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腎源細(xì)胞及在組織修復(fù)和再生中的使用方法

文檔序號:595175閱讀:426來源:國知局
專利名稱:腎源細(xì)胞及在組織修復(fù)和再生中的使用方法
腎源細(xì)胞及在組織修復(fù)和再生中的使用方法 相關(guān)申請的交叉參考 推定的人祖細(xì)胞分離自尸體腎臟的腎組織。這些細(xì)胞的 分離基于針對表面標(biāo)記CD133的磁珠細(xì)胞分離。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明, 腎源CD133+細(xì)胞有能力在培養(yǎng)物中擴(kuò)增,并在體外分化為上皮細(xì)胞 或內(nèi)皮細(xì)胞。在植入SCID小鼠中時(shí),CD133+細(xì)胞形成表達(dá)腎上皮標(biāo) 記的管狀結(jié)構(gòu)。另外,靜脈內(nèi)注射到具有甘油誘導(dǎo)的腎小管壞死的小 鼠中的CD133+細(xì)胞遷移并整合到受傷的腎臟組織中。Bussolati等, 0/尸W/2o/ogy, 166: 545-555, 2005。這些數(shù)據(jù)表明,祖細(xì)胞 存在于人腎臟組織中,它們可能在腎修復(fù)中起作用。然而,在成人腎 臟組織中駐留的CD133+細(xì)胞群非常低,因此對基于異種的細(xì)胞療法 是不切實(shí)際的。最近鑒定器官特異性干細(xì)胞的方法利用基于祖細(xì)胞流 出Hoechst 33342染料的能力的分離方法。表現(xiàn)出該能力的細(xì)胞被稱 為SP(側(cè)群)細(xì)胞,已顯示出可變程度的干細(xì)胞特征。研究已表明,嚙 齒動物腎臟的腎間質(zhì)含有SP細(xì)胞。另夕卜,將腎SP細(xì)胞輸注入患有急 性腎衰竭的小鼠中。Hishikawa等人,J. o/CW/169: 921-928, 2005。這些細(xì)胞似乎遷移到胞間隙,并在受損的腎組織修復(fù)中起作用。
然而,仍要確定在人腎臟組織中存在SP細(xì)胞。在本領(lǐng)域需要改善的 哺乳動物或人腎源細(xì)胞源用于細(xì)胞療法,該細(xì)胞源可分離自正常哺乳
動物或人腎臟組織,并在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供得自哺乳動物腎臟組織的分離或純化的哺 乳動物腎源細(xì)胞群。提供用于分離和純化哺乳動物腎源細(xì)胞群的方 法。獨(dú)特的哺乳動物腎源細(xì)胞群的特征在于表型特征,例如形態(tài)、生 長潛力、表面標(biāo)記表型、早期發(fā)育基因表達(dá)和腎發(fā)育基因表達(dá)。表面 標(biāo)記和基因表達(dá)表型在哺乳動物腎源細(xì)胞群于培養(yǎng)物中多次傳代后仍被保留。
0007]在本發(fā)明的一個(gè)方面,4是供分離或純化的哺乳動物腎源
細(xì)胞群,所述細(xì)胞群能夠在培養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增,其中所述細(xì)胞
群對Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、鉤粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá) 為陽性,且對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少 一種的表達(dá)為陰性。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述細(xì)胞對Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為 陽性,且對Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一種的表達(dá)為陰性。 本發(fā)明的又 一 方面涉及選擇性富集或分離哺乳動物腎 源細(xì)胞群的方法。該方法包括由哺乳動物腎臟的包膜下區(qū)、皮質(zhì)或髓 質(zhì)獲得組織,在金屬蛋白酶、中性蛋白酶或粘多糖酶存在下溫育組織, 將細(xì)胞接種在組織培養(yǎng)容器中,鑒定對Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、釣粘素 -11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá)為陽性并對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一種的表達(dá)為陰性的細(xì)胞群,并分離 哺乳動物腎源細(xì)胞群。在又一方面,細(xì)胞群對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAI、 CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166或SSEA-4中的至少一 種為陽性,且對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAII、 CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141 或E-鈣粘素中的至少 一種為陰性。 提供分離的或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群,所述細(xì)胞群 能夠在培養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增,其中所述細(xì)胞群對Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、鈣粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC誦R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá)為陽性,并對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一種的表達(dá)為陰性。 