專利名稱：使用具有過氧化水解活性的酶生產(chǎn)過酸的制作方法
本申請是于2006年12月12日提交的第11/638,635號美國專利申請的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請要求于2005年12月13日提交的第60/750,092號美國臨時申請和于2006年10月20日提交的第60/853,065號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及過酸生物合成和原位酶催化領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了使用酶的過氧化水解(perhydrolysis)活性產(chǎn)生過酸的方法，所述酶在結(jié)構(gòu)上被鑒定為屬于糖酯酶的CE-7家族，包括頭孢菌素乙酰水解酶(CAHs；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。該酶促方法由羧酸酯底物產(chǎn)生過羧酸。此外，本發(fā)明還提供了包含通過本文所述方法產(chǎn)生的過酸的消毒制劑。
背景技術(shù)：
過酸組合物已報道是有效的抗微生物劑。針對不希望有的微生物生長使硬質(zhì)表面、肉制品、活植物組織和醫(yī)療器材清潔、消毒和/或衛(wèi)生處理的方法已得到描述(美國專利6,545,047；美國專利6,183,807；美國專利6,518,307；美國專利申請公布20030026846；和美國專利5,683,724)。也已報道過酸在制備用于衣物洗滌劑應(yīng)用的漂白組合物中是有用的(美國專利3,974,082；美國專利5,296,161；和美國專利5,364,554)。
過酸可以通過羧酸和過氧化氫的化學(xué)反應(yīng)進行制備(參見“OrganicPeroxides”，Daniel Swern編輯，第1卷，第313-516頁；Wiley Interscience，New York，1971)。該反應(yīng)通常由強無機酸例如濃硫酸催化。過氧化氫與羧酸的反應(yīng)是平衡反應(yīng)，并且過酸的產(chǎn)生通過使用過量濃度的過氧化物和/或羧酸，或通過去除水而得到促進。關(guān)于用于過酸產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)存在幾個缺點a)用于促進過酸產(chǎn)生的高濃度羧酸在使用含過酸溶液時可以導(dǎo)致不希望有的氣味，2)過酸隨著時間的過去在溶液中時常是不穩(wěn)定的，并且溶液中的過酸濃度在使用前的貯存期間降低，和3)由于使用濃硫酸作為催化劑該制劑通常是強酸性的。
克服過酸化學(xué)生產(chǎn)的缺點的一種方法是使用酶催化劑代替強酸催化劑。酶催化劑的使用允許在使用和/或應(yīng)用時快速產(chǎn)生過酸，從而避免了與過酸溶液貯存和隨著時間的過去過酸濃度變化相關(guān)的問題。一般用于經(jīng)由與過氧化氫的直接化學(xué)反應(yīng)來產(chǎn)生過酸的高濃度的羧酸不是過酸的酶促生產(chǎn)所需的，其中酶催化的反應(yīng)可以使用濃度比化學(xué)反應(yīng)中一般使用的濃度低得多的羧酸酯作為底物。酶反應(yīng)可以跨越廣泛范圍的pH來進行，取決于在給定pH下的酶活性和穩(wěn)定性，并且取決于在給定pH下對于過氧化水解的底物特異性。
酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相應(yīng)的羧酸的能力(式1)。
式1脂肪酶、酯酶或 蛋白酶 R1COOR2+H2O→R1COOH+HOR2 某些酯酶、蛋白酶和脂肪酶還顯示出過氧化水解活性，催化來自烷基酯的過酸合成(式2)。
式2 脂肪酶、酯酶或 蛋白酶 R1COOR2+H2O2→R1COOOH+HOR2 O.Kirk等人(Biocatalysis，1165-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化酰基底物與過氧化氫的過氧化水解以形成過氧羧酸，并且報道過氧化水解在水系統(tǒng)中以非常低的效率進行。此外，他們發(fā)現(xiàn)脂肪酶和酯酶使過羧酸降解成相應(yīng)的羧酸和過氧化氫。他們還發(fā)現(xiàn)蛋白酶在水中既不降解羧酸酯也不催化羧酸酯的過氧化水解。作者得出結(jié)論，酯酶、脂肪酶和蛋白酶一般不適于在水環(huán)境中催化簡單酯類例如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯(trioctanoin)的過氧化水解。
美國專利3,974,082描述了通過使待漂白的材料與水溶液接觸來生產(chǎn)用于衣物洗滌劑應(yīng)用的漂白組合物，所述水溶液包含釋放氧的無機過氧化合物、酰基烷基酯和能夠使該酯水解的酯酶或脂肪酶。
美國專利5,364,554描述了用于使用蛋白酶、過氧化氫來源和優(yōu)選地在化學(xué)上不能過氧化水解的酯底物在水溶液中原位生成過酸的活化氧化劑系統(tǒng)。還公開了漂白方法和形成過酸的方法。
美國專利5,296,161描述了在包含一種或多種特定酯酶和脂肪酶、過氧化氫來源和適于在漂白組合物中使用的官能化酯底物的水溶液中生產(chǎn)過酸。然而，產(chǎn)生的過酸濃度一般不足以用于在許多商業(yè)消毒應(yīng)用中使用。
用于使用酶催化劑由相應(yīng)的羧酸酯制備過酸的大部分已知方法不能產(chǎn)生和積聚濃度高至足以在各種應(yīng)用中有效消毒的過酸。近期已報道，幾種蛋白酶和脂肪酶組合原位產(chǎn)生濃度適于用作消毒劑和/或商業(yè)漂白劑的過酸(例如過乙酸)(參見共同擁有的美國專利申請11/413,246和11/588,523；引入本文作為參考)。然而，仍需要鑒定能夠原位產(chǎn)生過酸的另外的過氧化水解酶(perhydrolase)。
美國專利4,444,886描述了具有酯水解酶活性(描述為“甘油二乙酸酯酶(acetinase)”)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株(ATCC31954TM)，其具有用于水解具有含2-8個碳原子的?；母视王サ母咛禺愋?。美國專利4,444,886沒有描述、討論或預(yù)測這種菌株的酯水解酶活性具有對于羧酸酯(包括甘油酯)的過氧化水解酶活性。
待解決的問題是提供原位酶促生成濃度適于在各種消毒應(yīng)用和/或漂白應(yīng)用中使用的過酸的方法。優(yōu)選地，用于生成過酸組合物的底物應(yīng)當(dāng)是相對無毒和價廉的，例如羧酸酯，特別是單?；视?、二?；视秃腿；视?，其中酰基具有1-8個碳原子，以及乙?；恰?br>
發(fā)明簡述 所述問題已通過下述發(fā)現(xiàn)得到解決在結(jié)構(gòu)上屬于CE-7酯酶家族的酶(例如頭孢菌素C脫乙酰酶[CAHs]和乙酰木聚糖酯酶[AXEs])表現(xiàn)出用于將羧酸酯(在過氧的無機來源例如過氧化氫存在下)轉(zhuǎn)化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過酸的顯著過氧化水解活性。該系統(tǒng)通過產(chǎn)生高濃度過酸而又不需要高濃度過氧而實現(xiàn)效率。
過氧化水解酶的具體實例來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(ATCC 31954TM)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BE1010(Payne andJackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))，枯草芽孢桿菌ATCC6633TM(U.S.6,465,233)，枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM；地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM(Rey等人，genome Biol.，5(10)article77(2004))，熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC 27405TM(Copeland等人，
ZP 00504991，B.pumilus PS213(Degrassi等人，Microbiology，1461585-1591(2000))，和那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)(
AAB70869.1)。
本文所描述的每一本發(fā)明過氧化水解酶享有保守結(jié)構(gòu)特征(即保守特征基序(signature Motif))以及與其他α/β-水解酶(例如可商購獲得的脂肪酶；參見比較實施例26和28)相比具有優(yōu)異的過氧化水解活性，使得該獨特的酶家族特別適于原位生成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過酸。適用于本發(fā)明方法的過氧化水解酶可通過在糖酯酶CE-7家族內(nèi)發(fā)現(xiàn)的保守特征基序來鑒定。
在本發(fā)明的一個方面，提供了方法，包括用于由羧酸酯生產(chǎn)過氧羧酸的方法，所述方法包括 a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括 1)選自下列的羧酸酯 i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及 iii)選自乙酰化單糖、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?； 2)過氧源；以及 3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶包含特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和 b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此產(chǎn)生過氧羧酸。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了方法，包括使用酶促產(chǎn)生的過氧酸組合物消毒硬質(zhì)表面或無生命物體的方法，所述方法包括 a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括 1.選自下列的底物 i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)； iii)選自乙?；瘑翁?、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?； 2)過氧源；以及 3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶催化劑包含特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和 b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此形成過氧羧酸產(chǎn)物； c)任選將所述過氧羧酸產(chǎn)物稀釋；以及 d)將所述硬質(zhì)表面或無生命物體與在步驟b)或步驟c)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，由此將所述表面或所述無生命物體消毒。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了系統(tǒng)，包括產(chǎn)生過氧羧酸的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 a)選自下列的底物 1)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 2)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及 3)選自乙?；瘑翁?、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?； 以及 b)過氧源；以及 c)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶具有特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了制劑，所述制劑包含 a)包含酶催化劑和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化劑包含具有CE-7特征基序的過氧化水解酶，所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物；所述第一混合物任選包含選自下列的另外組分無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、潤濕劑、以及它們的組合；以及 b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選還包含螯合劑。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了制劑，所述制劑包含 a)包含酶催化劑和乙?；堑牡谝换旌衔铮雒复呋瘎┌哂蠧E-7特征基序的過氧化水解酶，所述乙?；沁x自乙酰化單糖、乙酰化二糖、乙?；嗵且约八鼈兊慕M合，所述第一混合物任選還包含無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑和潤濕劑；以及 b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選包含螯合劑。
在其他方面，可以將上述第一和第二混合物合并以用于生產(chǎn)過氧羧酸。在另一個方面，可將上述第一和第二混合物合并以形成消毒制劑。
本發(fā)明的另一個方面是重組大腸桿菌(Escherichia coli)細胞，所述細胞包含katE中的破壞(disruption)和katG中的破壞，條件是所述宿主細胞不是大腸桿菌(Escherichia coli)UM2。在另一個方面，包含katE中的破壞和katG中的破壞的重組大腸桿菌宿主細胞源自大腸桿菌菌株MG1655。在另一個方面，大腸桿菌宿主細胞或菌株產(chǎn)生或包含至少一種具有過氧化水解酶活性的酶。在另一個方面，所述酶能夠使用或者產(chǎn)生過氧化氫。
具有在本發(fā)明方法中使用的過氧化水解活性的酶催化劑可以是非存活完整細胞、透化的完整細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞成分、部分純化的酶和純化的酶的形式。酶催化劑可以是未固定或固定的，包括但不限于固定在不溶性固體載體中或其上，與可溶性聚合物(例如，低分子量聚乙二醇(PEG))共價附著，和在空心纖維筒中作為可溶性酶固定。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了降低硬質(zhì)表面或無生命物體上的微生物群體濃度的方法，所述方法包括將由上述方法產(chǎn)生的過酸組合物與所述硬質(zhì)表面或無生命物體接觸，由此使存活微生物群體的濃度降低至少3-log，優(yōu)選地至少4-log，更優(yōu)選地至少5-log，并且最優(yōu)選地至少6-log。在另一個方面，在與待處理的表面或無生命物體接觸前，通過上述方法產(chǎn)生的過酸組合物可以任選稀釋至所需有效濃度。
附圖簡述
圖1(組a-c)是本發(fā)明過氧化水解酶的CLUSTALW比對。每一種過氧化水解酶在結(jié)構(gòu)上被歸類為糖酯酶家族7(CE-7)，并且共享一些保守域。已經(jīng)鑒定了幾個保守基序(加下劃線)，它們一起形成CE-7糖酯酶的特征基序。另外的基序(LXD；SEQ ID NO2的氨基酸殘基267-269)也加了下劃線，并且可用于進一步表征特征基序。
生物序列簡述 下面的序列遵照37C.F.R.以下序列遵照C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”(對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求-序列規(guī)則))，并且符合World Intellectual Property Organization(世界知識產(chǎn)權(quán)組織，WIPO)ST.25標準(1998)以及歐洲專利公約(EPC)和專利合作條約(PCT)的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)以及行政指令的第208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的規(guī)則。
隨同在光盤上提供了序列表。隨同在光盤上提供了序列表。包含序列表的光盤的內(nèi)容依照37CFR 1.52(e)在此引入作為參考。
SEQ ID NO1是來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM的頭孢菌素C脫乙酰酶(cah)編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO2是來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO3和4是用于PCR擴增來自枯草芽孢桿菌物種的過氧化水解酶基因以構(gòu)建pSW186、pSW187、pSW188和pSW190的引物。
SEQ ID NO5是來自枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO6是來自枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列，并且與來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BE1010的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列相同。
SEQ ID NO7是來自枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM的頭孢菌素乙酰酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO8是來自枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM的頭孢菌素乙酰酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO9是來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM的頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO10是來自地衣芽孢桿菌ATCC 14580TM的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO11是來自短小芽孢桿菌(B.pumilus)PS213的乙酰木聚糖酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO12是來自短小芽孢桿菌PS213的乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO13是來自熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405TM的乙酰木聚糖酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO14是來自熱纖梭菌ATCC 27405TM的乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO15是來自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO16是來自那不勒斯棲熱袍菌的乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO17是來自海棲熱袍菌(Thermotoga Maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO18是來自海棲熱袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO19是來自熱厭氧芽孢桿菌屬(Thermoanaerobacteriumsp.)物種JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO20是來自熱厭氧芽孢桿菌屬物種JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO21是來自芽孢桿菌屬(Bacillus sp)物種NRRL B-14911的頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO22是來自芽孢桿菌屬物種NRRL B-14911的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO23是來自喜鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)C-125的頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO24是來自喜鹽芽孢桿菌C-125的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO25是來自克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)KSM-K16的頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)的核酸序列。
SEQ ID NO26是來自克勞氏芽孢桿菌KSM-K16的頭孢菌素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO27和28是用于PCR擴增來自枯草芽孢桿菌物種的過氧化水解酶基因以構(gòu)建pSW194和pSW189的引物。
SEQ ID NO29是克隆到pSW194內(nèi)的PCR產(chǎn)物的核酸序列。
SEQ ID NO30是克隆到pSW189內(nèi)的PCR產(chǎn)物的核酸序列。
SEQ ID NO31是克隆到pSW190內(nèi)的枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM頭孢菌素C脫乙酰酶(cah)基因的核酸序列。
SEQ ID NO32是枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM頭孢菌素C脫乙酰酶(CAH)的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO33和34是用于PCR擴增地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)ATCC 14580TM頭孢菌素C脫乙酰酶基因以構(gòu)建pSW191的引物， SEQ ID NO35和36是用于PCR擴增熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405TM乙酰木聚糖酯酶基因以構(gòu)建pSW193的引物。
SEQ ID NO37和38是用于PCR擴增短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶編碼序列(
AJ249957)以構(gòu)建pSW195的引物。
SEQ ID NO39和40是用于PCR擴增那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶基因(
58632)以構(gòu)建pSW196的引物。
SEQ ID NO41是在質(zhì)粒pSW196中的那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的變型的核酸序列。
SEQ ID NO42是卡那霉素抗性基因的核酸序列。
SEQ ID NO43是質(zhì)粒pKD13的核酸序列。
SEQ ID NO44和45是用于產(chǎn)生編碼卡那霉素基因的PCR產(chǎn)物的引物，所述卡那霉素基因的側(cè)翼是與katG大腸桿菌(E.coli)MG1655中的katG過氧化氫酶基因具有同源性的區(qū)域。所述產(chǎn)物用于破壞內(nèi)源性katG基因。
SEQ ID NO46是編碼卡那霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的側(cè)翼是與大腸桿菌MG1655中的katG過氧化氫酶基因具有同源性的區(qū)域。所述產(chǎn)物用于破壞內(nèi)源性katG基因。
SEQ ID NO47是大腸桿菌MG1655中的katG過氧化氫酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO48是大腸桿菌MG1655中的katG過氧化氫酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO49是質(zhì)粒pKD46的核酸序列。
SEQ ID NO50和51是用于證實katG基因破壞的引物。
SEQ ID NO52是質(zhì)粒pCP20的核酸序列。
SEQ ID NO53和54是用于產(chǎn)生編碼卡那霉素基因的PCR產(chǎn)物的引物，所述卡那霉素基因的側(cè)翼是與大腸桿菌MG1655中的katE過氧化氫酶基因具有同源性的區(qū)域。所述產(chǎn)物用于破壞內(nèi)源性katE基因。
SEQ ID NO55是編碼卡那霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的側(cè)翼是與大腸桿菌MG1655中的katE過氧化氫酶基因具有同源性的區(qū)域。所述產(chǎn)物用于破壞內(nèi)源性katE基因。
SEQ ID NO56是大腸桿菌MG1655中的katE過氧化氫酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO57是大腸桿菌MG1655中的katE過氧化氫酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO58和59是用于證實以下菌株中的katE基因破壞的引物單剔除菌株大腸桿菌MG1655ΔkatE，和雙剔除菌株大腸桿菌MG1655ΔkatGΔkatE，后者在本文中稱為大腸桿菌KLP18。
SEQ ID NO60是編碼氨基酸序列SEQ ID NO12的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)PS213的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的變型的核酸序列。
SEQ ID NO61是包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基118-299的區(qū)域的氨基酸序列。
發(fā)明詳述 所述問題已通過下述發(fā)現(xiàn)得到解決屬于CE-7糖酯酶家族的酶表現(xiàn)出用于將羧酸酯底物轉(zhuǎn)化成過酸的顯著過氧化水解活性。該家族的在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶可用于產(chǎn)生具有用于消毒和/或漂白應(yīng)用的高效率的過酸濃縮物。
在本公開中，使用了大量術(shù)語和縮寫。除非另有具體說明，應(yīng)用下述定義。
