管道126。根據(jù)特定熱依賴性反應的特性和要求確定各扇區(qū)118的所需溫度。調溫裝置134和變溫裝置120被激發(fā)，以致達到各扇區(qū)118的所需溫度。溫度傳感器130測量各扇區(qū)118的實際溫度，酌情激發(fā)或關閉各變溫裝置120以達到并維持各扇區(qū)118的所需溫度。流體移動裝置106移動或推動流體128通過一段管道126。因此流體128在循環(huán)基礎上經(jīng)歷一系列不同的溫度區(qū)域，最終導致流體128向一個或多個產物的轉化或反應。任選的溫度控制體102可以附著于支持基質上。用于轉動溫度控制體102的裝置也可以任選的用于便于將一段管道126置于具溝通道內或沿著具溝通道放置。這類轉動裝置可以包括具有輪子和齒輪部件的電動機或類似替代性裝置。熱循環(huán)系統(tǒng)100特別地適合于通過PCR的DNA大規(guī)模擴增。因此，熱循環(huán)系統(tǒng)100的特定實施方案含有具溝通道^各徑104，其環(huán)繞單個圓柱狀溫度控制體102的外表面132。因此，該通道具有鄰近溫度控制體102的頂部邊纟彖110的第一末端114和鄰近溫度控制體102的底部邊纟彖112的第二末端116。溝的深度是任意的，并且可以取決于一段管道126(可以置于溝內或沿著溝放置)的直徑和/或可以取決于熱循環(huán)系統(tǒng)的特定應用。圓柱狀溫度控制體具有12個相同大小的弧形扇區(qū)118,每個扇區(qū)118都具有一個變溫裝置120。每個扇區(qū)118都具有一個溫度傳感器130(具體來說是K型熱電偶)，內置于扇區(qū)118中。流體移動裝置106(優(yōu)選的是加壓氦氣系統(tǒng))使流體128流過一段管道126。流體128優(yōu)選的包括待擴增的DNA鏈，兩條引物和熱穩(wěn)定的Taq聚合酶。此外，流體128中還包含有利于通過PCR擴增DNA的物質。優(yōu)選的單個調溫裝置134調節(jié)每個變溫裝置120。流體移動裝置1064吏流體128從扇區(qū)118移到扇區(qū)118，以致通過PCR的DNA擴增^皮優(yōu)化。在熱循環(huán)系統(tǒng)100的一個實施方案中，圓柱狀溫度控制體102被分成3個相等的扇形扇區(qū)118，圍繞該圓柱的通道有約30到約40個"圈(tums)"，特定數(shù)目為約33個圈。通道的每個"圏"是流體128圍繞圓柱的外表面132圓周流動的一個"循環(huán)"。此外，該通道內的管道126(諸如PTFE管道或TEFLON管道或合成樹脂含氟聚合物管道)被3個絕緣層124(每個扇區(qū)118—個)圍繞，其中每個絕緣層124具有8個溫度傳感器130。蠕動泵106被置于距離管道126延伸離開圓柱的底112的點約6到約7英寸處。利用裝置的這種布置，使用本裝置的優(yōu)選方法以45秒每部分118(溫度帶)的速率推動流體128通過管道126，導致約135秒每循環(huán)的流速(管道126圍繞圓柱r'圈";)。扇區(qū)/溫度帶118施加在試劑上的溫度和循環(huán)次數(shù)優(yōu)選的符合7>知的和現(xiàn)有的PCR方法。用于連續(xù)熱循環(huán)系統(tǒng)的本裝置和方法的優(yōu)選用途是擴增DNA，但本發(fā)明的該用途只是為了方便的目的。在需要連續(xù)加熱或冷卻流體128通過多個溫度帶的不同應用中使用本發(fā)明的裝置和方法，這對于相關領域的普通技術人員來說是顯而易見的?？梢栽趯⒘黧w128引入一段管道126之前，大批量混合或產生流體128，或在即將將其引入一段管道126前，及時或快速地產生流體128。流體128優(yōu)選的是基本上均質的溫度依賴性反應混合物，并且優(yōu)選的存在通過一段管道126的連續(xù)供應這類流體128。可以使用控制流體128引入的裝置，諸如計算機系統(tǒng)和軟件程序。所述軟件程序優(yōu)選的使用用于確定正確混合(通過比例)、相繼次序和向一段管道126內輸入流體128和/或流體組分的時間的預定實驗步驟。在一個實施方案中，根據(jù)特定的PCR要求確定引入流體128組分的實驗步驟。可以使用引入流體128的任意裝置，諸如本領域技術人員已知的泵閥管線或網(wǎng)絡。通過常規(guī)方法收集從管道末端獲得的流體128輸出物。