分離的或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群是穩(wěn)定的,并能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物 中自我更新和擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中,細(xì)胞對Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性,并 對Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一種的表達(dá)為陰性。所述細(xì)胞 群對于哺乳動物患者的同種異體移植為非免疫原性的,證據(jù)是發(fā)現(xiàn)分 離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAI為陽性,并對 細(xì)胞表面標(biāo)記HLAII、 CD80或CD86中的至少一種為陰性。
0018哺乳動物腎源細(xì)胞群可以分泌營養(yǎng)因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TIMP-1、 TIMP-2、 MMP-2或VEGF中的至少一種,且不分 泌營養(yǎng)因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一種。所述細(xì)胞群可來源于 人、靈長類動物或嚙齒類動物的腎包膜下區(qū)、腎皮質(zhì)或腎髓質(zhì)。哺乳 動物腎源細(xì)胞群可以包括腎祖細(xì)胞。腎祖細(xì)胞能夠分化為不同的細(xì)胞 譜系,例如脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
來源于哺乳動物腎源細(xì)胞群的分化細(xì)胞還可以用于治 療疾病,例如急性腎衰竭、急性腎炎綜合征、鎮(zhèn)痛劑腎病、動脈粥樣 硬化栓塞性腎病、慢性腎衰竭、慢性腎炎、先天性腎病綜合征、晚期 腎病、Goodpasture綜合征、IgM腎小5求膜增殖性腎小球腎炎、間質(zhì)性 腎炎、腎臟癌癥、腎癌、腎上腺樣瘤;腎細(xì)胞腺癌、腎臟損傷、腎臟 感染、腎臟傷害、腎結(jié)石、狼瘡腎炎、膜增生性GNI、膜增生性GN II、膜性腎病、微小病變腎病、壞死性腎小球腎炎、腎胚細(xì)胞瘤、腎 鈣質(zhì)沉著癥、腎原性尿崩癥、腎病-IgA、腎變病(腎變病綜合征)、多 嚢性腎臟疾病、鏈球菌感染后GN、反流性腎病、腎動脈栓塞、腎動 脈狹窄、腎障礙、腎乳頭壞死、腎小管酸中毒I型、腎小管酸中毒II 型、腎低灌注或腎靜脈血栓癥。0064] 哺乳動物腎源細(xì)胞群可用于將細(xì)胞移植到哺乳動物中, 包括給予自體、同種異體或異體細(xì)胞,以恢復(fù)或修正哺乳動物的組織 特異性代謝、酶、結(jié)構(gòu)或其它功能。所述細(xì)胞可用于將細(xì)胞移植到哺 乳動物中,引起細(xì)胞類型的體內(nèi)分化,以及可用于將哺乳動物腎源細(xì) 胞給予到哺乳動物中。.細(xì)胞或其體外或體內(nèi)的分化子代,可用于修正 遺傳疾病、退化性疾病或癌癥疾病過程。
用于制備本文所述的載體裝置、支架或基質(zhì)的聚合物為 生物可降解的和生物可相容的。生物可降解的聚合物在接觸濕潤的機(jī) 體組織時(shí)易于分裂為小片段。然后這些片段被機(jī)體吸收,或者透過機(jī) 體。更具體地說,生物降解性片段不激發(fā)長期慢性外源性機(jī)體反應(yīng), 因?yàn)樗鼈僞皮機(jī)體吸收或由機(jī)體排除,使得沒有永久性的痕量或殘留片 段一皮機(jī)體保 留。
就涉及分泌性蛋白(如激素、酶、細(xì)胞因子、生長因子等) 缺陷的疾病而言,可通過使用含有哺乳動物腎源細(xì)胞群的擴(kuò)增的細(xì)胞 制備物,治療涉及腎臟系統(tǒng)的疾病之外的疾病。將編碼靶蛋白的基因 轉(zhuǎn)移到哺乳動物腎源細(xì)胞群中,處于適宜的啟動子控制之下,可誘導(dǎo) 和表達(dá)缺陷蛋白??煽刂频鞍椎谋磉_(dá),以獲得與體內(nèi)天然表達(dá)所獲的 活性相同的活性。
可使用眾多載體中的任一種工程改造本發(fā)明的哺乳動 物腎源細(xì)胞群,所述載體包括但不限于整合病毒載體,例如逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體或腺相關(guān)病毒載體;非整合復(fù)制載體,例如乳頭瘤病毒載體、 SV40載體、腺病毒載體;或復(fù)制缺陷型病毒載體。將DNA導(dǎo)入細(xì)胞 中的其它方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、粒子槍或直接DNA注射。
在導(dǎo)入外源DNA之后,可使工程改造的細(xì)胞在富集培 養(yǎng)基中生長,然后轉(zhuǎn)換至選擇培養(yǎng)基。在外源DNA中的選擇標(biāo)記賦 予對選擇的抗性,使細(xì)胞將例如質(zhì)粒上的外源DNA穩(wěn)定整合入其染 色體中,并培養(yǎng)至形成基因座(foci),其又可被克隆和擴(kuò)增入細(xì)胞系中。 該方法可有利地用于工程改造表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。10080
任何啟動子均可用于驅(qū)動插入基因的表達(dá)。例如,病毒啟動子包括但不限于CMV啟動子/增強(qiáng)子、SV40、乳頭瘤病毒、EB 病毒或彈性蛋白基因啟動子。優(yōu)選地,用于控制目標(biāo)基因表達(dá)的控制 元件應(yīng)允許調(diào)節(jié)基因表達(dá),使得僅在需要時(shí)在體內(nèi)合成產(chǎn)物。如果需 要瞬時(shí)表達(dá),則優(yōu)選在非整合栽體和/或復(fù)制缺陷型載體中使用組成型 啟動子。或者,可在需要時(shí)用誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動摻入基因的表達(dá)。0081] 誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于與金屬硫蛋白和熱激蛋白 相關(guān)的那些啟動子。已描述了表現(xiàn)出組織特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的實(shí) 例。