如本文所使用，術(shù)語“包含”意指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟或成分的存在，但它不預(yù)先排除一種或多種其他特征、整數(shù)、步驟、成分或其組的存在或添加。
如本文所使用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量或使用的術(shù)語“約”是指可以通過例如以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化在真實世界中用于制備濃縮物或使用溶液的一般測量和液體處理操作；這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等等。術(shù)語“約”還包括由于對于起因于特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。
如本文所使用，術(shù)語“過酸”與過氧酸(peroxyacid)、過氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、過氧酸(peroxy acid)、過羧酸(percarboxylicacid)和過氧性酸(peroxoic acid)同義。
如本文所使用，術(shù)語“過乙酸”縮寫為“PAA”，并且與過氧乙酸、乙過氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登記號79-21-0的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油一乙酸酯”與甘油單乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油單醋酸酯同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油二乙酸酯”與二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登記號25395-31-7的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油三乙酸酯”與三乙酸甘油酯；三醋酸甘油酯；甘油三醋酸酯；1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登記號102-76-1的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油一丁酸酯”與一丁酸甘油酯、甘油單丁酸酯和一丁酸甘油基酯同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油二丁酸酯”與二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油三丁酸酯”與三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁?；视鸵约癈AS登記號60-01-5的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油一丙酸酯”與一丙酸甘油酯、甘油單丙酸酯和一丙酸甘油基酯同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油二丙酸酯”與二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同義。
如本文所使用，術(shù)語“甘油三丙酸酯”與三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙?；视鸵约癈AS登記號139-45-7的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“乙酸乙酯”與醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登記號141-78-6的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“乳酸乙酯”與乳酸乙基酯以及CAS登記號97-64-3的所有其他同義詞同義。
如本文所使用，術(shù)語“乙酰化糖”和“乙?；嗵恰笔侵赴辽僖粋€乙?；膯翁?、二糖和多糖。實例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙?；揪厶?、乙?；揪厶瞧巍ⅵ?D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙?；?葡萄烯糖。
如本文所使用，術(shù)語“合適的酶促反應(yīng)混合物”、“適于原位生產(chǎn)過酸的成分”、“合適的反應(yīng)成分”和“合適的含水反應(yīng)混合物”是指其中反應(yīng)物和酶催化劑發(fā)生接觸的材料和水。本文提供了合適的含水反應(yīng)混合物的成分，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解適于這種方法的成分變化范圍。在一個實施方案中，合適的酶促反應(yīng)混合物在反應(yīng)成分組合后原位生產(chǎn)過酸。像這樣，反應(yīng)成分可以作為其中一種或多種反應(yīng)成分保持分離直至使用的多成分系統(tǒng)提供。用于使多種活性成分組合的系統(tǒng)和裝置的設(shè)計是本領(lǐng)域已知的，并且一般將取決于個別反應(yīng)成分的物理形式。例如，多重活性流體(液體-液體)系統(tǒng)一般使用多室分配瓶或二相系統(tǒng)(美國專利申請公開2005/0139608；美國專利5,398,846；美國專利5,624,634；美國專利6,391,840；E.P.專利0807156B1；美國專利申請公開2005/0008526；和PCT公開WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白劑在使反應(yīng)性流體混合后產(chǎn)生的某些漂白應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的。用于產(chǎn)生過酸的其他形式的多成分系統(tǒng)可以包括但不限于，設(shè)計用于一種或多種固體成分或固體-液體成分組合的那些，例如粉劑(例如，許多商購可得的漂白組合物，美國專利5,116,575)、多層片(美國專利6,210,639)、具有多個隔室的水溶性包(美國專利6,995,125)和在水添加后反應(yīng)的固體凝聚物(美國專利6,319,888)。在一個實施方案中，制劑是作為兩個單獨混合物提供，由此在將兩個混合物合并后產(chǎn)生過氧羧酸。在另一個實施方案中，提供了制劑，所述制劑包含 a)第一混合物，所述第一混合物包含 i)具有過氧化水解酶活性的酶催化劑，所述酶催化劑包含具有CE-7特征基序的酶；以及 ii)羧酸酯底物，所述第一混合物任選包含選自下列的另外組分無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、潤濕劑、以及它們的組合；以及 b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選還包含螯合劑。
在另一個實施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯以及它們的組合。在另一個實施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯是乙酰化糖。在另一個實施方案中，所述第一混合物中的酶催化劑是固體顆粒。在另一個實施方案中，所述第一混合物是固體片或粉末。
如本文所使用，術(shù)語“過氧化水解”定義為所選底物與過氧化物的形成過酸的反應(yīng)。一般地，無機過氧化物與所選底物在催化劑存在下反應(yīng)以生成過酸。如本文所使用，術(shù)語“化學(xué)過氧化水解”包括其中底物(過酸前體)與過氧化氫來源組合的過氧化水解反應(yīng)，其中過酸在不存在酶催化劑的情況下形成。
如本文所使用，術(shù)語“過氧化水解酶活性”是指每單位質(zhì)量(例如毫克)蛋白、干細胞重量或固定的催化劑重量的催化劑活性。
如本文所使用，“一個酶活性單位”或“一個活性單位”或“U”定義為，在指定溫度每分鐘產(chǎn)生1μmol過酸產(chǎn)物所需的過氧化水解酶活性的量。
如本文所使用，術(shù)語“酶催化劑”和“過氧化水解酶催化劑”是指包含具有過氧化水解活性的酶的催化劑，并且可以是完整微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式。酶催化劑還可以是化學(xué)修飾的(例如通過聚乙二醇化(pegylation)或者通過與交聯(lián)試劑反應(yīng)來修飾)。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將過氧化水解酶固定在可溶性或不溶性載體上；參見例如“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有過氧化水解活性的所有本發(fā)明酶在結(jié)構(gòu)上都是酶的糖家族酯酶家族7(CE-7家族)的成員(參見Coutinho，P.M，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymesan integrated database approach”，“RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat and B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12頁)。
CE-7家族的成員包括頭孢菌素C脫乙酰酶(CAHs；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成員共享保守特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330593-606(2003))。包含CE-7特征基序和/或基本上類似結(jié)構(gòu)的過氧化水解酶都適用于本發(fā)明。用于鑒定基本上類似生物分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如序列比對方案、核酸雜交、保守特征基序的存在等)。在一個方面，本發(fā)明方法中的酶催化劑包含與本文提供的序列具有至少40％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、甚至更優(yōu)選至少70％、更加優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％的同一性，并且最優(yōu)選至少95％氨基酸同一性的基本上類似的酶。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明CE-7糖酯酶的核酸分子。在另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的過氧化水解酶催化劑由在嚴格條件下與一個本發(fā)明核酸分子雜交的核酸分子編碼。
如本文所使用，術(shù)語“頭孢菌素C脫乙酰酶”和“頭孢菌素C乙?；饷浮笔侵复呋^孢菌素例如頭孢菌素C和7-氨基頭孢烷酸的脫乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，同上)。如本文所述，提供了具有顯著過氧化水解活性的幾種頭孢菌素C脫乙酰酶。
如本文所使用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰化糖的脫乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXEs)。如本文所述，提供了具有顯著過氧化水解酶活性的歸類為乙酰木聚糖酯酶的幾種酶。
如本文所使用，術(shù)語“枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ATCC31954TM)”是指具有國際保藏登記號ATCC 31954TM的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的細菌細胞。已報道枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM具有能夠水解具有2-8個碳酰基的甘油酯，特別是甘油二乙酸酯的酯水解酶(“甘油二乙酸酯酶”)活性(美國專利4,444,886；全文引入本文以供參考)。如本文所描述的，已從枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM中分離出具有顯著過氧化水解酶活性的酶，并且作為SEQ ID NO2提供。分離的酶的氨基酸序列與由
登記號BAA01729.1提供的頭孢菌素C脫乙酰酶具有100％的氨基酸同一性。
如本文所使用，術(shù)語“枯草芽孢桿菌BE1010”是指如由Payne和Jackson(J.Bacteriol.1732278-2282(1991))報道的枯草芽孢桿菌菌株?？莶菅挎邨U菌BE1010是在編碼枯草桿菌蛋白酶和中性蛋白酶的基因中具有染色體缺失的衍生枯草芽孢桿菌枯草亞種(subtilis)菌株BR151(ATCC33677TM)。如本文所述，已從枯草芽孢桿菌AB.subtilis BE1010中分離出了具有顯著過氧化水解酶活性的酶，并且作為SEQ ID NO6提供。分離的酶的氨基酸序列與由枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168中報道的頭孢菌素C脫乙酰酶(Kunst等人，同上)具有100％的氨基酸同一性。
如本文所使用，術(shù)語“枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM”是指具有國際保藏登記號ATCC 31954TM的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢桿菌菌株。如本文所描述，已從枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM中分離出和測序了具有顯著過氧化水解酶活性的酶，并且作為SEQ IDNO32提供。
如本文所使用，術(shù)語“熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405TM”是指具有國際保藏登記號ATCC 27405TM的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的熱纖梭菌菌株。來自熱纖梭菌(C.thermocellum)ATCC 27405TM的具有過氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作為SEQ ID NO14提供。
如本文所使用，術(shù)語“枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM”是指具有國際保藏登記號ATCC 6633TM的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的細菌細胞。已有報道枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM具有頭孢菌素乙酰水解酶活性(美國專利6,465,233)。來自枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM的具有過氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作為SEQ ID NO8提供。
如本文所使用，術(shù)語“地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580TM”是指具有國際保藏登記號ATCC 14580TM的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的細菌細胞。已有報道地衣芽孢桿菌ATCC14580TM具有頭孢菌素乙酰水解酶活性。來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM的具有過氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作為SEQ ID NO10提供。
如本文所使用，術(shù)語“短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)PS213”是指據(jù)報道具有乙酰木聚糖酯酶活性的細菌細胞(
AJ249957)。來自短小芽孢桿菌PS213的具有過氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作為SEQ ID NO12提供。
如本文所使用，術(shù)語“那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)”是指據(jù)報道具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯棲熱袍菌菌株(
58632)。來自那不勒斯棲熱袍菌的具有過氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作為SEQ ID NO16提供。
如本文所使用，“分離的核酸分子”和“分離的核酸片段”將可互換使用，并且是指單鏈或雙鏈的，任選含有合成的、非天然的或改變了的核苷酸堿基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區(qū)段構(gòu)成。
術(shù)語“氨基酸”是指蛋白質(zhì)或多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)單位。在本文中使用下列縮寫來表示具體氨基酸 三字母 單字母 氨基酸 縮寫 縮寫 丙氨酸 AlaA 精氨酸 ArgR 天冬酰胺 AsnN 天冬氨酸 AspD 半胱氨酸 CysC 谷氨酰胺 GlnQ 谷氨酸 GluE 甘氨酸 GlyG 組氨酸 HisH 異亮氨酸 IleI 亮氨酸 LeuL 賴氨酸 LysK 甲硫氨酸 MetM 苯基丙氨酸 PheF 脯氨酸 ProP 絲氨酸 SerS 蘇氨酸 ThrT 色氨酸 TrpW 酪氨酸 TyrY 纈氨酸 ValV 任何氨基酸或如本文中所定義 XaaX 如本文所使用，“基本上相似的”是指其中一個或多個核苷酸堿基中的改變導(dǎo)致一個或多個氨基酸的添加、取代或缺失，但不影響由DNA序列編碼的蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)(即過氧化水解活性)的核酸分子。如本文所使用，“基本上相似的”還指具有與本文報道的序列有至少40％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、更加優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％同一性的氨基酸序列的酶，其中所得到的酶保留功能性質(zhì)(即，過氧化水解活性)?！盎旧舷嗨啤边€可以指由在嚴格條件下與本文報道的核酸分子雜交的核酸分子編碼的具有過氧化水解活性的酶。因此應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包含了超過具體的示例性序列。
例如，本領(lǐng)域眾所周知的是，在給定位點處導(dǎo)致產(chǎn)生化學(xué)上等價的氨基酸但不影響編碼蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)的基因中的改變是常見的。為了本發(fā)明的目的，取代定義為在下述5組之一內(nèi)的交換 1.小的脂族非極性殘基或稍微極性的殘基Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)； 2.極性的、帶負電荷的殘基和它們的酰胺Asp、Asn、Glu、Gln； 3.極性的、帶正電荷的殘基His、Arg、Lys； 4.大的脂族非極性殘基Met，Leu，Ile，Val(Cys)；以及 5.大的芳族殘基Phe、Tyr、Trp。
因此，關(guān)于氨基酸丙氨酸，一種疏水性氨基酸的密碼子，可以被編碼另一個疏水性更弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性更強的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)取代。類似地，導(dǎo)致用一個帶負電荷的殘基替換另一個帶負電荷的殘基(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個帶正電荷的殘基替換另一個帶正電荷的殘基(例如賴氨酸替換精氨酸)的改變也可以預(yù)期產(chǎn)生功能上等價的產(chǎn)物。在許多情況下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化也預(yù)期不改變蛋白質(zhì)的活性。
所提議的修飾中的每一種完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如編碼產(chǎn)物的生物活性保留的測定。此外，技術(shù)人員認識到本發(fā)明包括基本上相似的序列。在一個實施方案中，基本上相似的序列由其在嚴格條件下(0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS洗滌，隨后為0.1×SSC，0.1％SDS，65℃)與本文例示的序列雜交的能力限定。在一個實施方案中，本發(fā)明包括由在嚴格條件下與本文報道的核酸分子雜交的分離核酸分子編碼的具有過氧化水解酶活性的酶。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括由在嚴格條件下與具有選自下列的核酸序列的核酸分子雜交的分離核酸分子編碼的具有過氧化水解酶活性的酶SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
如本文所用，當(dāng)在合適的溫度和溶液離子強度條件下單鏈形式的第一個分子可以退火至另一分子時，核酸分子“可雜交”至另一核酸分子，例如cDNA、基因組DNA或RNA分子。雜交和洗滌條件是眾所周知的，并且在Sambrook，J.和Russell，D.，T.“Molecular CloningA LaboratoryManual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)中舉例說明。溫度和離子強度條件確定了雜交的“嚴格性”。可以調(diào)節(jié)嚴格條件以篩選中度相似的分子例如來自遠緣生物的同源序列)，到篩選高度相似的分子例如從近緣生物復(fù)制功能性酶的基因。雜交后洗滌通常決定嚴格條件。一組優(yōu)選的條件采用一系列如下洗滌開始采用6×SSC、0.5％SDS在室溫下持續(xù)洗滌15分鐘，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗滌30分鐘，最后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重復(fù)洗滌30分鐘兩次。更優(yōu)選的一組條件采用更高的溫度，其中洗滌與上述洗滌相同，不同的是最后兩次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗滌30分鐘時的溫度被增加到60℃。另一組優(yōu)選的嚴格雜交條件為0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS洗滌，隨后為與本文例示序列的0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最終洗滌。
雜交需要兩種核酸含有互補序列，但是取決于雜交的嚴格性，堿基之間可能會發(fā)生錯配。用于使核酸雜交的合適嚴格性取決于核酸的長度和互補的程度，所述長度和互補程度是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的變量。兩條核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的雜交體的Tm值就越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)較高的Tm)按以下順序依次降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對于長度超過100個核苷酸的雜交體，已經(jīng)推導(dǎo)出了用于計算Tm的公式(請參見Sambrook和Russell，同上)。對于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯配的位置變得更重要，而且寡核苷酸的長度決定了其特異性(參見Sambrook和Russell，同上)。在一個方面，可雜交核酸的長度為至少約10個核苷酸。優(yōu)選地，關(guān)于可雜交核酸的最低限度長度為長度至少約15個核苷酸，更優(yōu)選長度至少約20個核苷酸，更加優(yōu)選長度至少30個核苷酸，更加優(yōu)選長度至少300個核苷酸，最優(yōu)選長度至少800個核苷酸。此外，技術(shù)人員將認識到，可根據(jù)需要根據(jù)諸如探針長度之類的因素來調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。
如本文所使用，術(shù)語“同一性百分比”是兩條或更多條多肽序列之間或兩條或更多條多核苷酸序列之間的關(guān)系，該關(guān)系通過對序列進行比較而確定。在本領(lǐng)域中，“同一性”還表示多肽或多核苷酸序列之間序列關(guān)聯(lián)的程度。根據(jù)具體情況，它由這些序列的序列串之間的匹配程度確定?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨扇菀椎赝ㄟ^已知方法計算出來，所述的方法包括但不限于以下文獻中所描述的那些“ComputationalMolecular Biology”(Lesk，A.M.，ed.)Oxford UniversityPress，NY(1988)；“BiocomputingInformatics andgenome Projects”(Smith，D.W.，ed.)Academic Press，NY(1993)；“Computer Analysis ofSequence Data，Part I”(Griffin，A.M.，和Griffin，H.g.，eds.)Humana Press，NJ(1994)；“Sequence Analysis inMolecular Biology”(von Heinje，g.，ed.)Academic Press(1987)；and“Sequence Analysis Primer”(Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.)Stockton Press，NY(1991)。確定同一性和相似性的方法在可公開獲得的計算機程序中編成了代碼。序列比對和同一性百分比計算可以使用LASERGENE生物信息學(xué)計算套件(DNASTARInc.，Madison，WI)的Megalign程序，Vector NTI v.7.0(Informax，Inc.，Bethesda，MD)的AlignX程序，或EMBOSS Open SoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends ingenetics16，(6)pp276-277(2000))來進行。序列的多重比對可以使用Clustal比對法(即CLUSTALW；例如1.83版本)(Higgins和Sharp，CABIOS，5151-153(1989)；Higgins等人，NucleicAcids Res.224673-4680(1994)；和Chenna等人，Nucleic Acids Res31(13)3497-500(2003))，得自EuropeanMolecular Biology Laboratory viathe European Bioinformatics Institute)使用缺省參數(shù)來進行。有關(guān)CLUSTALW蛋白比對的合適參數(shù)包括缺口存在罰分(GAP Existencepenalty)＝15，缺口延長(gAP extension)＝0.2，矩陣(matrix)＝gonnet(例如Gonnet250)，蛋白ENDGAP＝-1，蛋白GAPDIST＝4，和KTUPLE＝1。在一個實施方案中，采取默認設(shè)定使用快速或緩慢比對，其中緩慢比對是優(yōu)選的?；蛘撸褂肅LUSTALW方法(1.83版本)的參數(shù)還可以進行改進，以還使用KTUPLE＝1，缺口罰分(GAP PENALTY)＝10，缺口延長(gAP extension)＝1，矩陣(matrix)＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口(WINDOW)＝5，以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在本發(fā)明的一個方面，合適的分離核酸分子(本發(fā)明的分離多核苷酸)編碼多肽，所述多肽具有與本文所報道的氨基酸序列有至少約50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的合適的核酸分子不僅具有上述同源性，而且通常還編碼具有約300至約340個氨基酸、更優(yōu)選約310至約330個氨基酸、最優(yōu)選約318個氨基酸的多肽。