在一個優(yōu)選實施方案中，所獲流體包含擴增的DNA。此外，顯而易見本發(fā)明的裝置和方法將提供擴增DNA的連續(xù)供應，只要泵按照本文所述通過所述裝置補充流體組分。然后可以從反應混合物中分離DNA，諸如去除表面吸附聚合物，諸如其中的嵌段共聚物。本發(fā)明的方法用于促進需要周期性溫度變化的化學反應，因此包括激發(fā)熱循環(huán)系統(tǒng)100上的變溫裝置120,所述熱循環(huán)系統(tǒng)100具有輸送流體的裝置諸如沿著路徑104延伸的一段管道126，將基本上同質的溫度依賴性反應混合物引入輸送裝置，激發(fā)移動裝置106,以致反應混合物穿過輸送裝置并且反應混合物發(fā)生反應形成產物，以及在輸送裝置的末端收集產物。所述化學反應優(yōu)選的是聚合酶鏈式反應。該方法任選的還包括在輸送裝置的一個末端連續(xù)補充流體。用于連續(xù)調節(jié)流體溫度的裝置，包括含有至少兩個扇區(qū)、外表面、頂部邊緣、底部邊緣、每個所述扇區(qū)內的至少一個溫度控制裝置和所述外表面中的通道的圓柱，其中所述通道具有第一末端和第二末端，并且其中所述通道圍繞所述外表面盤旋；一部分管道具有第一末端、第二末端和一段長度，所述管道置于所述通道內，其中所述管道的所述第一末端自所述通道的所述第一末端延伸，并且所述管道的所述第二末端自所述通道的所述第二末端延伸；用于將流體分配入所述管道的所述第二末端的裝置；與所述管道聯(lián)通的移動裝置，其中所述移動裝置使所述流體通過所述管道從所述管道的所述第二末端移動到所述管道的所述第一末端；當所述流體流過所述管道穿過所述圓柱的每個所述扇區(qū)時，測定所述管道溫度的裝置；和用于調節(jié)所述一個或多個溫度控制裝置的裝置，其中所述調節(jié)裝置與所述測定裝置聯(lián)通。在該裝置中，所述通道的所述第一末端在鄰近所述圓柱的所述頂部邊緣終止，所述通道的所述第二末端在鄰近所述圓柱的所述底部邊緣終止。用于促進需要周期性溫度變化的化學反應的方法，所述方法包括以下步驟(a)激發(fā)熱循環(huán)系統(tǒng)上的變溫裝置，其中所述熱循環(huán)系統(tǒng)包括包括至少兩個扇區(qū)、外表面和循環(huán)地穿過所述扇區(qū)的路徑的溫度控制體，其中每個所述扇區(qū)包括至少一個所述變溫裝置；輸送流體的裝置，其中所述輸送裝置沿著所述路徑延伸；以及與所述輸送裝置聯(lián)通的移動裝置，其中所述移動裝置適宜使所述流體移動通過所述輸送裝置；(b)將基本上均質的溫度依賴性反應混合物31入所述輸送裝置；(c)激發(fā)所述移動裝置，以致所述反應混合物穿過所述輸送裝置，并且以致所述反應混合物反應形成產物；和(d)在所述輸送裝置的第一末端收集所述產物。圖15、圖16和圖17顯示可以用于本發(fā)明的液體冷卻組件。所述冷卻組件是連續(xù)PCR熱循環(huán)儀的附加裝置，其增加熱負荷，可以被置于熱循環(huán)儀的熱反應圓柱上，從而增加其中所含流體的流速或者體積以更快的產生特定DNA結構。通過對該裝置實施方案進行的實驗，已經(jīng)觀察到多至60。C的降溫。這使熱循環(huán)儀的流體體積增加4倍，等于產生速度增力口4倍。液體冷卻組件134由鋁組件組成，該鋁組件由兩塊板136和138制成，這兩塊板用螺釘140擰接在一起并用墊圈142密封。提供輸入和輸出口144和146,以1更冷卻液流過組件134。在才喿作期間，所述組件凈皮附著到加熱的圓柱溫度控制體102的側面，所述溫度控制體102在其外表面圍繞有螺紋，并按照環(huán)狀排列被分成24個部分150。每個部分的溫度可以被獨立設置。組件134中每個部分具有相同的寬度和高度。管道沿著置入表面的螺紋環(huán)繞圓柱，而所述組件被附著到必須發(fā)生明顯降溫的部分。用于PCR的DNA試劑流過管道(該管道沿著圍繞圓柱外周的螺旋路徑)，當它們穿過每個部分時被加熱或冷卻。當所述試劑達到組件時，它們在組件134的圓柱部分和外表面進行力。熱。當所述試劑進入下一個部分時，它們非常接近于該部分的溫度。為了/人圓柱散熱，所述組件具有貫穿其的盤旋通道148，所述通道148載有高流速的流體冷卻劑。這些盤旋設計在冷卻劑內產生渦流，從而增加組件與冷卻劑間的熱轉移。一旦冷卻劑穿過組件，其通過端口146從系統(tǒng)排出?？