例如,促紅細(xì)胞生成素啟動子是腎臟組織特異性的;大容量(2型) NaV葡萄糖協(xié)同運(yùn)輸基因(Sg/G),該基因是僅在腎臟的早期近端小管 中表達(dá)的基因;人有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3 (hOAT3/SLC22A8)主要在腎臟 的近端小管中表達(dá)。00821 本發(fā)明的細(xì)胞可4皮基因工程改造,以"敲除"在植入部 位促進(jìn)炎癥或排斥的因子的表達(dá)。下文論述了降低目標(biāo)基因表達(dá)水平 或目標(biāo)基因產(chǎn)物活性水平的負(fù)調(diào)節(jié)技術(shù)。本文使用的"負(fù)調(diào)節(jié)"是指 在沒有調(diào)節(jié)性治療的情況下,目標(biāo)基因產(chǎn)物的水平和/或活性相對于該 目標(biāo)基因產(chǎn)物的水平和/或活性的下降??墒褂帽姸嗉夹g(shù)降低或敲除哺 乳動物腎源細(xì)胞的天然基因表達(dá),所述技術(shù)包括例如使用同源重組技 術(shù)通過完全失活基因(通常稱為"敲除,,)抑制表達(dá)。通常,編碼蛋白 的重要區(qū)域的外顯子被正選擇標(biāo)記如neo中斷,阻止由耙基因產(chǎn)生正 常mRNA,并導(dǎo)致該基因失活。還可以通過產(chǎn)生部分基因缺失或通過 缺失整個(gè)基因失活基因。使用具有和靶基因同源的、在基因組中離得 很遠(yuǎn)的兩個(gè)區(qū)域的構(gòu)建體,可以缺失插入兩個(gè)區(qū)域的序列(Mombaerts 等人,1991, P亂淑.Jcad. 88:3084)。|0083抑制耙基因表達(dá)的反義的DNA酶和核酶分子也可以按 照本發(fā)明用于降低輩巴基因活性水平。例如,反義RNA分子抑制主要 組織相容性基因復(fù)合物(HLA)的表達(dá),已表明其對免疫應(yīng)答最通用。 反義RNA分子包括但不限于SiRNA寡核苷酸或產(chǎn)生SiRNA寡核苷 酸的cDNA。更進(jìn)一步,三股螺旋分子可用于降低耙基因活性水平。280084] 這些技術(shù)詳述于L.G. Davis等人(編著),1994,萬oy/c A/"/70(is z力A/o/ecw/ar S/o/ogy,第2版,Appleton & Lange, Norwalk, Conn.,其整體在此引入作為參考。
哺乳動物腎源細(xì)胞群可用于治療導(dǎo)致發(fā)病或降低平均 壽命的疾病或慢性病癥。這些病癥和疾病包括但不限于急性腎衰竭、 急性腎臟綜合征、鎮(zhèn)痛劑腎病、鎮(zhèn)痛劑腎病、動脈粥樣硬化栓塞性腎 病、慢性腎病、慢性腎炎、先天性腎病綜合征、晚期腎病、Goodpasture 綜合征、IgM腎小球膜增殖性腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、腎臟癌癥、 腎癌、腎上腺樣瘤;腎細(xì)胞腺癌、腎臟損傷、腎臟感染、腎臟傷害、 腎結(jié)石、狼瘡腎炎、膜增生性GNI、膜增生性GNII、膜性腎病、微 小病變腎病、壞死性腎小球腎炎、腎胚細(xì)胞瘤、腎鈣質(zhì)沉著癥、腎原 性尿崩癥、糖尿病視網(wǎng)膜病、腎病-IgA、腎變病(腎變病綜合征)、多 嚢性腎臟疾病、鏈球菌感染后GN、反流性腎病、腎動脈栓塞、腎動 脈狹窄、腎障礙、腎乳頭壞死、腎小管酸中毒I型、腎小管酸中毒II 型、腎低灌注或腎靜脈血栓癥。臨床管理策略經(jīng)常集中于預(yù)防進(jìn)一步 的損傷或傷害,而不是置換或修復(fù)受損組織(例如腎小管、腎小球、神 經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、心肌)。臨床管理策略包括用外源類固醇類和合成的 非細(xì)胞藥物治療,成功的程度不定,可取決于類固醇或合成藥物的持 續(xù)給藥。
同樣,任選地通過重復(fù)過程可以修飾分化細(xì)胞的人白細(xì) 胞抗原(HLA)譜,其中分化細(xì)胞接觸正常的同種異體淋巴細(xì)胞,并選 擇存活細(xì)胞。或者,使用定向誘變方法消除分化細(xì)胞表面的HLA標(biāo) 記,將由此產(chǎn)生的修飾的分化細(xì)胞植入需要此植入的受體哺乳動物 中。
本發(fā)明的細(xì)胞和組織可以用作研究生理學(xué)或病理學(xué)狀況的^^型系統(tǒng)。例如,本發(fā)明的哺乳動物腎源細(xì)胞群可用于研究疾病 狀態(tài),例如急性腎衰竭、'隄性腎衰竭、腎臟癌癥、腎癌、腎上腙j羊瘤; 腎細(xì)胞腺癌、腎臟損傷、腎臟感染、腎臟傷害、腎結(jié)石、狼瘡腎炎、 多嚢性腎臟疾病或腎靜脈血栓癥。
基本上,隨著新鮮培養(yǎng)基通過三維培養(yǎng)物,生物產(chǎn)物從 培養(yǎng)物洗出,然后可以如上由流出物分離。
依據(jù)本說明書,將細(xì)胞給予患者的多種方法對本領(lǐng)域技 術(shù)人員是顯而易見的。這些方法包括將細(xì)胞注射入患者的靶部位。可 將細(xì)胞插入傳遞裝置中,該裝置有利于通過注射入或植入患者中導(dǎo) 入。這類傳遞裝置可以包括用于將細(xì)胞或流體注射入受體患者機(jī)體中 的管,例如導(dǎo)管。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述管另外具有針頭,例如 注射器,通過其可將本發(fā)明的細(xì)胞導(dǎo)入到患者的目標(biāo)位置。在優(yōu)選的35實(shí)施方案中,哺乳動物腎源細(xì)胞群配制用于經(jīng)導(dǎo)管給予到血管中(其中 術(shù)語"導(dǎo)管"意在包括多種管樣系統(tǒng)中的任一種,用于將物質(zhì)傳遞至 血管)?;蛘?,可將細(xì)胞插入支架中或插在支架上,所述支架包括但不 限于紡織物,如梭織、針織、編織、篩,和非紡織物、打孔膠片、海 綿和泡沫材料,以及珠,例如固體或多孔珠、微粒、納粒等。細(xì)胞可 被制備用于以多種不同形式傳遞。例如,細(xì)胞可以懸浮在溶液或凝膠 中。細(xì)胞可與本發(fā)明的細(xì)胞在其中保持存活的藥學(xué)上可接受的載體或 稀釋劑混合。藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑包括鹽水、水性緩沖溶液、 溶劑和/或分散介質(zhì)。這些載體和稀釋劑的用途在本領(lǐng)域眾所周知。溶 液優(yōu)選為無菌的和液體,并經(jīng)常是等滲的。優(yōu)選地,溶液在生產(chǎn)和儲 存條件下是穩(wěn)定的,并通過使用例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、抗壞 血酸、硫柳汞等防腐,以對抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。