如本文所使用，術(shù)語“特征基序”、“CE-7特征基序”和“標志性基序”是指具有限定活性的酶家族所共享的保守結(jié)構(gòu)。特征基序還可用于限定和/或鑒定對于限定底物家族具有類似酶活性的在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶家族。特征基序還可以是一個鄰接氨基酸序列或者是一起形成特征基序的非鄰接保守基序的集合。保守繼續(xù)通常用氨基酸序列表示。如本文所述，本發(fā)明過氧化水解酶屬于CE-7糖酯酶家族。該酶家族可通過特征基序的存在來限定(Vincent等人，同上)。如本文所定義的，CE-7酯酶的特征基序包含3個保守基序(相對于參考序列SEQ ID NO2的殘基位置編號) a)Arg118-Gly119-Gln120； b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和 c)His298-Glu299。
在氨基酸殘基位置180的Xaa通常是甘氨酸或丙氨酸。屬于催化三聯(lián)體的氨基酸殘基以粗體表示。
對于CE-7糖酯酶家族內(nèi)的保守基序的進一步分析表明存在另外的保守基序(在SEQ ID NO2的氨基酸位置267-269上的LXD)，其可以進一步限定屬于CE-7糖酯酶家族的過氧化水解酶(圖1a-c)。在另一個實施方案中，上面限定的特征基序包括如下所定義的第四個保守基序 Leu267-Xaa268-Asp269； 在氨基酸殘基位置268的Xaa通常是異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸。所述第四個基序包括屬于催化三聯(lián)體(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸殘基(粗體)。
可使用多種眾所周知的通用比對算法(即序列分析軟件)來比對代表具有過氧化水解酶活性的酶的兩個或多個氨基酸序列，以確定酶是否包含本發(fā)明特征基序。將比對序列與參考序列(SEQ ID NO2)進行比較以確定特征基序的存在。在一個實施方案中，采用參考氨基酸序列(在本文中用作過氧化水解酶序列(SEQ ID NO2)，來自枯草芽孢桿菌ATCC31954TM)的CLUSTAL比對(CLUSTALW)被用于鑒定屬于CE-7酯酶家族的過氧化水解酶。保守氨基酸殘基的相對編號是基于參考氨基酸序列的殘基編號，以說明比對序列內(nèi)的少量插入或缺失(例如少于5個氨基酸)。
可用于鑒定包含本發(fā)明特征基序的序列(當(dāng)與參考序列比較時)的其他適當(dāng)算法的實例包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；一種通用比對工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147195-197(1981)；一種局部使用的比對工具)。在一個實施方案中，使用默認參數(shù)來進行Smith-Waterman比對。合適的默認參數(shù)的實例包括使用BLOSUM62評分矩陣(scoring Matrix)，其采用缺口開放罰分(GAP open penalty)＝10和缺口延長罰分(GAP extension penalty)＝0.5。
本文中例舉的過氧化水解酶當(dāng)中的總體同一性百分比的比較表明，與SEQ ID NO2具有小至42％同一性的酶(同時保留特征基序)表現(xiàn)出顯著過氧化水解酶活性，并且在結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7糖酯酶。在一個實施方案中，本發(fā)明過氧化水解酶包括這樣的酶，所述酶包含本發(fā)明特征基序，并且與SEQ ID NO2具有至少40％，優(yōu)選至少42％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，還甚至更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的同一性。
或者，包括含有保守基序(即SEQ ID NO2的氨基酸殘基118-299；單獨作為SEQ ID NO63提供)的區(qū)域的鄰接氨基酸序列可用于鑒定CE-7糖酯酶家族成員。在另一個實施方案中，合適的過氧化水解酶是這樣的酶，其具有過氧化水解酶活性，并且與SEQ ID NO61具有至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選80％，甚至更優(yōu)選90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸同一性。
如本文所使用，“密碼子簡并性”是指遺傳密碼允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下變化的性質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及編碼氨基酸序列的所有或基本部分的任何核酸分子，所述氨基酸序列編碼本發(fā)明微生物多肽。技術(shù)人員非常了解在使用核苷酸密碼子確定給定氨基酸時特定宿主細胞顯示出的“密碼子偏好性”。因此，在合成基因以改善其在宿主細胞中的表達時，希望設(shè)計基因以使得其密碼子使用頻率接近宿主細胞中優(yōu)選的密碼子使用頻率。
如本文所使用，“合成的基因”可由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)件裝配而成。將這些構(gòu)件進行連接并退火以形成基因節(jié)段，該基因節(jié)段隨后在酶促作用下裝配而構(gòu)建成完整的基因。與DNA序列有關(guān)的“化學(xué)合成”是指在體外對組分核苷酸進行裝配?？梢圆捎猛晟平⒌姆椒▉硗瓿蒁NA的手工化學(xué)合成，或者可使用許多種可商業(yè)獲得的機器的其中一種來完成自動化學(xué)合成。因此，基于最優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細胞的密碼子偏倚，可以定制基因用以最優(yōu)化基因表達。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術(shù)人員會理解成功的基因表達的可能性。優(yōu)選的密碼子的確定可基于對來源于宿主細胞的基因(其中序列信息可獲得)的檢測。
如本文所使用，“基因”是指能夠表達特定蛋白質(zhì)的核酸分子，其包括編碼序列前的調(diào)控序列(5′非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)控序列(3′非編碼序列)?！疤烊换颉笔侵柑烊淮嬖诘木哂衅渥约旱恼{(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉笔侵覆皇翘烊换虻娜魏位?，包含在天然情況下不是一起存在的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包含源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者包含源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。“內(nèi)源性基因”指位于生物的基因組內(nèi)它的天然位置的天然基因?！巴鈦怼被蛑刚Ｇ闆r下不存在于宿主生物體中，而是通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物體內(nèi)的基因。外來基因可以包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組內(nèi)的基因。
如本文所使用，“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“合適的調(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、中間或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，其可影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或者相關(guān)編碼序列的翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、RNA加工位點、效應(yīng)子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
如本文所使用，“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的DNA序列。一般來講，編碼序列位于啟動子序列的3′端。啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動子可以在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境條件或生理條件而引導(dǎo)基因的表達。導(dǎo)致基因在大部分時間內(nèi)表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。還應(yīng)當(dāng)進一步認識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全確定，因此不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。
如本文所使用，“3′非編碼序列”是指位于編碼序列下游且包括能夠影響mRNA加工或基因表達的多腺苷酸化識別序列(通常限于真核生物)和其他序列編碼調(diào)節(jié)信號的DNA序列。多腺苷酸化信號通常特征在于影響多聚腺苷酸片(通常限于真核生物)給mRNA前體3′末端的添加。
如本文所使用，術(shù)語“可操作地連接”是指單個核酸分子上的核酸序列的結(jié)合，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義的取向可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。
如本文所使用，術(shù)語“表達”是指源于本發(fā)明的核酸分子的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。
在本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主生物體的基因組內(nèi)，從而導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。在本發(fā)明中，宿主細胞的基因組包括染色體和染色體外(例如，質(zhì)粒)基因。含有轉(zhuǎn)化核酸分子的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物體。
如本文所使用，術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”是指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進一種獨特構(gòu)建體中，該獨特構(gòu)建體能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列與相應(yīng)的3′末端非翻譯序列一起引入細胞中?！稗D(zhuǎn)化盒”指含有外來基因并且除了該外來基因外還含有有利于轉(zhuǎn)化特定宿主細胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！氨磉_盒”是指包含外來基因并且除該外來基因以外還具有使得該基因在外來宿主中的表達增強的元件的特定載體。
如本文所使用，術(shù)語“序列分析軟件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計算機算法或軟件程序?！靶蛄蟹治鲕浖笨缮藤彨@得或獨立開發(fā)。一般的序列分析軟件將包括但不限于，GCG程序套件(Wisconsin Package Version 9.0，genetics Computergroup(GCG)，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Biol.215403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715USA)，CLUSTALW(例如1.83版本；Thompson等人，NucleicAcids Research，22(22)4673-4680(1994)，以及合并Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methodsgenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.編輯Suhai，Sandor.PublisherPlenum，New York，NY)，Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher版本4.05。在本專利申請案的上下文中應(yīng)當(dāng)理解，使用序列分析軟件進行分析時，除非另外指明，否則分析結(jié)果將基于所參考程序的“默認值”。如本文所使用，“缺省值”將意指當(dāng)?shù)谝淮纬跏蓟瘯r軟件最初裝載的由軟件制造商設(shè)定的任何值或參數(shù)組。
如本文所使用，術(shù)語“生物污染物”是指包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒顆粒、以及它們的混合物的一種或多種不需要的和/或病原性的生物。本發(fā)明方法產(chǎn)生用于減少和/或消除存活的生物污染物存在的有效濃度的至少一種過羧酸。在一個優(yōu)選實施方案中，微生物污染物是存活的病原微生物。
如本文所使用，術(shù)語“消毒”是指為了破壞或阻止生物微生物生長的過程。如本文所使用，術(shù)語“消毒劑”是指通過破壞、中和或抑制生物污染物生長的試劑。消毒劑通常用于處理無生命物體或表面。如本文所使用，術(shù)語“防腐劑”是指抑制攜帶疾病的微生物生長的化學(xué)試劑。在該實施方案的一個方面，生物污染物是致病微生物。
如本文所使用，術(shù)語“殺病毒劑”是指抑制或破壞病毒的試劑，并且與“殺病毒試劑(viricide)”同義。過酸可以具有殺病毒活性。可適用于本發(fā)明的本領(lǐng)域已知的一般供選擇的殺病毒劑包括例如醇類、醚類、氯仿、甲醛、酚類、β-丙內(nèi)酯、碘、氯、汞鹽、羥胺、環(huán)氧乙烷、乙二醇、季銨化合物、酶和洗滌劑。
如本文所使用，術(shù)語“殺生物劑”是指滅活或破壞微生物，一般是廣譜的化學(xué)試劑。顯示出滅活或破壞微生物的能力的試劑描述為具有“殺生物”活性。過酸可以具有殺生物活性?？蛇m用于本發(fā)明的本領(lǐng)域已知的一般供選擇的殺生物劑包括例如氯、二氧化氯、氯異氰尿酸酯、次氯酸鹽、臭氧、丙烯醛、胺類、氯化酚類化合物、銅鹽、有機硫化合物和季銨鹽。
如本文所使用，短語“最小殺生物濃度”是指對于特定接觸時間在目標微生物的存活群體中將產(chǎn)生所需致命的、不可逆的減少的殺生物試劑的最小濃度。效力可以通過處理后存活微生物中的log10減少進行度量。在一個方面，處理后存活微生物中的目標減少是至少3-log減少，更優(yōu)選至少4-log減少，最優(yōu)選至少5-log減少。在另一個方面，最小殺生物濃度是存活微生物細胞中的至少6-log減少。
如本文所使用，術(shù)語“過氧源”和“過氧的來源”是指當(dāng)在水溶液中時，能夠提供濃度為約1mM或更高的過氧化氫的化合物，包括但不限于過氧化氫、過氧化氫加合物(例如脲-過氧化氫加合物(過氧化脲))、過硼酸鹽和過碳酸鹽。如本文所描述，在反應(yīng)成分組合后，由含水反應(yīng)混合物中的過氧化合物提供的過氧化氫濃度最初為至少1mM。在一個實施方案中，含水反應(yīng)混合物中的過氧化氫濃度為至少10mM。在另一個實施方案中，含水反應(yīng)混合物中的過氧化氫濃度為至少100mM。在另一個實施方案中，含水反應(yīng)混合物中的過氧化氫濃度為至少200mM。在另一個實施方案中，含水反應(yīng)混合物中的過氧化氫濃度為500mM或更高。在另一個實施方案中，含水反應(yīng)混合物中的過氧化氫濃度為1000mM或更高。含水反應(yīng)混合物中過氧化氫與酶底物例如甘油三酸酯(H2O2∶底物)的摩爾比可以是約0.002-20，優(yōu)選約0.1-10，最優(yōu)選約0.5-5。
用于由羧酸酯和過氧化氫來酶催化制備過酸的合適的反應(yīng)條件 在本發(fā)明的一個方面，提供了生產(chǎn)包含過酸的含水混合物的方法，所述方法包括在具有過氧化水解活性的酶催化劑存在下將羧酸酯與無機過氧化物反應(yīng)，所述無機過氧化物不限于過氧化氫、過硼酸鈉或過碳酸鈉。在一個實施方案中，酶催化劑包含具有屬于CE-7糖酯酶家族的結(jié)構(gòu)的過氧化水解酶。在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑在結(jié)構(gòu)上歸類為頭孢菌素C脫乙酰酶。在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑在結(jié)構(gòu)上歸類為乙酰木聚糖酯酶。
在一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包括酶，所述酶具有過氧化水解活性，并且當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶具有特征基序，所述特征基序包括 a)在氨基酸殘基118-120上的RGQ基序； b)在氨基酸殘基179-183上的GXSQG基序；和 c)在氨基酸殘基298-299上的HE基序。
在另一個實施方案中，當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，特征基序還包括第四個保守基序，該保守基序定義為在氨基酸殘基267-269上的LXD基序。
在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包含具有本發(fā)明特征基序，并且與SEQ ID NO2具有至少40％氨基酸同一性的酶。
在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包含選自下列的具有過氧化水解酶活性的酶SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SEQ IDNO32。
在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包含這樣的酶，該酶與如SEQ ID NO61所限定的鄰接特征基序具有至少40％的氨基酸同一性，其中上述保守基序(例如RGQ、GXSQG和HE，以及任選LXD)被保留。
在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包含這樣的酶，該酶具有由核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子在嚴格雜交條件下與選自下列的核酸序列雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
在另一個實施方案中，過氧化水解酶催化劑包含具有選自下列的氨基酸序列的酶SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SE ID NO32，其中所述酶可具有一個或多個添加、缺失或取代，只要特征基序被保留，并且過氧化水解酶活性得以保留。
合適的羧酸酯具有選自下列的式 a)具有以下式的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1-10； b)具有以下式的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及 c)選自乙酰化單糖、乙酰化二糖和乙?；嗵堑囊阴；恰?br>
在一個優(yōu)選的實施方案中，乙酰化糖包括乙?；瘑翁?、乙?；呛鸵阴；嗵?。在另一個實施方案中，乙?；沁x自乙?；揪厶?、乙?；揪厶瞧?、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙?；咸烟?例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖，以及乙?；w維素。在一個優(yōu)選的實施方案中，乙?；沁x自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙?；?葡萄烯糖，以及乙?；w維素。這樣，乙?；强梢允怯糜谕ㄟ^本發(fā)明方法(即在過氧源存在下)產(chǎn)生過羧酸的合適的底物。
在另一個方面，羧酸酯選自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯、2-乙?；鶛幟仕崛阴?、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸內(nèi)酯、甘油酯(例如甘油單酯、二酯和三酯)例如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙?；视?、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁?；视?、乙?；?、以及它們的混合物。在另一個方面，在另一個方面，羧酸酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在另外一個方面，羧酸酯底物選自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在一個優(yōu)選的方面，羧酸酯是選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物的甘油酯。
羧酸酯以在酶催化的過氧化水解后足以產(chǎn)生所需過酸濃度的濃度存在于反應(yīng)混合物中。羧酸酯無需完全溶解于反應(yīng)混合物中，但具有足夠的溶解性，以允許通過過氧化水解酶催化劑將酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的過酸。羧酸酯以反應(yīng)混合物的0.05重量％至40重量％的濃度存在于反應(yīng)混合物中，優(yōu)選以反應(yīng)混合物的0.1重量％至20重量％的濃度，和更優(yōu)選以反應(yīng)混合物的0.5重量％至10重量％的濃度存在于反應(yīng)混合物中。
過氧源可以包括但不限于過氧化氫、過氧化氫加合物(例如脲-過氧化氫加合物(過氧化脲))、過硼酸鹽和過碳酸鹽。反應(yīng)混合物中過氧化合物的濃度可以為0.0033重量％至約50重量％，優(yōu)選0.033重量％至約40重量％，更優(yōu)選0.33重量％至約30重量％。
許多過氧化水解酶催化劑(完整細胞、透化的完整細胞和部分純化的完整細胞提取物)已報道具有過氧化氫酶活性(EC 1.11.1.6)。過氧化氫酶催化過氧化氫轉(zhuǎn)化成氧和水。在一個方面，過氧化水解催化劑缺乏過氧化氫酶活性。在另一個方面，向反應(yīng)混合物中添加過氧化氫酶抑制劑。過氧化氫酶抑制劑的實例包括但不限于疊氮化鈉和硫酸羥胺。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要調(diào)整過氧化氫酶抑制劑的濃度。過氧化氫酶抑制劑的濃度一般為0.1mM至約1M；優(yōu)選為約1mM至約50mM；更優(yōu)選為約1mM至約20mM。在一個方面，疊氮化鈉濃度一般為約20mM至約60mM，而硫酸羥胺的濃度一般為約0.5mM至約30mM，優(yōu)選約10mM。
在另一個實施方案中，酶催化劑缺乏顯著的過氧化氫酶活性或被改造以降低或消除過氧化氫酶活性。宿主細胞中的過氧化氫酶活性可以通過使用眾所周知的技術(shù)破壞負責(zé)過氧化氫酶活性的基因的表達而得到下調(diào)或消除，所述技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)座子誘變、RNA反義表達、靶向誘變和隨機誘變。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼內(nèi)源性過氧化氫酶活性的基因被下調(diào)或破壞(即剔除)。如本文所使用，“破壞的”基因是其中由修飾基因編碼的蛋白的活性和/或功能不再存在的基因。破壞基因的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括但不限于對基因進行插入、刪除或突變，只要相應(yīng)蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一個優(yōu)選的實施方案中，生產(chǎn)宿主是大腸桿菌生產(chǎn)宿主，其包含選自katG(SEQ IDNO47)和katE(SEQ ID NO56)的破壞的過氧化氫酶基因。在另一個實施方案中，生產(chǎn)宿主是大腸桿菌菌株，其包含katg1和katE過氧化氫酶基因中的下調(diào)和/或破壞。本文提供了包含katG和katE的雙破壞的大腸桿菌菌株(參見實施例15；大腸桿菌菌株KLP18)。
證實了對于過氧化水解酶的大規(guī)模(10-L和更大)生產(chǎn)，與過氧化氫酶陰性菌株UM2(大腸桿菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)相比，所構(gòu)建的過氧化氫酶陰性大腸桿菌菌株KLP18(katG和katE雙剔除)(實施例15)是優(yōu)良的宿主，這是通過在發(fā)酵罐條件下的生長而確定的(實施例17-19)。雖然KLP18和UM2都是過氧化氫酶陰性菌株，但是已知UM2具有多種營養(yǎng)缺陷，因此需要富含酵母提取物和蛋白胨的培養(yǎng)基。甚至當(dāng)采用富含培養(yǎng)基進行發(fā)酵時，UM2的生長也不佳，并且達到有限的最大細胞密度(OD)。相反，KLP18沒有專門的營養(yǎng)需求，并且在單獨的無機培養(yǎng)基中或者采用另外的酵母提取物都生長至高細胞密度(實施例20)。