梢詫⒗鋮s劑收集到冷卻器中進行冷卻并再次穿過系統(tǒng)，或被永久排出。實施例1制備樣品，其包含12%MgCl2(25mM)，0.33%TaqDNA聚合酶(5單位V1)，2.0。/。dNTPs(三磷酸脫氧腺普(dATP),三磷酸脫氧胞香(dCTP)，三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)和三磷酸脫氧胸苦(dTTP))，8.0%模板(2嗎/ml)，61.66。/o普朗尼克F108溶液(1.5。/o溶液)，4%正向引物，4%反向引物，8%反應緩沖液(10x濃度)。利用這些數(shù)字可以將溶液擴充至恰當?shù)捏w積。圓柱狀溫度控制體102的12個垂直扇區(qū)118被加熱到3種不同溫度，4個相鄰扇區(qū)118^皮加熱到95°C，另一4個相鄰扇區(qū)118,皮加熱到59°C,和最后4個相鄰扇區(qū)118^皮加熱到72°C。內徑(ID)l/32"、外徑(OD)l/16"的TEFLONPTFE管道環(huán)繞溫度控制體102共30次，^f吏一段管道126和反應混合物連續(xù)經(jīng)歷3種不同溫度共30次。然后利用20PSI的增壓容器推動該反應混合物通過該管道126。在將反應混合物提供給溫度控制體102后，使用礦物油推動樣品通過管道126的全長。用流量閥將反應混合物的流速控制為0.25ml/分鐘。當特定DNA序列循環(huán)通過所述溫度帶時，樣品中存在的特定DNA序列(其界限由寡核苷酸引物確定)被擴增。第30個循環(huán)后，管道126退出圓柱102，收集內容物。樣品在CambrexReliantPrecast2%瓊脂糖凝膠上進行分析并用溴化乙錠染色。利用BIORadGeldocEQ系統(tǒng)獲得凝膠圖像，顯示于圖14。各泳道的內容物如下泳道l，空；泳道2，分子量梯度物(ladder);泳道3,無模板陰性對照(樣品A);泳道4，空；泳道5，在熱系統(tǒng)100的實施方案中擴增的樣品(樣品B);泳道6,空；泳道7，在熱循環(huán)系統(tǒng)100的實施方案中擴增繼之以在常規(guī)PerkinElmer480裝置中擴增的樣品(樣品C);泳道8，空；泳道9，用常規(guī)PerkinElmer480裝置運行的陽性對照樣品(樣品D);泳道IO,分子量梯度物；泳道ll,空；和泳道12,空。利用ImageJ1.33u版軟件分析圖像，其中提取強度數(shù)據(jù)以獲得積分強度及包括扣除本底的計算值，不進行其他標準化。樣品A的條帶強度是0.07,樣品B的條帶強度是3.62,樣品C的條帶強度是3.77,和樣品D的條帶強度是3.19。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的系統(tǒng)和方法即使不比標準商品化系統(tǒng)的實例(PerkinElmer480裝置)更有效，也與其一樣有效。制備3種相同的反應混合物，一個樣品以其無模板的未擴增形式被4全測(樣品A),—個樣品用本發(fā)明的系統(tǒng)運行(樣品B),—個樣品先用本發(fā)明的系統(tǒng)運行再用常規(guī)商品化系統(tǒng)運行(樣品C),和一個樣品用常規(guī)商品化系統(tǒng)運行(樣品D)。凝膠上目標質量(300bp)處條帶的強度是產生的DNA產物數(shù)量的指標。樣品C產生最強的條帶，但是它并不比單獨用本發(fā)明產生的樣品強很多。因為樣品C經(jīng)歷熱循環(huán)系統(tǒng)100實施方案的30個循環(huán)，然后經(jīng)歷商品化系統(tǒng)的30個循環(huán)，如果離開本發(fā)明使用的裝置后仍然剩余活性試劑，則可以合理預期一些額外的擴增。樣品B(利用本發(fā)明使用的裝置產生的DNA)產生第二強的條帶。包括樣品D是為了顯示從常身見商品化系統(tǒng)PerkinElmer系統(tǒng)預期的DNA的相對量。來自該商品化系統(tǒng)的條帶(樣品D)的強度要低于來自本發(fā)明的所述系統(tǒng)和方法的條帶(樣品B)。這表明本發(fā)明使用的系統(tǒng)和方法的效率等于或高于該商品化系統(tǒng)。樣品A用于指示在經(jīng)歷擴增條件(在PerkinElmer商品化系統(tǒng)中)但無模板DNA的系統(tǒng)中沒有觀察到DNA(或可忽略量的信號)，并且在反應溶液中沒有污染物(其可能被誤解為擴增)。