給予哺乳動物腎源細(xì)胞群(例如對Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性且對 Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一種的表達(dá)為陰性的細(xì)月包)的方式 包括但不限于系統(tǒng)、腎臟內(nèi)、靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射和直接注射入組織 中的預(yù)期作用部位。制備物可通過任何常規(guī)途徑給予,例如通過輸注 或濃注,并可以與其它生物活性藥物一起給予。給藥優(yōu)選是系統(tǒng)的。 最優(yōu)選地,給藥部位接近或最接近預(yù)期作用部位。就患者罹患全身缺 血時(shí)的情況而言,優(yōu)選系統(tǒng)給藥,例如靜脈內(nèi)給藥。無意受機(jī)制束縛, 含有哺乳動物腎源細(xì)胞群的組^^物在給予時(shí),響應(yīng)于由于傷害產(chǎn)生的 趨化因子而遷移或歸巢至缺血組織,例如腎臟中的缺血組織。可通過 本發(fā)明方法治療的缺血組織包括但不限于腎缺血。
本文描述的方法提供了連同細(xì)胞給予 一起給予患者的 重組多肽或藥物。多肽或藥物可在給予細(xì)胞之前、同時(shí)或之后給予患 者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,重組多肽或藥物促進(jìn)血管新生、血管 發(fā)生或這二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中,重組多肽或藥物促進(jìn)哺乳動物 腎源細(xì)胞群的增殖或分化。在一個(gè)實(shí)施方案中,重組多肽為VEGF、FGF2、 SDF、 CXCR-4或CXCR-5,或其保留了對缺血組織的治療活 性的片段。
本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)一步提供一種藥學(xué)制劑,其包含(a) 哺乳動物腎源細(xì)胞群,例如對Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性且對Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一種的表達(dá)為陰性的細(xì)胞,和藥學(xué)上可接受的 載體。在某些實(shí)施方案中,所述制劑包含104至109個(gè)哺乳動物腎源細(xì) 胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中,所述制劑準(zhǔn)備通過導(dǎo)管給藥。
在適宜的情況下和除非另有說明,否則將使用常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、病毒學(xué)技術(shù)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)實(shí)施本發(fā) 明,這些技術(shù)在本領(lǐng)域的知識范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中描述。參見 例3口 A/o/ecw/ar C7om力gv j Z/<ar6<9rdto/7 A/orwwa/,第3片反,Sambrook和 Russell編著(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001);論文她^掛 5"拜膨/ogy (Academic Press, Inc., N.Y.); 版wgy4油力Ofifes,第2版, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; CWm^ 尸rotoc0/5 z'w Ce〃 5/o/ogy, 由Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford和Yamada編著,John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999。
將消化物以150 x g離心5分鐘,吸出上清液。將產(chǎn)生 的細(xì)胞沉淀重懸浮在20 ml REGM或MSCGM中。細(xì)胞懸浮液通過40-微米尼龍BD FALCON細(xì)胞濾網(wǎng)(BD Biosciences, San Jose, CA)過濾。 將濾過液重懸浮在培養(yǎng)基(總體積50 ml)中,并以150 x g離心5分鐘。 吸出上清液,將細(xì)胞沉淀重懸浮在50 ml新鮮培養(yǎng)基中。再重復(fù)該過 程2次。
總之,腎源細(xì)胞在培養(yǎng)物中具有強(qiáng)壯的生長潛力。這些 數(shù)據(jù)可用于估計(jì)由1個(gè)完整人腎臟產(chǎn)生的細(xì)胞總數(shù)。如果所有的腎臟 組織都被處理,且產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)31次群體倍增,則1個(gè)完整人 腎臟應(yīng)產(chǎn)生估計(jì)1.89><1016個(gè)總細(xì)胞。因此,考慮到細(xì)胞的1個(gè)治療劑 量為lxl()S個(gè)細(xì)胞/人,分離自單個(gè)腎臟的腎源細(xì)胞將足以治療1.89億 名患者。最后,這些細(xì)胞是用于基于同種異體的細(xì)胞療法的高度可擴(kuò) 增的細(xì)胞來源。實(shí)施例4腎源細(xì)胞表面標(biāo)記表型0129對腎源細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,以確定表面標(biāo)記表 型。