含水反應(yīng)混合物中催化劑的濃度依賴于催化劑的具體催化活性，并且進行選擇以獲得所需反應(yīng)速率。過氧化水解反應(yīng)中的催化劑的重量一般為0.0005mg至10mg/mL反應(yīng)總體積，優(yōu)選為0.010mg至2.0mg/mL。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將催化劑固定在可溶性或不溶性載體上；參見例如，“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。固定化催化劑的使用允許在后續(xù)反應(yīng)中回收和重新使用催化劑。酶催化劑可以是完整微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化或純化的酶、以及它們的混合物的形式。
在一個方面，通過羧酸酯的化學(xué)過氧化水解和酶促過氧化水解的組合產(chǎn)生的過酸濃度足以提供在所需pH下用于漂白或消毒的有效濃度的過酸。在另一個方面，本方法提供了酶和酶底物的組合以產(chǎn)生所需有效濃度的過酸，其中在不存在添加的酶的情況下，產(chǎn)生的過酸濃度顯著較低。盡管在許多情況下通過無機過氧化物與酶底物的直接化學(xué)反應(yīng)可能存在酶底物的基本化學(xué)過氧化水解，但產(chǎn)生的過酸濃度可能不足以在所需應(yīng)用中提供有效濃度的過酸，并且通過向反應(yīng)混合物中添加合適的過氧化水解酶催化劑達到了過酸總濃度的顯著增加。
通過至少一種羧酸酯的過氧化水解所產(chǎn)生的過酸(例如過乙酸)的濃度是在過氧化水解反應(yīng)起始的10分鐘內(nèi)、優(yōu)選5分鐘內(nèi)至少約20ppm，優(yōu)選至少100ppm，更優(yōu)選至少約200ppm過酸，更優(yōu)選至少300ppm，更優(yōu)選至少500ppm，更優(yōu)選至少700ppm，更優(yōu)選至少約1000ppm過酸，最優(yōu)選至少2000ppm過酸。包含過酸的產(chǎn)物混合物可以任選用水或主要包含水的溶液稀釋，以產(chǎn)生具有所需較低濃度的過酸的混合物。在一個方面，產(chǎn)生所需過酸濃度需要的反應(yīng)時間不超過約2小時，優(yōu)選不超過約30分鐘，更優(yōu)選不超過約10分鐘，最優(yōu)選在約5分鐘或更少時間內(nèi)。在其他方面，在組合所述反應(yīng)成分后的約5分鐘至約168小時內(nèi)，或者在組合所述反應(yīng)成分后的約5分鐘至約48小時內(nèi)，或約5分鐘至2小時內(nèi)，或其中的任何此類時間間隔，將被一定濃度微生物群體污染的硬質(zhì)表面或無生命物體與按照本文描述的方法形成的過酸接觸。
選擇反應(yīng)溫度以控制反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可以是僅高于反應(yīng)混合物的凝固點(大約0℃)至約75℃，反應(yīng)溫度的優(yōu)選范圍為約5℃至約55℃。
包含過酸的最終反應(yīng)混合物的pH是約2至約9，優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約5至約8，甚至更優(yōu)選約6至約8，還甚至更優(yōu)選約6.5至約7.5。在另一個實施方案中，反應(yīng)混合物的pH是酸性的(pH＜7)。反應(yīng)和最終反應(yīng)混合物的pH可以通過添加合適的緩沖劑來加以控制，所述緩沖劑包括但不限于磷酸鹽、焦磷酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽。當(dāng)采用時，緩沖劑的濃度通常為0.1mM至1.0M，優(yōu)選為1mM至300mM，最優(yōu)選為10mM至100mM。
在另一個方面，酶促過氧化水解產(chǎn)物可以包含提供所需功能性的另外的成分。這些另外的成分包括但不限于緩沖劑、洗滌劑助劑、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、潤濕劑、抗腐蝕劑(例如苯并三唑)、酶穩(wěn)定劑和過氧化物穩(wěn)定劑(例如金屬離子螯合劑)。許多另外的成分是洗滌劑工業(yè)中眾所周知的(參見例如美國專利5,932,532；在此引入作為參考)。乳化劑的實例包括聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠劑的實例包括但不限于
RD、玉米淀粉、PVP、
聚山梨醇酯20、PVA和卵磷脂。緩沖系統(tǒng)的實例包括但不限于磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉；氨基磺酸/三乙醇胺；檸檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性劑的實例包括但不限于a)非離子表面活性劑例如環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，乙氧基化或丙氧基化直鏈和支鏈伯醇和仲醇，以及脂族氧化膦，b)陽離子表面活性劑例如季銨化合物，特別是具有與氮原子結(jié)合的C8-C20烷基，并且該氮原子還與3個C1-C2烷基結(jié)合的季銨化合物，c)陰離子表面活性劑例如烷基羧酸(例如，C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸鹽、鏈烷磺酸鹽(例如十二烷基硫酸鈉“SDS”)或直鏈或支鏈烷基苯磺酸鹽、烯烴磺酸鹽和d)兩性和兩性離子表面活性劑例如氨基羧酸、氨基二羧酸和烷基甜菜堿(alkybetaine)以及它們的混合物。另外的成分可以包括芳香劑、染料和過氧化氫穩(wěn)定劑(例如金屬螯合劑例如1-羥基亞乙基-1，1-二膦酸(
2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、
SL、
0520、
0531、酶活性穩(wěn)定劑(例如聚乙二醇(PEG))和洗滌劑助劑。
使用過氧化水解酶催化劑原位生產(chǎn)過酸 頭孢菌素C脫乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系統(tǒng)命名頭孢菌素C乙酰水解酶；CAHs)是具有能夠?qū)㈩^孢菌素例如頭孢菌素C、7-氨基頭孢烷酸(cephalosporanic acid)和7-(噻吩-2-乙酰氨基)頭孢烷酸上的乙?；ユI水解的能力的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)413-419(1975))。CAH屬于在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶的較大家族，該家族稱為糖酯酶家族7(CE-7；參見Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymesan integrated database approach”，“RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12.) CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成員共享共同結(jié)構(gòu)基序，并且是非常與眾不同的，因為它們通常對于乙?；咎切偷途厶?xylooliogsaccharide)和頭孢菌素C都表現(xiàn)出酯水解活性，這意味著CE-7家族代表一類具有針對一定范圍小底物的多功能脫乙酰酶活性的蛋白(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330593-606(2003))。Vincent等人描述了在該家族成員之間的結(jié)構(gòu)類似性，并且限定了CE-7家族的特征序列基序。
在植物、真菌(例如頂頭孢霉(Cephalosporidium acremonium))，酵母(例如，紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis))和細菌例如熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacteriumsp.)物種；地中海擬無枝菌酸菌(Norcardia lactamdurans)，和芽孢桿菌屬(Bacillus)的各個成員中發(fā)現(xiàn)了CE-7家族的成員(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.8553-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol1795436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)406-412(2000)；Mitshushima等人，同上，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)413-419(1975)；Vincent等人，同上，Takami等人，NAR，28(21)4317-4331(2000)；Rey等人，genome Biol.，5(10)article77(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，1461585-1591(2000)；美國專利6,645,233；美國專利5,281,525；美國專利5,338,676；和WO 99/03984。與SEQ ID NO2具有顯著同源性的CE-7糖酯酶家族成員的不完全列表在表1中提供。
表1與SEQ ID NO2具有顯著同源性的CE-7酶的實例
本發(fā)明過氧化水解酶是CE-7糖酯酶家族的所有成員。如Vincent等人(同上)所述，該家族成員共享作為該家族特征的共同特征基序。本發(fā)明過氧化水解酶的CLUSTALW比對表明所有成員都屬于CE-7糖酯酶家族(圖1a-c)。表2提供了本發(fā)明過氧化水解酶之間的總體氨基酸同一性百分比的比較。
表2過氧化水解酶之間的氨基酸同一性百分比1 1＝通過使用BLOSUM62的blast2seq比對確定的同一性百分比，缺口開放(gap open)＝11，缺口延長(gAP extension)＝1，x_drop＝0，預(yù)期(expect)＝10，并且字長(wordsize)＝3。Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”，F(xiàn)EMSMicrobiol Lett。174247-250 雖然在總體氨基酸同一性百分比方面觀察到了差異(即熱纖梭菌ATCC 27405TM過氧化水解酶；SEQ ID NO14與枯草芽孢桿菌ATCC31954TM過氧化水解酶；SEQ ID NO2僅具有57％的氨基酸同一性，而那不勒斯棲熱袍菌過氧化水解酶(SEQ ID NO16)與SEQ ID NO2僅具有42％的同一性)，但是每一種本發(fā)明過氧化水解酶都具有CE-7特征基序。因此，本發(fā)明過氧化水解酶催化劑是在結(jié)構(gòu)上被歸類為屬于CE-7糖酯酶家族的酶。每一種本發(fā)明過氧化水解酶都包含CE-7特征(標志性)基序。
Vincent等人(同上)分析了CE-7酯酶的結(jié)構(gòu)，并且已經(jīng)鑒定了作為該家族標志的幾個高度保守基序。如圖1所示，高度保守基序(在圖1中加下劃線的；相對于SEQ ID NO2的位置編號)包括Arg118-Gly119-Gln120(RGQ)、Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183(GXSQG)和His298-Glu299(HE)。此外，圖1示出了可用于進一步表征特征基序的另外一個高度保守的Lys267-Xaa268-Asp269(LXD)基序。所有編號都是相對于參考序列(枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶；SEQ ID NO2)的編號。
在一個實施方案中，合適的過氧化水解酶可以由sCE-7特征基序的存在來鑒定(Vincent等人，同上)。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶(SEQ ID NO2；即用于相對氨基酸位置編號的參考序列)，使用CLUSTALW比對來鑒定包含CE-7特征基序的過氧化水解酶。根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸殘基編號，CE-7特征基序包括 如下所定義的3個保守基序 a)Arg118-Gly119-Gln120； b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和 c)His298-Glu299。
在氨基酸殘基位置180的Xaa通常是甘氨酸或丙氨酸。屬于催化三聯(lián)體的氨基酸殘基以粗體表示。
對CE-7糖酯酶家族內(nèi)的保守基序的進一步分析表明，存在另外一個可進一步限定屬于CE-7糖酯酶家族的過氧化水解酶的保守基序(在SEQ ID NO2的氨基酸位置267-269的LXD)(圖1a-c)。在另一個實施方案中，上面限定的特征基序包括如下所定義的第四個保守基序 Leu267-Xaa268-Asp269。
在氨基酸殘基位置268的Xaa通常是異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸。所述第四個基序包括屬于催化三聯(lián)體(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸殘基(粗體)。
可使用多種眾所周知的通用比對算法(即序列分析軟件)來比對兩個或多個氨基酸序列(代表具有過氧化水解酶活性的酶)，以確定本發(fā)明特征基序的存在(例如，CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48443-453(1970))。將比對序列與參考序列(SEQ ID NO2)進行比較。在一個實施方案中，采用參考氨基酸序列(如在本文中使用的CAH序列(SEQ ID NO2)，來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM)的CLUSTAL比對(CLUSTALW)被用于鑒定屬于CE-7酯酶家族的過氧化水解酶。保守氨基酸殘基的相對編號是基于參考氨基酸序列的殘基編號，以說明比對序列內(nèi)的少量插入或缺失(5個氨基酸或更少)。
本文中例舉的過氧化水解酶當(dāng)中的總同一性百分比的比較表明，與SEQ ID NO2具有小至42％同一性的酶(同時保留特征基序)表現(xiàn)出顯著過氧化水解酶活性，并且在結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7糖酯酶。在一個實施方案中，本發(fā)明過氧化水解酶包括這樣的酶，所述酶包含本發(fā)明特征基序，并且與SEQ ID NO2具有至少40％，優(yōu)選至少42％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，還甚至更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸同一性。
所有本發(fā)明過氧化水解酶都包含如表3中所示的上述特征基序。
表3在具有過氧化水解酶活性的本發(fā)明酶中發(fā)現(xiàn)的保守基序。
a＝由Vincent等人，同上定義的用于限定特征基序的保守基序。
b＝用于進一步限定Vincent等人，同上定義的特征基序的在本文中鑒定的另一個基序。
或者，包含4個保守基序(RGQ、GXSQG、LXD和HE；SEQ ID NO2的氨基酸殘基118-299)的鄰接特征基序(SEQ ID NO61)也可用作鄰接特征基序來鑒定CE-7糖酯酶(圖1a-c)。這樣，期望具有過氧化水解酶活性的合適的酶還可以鑒定為，與SEQ ID NO61(將在CE-7糖酯酶中發(fā)現(xiàn)的4個保守基序加下劃線)具有至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選80％，甚至更優(yōu)選90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸同一性。
RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVIS SFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE(SEQID NO61) 表4中提供了使用鄰接特征序列針對具有過氧化水解酶活性的本發(fā)明CE-7酯酶的比較。使用采用默認參數(shù)的BLASTP。
表4具有過氧化水解活性的各種CE-7糖酯酶相對于鄰接特征序列(SEQ ID NO61)的氨基酸同一性百分比 或者，還可以使用與全長的一種或多種本發(fā)明過氧化水解酶相比的氨基酸同一性百分比。因此，具有過氧化水解酶活性的合適的酶與SEQID NO2具有至少40％，優(yōu)選至少42％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，還甚至更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸同一性。在另一個實施方案中，合適的過氧化水解酶催化劑包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
合適的過氧化水解酶還可以包括相對于一種本發(fā)明過氧化水解酶(例如SEQ ID NOs 2、6、8、10、12、14、16和32)具有一個或多個缺失、取代和/或插入的酶。如表3所示，具有過氧化水解酶活性的CE-7糖酯酶共享小至42％的總體氨基酸同一性?；诒景l(fā)明實施例中提供的數(shù)據(jù)，具有屬于CE-7糖酯酶家族的過氧化水解酶活性的另外的酶可具有甚至更低的同一性百分比，只要酶保留保守特征基序即可。這樣，缺失、取代和/或插入的數(shù)目可以改變，只要在酶內(nèi)其相對位置發(fā)現(xiàn)保守特征基序即可(見表2)。
此外，根據(jù)在相應(yīng)核酸序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)類似性來鑒定合適的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。可使用雜交序列來鑒定類似基因序列。因此，本發(fā)明合適的過氧化水解酶催化劑包括由在嚴格條件下與具有選自下列的核酸序列的核酸分子雜交的核酸分子編碼的氨基酸序列1，SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
本發(fā)明方法使用屬于CE-7家族糖酯酶的酶的過氧化水解酶活性，在含水反應(yīng)條件下原位產(chǎn)生工業(yè)上有用的、有效濃度的過酸。在一個實施方案中，具有過氧化水解酶活性的酶在結(jié)構(gòu)和功能上歸類為頭孢菌素C脫乙酰酶(CAH)。在另一個實施方案中，具有過氧化水解酶活性的酶在結(jié)構(gòu)和功能上歸類為乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
產(chǎn)生的過酸是具有相當(dāng)反應(yīng)性的，并且在濃度方面一般是隨著時間的過去而降低。這樣，可能希望使各種反應(yīng)成分保持分離，特別是對于液體制劑。在一個方面，使過氧化氫來源與底物或過氧化水解酶催化劑分離，優(yōu)選地與兩者分離。這可以使用各種技術(shù)，包括但不限于使用多隔室分室分配器(美國專利4,585,150)，以及在使用時將過氧化水解酶催化劑與無機過氧化物和本發(fā)明底物在物理上組合以起始含水酶促過氧化水解反應(yīng)來實現(xiàn)。在接觸用于目標處理的表面和/或物體之前，過氧化水解酶催化劑可以任選固定在反應(yīng)室主體內(nèi)或與包含過酸的反應(yīng)產(chǎn)物分離(例如過濾等)。過氧化水解酶催化劑可以為液體基質(zhì)或固體形式(即粉末化的，片)或包埋在固體基質(zhì)內(nèi)，所述固體基質(zhì)隨后與底物混合以起始酶促過氧化水解反應(yīng)。在一個進一步的方面，過氧化水解酶催化劑可以包含在可溶性或多孔性小袋內(nèi)，所述小袋可以加入含水底物基質(zhì)中以起始酶促過氧化水解。在另一個進一步方面，將包含酶催化劑的粉末懸浮在底物(例如甘油三乙酸酯)中，并且在使用時與在水中的過氧源混合。
用于測定過酸和過氧化氫濃度的HPLC測定方法。
在本發(fā)明方法中，可使用各種分析方法來分析反應(yīng)物和產(chǎn)物，包括但不限于滴定、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質(zhì)譜法(MS)、毛細管電泳法(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)3623-3627(1997))，以及如本文實施例中描述的2，2’-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸鹽(ABTS)分析(S.Minning，等人，AnalyticaChimica Acta 378293-298(1999)和WO 2004/058961A1)。
過酸的最小殺生物濃度的測定 由J.gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 5063-73(2002))描述的方法可用于測定過酸或過氧化氫和酶底物的最小殺生物濃度(MBC)。該測定方法基于XTT還原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽，單鈉鹽)是氧化還原染料，其通過在490nm或450Mn處測量的光密度(OD)中的變化來指示微生物的呼吸活性。然而，存在可用于檢測消毒劑和殺菌劑活性的各種其他方法，包括但不限于存活平板計數(shù)、直接顯微計數(shù)、干重、濁度測量、吸光度和生物發(fā)光(參見例如Brock，Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版本，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001). 酶促制備的過酸組合物的用途 根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的酶催化劑產(chǎn)生的過酸可以在各種硬質(zhì)表面/無生命物體應(yīng)用中用于降低微生物、真菌、朊病毒相關(guān)和病毒污染物的濃度，例如下述的凈化醫(yī)療器械(例如內(nèi)窺鏡)、紡織品(例如衣服、地毯)、食物制劑表面、食物貯存和食物包裝設(shè)備、用于食品包裝的材料、雞孵化場和生長設(shè)施、動物圍欄和具有微生物和/或殺病毒活性的用過的加工水。酶產(chǎn)生的過酸可以在設(shè)計為滅活朊病毒(例如某些蛋白酶)以另外提供殺生物活性的制劑中使用。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明過酸組合物作為用于不可高壓滅菌的醫(yī)療器械和食物包裝設(shè)備的消毒劑是特別有用的。因為含過酸的制劑可以使用GRAS或食物級別成分(酶、酶底物、過氧化氫和緩沖劑)進行制備，所以酶產(chǎn)生的過酸還可以用于動物獸體、肉、水果和蔬菜的凈化，或用于預(yù)制食物的凈化。酶產(chǎn)生的過酸可以引入產(chǎn)物內(nèi)，所述產(chǎn)物的最終形式是粉末、液體、凝膠、薄膜、固體或氣溶膠。酶產(chǎn)生的過酸可以稀釋至仍提供有效凈化的濃度。
通過使表面或物體與通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)物接觸，包含有效濃度的過酸的組合物可以用于消毒被病原微生物污染物污染(或懷疑被污染)的表面和/或物體。如本文所使用，“接觸”是指使包含有效濃度的過酸的消毒組合物放置與懷疑被致病實體污染的表面或無生命物體接觸足以清潔和消毒的一段時間。接觸包括對懷疑被一定濃度微生物群體污染的表面或無生命物體噴霧、處理、浸沒、沖刷、傾瀉在其上或其內(nèi)、混合、組合、涂抹、覆蓋、施加、附著或以其他方式給予包含有效濃度過酸的過酸溶液或組合物，或形成有效濃度過酸的溶液或組合物?？蓪⑾緞┙M合物與清潔組合物合并以提供清潔和消毒?；蛘撸梢詫⑶鍧崉?例如表面活性劑或洗滌劑)摻入到制劑內(nèi)以在單一組合物中提供清潔和消毒。
包含有效濃度過酸的組合物還可以包含至少一種另外的抗微生物劑、朊病毒降解蛋白酶組合、殺病毒劑、殺孢子劑或殺生物劑。當(dāng)用于清潔和消毒被病原微生物、孢子、病毒、真菌和/或朊病毒污染(或懷疑被污染)的表面和/或物體時，這些試劑與通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的過酸的組合可以提供增加的和/或協(xié)同效應(yīng)。合適的抗微生物劑包括羧酸酯(例如對羥基苯甲酸烷基酯和肉桂酸烷基酯)，磺酸(例如十二烷基苯磺酸)，碘化合物或活性鹵素化合物(例如，元素鹵素，鹵素氧化物(例如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO2)，碘，鹵間化物(interhalides)(例如，一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘或二溴化碘)，多鹵化物，次氯酸鹽，次氯酸，次溴酸鹽，次溴酸，氯和溴乙內(nèi)酰脲，二氧化氯和亞氯酸鈉)，有機過氧化物，包括過氧化苯甲酰、過氧化烷基苯甲酰、臭氧、單態(tài)氧發(fā)生器、以及它們的混合物，酚衍生物(例如鄰苯基苯酚、鄰芐基對氯苯酚、叔戊基苯酚和羥基苯甲酸C1-C6烷基酯)、季銨化合物(例如氯化烷基二甲基芐基銨、氯化二烷基二甲基銨、以及它們的混合物)，和此類抗微生物劑的混合物，其量足以提供所需微生物保護程度?？刮⑸飫┑挠行Я堪s0.001重量％至約60重量％抗微生物劑、約0.01重量％至約15重量％的抗微生物劑或約0.08重量％至約2.5重量％的抗微生物劑。
在一個方面，當(dāng)應(yīng)用于部位上和/或部位處時，通過本方法形成的過酸可用于降低存活微生物污染物(例如，存活微生物群體)的濃度。如本文所使用，本發(fā)明“部位”包含適合于消毒或漂白的部分或全部靶表面。靶表面包括可能潛在被微生物、病毒、真菌、朊病毒或其組合污染的所有表面。非限制性實例包括在食物或飲料工業(yè)中發(fā)現(xiàn)的設(shè)備表面(例如罐、傳送機、地板、排水管、冷卻器、致冷機、設(shè)備表面、墻壁、閥、帶、管、排水管、接頭、裂縫其組合等)；建筑物表面(例如墻壁、地板和窗戶)；非食物工業(yè)相關(guān)管和排水管，包括水處理設(shè)施、池和礦泉以及發(fā)酵罐；醫(yī)院或獸醫(yī)診所表面(例如墻壁、地板、床、設(shè)備(例如內(nèi)窺鏡)、醫(yī)院/獸醫(yī)或其他醫(yī)療保健設(shè)施中穿著的衣物，包括衣服、刷、鞋和其他醫(yī)院或獸醫(yī)表面)；餐館表面；浴室表面；盥洗室；衣物和鞋；用于家畜的畜舍或馬房表面，所述家畜是例如家禽、牛、奶牛、羊、馬和豬；用于家禽或用于蝦的孵化場；以及藥物或生物藥物表面(例如藥物或生物藥物制造設(shè)備，藥物或生物藥物成分，藥物或生物藥物賦形劑)。另外的硬質(zhì)表面還包括食品，例如牛肉、家禽、豬肉、蔬菜、水果、海鮮、其組合等。部位還可以包括吸水材料例如受感染的亞麻制品或其他紡織品。部位還包括收獲的植物或植物產(chǎn)品，包括種子、球莖、根莖、水果和蔬菜、生長植物，和特別是農(nóng)作物生長植物，包括谷類、葉菜類和沙拉農(nóng)作物、根菜類、豆類、漿果類、柑橘類水果和硬水果。
硬質(zhì)表面材料的非限制性實例是金屬(例如鋼、不銹鋼、鉻、鈦、鐵、銅、黃銅、鋁及其合金)，礦物質(zhì)(例如混凝土)，聚合物和塑料(例如聚烯烴，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯例如聚對苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺例如尼龍)。另外的表面包括磚、瓦、陶器、瓷器、木材、乙烯樹脂(vinyl)、油氈和地毯。