該數(shù)據(jù)的重要特征是樣品B條帶比在常規(guī)系統(tǒng)中實施的相同反應更強(指示更好的反應)。實施例2通過將3%重量/體積的普朗尼克F127與水混合并將其添加到PCR反應混合物中構建含普朗尼克的反應混合物，得到下列濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在泵入所述裝置前及收集后，均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道，其內徑(ID)為1/16英寸，外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足500ml,循環(huán)前在4攝氏度保存。該實施例中，所述裝置的扇區(qū)被等分成12個扇區(qū)。前4個扇區(qū)被加熱到95攝氏度，接下來4個扇區(qū)被加熱到58攝氏度，最后4個扇區(qū)被加熱到72攝氏度。維持泵的流速，以致流體用33秒流過4個扇區(qū)，管道每個順序圏共用99秒，溶液第一次完全穿過管道共用2970秒。實施例3描述普朗尼克的濃度范圍，利用如實施例2所述的相同DNA模板、寡核苷酸引物和溫度/流動濃度及含普朗尼克F108的反應混合物，所述反應混合物通過將1.5%重量/體積的普朗尼克F108與水混合并將其與適量MilliQ水添加到PCR反應混合物中使終體積到100%而制備。試劑母液濃度最終溶液％MilliQ水64%-0%普朗尼克F108向水中添加1.5%粉末溶解8%-72%PCR緩沖液(匹配制造商的酶)10x8%pGEM3ZF+質粒0.1毫克/毫升8%MgCl225毫摩12%正向引物CGATTTCGGCCTATTGGTTA10微摩4%反向引物CGGTGAAAACCTCTGACACAIO微摩4%TaqDNA聚合酶5單位/微升0.33%脫氧核苷酸混合物每核普酸10微摩2%100%在泵入所述裝置前及收集后，均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道，其內徑(ID)為1/16英寸，外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足至50ml，循環(huán)前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區(qū)^皮等分成12個扇區(qū)。前4個扇區(qū)被加熱到95攝氏度，接下來4個扇區(qū)被力o熱到58攝氏度，最后4個扇區(qū)被加熱到72攝氏度。維持泵的流速，以致流體用33秒流過4個扇區(qū)，管道每個連續(xù)圈共用99秒，溶液第一次完全穿過管道共用時2970秒。實施例4該實施例描述^f吏用1.5%普朗尼克溶液清洗1次裝置中的管道，時間范圍為30分鐘到60分鐘以預處理該管道，然后泵入不含普朗尼克或其他表面吸附聚合物的PCR試劑混合物。該實施例使用實施例2的反應混合物中相同的DNA才莫板、寡核苷酸引物和溫度/流動濃度。18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在泵入所述裝置前及收集后，均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用30圈的PFTE管道，其內徑(ID)為1/32英寸，外徑(OD)為1/16英寸。將PCR混合物體積補足至10ml，循環(huán)前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區(qū)被等分成12個扇區(qū)。前4個扇區(qū)被加熱到95攝氏度，接下來4個扇區(qū)被加熱到58攝氏度，最后4個扇區(qū),皮加熱到72攝氏度。維持泵的流速，以致流體用33秒流過4個扇區(qū)，管道每個連續(xù)圈共用99秒，溶液第一次完全穿過管道共用時2970秒。實施例5如下構建75毫升的反應混合物。將裝置預設為按以下溫度和時間運行95攝氏度30秒，56攝氏度30秒和72攝氏度45秒，共36個循環(huán)。流速為0.222813ml/分鐘。在合適大小的聚丙蟑容器內制備PCR反應混合物，通過顛倒(無需渦旋)進行混合。