得自實(shí)施例1的9個(gè)分離林的細(xì)胞在T75燒瓶上的REGM中于 37°C和5%二氧化碳中被擴(kuò)增至第4代和第10代。用PBS洗滌粘附 細(xì)胞,并用TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY)解離。收獲、離心細(xì)胞,并以2xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸浮在3% (v/v) FBS的PBS溶 液中。將特異性抗體加至100pl細(xì)胞懸浮液,并將混合物在黑暗中于 4°C溫育30-45分鐘。在溫育后,用PBS洗滌細(xì)胞,并離心以除去過 量的抗體。將細(xì)胞重懸浮在500 ^1PBS中,并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。 用Guavai殳備4義器(Guava Technologies, Hayward, CA)進(jìn)4亍流式細(xì)』包術(shù) 分析。用于表征表面標(biāo)記表型的抗體示于表3。表3:用于表征腎源細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記表型的抗體??贵w生產(chǎn)商目錄號CD34BD Pharmingen555821CD44BD Pharmingen555478CD45RBD Pharmingen555489CD117BD Pharmingen340529CD141BD Pharmingen559781CD31BD Pharmingen555446CD49cBD Pharmingen556025CD73BD Pharmingen550257CD90BD Pharmingen555596HLA-IBD Pharmingen555553HLA-IIBD Pharmingen555558CD133Miltenyi Biotech120-001-243SSEA4R&D SystemsFAB1435PCD105SantaCruz BiotechSC-21787CD104BD Pharmingen555720CD166BD. Pharmingen559263CD29BD Pharmingen555442CD24BD Pharmingen555428CD56AbCAMMEM188CD138BD Pharmingen550805CD80BD Pharmingen55722643CD86BD Pharmingen555659E-鈣粘素BD Pharmingen612130IgG-FITCBD Pharmingen555748IgG-PEBD Pharmingen555749
表4顯示了所有表面標(biāo)記表型數(shù)據(jù)的匯總。所測試的所 有分離抹都顯示出對CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166、 SSEA-4和HLAI正染色和對CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141、 E4丐粘 素和HLAII負(fù)染色。另外,所分析的所有分離抹都擴(kuò)增多代(10代), 仍保留其表面標(biāo)記表型。
總之,這些數(shù)據(jù)證實(shí),可在多個(gè)條件(表l)下由多個(gè)供 體分離腎源細(xì)胞,但仍保留其表面標(biāo)記表型。另外,它們表達(dá)推定的 祖細(xì)月包標(biāo)記,如CD24和SSEA-4, ^旦不表達(dá)成熟的譜系-定向標(biāo)記, 如E-鈣粘素。最后,腎源細(xì)胞是非免疫原性的,因此是用于同種異體 細(xì)胞治療的有吸引力的細(xì)胞來源。表4:表面標(biāo)記分析的匯總。未測定(ND)。正染色(+)。負(fù)染色(-)。分離抹表面標(biāo)記又名12 17 18 19 20 21 22 23 24CD29Bl-整聯(lián)蛋白+++++++++CD44HCAM+++++++++CD49Ca3-整聯(lián)蛋白NDND+++++++CD166ALCAM+++++++++CD24熱激抗原-1ND+++++++CD73SH3NDND+++++++CD90Thy-lNDND+++++++SSEA4無+++++++++CD31PECAM畫1CD34gpl05CD45Ly5CD56NCAMNDNDCD104b4-整聯(lián)蛋白CD138Syndecan-lNDCD141血栓調(diào)節(jié)蛋白E-鈣粘素?zé)oCD105內(nèi)皮糖蛋白CD117c-KitCD 133AC133CD80B7畫lNDNDNDNDNDCD86B7-2NDNDNDNDNDNDNDHLAIMHC-a,b,cNDNDNDNDNPND++HLAII固C-DP ,DQ, DRNDNDNDNDND實(shí)施例545腎源細(xì)胞基因表達(dá)
總之,這些數(shù)據(jù)證實(shí),腎源細(xì)胞是推定的腎祖細(xì)胞源, 其可用于基于細(xì)胞的療法,以保護(hù)或修復(fù)受損的腎臟組織。實(shí)施例6營養(yǎng)因子分泌分析01391已表明腎源細(xì)胞始終生產(chǎn)保護(hù)和修復(fù)腎臟的營養(yǎng)因子。 因此,這些細(xì)胞可用作治療腎臟疾病的治療劑。01401 將得自分離抹17-21的第3代細(xì)胞以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2、 1個(gè)T75燒弁fl/分離抹接種,每個(gè)燒瓶含有15 ml REGM。將細(xì)胞在5% 二氧化碳中于37°C培養(yǎng)。在過夜培養(yǎng)后,將培養(yǎng)基改變?yōu)闊o血清培 養(yǎng)基(DMEM-低葡萄糖(Gibco), 0.1% (w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青 霉素(50單位/ml)和鏈霉素(50 pg/ml)(Oibco)),并進(jìn)一步培養(yǎng)8小時(shí)。 在溫育結(jié)束時(shí)以14,000 x g離心5分鐘收集條件化的無血清培養(yǎng)基, 并儲存于-20。C。0141!