重組微生物表達 本發(fā)明序列的基因和基因產(chǎn)物可以在異源宿主細胞中，特別是在微生物宿主細胞中產(chǎn)生。用于表達本發(fā)明基因和核酸分子的優(yōu)選異源宿主細胞是微生物宿主，其可以在真菌或細菌家族內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并且在寬范圍的溫度、pH值和溶劑耐受力下生長。例如，預(yù)期任何細菌、酵母和絲狀真菌可以適當(dāng)?shù)爻洚?dāng)本發(fā)明核酸分子表達的宿主。過氧化水解酶可以在細胞內(nèi)、細胞外或者在細胞內(nèi)和細胞外的組合表達，其中與用于回收通過細胞內(nèi)表達產(chǎn)生的蛋白的方法相比，細胞外表達使得能夠更容易地從發(fā)酵產(chǎn)物中回收所需蛋白。轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)生物合成裝置相對于用于產(chǎn)生細胞生物質(zhì)的細胞原料保持不變；無論如何功能基因?qū)⒌玫奖磉_。宿主菌株的實例包括但不限于細菌、真菌或酵母物種例如曲霉菌屬(Aspergillus)、木霉菌屬(Trichoderma)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、法夫酵母屬(Phaffia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、單胞發(fā)酵菌屬(Zymomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、赤桿菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、色菌屬(Chromatium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、纖維粘菌屬(Cytophaga)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、假平胞菌屬(Sphingomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、集胞藻屬(Synechocystis)、聚球藻屬(Synechococcus)、魚腥藻屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和粘球菌屬(Myxococcus)物種。在一個實施方案中，在一個實施方案中，細菌宿主菌株包括埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬物種。在一個優(yōu)選的實施方案中，細菌宿主細胞是大腸桿菌。
大規(guī)模的微生物生長和功能基因表達可以使用寬范圍的簡單或復(fù)雜的碳水化合物、有機酸和醇或飽和烴，例如在光合或化能自養(yǎng)宿主的情況下甲烷或二氧化碳，氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量微量營養(yǎng)素，包括小無機離子的形式和量。生長速度的調(diào)節(jié)可以通過給培養(yǎng)物添加或不添加一般不視為營養(yǎng)素或能量來源的特定調(diào)節(jié)分子來進行。
用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞的載體或盒是本領(lǐng)域眾所周知的。一般地，載體或盒包含指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選標記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含含有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5′區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3′區(qū)域。最優(yōu)選的是當(dāng)2個控制區(qū)都來源于與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源和/或?qū)ιa(chǎn)宿主是天然的基因，盡管這樣的控制區(qū)無需是這樣來源的。
可用于驅(qū)動本發(fā)明頭孢菌素C脫乙酰酶編碼區(qū)在所需宿主細胞中表達的起始控制區(qū)或啟動子有很多，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。基本上能夠驅(qū)動這些基因的任何啟動子都適于本發(fā)明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在糖酵母屬(Saccharomyces)中的表達)；AOX1(可用于在畢赤酵母菌屬中的表達)；和lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大腸桿菌中表達)以及可用于在芽孢桿菌屬物種中表達的amy、apr、npr啟動子和各種噬菌體啟動子。
終止控制區(qū)也可以來源于對優(yōu)選宿主細胞是天然的各種基因。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的包括是任選的。在另一個實施方案中，嵌合基因包括來源于優(yōu)選宿主細胞的終止控制區(qū)。
工業(yè)生產(chǎn) 可以應(yīng)用各種培養(yǎng)方法以產(chǎn)生本發(fā)明過氧化水解酶催化劑。例如，由重組微生物宿主過量表達的特定基因產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)可以通過分批和連續(xù)培養(yǎng)方法來生產(chǎn)。
經(jīng)典的分批培養(yǎng)方法是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在培養(yǎng)開始時設(shè)定并且在培養(yǎng)過程期間不進行人工改變。因此，在培養(yǎng)過程開始時，用所需的一種或多種生物接種培養(yǎng)基，并且不向系統(tǒng)中進一步添加任何物質(zhì)可以發(fā)生生長或代謝活性。然而，通常來說，“分批”培養(yǎng)是指碳源的添加是成批的，但經(jīng)常試圖控制諸如pH和氧濃度之類的因素。在分批系統(tǒng)中，代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直至培養(yǎng)結(jié)束時。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細胞緩慢通過靜態(tài)延緩期到達高速生長對數(shù)期，并最后達到穩(wěn)定期，此時生長速率減緩或終止。如果不加以處理，穩(wěn)定期的細胞將最終死亡。在某些系統(tǒng)中對數(shù)期中的細胞通常負責(zé)最終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的批量生成。在其他系統(tǒng)中可以獲得穩(wěn)定或指數(shù)后期生成。
標準分批式系統(tǒng)的一種變型是補料-分批系統(tǒng)。補料-分批培養(yǎng)方法也適用于本發(fā)明，并且包括典型的分批式系統(tǒng)，不同的是隨著培養(yǎng)進程遞增地添加底物。在代謝產(chǎn)物往往抑制細胞的代謝作用，以及其中期望培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補料-分批式系統(tǒng)是有用的。補料-分批式系統(tǒng)中的實際底物濃度難于測量，并根據(jù)一些可測量因素(例如pH、溶解的氧以及廢氣例如CO2的分壓)進行評估。分批和補料-分批培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域內(nèi)是常用的且眾所周知，并且實例可見于如下文獻Thomas D.Brock，“BiotechnologyA Textbook ofIndustrialMicrobiology”，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
所需產(chǎn)物的商業(yè)生產(chǎn)也可以用連續(xù)培養(yǎng)來實現(xiàn)。連續(xù)培養(yǎng)是一種開放式系統(tǒng)，其中將設(shè)定好的培養(yǎng)基連續(xù)加入到生物反應(yīng)器中，并同時移出等量條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)培養(yǎng)一般使細胞維持在其中細胞主要處于對數(shù)生長期的恒定高液相密度?；蛘撸B續(xù)培養(yǎng)可以用固定化細胞來進行，其中連續(xù)添加碳和營養(yǎng)素，并且連續(xù)從細胞團塊中取出有價值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢棄物。細胞固定可以使用廣泛多樣的由天然和/或合成材料組成的固體載體來進行。
連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)允許調(diào)節(jié)影響細胞生長或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或任何數(shù)目的因素。例如，一種方法將以固定的速率維持限制性營養(yǎng)物質(zhì)(例如碳源或氮水平)并且允許所有其它參數(shù)適度。在其他系統(tǒng)中影響生長的許多因素可以連續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持不變。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)態(tài)生長條件，并且因此由于培養(yǎng)基取出的細胞喪失必須針對培養(yǎng)基中的細胞生長速度進行平衡。對于連續(xù)培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)營養(yǎng)素和生長因子的方法以及用于使產(chǎn)物形成速度達到最大的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，并且各種方法由Brock，同上所述。
本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的底物可包括但不限于單糖，例如葡萄糖和果糖；二糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纖維素或它們的混合物；以及來自可再生原料的未純化混合物，例如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜及大麥麥芽。此外，碳底物還可以是一碳底物例如二氧化碳、甲烷或甲醇(例如，當(dāng)宿主細胞是甲基營養(yǎng)微生物時)。-類似地，假絲酵母屬的多種物種將會代謝丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153485-489(1990))。因此，設(shè)想本發(fā)明中所利用的碳源可涵蓋各種含碳底物并且將僅受限于生物體的選擇。
申請人:特別將所有引用的參考文獻的完整內(nèi)容引入本公開內(nèi)容中。此外，當(dāng)一個數(shù)量、濃度或其他數(shù)值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時，它應(yīng)理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值的任何一對所構(gòu)成的所有范圍，而不管所述范圍是否被單獨地公開。凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍均意在包括其端點，以及位于該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分數(shù)，除非另行指出。當(dāng)定義一個范圍時，不希望將本發(fā)明的范圍限定于所列舉的具體數(shù)值。
一般方法 提供下述實施例以證實本發(fā)明的優(yōu)選方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例中公開的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實踐中良好發(fā)揮作用的技術(shù)，并且因此可以視為構(gòu)成關(guān)于其實踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以在公開的具體實施方案中進行許多改變并且仍獲得相同或相似結(jié)果。
除非另有說明，所有試劑和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)。
說明書中的下述縮寫對應(yīng)如下的測量單位、技術(shù)、性質(zhì)或化合物“sec”或“s”是指秒，“min”是指分鐘，“h”或“hr”是指小時，“μμL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mM”是指毫摩爾濃度，“M”是指摩爾濃度，“mmol”是指毫摩爾，“ppm”是指每百萬份數(shù)，“wt”是指重量，“wt％”是指重量百分比，“g”是指克，“μμg”是指微克，“g”是指重力，“HPLC”是指高效液相層析法，“dd H2O”是指蒸餾和去離子水，“dcw”是指細胞干重，“ATCC”或
是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)，“U”是指過氧化水解酶活性單位，“rpm”是指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，并且“EDTA”是指乙二胺四乙酸。
實施例1 枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM的生長和細胞提取物的制備 將干燥培養(yǎng)物懸浮于5ML營養(yǎng)肉湯(DIFCO；0003-01-6)中，并且在30℃培養(yǎng)3天，來將枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM培養(yǎng)物恢復(fù)活力。Fo培養(yǎng)第3天后，將等分試樣的培養(yǎng)物在胰酪胨大豆(trypticase soy)瓊脂培養(yǎng)平板(Becton，Dickinson，and Company；Franklin Lakes，NJ)上進行劃線，并且在35℃培養(yǎng)24小時。將幾個單個菌落刮到1微升接種環(huán)(Becton Dickinson；目錄#220215)上，并且轉(zhuǎn)移到50ML乳桿菌屬Lactobacillus MRS肉湯(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA；目錄#C5931)內(nèi)。然后將培養(yǎng)物在30℃和200rpm攪拌速度下生長12小時。生長12小時后，將2ML培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到包含100MLMRS肉湯的無擋板的500mL搖瓶內(nèi)，用于在30℃和200rpm攪拌速度下生長12-14小時。然后通過在5℃以15,000×g離心25分鐘來收獲細胞，并且將所得細胞糊貯存于-80℃。
對于細胞提取物制備，將0.9g細胞糊以25重量％(細胞干重)懸浮于包含二硫蘇糖醇(1mM)和EDTA(1mM)的0.05M磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中。使細胞懸浮液2次通過具有16,000psi工作壓力的弗氏壓碎器。然后將粗提取物以20,000×g離心以去除細胞碎片，產(chǎn)生用于可溶性總蛋白測定的澄清細胞提取物(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，Sigma Aldrich，Sigma目錄#BCA 1-KT)，然后在-80℃冷凍和貯存。
實施例2 枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM半純化的細胞提取物的過氧化水解活性的測定 將1.0mL等分試樣的枯草芽孢桿菌(ATCC 31954TM)細胞提取物(10Mg總蛋白/mL，如實施例1中所述制備)用等體積的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進行稀釋，并通過100,000分子量截留(Molecular WeightCutoff)(MWCO)Centricon膜裝置(Millipore Corp，Bedford，MA)進行過濾。所得到的濾液(半純化的細胞提取物)包含用于可溶性總蛋白測定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，Sigma目錄#BCA1-KT)的1.5Mg總蛋白/mL，并且該濾液的測定指出沒有可測量的過氧化氫酶活性。
將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(2.5M)和0.100ML半純化的細胞提取物(0.15Mg提取總蛋白)的1mL反應(yīng)混合物于25℃混合。對照反應(yīng)通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換半純化的細胞提取物來進行，以測定在不存在添加的半純化細胞提取物的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸的濃度。
根據(jù)由Karst等人描述的方法來進行反應(yīng)混合物中過乙酸濃度的測定。在10分鐘和30分鐘時取出等分試樣(0.250ML)的反應(yīng)混合物，并且使用
MC-濾器裝置(30,000標稱分子量極限(NormalMolecular Weight Limit)(NMWL)，Millipore目錄#UFC3LKT 00)通過在12,000rpm下離心2分鐘進行過濾；通過過濾去除等分試樣的蛋白質(zhì)成分來終止反應(yīng)。將等分試樣(0.100ML)的所得到的濾液轉(zhuǎn)移至包含0.300Ml去離子水的1.5mL螺旋瓶蓋HPLC瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)中，然后加入0.100ML 20mMMTS(甲基對甲苯基硫)在乙腈中的溶液，將瓶蓋上蓋子，使內(nèi)容物短暫混合，然后在約25℃于不存在光的情況下培養(yǎng)10分鐘。隨后向每個瓶中添加0.400ML乙腈和0.100ML三苯基膦(TPP，40mM)在乙腈中的溶液，再次將瓶蓋上蓋子，并且使所得溶液混合，并且在約25℃下于不存在光的情況下培養(yǎng)30分鐘。隨后向每個管形瓶中添加0.100ML 10mM N，N-二乙基-間甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外標)，并且如下所述通過HPLC分析所得到的溶液。在10分鐘和30分鐘內(nèi)產(chǎn)生的過乙酸濃度列舉于表5中。
HPLC方法 Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(cat.#569422-U)w/前置柱Supelco Supelguard Discovery C8(Sigma-Aldrich；目錄#59590-U)；10微升注射體積；采用CH3CN(Sigma-Aldrich；#270717)和去離子H2O以1.0ML/min和室溫進行梯度洗脫 時間(分鐘秒) (％CH3CN) 0:00 40 3:00 40 3:10 100 4:00 100 4:10 40 7:00(停止) 40 表5在枯草芽孢桿菌(ATCC 31954TM)半純化細胞提取物的存在或不存在下，通過甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(2.5M)于pH 6.5反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例3 來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM細胞提取物的半純化酶的過氧化水解活性 如實施例1中所述進行枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM生長和提取物制備，除了粗提取物不進行離心。將粗提取物用冷正丙醇(-20℃)進行分級處理。將包含無細胞提取物的燒瓶在冰浴中攪拌15分鐘，隨后滴加(以防止提取物凝固)正丙醇(-20℃)至40％(v/v)的濃度。將所得到的提取物/丙醇混合物在冰浴中攪拌30分鐘，隨后以12,000×g下于5℃離心10分鐘，并將上清液放回到燒瓶中并置于冰浴內(nèi)。在攪拌下向上清液中緩慢加入另外的正丙醇-20℃)至60％(v/v)的濃度，并且如上所述在冰浴中將所得到的混合物攪拌30分鐘，然后離心。將來自該第二個級份的團塊保存于冰上，并將上清液放回到燒瓶中并置于冰浴內(nèi)。在攪拌下向上清液中緩慢加入冷正丙醇至80％(v/v)的濃度，并且如上所述將混合物攪拌30分鐘且離心。將來自60-80％級份的團塊保存于冰上。將來自40-60％(v/v)正丙醇級份和60-80％(v/v)正丙醇級份的團塊溶解于最小量的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，并且測定所得溶液的可溶性總蛋白(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，目錄#BCA1-KT)，隨后冷凍和貯存于-80℃。
將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和來自細胞提取物的40-60％(v/v)或60-80％(v/v)正丙醇級份(如上所述制備的)的0.10Mg/mL可溶性總蛋白的1mL反應(yīng)混合物于25℃進行混合。對照反應(yīng)通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)替換包含半純化酶的細胞提取物的正丙醇級份來進行，以測定在不存在添加的半純化酶的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解所產(chǎn)生的過乙酸濃度。使用實施例2中描述的操作在5分鐘和30分鐘時測定反應(yīng)混合物的過乙酸，并且將通過添加的酶產(chǎn)生的過乙酸濃度列于表6中。
表6。在枯草芽孢桿菌(ATCC 31954TM)半純化細胞提取物的存在或不存在下，通過甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(1.0M)于pH 6.5反應(yīng)所產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例4 來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM細胞提取物的具有過氧化水解活性的頭孢菌素C脫乙酰酶的鑒定 將實施例3中描述的40-60％正丙醇級份的0.1ML樣品(500μg總蛋白)在室溫下與等體積的2×非變性(天然)樣品緩沖液(Invitrogen)混合，并裝載到1.5mM 8-16％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺mini-凝膠(2D凝膠；Invitrogen)的制備樣品孔內(nèi)。天然凝膠電泳使用Tris-甘氨酸電泳緩沖液(Invitrogen)在125V下操作90分鐘。電泳后，制備凝膠用于使用pH指示劑溴百里酚藍的原位酯酶活性測定。
將凝膠用去離子水洗滌10分鐘×2，并且進行緩慢機械混合。然后使用10mM磷酸鹽緩沖液將凝膠洗滌10分鐘。除去磷酸鹽緩沖液后，使包含665μL飽和溴百里酚藍(溶于水中)的50ML 10mM磷酸鹽緩沖液與凝膠一起培養(yǎng)10分鐘，然后添加1ML純甘油三乙酸酯(SigmaAldrich)。在培養(yǎng)10分鐘內(nèi)，在凝膠上146kD處出現(xiàn)指示酯酶活性的1個黃色條帶。
從凝膠中切下酯酶陽性條帶，并且轉(zhuǎn)移到50ML聚丙烯圓錐形管(Falcon)內(nèi)。伴隨輕輕混合的2-5ML去離子水洗滌后，從凝膠切片中取出黃色的溴百里酚藍斑點。然后在輕輕混合下將凝膠切片用0.9ML 2×Novex Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液加100μL 10×NuPAGE還原劑(Invitrogen)處理30分鐘。樣品處理后，使用熱水浴將凝膠切片和樣品緩沖液于85℃培養(yǎng)5分鐘。隨后從培養(yǎng)管中取出凝膠切片，并且小心地置于1.5mM 8-16％Tris-GlyMini-凝膠的單個制備孔中。小心地排除氣泡并且與成層凝膠直接接觸。將在去離子水中制備的250-300μL溫0.5％瓊脂糖溶液加到制備孔內(nèi)后，原位固定凝膠切片。將單個分子標記泳道裝載15μL
Plus2預(yù)染色MW標記(Invitrogen)。
凝膠切片的電泳在30V下操作30分鐘，用于將蛋白質(zhì)從凝膠切片電洗脫到平板凝膠內(nèi)。電壓隨后經(jīng)過10分鐘從30V斜線上升至125V，隨后為在125V進行90分鐘的操作。電泳后，如XCell IITM印跡手冊(Invitrogen)中所述將分離的蛋白條帶印跡到PVDF膜上，并且印跡緩沖液是10mM CAPS，pH 11.0。電泳印跡操作在25V下在轉(zhuǎn)移裝置的夾套中于室溫用冰水操作2小時。
轉(zhuǎn)移后，將PVDF膜用ProBlot染色溶液(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)染色1分鐘，隨后用甲醇∶水(50∶50)脫色。鑒定6個蛋白質(zhì)條帶并且各自進行N-末端測序。
氨基酸序列數(shù)據(jù)庫的Blast搜索后，具有酯酶相關(guān)序列同源性的唯一條帶鑒定為條帶1，并且17個N-末端氨基酸調(diào)用與枯草芽孢桿菌頭孢菌素C脫乙酰酶(
BAA01729；Mitsushima等人，同上；美國專利5,528,152；和美國專利5,338,676)具有100％的氨基酸同一性。
實施例5 來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)(Gentra Systems，Minneapolis MN)從枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM分離出基因組DNA。通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得到的核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO1)亞克隆到pTrcHis2-