移出50微升的等分試樣用作無模板對照。試劑母液濃度最終溶液％MilliQ水75.3%普朗尼克F1082.5%粉末質量/體積，溶于MilliQ水6%PCR緩沖液(NatureTechnologies)10x10%pGEM3ZF+質粒pGEM3ZF+DNA插入物范圍從0到1200bp的質粒100ng/毫升0.06%MgCl225微摩2%正向引物5，AAAGGGAATAAGGGCGACAC3'IO微摩2%反向引物5，CCTGATGCGGTATTTTCTCC3'IO微摩2%NatureTechnologies的TaqDNA聚合酵5單位A徵升0.7%脫氧核苦酸混合物每核苷酸10微摩2%100%在泵入所述裝置前及收集后，均低溫保存PCR混合物。所述裝置使用36圈的PFTE管道，其內徑(ID)為1/16英寸，外徑(OD)為1/8英寸。將PCR混合物體積補足至250ml，循環(huán)前在4攝氏度保存。該實施例中所述裝置的扇區(qū)^皮等分成24個扇區(qū)。前6個扇區(qū)一皮力。熱到95攝氏度，接下來6個扇區(qū)被加熱到56攝氏度，最后10個扇區(qū)被加熱到72攝氏度。維持泵的流速，以致流體用105秒流過管道的每個連續(xù)圈，溶液第一次完全穿過管道共用時3780秒。冷卻扇區(qū)被用于裝置的被設為56攝氏度的第一個6個扇區(qū)。自來水流過冷卻扇區(qū)以<更散熱并且更快的將溶液/人95攝氏度降到56攝氏度。在多次使用之間，該裝置的管道用10%漂白劑或商品化PCR清潔劑諸如Bleachrite清洗，并在多次使用之間用MilliQ水清洗。通過膜濾法和乙醇沉淀，從樣品中去除核苷酸和引物后，該實驗中475個石威基對DNA擴增子的產量是1263微克。20權利要求1.進行聚合酶鏈式反應的方法，包括將液體運輸通過聚合管道，所述聚合管道被設置為通過第一反應循環(huán)區(qū)域和至少第二反應循環(huán)區(qū)域，所述區(qū)域中的每個均包含至少第一和第二溫度帶，所述至少第二區(qū)域中每個帶的溫度與所述第一區(qū)域中相應的第一和第二帶的溫度基本相同，其中所述液體是含有聚合酶鏈式反應的反應物和表面吸附聚合物的水溶液。2.如權利要求l所述的方法，其中所述方法包括輸送所述液體通過約10到40個反應循環(huán)區(qū)域，所述區(qū)域中的每個均包含至少第一和第二溫度帶，所述區(qū)域中每個帶的溫度與所述第一區(qū)域中對應帶的溫度基本相同。3.如權利要求l所述的方法，其中所述聚合管道是柔性聚四氟乙烯管道。4.如權利要求l所述的方法，其中所述表面吸附聚合物是氧化乙烯和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物。5.如權利要求1所述的方法，其中輸送所述液體進入、通過并流出所述聚合管道，所述聚合管道中沒有物理屏障。6.如權利要求l所述的方法，其中所述液體是均質水溶液。7.如權利要求l所述的方法，其中所迷區(qū)域中的每個均包含第一、第二和第三溫度帶。8.如權利要求7所述的方法，其中所述第一溫度帶的溫度為約94-96。C，所述第二溫度帶的溫度為約55-60。C,和所述第三溫度帶的溫度為約70-73°C。9.進行聚合酶鏈式反應的方法，其包括以下步驟a)將含有表面吸附聚合物的水溶液輸送通過聚合管道，繼之以；b)在足以引起所述聚合酶鏈式反應的溫度下，將含有聚合酶鏈式反應物的第二水溶液運輸通過所述管道。全文摘要用于高分子量有機物質諸如DNA的有效、高速、大規(guī)模合成法，所述方法需要多個溫度環(huán)境。在聚合酶鏈式反應操作中，在存在足量表面吸附聚合物的條件下，將基本上均質的反應物液體通過管道輸送通過最少兩個溫度帶，所述足量表面吸附聚合物條件化管道并保護催化酶以提高產量和效率，并將進一步使用所需再生系統(tǒng)的間歇期降到最低。特別地，使用氧化乙烯和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物。文檔編號C12P19/34GK101589157SQ200780045281公開日2009年11月25日申請日期2007年10月4日優(yōu)先權日2006年10月6日發(fā)明者伊麗莎白·默里,威廉·伊恩·托爾樂,德里克·艾倫·格雷戈,賈斯廷·托馬斯·斯維克,邁克爾·路易斯·諾頓申請人:萬達利亞研究公司