用PBS洗滌細(xì)胞,使用4 ml TrypLE Select (Gibco)解離, 并用Guava4義器(Guava Technologies, Hayward, CA)i十?dāng)?shù),以4古^十每個(gè)49燒瓶中的細(xì)胞數(shù)。然后使用Searchlight蛋白質(zhì)組陣列(Pierce Biotechnology Inc)通過ELISA測定樣品的以下營養(yǎng)因子金屬蛋白酶 組織抑制劑-1 (TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)、血小板 衍生的上皮生長因子bb (PDGF-bb)、角化細(xì)胞生長因子(KGF)、千細(xì) 胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)、血管內(nèi)皮生長 因子(VEGF)、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、轉(zhuǎn)化生長因子oc(TGFoc)、 腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、基質(zhì)衍生因子lb(SDFlb)、睫狀神經(jīng)營 養(yǎng)因子(CNTF)、堿性神經(jīng)生長因子(b-NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)、 生長相關(guān)的致癌基因-oc (GRO-a)、白介素-lb (IL-lb)、白介素-12p40 (IL-12p40)、白介素-12p70 (IL-12p70)、白介素-11 (IL-ll)、白介素-15 (IL-15)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)、 促血管生成素-2 (ANG-2)和人生長激素(HGH)。營養(yǎng)因子生產(chǎn)的分析
盡管為了透徹理解目的已通過闡述和實(shí)施例相當(dāng)詳細(xì) 地描述了上文的發(fā)明,但對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易見的是,根據(jù) 本發(fā)明的講述,可在不偏離隨.附權(quán)利要求的精神或范圍的情況下,對 本發(fā)明實(shí)施某些改變和修改。
權(quán)利要求
1.一種分離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群,所述細(xì)胞群能夠在培養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增,其中所述細(xì)胞群陽性表達(dá)Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一種,且陰性表達(dá)Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一種。
2. 權(quán)利要求1的細(xì)胞群,所述細(xì)胞群陽性表達(dá)Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中的至少一種,且陰 性表達(dá)Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中的至少一種。
3. 權(quán)利要求1的細(xì)胞群,所述細(xì)胞群對細(xì)胞表面標(biāo)記HLA I、 CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166或SSEA國4中的至少一 種為陽性,且對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAII、 CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141 或E-鉤粘素中的至少一種為陰性。
4. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,所述細(xì)胞群對表面標(biāo)記HLAI、 CD166 或SSEA-4中的至少一種為陽性,且對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAII、 CD80、 CD86、 CD133、 CD141或E4丐粘素中的至少一種為陰性。
5. 權(quán)利要求1的細(xì)胞群,所述細(xì)胞群對細(xì)胞表面標(biāo)記HLA I為 陽性,且對細(xì)胞表面標(biāo)記HLA II、 CD80或CD86中的至少一種為陰 性。
6. 權(quán)利要求5的細(xì)胞群,其中對于哺乳動物患者的同種異體移 植,所述細(xì)胞群為非免疫原性的。
7. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞來源于腎皮質(zhì)。
8. 權(quán)利要求1的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞來源于腎髓質(zhì)。
9. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞來源于腎包膜下區(qū)。
10. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞群分泌營養(yǎng)因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TEMP-1、 TIMP-2、 MMP-2或VEGF中的至少一種,且不分泌營養(yǎng)因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一種。
11. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞群包括人細(xì)胞、靈長類 動物細(xì)力包或嚙齒類動物細(xì)月包。
12. 權(quán)利要求l的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞群包括腎祖細(xì)胞。
13. 權(quán)利要求12的細(xì)胞群,其中所述腎祖細(xì)胞能夠分化為脂肪細(xì) 胞或成骨細(xì)胞。