(Invitrogen，Carlsbad CA)內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW186的質(zhì)粒。還通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ IDNO27和SEQ ID NO28的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO29)用限制酶PstI和XbaI切開，并且亞克隆到pUC19中的PstI與XbaI位點之間，以產(chǎn)生鑒定為pSW194質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW186和pSW194來轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen，CarlsbadCA)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌geneticStock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194的菌株。將TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例6 來自枯草芽孢桿菌BE1010的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)(Gentra Systems)從枯草芽孢桿菌BE1010(Payne和Jackson 1991J.Bacteriol.1732278-2282)分離出基因組DNA。通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO5)亞克隆到pTrcHis2-
(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW187的質(zhì)粒。還通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO27和SEQ ID NO28的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO30)用限制酶PstI和XbaI切開，并且亞克隆到pUC19中的PstI與XbaI位點之間，以產(chǎn)生鑒定為pSW189的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW187和pSW189來轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為TOP10/pSW187，MG1655/pSW187，UM2/pSW187，KLP18/pSW187，TOP10/pSW189，MG1655/pSW189，UM2/pSW189和KLP18/pSW19的菌株。將TOP10/pSW187、MG1655/pSW187、UM2/pSW187、KLP18/pSW187、TOP10/pSW189、MG1655/pSW189、UM2/pSW189和KLP18/pSW189在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例7 來自枯草芽孢桿菌ATCC 6633Tm的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)從枯草芽孢桿菌ATCC 6633TM分離出基因組DNA。通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO7)亞克隆到pTrcHis2-
內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW188的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW188來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)和大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW188和UM2/pSW188的菌株。將MG1655/pSW188和UM2/pSW188在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例8 來自枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)從枯草芽孢桿菌ATCC 29233TM分離出基因組DNA。通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO31)亞克隆到pTrcHis2-
內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW190的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW190來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190的菌株。將MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例9 來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580TM的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)從地衣芽孢桿菌ATCC 14580TM分離出基因組DNA。通過PCR(94℃05分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO9)亞克隆到pTrcHis2-
內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW191的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW191來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)、大腸桿菌PIR1(Invitrogen，Carlsbad CA)和大腸桿菌KLP 18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191的菌株。將MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例10 來自熱纖梭菌(Clostridia thermocellum)ATCC 27405TM的過氧化水解酶的克隆和表達 使用
DNA純化系統(tǒng)從熱纖梭菌ATCC 27405TM分離出基因組DNA。通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO35和SEQ ID NO36的引物，從基因組DNA擴增過氧化水解酶基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO13)亞克隆到pTrcHis2-
內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW193的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW193來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193的菌株。將MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例11 來自短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)PS213的過氧化水解酶的克隆和表達 使用對于在大腸桿菌中表達最優(yōu)化的密碼子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)來合成如在
(登錄號#AJ249957)中報道的來自短小芽孢桿菌PS213的編碼乙酰木聚糖酯酶的基因(axel)。然后通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ IDNO37和SEQ ID NO38的引物來擴增該基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ IDNO60)亞克隆到pTrcHis2-
(Invitrogen，Carlsbad CA)內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW195的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW195來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，YaleUniversity，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195的菌株。將MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例12 來自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的過氧化水解酶的克隆和表達 使用對于在大腸桿菌中表達最優(yōu)化的密碼子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)來合成如在
(登錄號#58632)中報道的來自那不勒斯棲熱袍菌的編碼乙酰木聚糖酯酶基因。然后通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO39和SEQ ID NO40的引物來擴增該基因。將所得核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO41)亞克隆到pTrcHis2-
內(nèi)，以產(chǎn)生鑒定為pSW196的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pSW196來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)、大腸桿菌UM2(大腸桿菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大腸桿菌KLP18(見實施例15)以產(chǎn)生分別鑒定為MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196的菌株。將MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196在LB培養(yǎng)基中于37℃在搖動下生長直至OD600nm＝0.4-0.5，這時加入IPTG至最終濃度為1mM，并且繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。通過離心收獲細胞，并且進行SDS-PAGE以證實在20-40％總可溶性蛋白的過氧化水解酶的表達。
實施例13 katG過氧化氫酶破壞的大腸桿菌菌株的構(gòu)建 通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO44和SEQ ID NO45的引物來從質(zhì)粒pKD13(SEQ ID NO43)擴增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO42)，以產(chǎn)生鑒定為SEQ ID NO46的PCR產(chǎn)物。katG核酸序列作為SEQ IDNO47提供，提供，并且相應(yīng)的氨基酸序列是SEQ ID NO48。用溫度敏感性質(zhì)粒pKD46(SEQ ID NO49)轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)，所述質(zhì)粒含有λ-Red重組酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA976640-6645)，并且在LB-amp平板上于30℃選擇24小時。通過電穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)將MG1655/pKD46用50-500ng PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，并且在LB-kan平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB-kan平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pKD46質(zhì)粒熟化。檢查菌落以證實kanR/ampS表型。使用
DNA純化系統(tǒng)從幾個菌落分離出基因組DNA，并且使用鑒定為SEQ ID NO50和SEQ ID NO51的引物，通過PCR檢查，以證實katG基因的破壞。將幾個katG-破壞的菌株用溫度敏感性質(zhì)粒pCP20(SEQ ID NO52)轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有用于切除kan基因的FLP重組酶，并且在LB-amp平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pCP20質(zhì)粒熟化。檢查兩個菌落以證實kanS/ampS表型，并且稱為MG1655KatG1和MG1655KatG2。
實施例14 katE過氧化氫酶破壞的大腸桿菌菌株的構(gòu)建 通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO53和SEQ ID NO54的引物來從質(zhì)粒pKD13(SEQ ID NO43)擴增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO42)以產(chǎn)生鑒定為SEQ ID NO55的PCR產(chǎn)物。katE核酸序列作為SEQ ID NO56提供，并且相應(yīng)的氨基酸序列是SEQ ID NO57。用溫度敏感性質(zhì)粒pKD46(SEQ ID NO49)轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC 47076TM)，所述質(zhì)粒含有λ-Red重組酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃選擇24小時。通過電穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)將MG1655/pKD46用50-500ng PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，并且在LB-kan平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB-kan平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pKD46質(zhì)粒熟化。檢查菌落以證實kanR/ampS表型。使用PUREGENE DNA純化系統(tǒng)從幾個菌落分離出基因組DNA，并且使用鑒定為SEQ ID NO58和SEQ ID NO59的引物，通過PCR檢查，以證實katE基因的破壞。將幾個katE-破壞的菌株用溫度敏感性質(zhì)粒pCP20(SEQID NO52)轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有用于切除kan基因的FLP重組酶，并且在LB-amp平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pCP20質(zhì)粒熟化。檢查兩個菌落以證實kanS/ampS表型，并且稱為MG1655KatE1和MG1655KatE2。
實施例15 katG過氧化氫酶和katE過氧化氫酶破壞的大腸桿菌菌株(KLP18)的構(gòu)建 通過PCR(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，70℃1分鐘，30個循環(huán))，使用鑒定為SEQ ID NO53和SEQ ID NO54的引物來從質(zhì)粒pKD13(SEQ ID NO43)擴增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO42)以產(chǎn)生鑒定為SEQ ID NO55的PCR產(chǎn)物。用溫度敏感性質(zhì)粒pKD46(SEQ IDNO49)轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655 KatG1(實施例13)，所述質(zhì)粒含有λ-Red重組酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃選擇24小時。通過電穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)將MG1655KatG1/pKD46用50-500ng PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，并且在LB-kan平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB-kan平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pKD46質(zhì)粒熟化。檢查菌落以證實kanR/ampS表型。使用
DNA純化系統(tǒng)從幾個菌落分離出基因組DNA，并且使用鑒定為SEQ ID NO58和SEQ ID NO59的引物，通過PCR檢查，以證實katE基因的破壞。將幾個katE-破壞的菌株(ΔkatE)用溫度敏感性質(zhì)粒pCP20(SEQ ID NO52)轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有用于切除kan基因的FLP重組酶，并且在LB-amp平板上于37℃選擇24小時。將幾個菌落劃線到LB平板上，并且在42℃培養(yǎng)過夜以讓pCP20質(zhì)粒熟化。檢查兩個菌落以證實kanS/ampS表型，并且稱為MG1655KatG1KatE18.1和MG1655KatG1KatE23。MG1655KatG1KatE18.1指定為大腸桿菌KLP18。
實施例16 評估過氧化水解酶分子質(zhì)量 將來自表達得自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和熱纖梭菌的過氧化水解酶基因的大腸桿菌KLP18，一種過氧化氫酶雙剔除的大腸桿菌MG1655的搖瓶生長物的細胞團懸浮在含有二硫蘇糖醇(1mM)的2.2ML0.05M磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中。將每個細胞懸浮液通過具有16,000psi(～110.3MPa)的工作壓力的French壓力機兩次。將粗提取物以20,000×g離心以除去細胞碎屑，獲得澄清粗提取物，分析其總可溶性蛋白(Bicinchoninic Acid Kit[BCA]for Protein Determination，SigmaAldrich，BCA1-KT)。
將含有20μg總蛋白的澄清化的粗提取物(5μL)在室溫與等體積的2×非變性(天然)樣本緩沖液(Invitrogen)混合，并且加載到1.5mM×10孔4-12％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺小凝膠(Invitrogen)的樣本孔內(nèi)，向兩個單獨的孔內(nèi)加載7.5μL NATIVEMARKTM Unstained Protein Standard(Invitrogen)。使用Tris-甘氨酸流動緩沖液(Invitrogen)在125V進行天然凝膠電泳105分鐘。電泳后，使用pH指示劑溴百里酚藍原位進行凝膠的酯酶活性測定。
在緩慢機械混合下，將凝膠用去離子水洗滌10Min×2。然后在緩慢機械混合下，將凝膠用10mM pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌10分鐘。除去磷酸鹽緩沖液之后，將含有400μL飽和溴百里酚藍水溶液的30ML10mM pH 7.0磷酸鹽緩沖液與凝膠培養(yǎng)10分鐘，然后加入1ML純凈的甘油三乙酸酯(Tessenderlo Fine Chemicals；Staffordshire，UK)。在培養(yǎng)2分鐘內(nèi)，在活性過氧化水解酶位點形成了黃色條帶。所有枯草芽孢桿菌物種和地衣芽孢桿菌都具有在約216kDa分子質(zhì)量的強條帶。熱纖梭菌表現(xiàn)出在約432kDa的強主要條帶以及在約576kDa的次要條帶，這表明了酯酶活性。通過在與條帶相鄰的凝膠中打小孔來將所有條帶標記。在緩慢機械混合下將凝膠用去離子水洗滌10Min×2以除去酯酶活性色斑。然后在緩慢機械混合下將凝膠用10mM pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌10分鐘以準備進行蛋白染色。加入考馬斯藍(Coomassie blue)染色劑以覆蓋凝膠。緩慢機械混合5分鐘后，傾析出考馬斯藍，并且用40ML去染液(de-stain)(10％乙酸、30％甲醇、60％去離子水)替換。去染后，估測活性區(qū)域的分子質(zhì)量。結(jié)果總結(jié)于表7中。
表7過氧化水解酶分子質(zhì)量的評估
實施例17 表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187的發(fā)酵 通過向2L搖瓶中加入包含LBMiller培養(yǎng)基(DIFCO)的0.5L接種培養(yǎng)基來制備發(fā)酵罐接種培養(yǎng)物。將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6.8，并且在搖瓶中滅菌。滅菌后，加入1ML氨芐青霉素貯備液(25Mg/mL)。給接種培養(yǎng)基接種1mL大腸桿菌UM2/pSW187在20％甘油中的培養(yǎng)物，并且在36℃以300rpm培養(yǎng)。將接種培養(yǎng)物以大約1-2OD550轉(zhuǎn)移到14L發(fā)酵罐(Braun)中，所述發(fā)酵罐在35℃包含8L培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(2.0g/L)、檸檬酸鈉二水合物(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡劑(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量因素溶液含有檸檬酸一水合物(10g/L)、MnSO4水合物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。滅菌后的加入包括60g補料分批溶液(見下文)和16.0ML氨芐青霉素貯備液(25Mg/mL)。所述補料分批溶液含有2.4kg 60％w/w葡萄糖、0.6L 25g/L酵母提取物和50g/L Bacto蛋白胨(DIFCO)。當(dāng)葡萄糖濃度降至低于0.5g/L時，開始葡萄糖進料，以0.3g/分鐘開始，并且每小時分別逐漸提高至0.35、0.40、0.47和0.53g/分鐘；之后速度保持恒定。監(jiān)測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，并且如果濃度超過0.1g/L，則降低加入速度或者暫時停止加入。在OD550＝7時，通過加入16ML IPTG(0.5M)來開始誘導(dǎo)。將溫度控制在36℃，并且充氣固定在2slpm(每分鐘標準升數(shù))，以400rpm進行攪拌。將pH控制在6.8；使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)來進行pH控制。頭部壓力為0.5巴。在加入IPTG之后8小時，通過離心來收獲細胞。
實施例18 表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186或表達地衣芽孢桿菌ATCC 14580TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW191的發(fā)酵 使用表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186或表達地衣芽孢桿菌ATCC 14580TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW191，如實施例17所述制備接種培養(yǎng)物。發(fā)酵培養(yǎng)基是LBMiller(25g/L，DIFCO)。滅菌后的加入包括50g葡萄糖溶液(50％w/w)和16.0ML氨芐青霉素貯備液(25Mg/mL)。使用葡萄糖(50％w/w)用于補料分批發(fā)酵。當(dāng)萄萄糖濃度降至低于0.5g/L時，以0.3g/分鐘的恒定速度開始葡萄糖進料。監(jiān)測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，并且如果濃度超過0.1g/L，則降低加入速度或者暫時停止加入。在OD550＝2時，通過加入16ML IPTG(0.5M)來開始誘導(dǎo)。將溫度控制在36℃，并且充氣固定在2slpm，以400rpm進行攪拌。將pH控制在6.8；使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)進行pH控制。頭部壓力為0.5巴。在加入IPTG之后8小時，通過離心來收獲細胞。
實施例19 表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌KLP18/PSW189或表達地衣芽孢桿菌ATCC 14580TM過氧化水解酶的大腸桿菌KLP18/PSW191的發(fā)酵 通過向2L搖瓶中加入0.5L接種培養(yǎng)基來制備發(fā)酵罐接種培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基含有酵母提取物(Amberx 695，5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、檸檬酸鈉二水合物(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水合物(1.0g/L)和檸檬酸鐵銨(0.10g/L)。將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6.8，并且將培養(yǎng)基在搖瓶中滅菌。滅菌后的加入包括葡萄糖(50wt％，10.0ML)和1ML氨芐青霉素(25Mg/mL)貯備液。給接種培養(yǎng)基接種1mL大腸桿菌KLP18/PSW189或KLP18/PSW191在20％甘油中的培養(yǎng)物，并且在35℃和300rpm培養(yǎng)。將接種培養(yǎng)物以約1-2OD550轉(zhuǎn)移到14L發(fā)酵罐(Braun)中，所述發(fā)酵罐在35℃包含8L培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(2.0g/L)、檸檬酸鈉二水合物(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡劑(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量因素溶液含有檸檬酸一水合物(10g/L)、MnSO4水合物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。滅菌后的加入包括葡萄糖溶液(50％w/w，80.0g)和氨芐青霉素(25Mg/mL)貯備液(16.00ML)。使用葡萄糖溶液(50％w/w)用于分批補料。當(dāng)葡萄糖濃度降至低于0.5g/L時，開始葡萄糖進料，以0.31g進料/分鐘開始，并且每小時分別逐漸提高至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、090、1.04、1.21、1.41、1.63g/分鐘；之后速度保持恒定。監(jiān)測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，并且如果濃度超過0.1g/L，則降低加入速度或者暫時停止加入。對于大腸桿菌KLP18/PSW191，在OD550＝80時，通過加入16ML IPTG(0.5M)來開始誘導(dǎo)，對于大腸桿菌KLP 18/PSW189，生長較慢，在OD550＝56時開始誘導(dǎo)。將溶解氧(DO)濃度控制在25％空氣飽和度。首先通過葉輪攪拌速度(400至1400rpm)，然后通過充氣速度(2至10slpm)來控制DO。將pH控制在6.8。使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)進行pH控制。頭部壓力為0.5巴。在加入IPTG之后16小時，通過離心來收獲細胞。