14. 一種治療哺乳動物患者的缺血性腎臟疾病的方法,該方法包 括給予哺乳動物患者治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞群, 由此減輕或消除哺乳動物患者的缺血性腎臟組織疾病。
15. 權(quán)利要求14的方法,其中給予所述細(xì)胞群誘導(dǎo)選自以下的作 用(a)形成向缺血組織供應(yīng)血液的血管;(b)血液流向缺血組織;(c) 向缺血組織供應(yīng)氧;和(d)它們的組合。
16. 權(quán)利要求14的方法,其中給予所述細(xì)胞群誘導(dǎo)形成腎包膜下 區(qū)組織、腎皮質(zhì)組織或腎髓質(zhì)組織。
17. 權(quán)利要求14的方法,其中所述哺乳動物患者為人、靈長類動 物或嚙齒類動物。
18. —種替代哺乳動物患者由于外傷、衰老、代謝性或毒性傷害、疾病或特發(fā)性病癥而損傷的腎組織、器官、組分或結(jié)構(gòu)的方法,該方法包括給予哺乳動物患者治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞群,由此減輕或消除哺乳動物患者的受損組織或器官并恢復(fù)腎功 沙R匕。
19. 權(quán)利要求18的方法,其中給予所述細(xì)胞群誘導(dǎo)選自以下的作 用(a)形成向腎臟組織供應(yīng)血液的血管;(b)血液流向腎臟組織;(c) 向腎臟組織供應(yīng)氧;和(d)它們的組合。
20. 權(quán)利要求18的方法,其中給予所述細(xì)胞群誘導(dǎo)形成腎包膜下 區(qū)組織、腎皮質(zhì)組織或腎髓質(zhì)組織。
21. 權(quán)利要求18的方法,其中所述哺乳動物患者為人、靈長類動 物或嚙齒類動物。
22. —種制備分離的哺乳動物腎源細(xì)胞群的方法,該方法包括 由哺乳動物腎臟的包膜下區(qū)、皮質(zhì)或髓質(zhì)獲得組織, 在一種或多種金屬蛋白酶、中性蛋白酶或粘多糖酶存在下溫育組織,以將至少一部分組織解離成單個(gè)細(xì)胞, 將細(xì)胞鋪在基底支持物上,鑒定所述細(xì)胞中以下特征的細(xì)胞亞類陽性表達(dá)Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、釣粘素畫ll、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2 、BMP7或GDF5中的至少 一種并且陰性表達(dá)Sox2 、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中的至少一種,和分離所述細(xì)胞亞類,以提供所述哺乳動物腎源細(xì)胞群。
23. 權(quán)利要求22的方法,其中所述細(xì)胞群陽性表達(dá)Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中的至少一種,且陰 性表達(dá)Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中的至少 一種。
24. 權(quán)利要求22的方法,還包括鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記HLA I為陽 性且細(xì)胞表面標(biāo)記HLA II、 CD80或CD86中的至少一種為陰性的細(xì) 胞亞類的步驟。
25. 權(quán)利要求24的方法,其中對于哺乳動物患者的同種異體移 植,所述細(xì)胞群為非免疫原性的。
26. 權(quán)利要求22的方法,其中所述組織來自哺乳動物腎臟的皮質(zhì)。
27. 權(quán)利要求22的方法,其中所述組織來自哺乳動物腎臟的髓質(zhì)。
28. 權(quán)利要求22的方法,其中所述組織來自哺乳動物腎臟的包膜 下區(qū)。
29. 權(quán)利要求22的方法,其中所述基底支持物為組織培養(yǎng)瓶、支 架或中空纖維型裝置。
30. 權(quán)利要求22的方法,還包括通過有限稀釋和擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)物 中的單個(gè)細(xì)胞從而分離單個(gè)哺乳動物腎源細(xì)胞。
31. 權(quán)利要求22的方法,其中所述組織來自人腎臟。
32. —種用基因療法治療哺乳動物患者的疾病的方法,該方法包括獲得能夠在培養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增的分離或純化的哺乳動物 腎源細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞群對Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、鈣粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá)為陽性,并對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一種的表達(dá)為陰性,遺傳改變分離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群的至少 一種細(xì)胞,以 產(chǎn)生治療性基因產(chǎn)物,擴(kuò)增培養(yǎng)物中遺傳改變的細(xì)胞,和給予哺乳動物患者遺傳改變的細(xì)胞,以減輕或消除哺乳動物患者 的所述疾病。
33. 權(quán)利要求32的方法,其中所述細(xì)胞群對Eyal 、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性,并 對Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一種的表達(dá)為陰性。
34. 權(quán)利要求32的方法,其中所述細(xì)胞群對細(xì)胞表面標(biāo)記HLAI 為陽性,并對細(xì)胞表面標(biāo)記HLA II、 CD80或CD86中的至少一種為 陰性。
35. 權(quán)利要求34的方法,其中所述細(xì)胞群對哺乳動物患者的同種 異體移植是非免疫原性的。
36. 權(quán)利要求32的方法,其中將遺傳改變的細(xì)胞給予哺乳動物患 者的腎膝,以治療哺乳動物患者的腎臟疾病、腎臟傷害、腎臟缺血或 遺傳缺陷。