實施例20 大腸桿菌KLP18與大腸桿菌UM2作為發(fā)酵宿主用于過氧化水解酶生產(chǎn)的比較 使用大腸桿菌KLP18(實施例15)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體(實施例5、8、9和10)，按照實施例19中描述的方法讓所述轉(zhuǎn)化體在多個10L發(fā)酵中生長。將這些運轉(zhuǎn)的最終OD與按照實施例17和18中描述的發(fā)酵方法運轉(zhuǎn)的產(chǎn)生表達這些相同過氧化水解酶的大腸桿菌UM2轉(zhuǎn)化體(實施例5、8、9和10)的發(fā)酵進行比較。表8總結(jié)了用UM2和KLP 18作為宿主的10-L發(fā)酵運轉(zhuǎn)，并且證明了與UM2相比，KLP18具有優(yōu)異的性能。
表8。
實施例21 在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中表達的枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的評估 將在實施例5中描述的3種轉(zhuǎn)化體大腸桿菌TOP10/pSW186、大腸桿菌MG1655/pSW186和大腸桿菌UM2/pSW186在包含具有氨芐青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB肉湯(50ML；Mediatech，Inc，Herndon，VA)的無擋板的搖瓶中，于35-37℃在200rpm攪拌下生長14-16小時。這3種轉(zhuǎn)化體過夜生長后，通過在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的新鮮Miller’s LB肉湯內(nèi)制備每種培養(yǎng)物的1∶100稀釋，將每種培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)。于35-37℃在200rpm攪拌下生長3小時后，通過添加IPTG至1mM的終濃度來誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物。在相同條件下另外生長3小時后，通過以26,000×g下于5℃離心20分鐘收獲來自每種培養(yǎng)物的細胞糊。將每種轉(zhuǎn)化體的細胞提取物根據(jù)實施例1中描述的操作進行制備，不同之處是用于制備25wt％濕細胞懸浮液的提取緩沖液由0.05M磷酸鉀(pH 7.0)和1mM二硫蘇糖醇組成。
包含在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中的甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和來自3種細胞提取物(如上所述制備)之一的50μg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)于25℃進行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。第二組對照反應(yīng)使用由未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP 10、大腸桿菌MG1655和大腸桿菌UM2的提取物制備的50μg提取總蛋白來進行，以測定在不存在表達的過氧化水解酶的情況下由每種菌株產(chǎn)生的過酸的本底水平。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表9)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表9在大腸桿菌TOP10/pSW186、大腸桿菌MG1655/pSW186和大腸桿菌UM2/pSW186的細胞提取物存在下，通過甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(1.0M)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例22 表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌TOP10/pSW186提取物的過氧化水解活性 按照實施例21中描述的方法，使用大腸桿菌TOP 10/pSW186轉(zhuǎn)化體提取物來運行單獨的1.0ML甘油三乙酸酯過氧化水解反應(yīng)，以在反應(yīng)中提供下列總蛋白濃度之一每一反應(yīng)中196μg/mL、98μg/mL、49μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.0μg/mL或1.5μg/mL總蛋白濃度(表10)。
表10在包含甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(1.0M)于pH6.5的反應(yīng)中，過乙酸(PAA)濃度對于來源于大腸桿菌TOP10/pSW186轉(zhuǎn)化體提取物的總蛋白濃度的依賴性。
實施例23 表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186提取物的過氧化水解活性 在包含在磷酸鹽緩沖液(Pi，100mM、200mM或300mM)中的甘油三乙酸酯(40mM或100mM)、過氧化氫(40mM或100mM)和提取總蛋白(0.1Mg/mL或1.0Mg/mL)的1.0ML過氧化水解反應(yīng)(如實施例21中所述進行)中，使用大腸桿菌UM2/pSW186轉(zhuǎn)化體提取物(20Mg總蛋白/mL提取物，如實施例21中所述制備)，每一反應(yīng)于pH 6.5或7.5在25℃進行(表11)。
表11使用來源于大腸桿菌UM2/pSW186轉(zhuǎn)化體提取物的過氧化水解酶，在pH 6.5或7.5下過乙酸(PAA)濃度對甘油三乙酸酯和過氧化氫濃度的依賴性。
實施例24 在來源于枯草芽孢桿菌BE1010的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中表達的過氧化水解酶的評估 將在實施例6中描述的大腸桿菌TOP10/pSW187、大腸桿菌MG1655/pSW187和大腸桿菌UM2/pSW187轉(zhuǎn)化體在包含具有氨芐青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB肉湯(50ML；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的無擋板的搖瓶中，于35-37℃在200rpm攪拌下生長14-16小時。這3種轉(zhuǎn)化體過夜生長后，通過在包含氨芐青霉素(100μg/mL)的新鮮Miller’s LB肉湯內(nèi)制備每種培養(yǎng)物的1∶100稀釋，將每種培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)。于35-37℃在200rpm攪拌下生長3小時后，通過添加IPTG至1mM的終濃度來誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物。在相同條件下另外生長3小時后，通過以26,000×g下于5℃離心20分鐘收獲來自每種培養(yǎng)物的細胞糊。將每種轉(zhuǎn)化體的細胞提取物根據(jù)實施例1中描述的操作進行制備，不同之處是用于制備25wt％濕細胞懸浮液的提取緩沖液由0.05M磷酸鉀(pH7.0)和1mM二硫蘇糖醇組成。
將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和50μg提取總蛋白的單獨1.0Ml反應(yīng)于25℃使用每種轉(zhuǎn)化體提取物來運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定通過甘油三乙酸酯由過氧化氫的化學(xué)過氧化水解產(chǎn)生的過乙酸濃度。第二組對照反應(yīng)使用由未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10、大腸桿菌MG1655和大腸桿菌UM2的提取物制備的50μg提取總蛋白來進行，以測定在不存在表達的過氧化水解酶的情況下由每種菌株生產(chǎn)的過酸的本底水平。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表12)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表12在大腸桿菌TOP 10/pSW187、大腸桿菌MG1655/pSW187和大腸桿菌UM2/pSW187的細胞提取物的存在下，通過甘油三乙酸酯(250mM)與過氧化氫(1.0M)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例25 評估在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中表達的過氧化水解酶 如實施例5、6、7、8、9、10、18和19中所述制備轉(zhuǎn)化體。將每種轉(zhuǎn)化體的細胞提取物根據(jù)實施例1中描述的操作進行制備，不同之處是用于制備25wt％濕細胞懸浮液的提取緩沖液由0.05M磷酸鉀(pH7.0)和1mM二硫蘇糖醇組成。
將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和50μg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)于25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。第二組對照反應(yīng)使用由未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10、大腸桿菌MG1655、大腸桿菌UM2和大腸桿菌KLP18的提取物制備的50μg提取總蛋白來進行，以測定在不存在表達的過氧化水解酶的情況下由每種菌株產(chǎn)生的過酸的本底水平。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表13)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表13在得自大腸桿菌TOP10、大腸桿菌MG1655、大腸桿菌UM2、大腸桿菌PIR2和大腸桿菌KLP18的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的50μg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(1.0M)于pH6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例26(比較實施例) 評估市售脂肪酶的過氧化水解 在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和50μg脂肪酶的單獨1mL反應(yīng)于25℃進行。不采用市售脂肪酶來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的脂肪酶下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表14)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。市售脂肪酶得自Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，BioCatalytics(Pasadena，CA)，Meito Sangyo Co.(Nagoya，Japan)，AmanoEnzymes(Lombard，IL)，Novozymes(Franklinton，NC)，Valley Research(South Bend，IN)和Enzyme Development Corporation(
NewYork，NY)。
表14在50μg/mL市售脂肪酶存在下通過甘油三乙酸酯(250mM)與過氧化氫(1.0M)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例27 評估在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中表達的過氧化水解酶 按照實施例21中描述的方法制備表達過氧化水解酶的轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)和1Mg或2Mg來自細胞提取物(如上所述制備的)的提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表15)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表15在得自大腸桿菌MG1655、大腸桿菌UM2、大腸桿菌PIR2和大腸桿菌KLP18的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg或2Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 6.5或7.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例28(比較實施例) 評估市售脂肪酶的過氧化水解 將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)和1Mg市售脂肪酶的單獨1mL反應(yīng)于25℃進行。不采用市售脂肪酶來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的脂肪酶下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表16)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表16在1Mg/mLmL市售脂肪酶存在下通過甘油三乙酸酯(105mM)與過氧化氫(78mM)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例29 具有潤濕劑的芽孢桿菌ATCC31954TM過氧化水解酶活性 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)、潤濕劑
MSC-NA(混合的短鏈二丙酸鈉；Colonial Chemical Co.)，
2502(一種乙氧基化/丙氧基化基于炔的表面活性劑；Air Products and Chemicals；Utrecht，NL)，
MD-20，
L7650(一種聚環(huán)氧烷改性的聚二甲基硅氧烷；Chemtura Corp，Middlebury，CT)或
L8620；一種基于硅氧烷的表面活性劑)和1Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表17)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表17在得自表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 7.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例30 具有潤濕劑的枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶活性 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)、潤濕劑(
17R4(一種聚氧化烯醚表面活性劑；BASF，Mount Olive，NJ)，
L43(一種雙官能嵌段共聚物表面活性劑)或
L7650)和1Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表18)是根據(jù)實施例2中描述的KarstKarst等人的方法測定的。
表18在得自表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例31 具有潤濕劑和螯合劑的過氧化水解酶活性 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)、潤濕劑(
L7650)、螯合劑(
SL；羥乙磷酸；Solutia Inc.，St.Louis，MO)和1Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表19)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表19在得自表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例32 具有潤濕劑、螯合劑和腐蝕抑制劑的過氧化水解酶活性 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、過氧化氫(78mM)、潤濕劑(
L7650)、螯合劑(
SL)、腐蝕抑制劑(苯并三唑)和1Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表20)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表20在得自表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW187的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例33 使用固定化枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM或BE1010過氧化水解酶的過乙酸生成 將0.50g
Oxirane酶固定聚合載體(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)在5.0ML 0.225M磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)中的懸浮液于室溫在旋轉(zhuǎn)平臺上混合24小時，所述緩沖液含有得自大腸桿菌KMP/pSW189(表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶)或大腸桿菌UM2/pSW186(表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶)的提取物(如實施例21中所述制備的)的10Mg/mL總可溶性蛋白，然后將懸浮液從固定化的酶中傾析出，用4份40mL體積的磷酸鹽緩沖液(50mM，pH65)洗滌，并且在該相同緩沖液中于5℃貯存。在使用之前，將固定化酶通過真空過濾來干燥。
將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、過氧化氫(1.0M)和1.5Mg/mL或5.0Mg/mL固定化過氧化水解酶(如上所述制備的)的單獨1mL反應(yīng)于25℃進行。進行對照反應(yīng)以確定在沒有添加的固定化酶存在的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表21)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表21在固定化枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM或BE1010過氧化水解酶存在下通過甘油三乙酸酯(250mM)和過氧化氫(1.0M)于pH 6.5的反應(yīng)產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例34 使用得自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和熱纖梭菌的過氧化水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的過氧化水解 將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)、過氧化氫(1.0M)和得自大腸桿菌UM2細胞提取物(如實施例21所述制備的)的含有過氧化水解酶的50μg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)于25℃進行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。使用由未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌UM2的提取物制備的50μg提取總蛋白來運行第二個對照反應(yīng)，以確定在沒有表達的過氧化水解酶存在的情況下由大腸桿菌菌株產(chǎn)生的過酸本底水平。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表22)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表22在得自表達過氧化水解酶的大腸桿菌UM2的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的50μμg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)的混合物與過氧化氫(1.0M)于pH 6.5的反應(yīng)而產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例35 使用得自枯草芽孢桿菌BE1010的過氧化水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的過氧化水解 將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(49.6mM)、甘油三乙酸酯(17.6mM)和甘油一乙酸酯(37.8mM)的混合物、過氧化氫(78mM)和得自細胞提取物(如實施例21所述制備的)的1Mg或2Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)在25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表23)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表23在得自表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌KLP18/pSW189的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的1Mg或2Mg總提取蛋白/mL存在下，通過甘油三乙酸酯(105mM)和過氧化氫(78mM)于pH 6.5的反應(yīng)而產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例36 通過枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的乙?；堑倪^氧化水解 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含0.1M乙?；?β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙?；?葡萄烯糖(Aldrich))、過氧化氫(100或500mM)、2Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)于25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表24)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表24在得自表達枯草芽孢桿菌ATCC 31954TM過氧化水解酶的大腸桿菌UM2/pSW186的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的2Mg總提取蛋白/mL存在下，通過乙酰化糖(100mM)和過氧化氫(100或500mM)于pH 6.5的反應(yīng)而產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
實施例37 通過枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的乙酰化糖的過氧化水解 按照實施例21中描述的方法制備表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌KLP18/pSW189轉(zhuǎn)化體的細胞提取物。將在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中包含0.1M乙?；?β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙?；?D-半乳醛或三-O-乙酰基-葡萄烯糖(Aldrich))、過氧化氫(100或500mM)、2Mg提取總蛋白的單獨1mL反應(yīng)于25℃運行。通過用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)替換提取總蛋白溶液來進行對照反應(yīng)，以測定在不存在添加的提取蛋白的情況下，通過甘油三乙酸酯被過氧化氫化學(xué)過氧化水解而產(chǎn)生的過乙酸濃度。反應(yīng)混合物中的過乙酸濃度(表25)是根據(jù)實施例2中描述的Karst等人的方法測定的。
表25在得自表達枯草芽孢桿菌BE1010過氧化水解酶的大腸桿菌KLP18/pSW189的轉(zhuǎn)化體細胞提取物的2Mg總提取蛋白/mL存在下，通過乙?；?100mM)和過氧化氫(100或500mM)于pH 6.5的反應(yīng)而產(chǎn)生的過乙酸(PAA)。
序列表
<110>E.I.duPont de Nemours and Company Inc.
Di Cos imo，Robert
Cooling，F(xiàn)rederick
Gavagan，John
Payne，Mark
<120>使用具有過氧化水解活性的酶生產(chǎn)過酸
<130>CL3345US CIP
<150>US 11/638,635
<151>2006-12-12
<150>US 60/750,092
<151>2005-12-13
<150>US 60/853,065
<151>2006-10-20
<160>61
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>960
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 31954
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(960)
<400>1
atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat tta cag ccg gtt gac144