37. 權(quán)利要求32的方法,其中所述哺乳動物患者為人、靈長類動 物或嚙齒類動物。
38. 權(quán)利要求32的方法,其中所迷哺乳動物腎源細(xì)胞群來源于 人、靈長類動物或嚙齒類動物的腎臟。
39. 權(quán)利要求38的方法,其中所述哺乳動物腎源細(xì)胞群來源于人 的腎臟,并且將所述細(xì)胞進(jìn)行子宮內(nèi)移植,從而在移植后在出生前或 出生后的人患者中產(chǎn)生人腎細(xì)胞,其中所述細(xì)胞在人或動物中產(chǎn)生治 療產(chǎn)物,以減輕或消除人患者的所述疾病。
40. —種篩選治療涉及哺乳動物患者腎細(xì)胞的疾病的藥物候選物 的方法,該方法包括以下步驟(a) 提供分離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群,所述細(xì)胞群能夠在培 養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增,其中所述細(xì)胞群對Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、 4丐 粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox誦17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá)為陽性,并對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一種的表達(dá)為陰性;(b) 在增殖條件下培養(yǎng)哺乳動物腎源細(xì)胞群,以獲得細(xì)胞組合物, 其包含具有體外自我更新和擴(kuò)增潛力或該潛力增加的細(xì)胞;(c) 使得自步驟(a)或(b)的培養(yǎng)細(xì)胞接觸藥物候選物;和(d) 檢測是否存在藥物候選物對細(xì)胞存活或所述細(xì)胞的形態(tài)、功能 或生理特征和/或分子生物學(xué)特性的作用,由此改變細(xì)胞存活、細(xì)胞的 形態(tài)、功能或生理特征和/或細(xì)胞的分子生物學(xué)特性的作用表明所述藥 物候選物具有治療腎細(xì)胞疾病的活性。
41. 權(quán)利要求40的方法,其中所述細(xì)胞群對Eyal、 WTl、FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性,且 對Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中至少 一種的表達(dá)為陰性。
42. 權(quán)利要求40的方法,其中細(xì)胞的形態(tài)、功能或生理特征是腎 小管形成增加或BMP或BMP受體表達(dá)增加。
43. 權(quán)利要求40的方法,其中細(xì)胞的形態(tài)、功能或生理特征是營 養(yǎng)因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TIMP-1、 TIMP-2、 VEGF或MMP-2中 至少一種或多種的分泌增加。
44. 權(quán)利要求40的方法,其中所述疾病為哺乳動物患者的缺血性 腎病或由于外傷、衰老、代謝性或毒性傷害、疾病或特發(fā)性病癥而引起的腎臟組織、器官、組分或結(jié)構(gòu)的損傷。
45. —種測定測試物影響腎細(xì)胞功能的毒性的方法,其包括以下 步驟(a) 提供能夠在培養(yǎng)物中自我更新和擴(kuò)增的分離或純化的哺乳動 物腎源細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞群對Oct-4、 Rex誦l、 Pax-2、鈣粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、麗F3B、 CXC畫R4、 Sox-17、 EpoR、 B證2、 BMP7或GDF5中至少一種的表達(dá)為陽性,并對Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一種的表達(dá)為陰性;(b) 使所述細(xì)胞群與測試物接觸;和(c) 檢測是否存在測試物對細(xì)胞群中的細(xì)胞存活或細(xì)胞群中的細(xì) 胞的形態(tài)、功能或生理特征和/或分子生物學(xué)特性的作用,由此改變細(xì) 胞群中的細(xì)胞存活、細(xì)胞的形態(tài)、功能或生理特征和/或細(xì)胞的分子生 物學(xué)特性的作用表明測試物對腎細(xì)胞功能具有毒性。
46. 權(quán)利要求45的方法,其中所述細(xì)胞群對Eyal、 WTl、FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一種的表達(dá)為陽性,并 對Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中至少 一種的表達(dá)為陰性。
47. 權(quán)利要求45的方法,其中細(xì)胞的形態(tài)、功能或生理特征是腎 小管形成或者BMP或BMP受體表達(dá)。
48. 權(quán)利要求47的方法,其中檢測到增加的測試物毒性為腎小管 形成減少或者BMP或BMP受體表達(dá)降低。
49. 權(quán)利要求45的方法,其中細(xì)胞的形態(tài)、功能或生理特征是營 養(yǎng)因子FGF2、 HGF、 TGFot、 TIMP-1、 TIMP-2、 VEGF或MMP-2中 至少一種或多種的分泌。
全文摘要
本發(fā)明提供得自哺乳動物腎臟組織的分離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群。提供分離和純化哺乳動物腎源細(xì)胞群的方法。提供通過給予哺乳動物患者分離或純化的哺乳動物腎源細(xì)胞群治療腎病的方法。
文檔編號C12N5/071GK101595212SQ200780045631
公開日2009年12月2日 申請日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者A·戈塞夫斯卡, A·西達(dá), C·S·比恩蘇西索, D·C·科爾特 申請人:伊西康公司
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