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc acatat aaa agc ttc 192
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc240
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat288
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca336
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att384
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
tca ctg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat432
Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg480
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt528
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg576
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc624
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa672
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag720
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga768
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg816
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
ccg ccg tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa864
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt912
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa960
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>2
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 31954
<400>2
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
LeuSer Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
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Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
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Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
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Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
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<220>
<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ttatcagcct ttaagatgct gcttaa 26
<210>5
<211>957
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168
<400>5
atgcaactat tcgatctgcc gctcgaccaa ttgcaaacat ataagcctga aaaaacagca 60
ccgaaagatt tttctgagtt ttggaaattg tctttggagg aacttgcaaa agtccaagca 120
gaacctgatt tacagccggt tgactatcct gctgacggag taaaagtgta ccgtctcaca 180
tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cggtgcctga caaggaaggc 240
ccgcatccgg cgatcgtgaa atatcatggc tacaatgcaa gctatgatgg tgagattcat 300
gaaatggtaa actgggcact ccatggctac gccacattcg gcatgcttgt ccgcggccag 360
cagagcagcg aggatacgag tatttcaccg cacggtcacg ctttgggctg gatgacgaaa 420
ggaattcttg ataaagatac atactattac cgcggtgttt atttggacgc cgtccgcgcg 480
cttgaggtca tcagcagctt cgacgaggtt gacgaaacaa ggatcggtgt gacaggagga 540
agccaaggcg gaggtttaac cattgccgca gcagcgctgt cagacattcc aaaagccgcg 600
gttgccgatt atccttattt aagcaacttc gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660
ccgtaccttg aaatcaattc cttcttcaga agaaatggca gcccggaaac agaagtgcag 720
gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtgcct 780
gtcctgatgt caatcggcct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgcc 840
tacaatcatt tggaaacaaa gaaagagctg aaggtgtacc gctacttcgg acatgagtat 900
atccctgctt ttcaaactga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957
<210>6
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168
<400>6
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Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
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100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
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130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Lys Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>7
<211>957
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 6633
<400>7
atgcaactat tcgatctgcc gctcgaccaa ttgcaaacgt ataagcctga aaaaacaaca 60
ccgaacgatt tttctgagtt ttggaaatcg tctttggacg aacttgcgaa agtcaaagca 120
gcacctgatt tacagctggt tgattatcct gctgatggag tcaaggtgta ccgcctcaca 180
tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cagtgcctga caaggaagga 240
ccgcatccgg cgatcgtcaa atatcatggc tacaacgcta gctatgacgg tgagattcat 300
gaaatggtaa actgggcgct ccacggttac gccgcattcg gcatgctagt ccgcggccag 360
cagagcagcg aggatacgag tatttctcca catggccatg ctttgggctg gatgacgaaa 420
ggaatccttg ataaagatac atactattac cggggcgttt atttggacgc tgtccgcgcg 480
cttgaggtca tcagcagctt tgacgaagtt gacgaaacaa gaatcggtgt gacaggcgga 540
agccaaggag gcggcttaac cattgccgca gccgctctgt cagacattcc aaaagccgcg 600
gttgccgatt atccttattt aagcaacttt gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660
ccgtaccttg aaatcaattc cttctttaga agaaatggaa gcccggaaac ggaagagaag 720
gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtccct 780
gtcctgatgt cgatcggtct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgca 840
tacaaccact tggagacaga gaaagagctc aaagtgtacc gctacttcgg gcatgagtat 900
atccctgcct ttcaaacaga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957
<210>8
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 6633
<400>8
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Pro Asn Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Ser Ser Leu
20 25 30
Asp Glu Leu Ala Lys Val Lys Ala Ala Pro Asp Leu Gln Leu Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>9
<211>957
<212>DNA
<213>地衣芽孢桿菌ATCC 14580
<400>9
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cacgatattg tcaattgggc tcttcacggc tatgcggcat tcggtatgct ggtccgcgga 360
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aaaggaatcc tcgatccgaa aacatattac tacagagggg tctatttaga tgccgtacga 480
gcagtcgaag tggtcagcgg ttttgctgaa gtcgatgaaa agcggatcgg ggtgatcggg 540
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tacatcccgc cgttccaaac cgaaaagctg gcgtttctga gaaagcatct gaaataa 957
<210>10
<211>318
<212>PRT
<213>地衣芽孢桿菌ATCC 14580
<400>10
Met Gln Gln Pro Tyr Asp Met Pro Leu Glu Gln Leu Tyr Gln Tyr Lys
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Pro Glu Arg Thr Ala Pro Ala Asp Phe Lys Glu Phe Trp Lys Gly Ser
20 25 30
Leu Glu Glu Leu Ala Asn Glu Lys Ala Gly Pro Gln Leu Glu Pro His
35 40 45
Glu Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Trp Leu Thr Tyr Arg Ser
50 55 60
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Gly Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr
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Asp Gly Asp Ile His Asp Ile Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala
100 105 110
Ala Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Asn Ser Ser Glu Asp Thr Glu
115 120 125
Ile Ser His His Gly His Val Pro Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu
130 135 140
Asp Pro Lys Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg
145 150 155 160
Ala Val Glu Val Val Ser Gly Phe Ala Glu Val Asp Glu Lys Arg Ile
165 170 175
Gly Val lle Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ala Val Ala Val Ser
180 185 190
Ala Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ser Glu Tyr Pro Tyr Leu
195 200 205
Ser Asn Phe Gln Arg Ala Ile Asp Thr Ala Ile Asp Gln Pro Tyr Leu
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Glu Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Thr Ser Pro Asp Ile Glu Gln
225 230 235 240
Ala Ala Met His Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Val Met Asn Leu Ala Gln
245 250 255
Leu Val Lys Ala Thr Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Val Asp Thr Ile
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Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Asp
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<212>DNA
<213>短小芽孢桿菌
<400>11
atgcaattgt tcgatttatc actagaagag ctaaaaaaat ataaaccaaa gaaaacagca 60
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tatcaaagct ttggacattc taaaattgaa ggcttttatg ctgtgcctga tcaaactggt 240
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gacatcgtca actgggcgct gcacggctat gcaacatttg gtatgctcgt ccgcggtcaa 360
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ggcattttat cgaaagatac gtactattat cgaggcgttt atctagatgc tgttcgtgca 480
cttgaagtca ttcagtcttt ccccgaagta gatgaacacc gtatcggcgt gatcggtgga 540
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taa 963
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<211>320
<212>PRT
<213>短小芽孢桿菌
<400>12
Met Gln Leu Phe Asp Leu Ser Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Lys Lys Thr Ala Arg Pro Asp Phe Ser Asp Phe Trp Lys Lys Ser Leu
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Glu Glu Leu Arg Gln Val Glu Ala Glu Pro Thr Leu Glu Ser Tyr Asp
35 40 45
Tyr Pro Val Lys Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Gln Ser Phe
50 55 60
Gly His Ser Lys Ile Glu Gly Phe Tyr Ala Val Pro Asp Gln Thr Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Leu Val Arg Phe His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Gly Ile His Asp Ile Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Thr
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gly Gly Ser Glu Asp Thr Ser Val
115 120 125
Thr Pro Gly Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Ser
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
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Leu Glu Val Ile Gln Ser Phe Pro Glu Val Asp Glu His Arg Ile Gly
165 170 175
Val Ile Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Val Val Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Val Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Tyr Phe Arg Arg Asn Ser Asp Pro Lys Val Glu Glu Lys
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Ala Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Leu Ala Gly Trp
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Val Lys Gln Pro Thr Leu Met Ala Ile Gly Leu Ile Asp Lys Ile Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Asp Lys
275 280 285
Asp Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Phe Ile Pro Ala Phe
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Gln Thr Glu Lys Leu Ser Phe Leu Gln Lys His Leu Leu Leu Ser Thr
305 310 315 320
<210>13
<211>963
<212>DNA
<213>熱纖梭菌ATCC 27405
<400>13
atggcacaat tatatgatat gcctttggag gaattaaaaa aatataagcc tgcgcttaca 60
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cccgatgtgg taaattgggc tttgaatgga tatgccgcat ttcttatgct tgttcgggga360
cagcagggaa gaagcgtgga caatattgtg cccggcagcg gtcatgcttt gggatggatg420
tcgaaaggta ttttgtcacc ggaggaatat tattatagag gagtatatat ggatgcggtt 480
cgtgctgttg aaattttggc ttcgcttcct tgtgtggatg aatcgagaat aggagtgaca 540
gggggcagcc agggtggagg acttgcactg gcggtggctg ctctgtccgg cataccgaaa 600
gttgcagccg tgcattatcc gtttctggca cattttgagc gtgccattga cgttgcgccg 660
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agacaggtaa agaaaaccct ttcctatttt gatatcatga atcttgctcc ccgtataaaa 780
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gaacatatgc caggaagcgt tgaaatcaag ctgaggatac ttatggatga gctgaatccg 960
taa963
<210>14
<211>320
<212>PRT
<213>熱纖梭菌ATCC 27405
<400>14
Met Ala Gln Leu Tyr Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Ala Leu Thr Lys Gln Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Lys Ser
20 25 30
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Pro Leu Lys Tyr Gln Leu Ile Pro Tyr
35 40 45
Asp Phe Pro Ala Arg Arg Val Lys Val Phe Arg Val Glu Tyr Leu Gly
50 55 60
Phe Lys Gly Ala Asn Ile Glu Gly Trp Leu Ala Val Pro Glu Gly Glu
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Pro Gly Leu Val Gln Phe His Gly Tyr Asn Trp Ala Met
85 90 95
Asp Gly Cys Val Pro Asp Val Val Asn Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Ala
100 105 110
Ala Phe Leu Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Gly Arg Ser Val Asp Asn
115 120 125
Ile Val Pro Gly Ser Gly His Ala Leu Gly Trp Met Ser Lys Gly Ile
130 135 140
Leu Ser Pro Glu Glu Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Met Asp Ala Val
145 150 155 160
Arg Ala Val Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Cys Val Asp Glu Ser Arg
165 170 175
Ile Gly Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ala Leu Ala Val
180 185 190
Ala Ala Leu Ser Gly Ile Pro Lys Val Ala Ala Val His Tyr Pro Phe
195 200 205
Leu Ala His Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Pro Asp Gly Pro Tyr
210 215 220
Leu Glu Ile Asn Glu Tyr Leu Arg Arg Asn Ser Gly Glu Glu Ile Glu
225 230 235 240
Arg Gln Val Lys Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala
245 250 255
Pro Arg Ile Lys Cys Arg Thr Trp Ile Cys Thr Gly Leu Val Asp Glu
260 265 270
Ile Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Val Tyr Asn His Leu Lys Cys
275 280 285
Pro Lys Glu Ile Ser Val Phe Arg Tyr Phe Gly His Glu His Met Pro
290 295 300
Gly Ser Val Glu Ile Lys Leu Arg Ile Leu Met Asp Glu Leu Asn Pro
305 310 315 320
<210>15
<211>978
<212>DNA
<213>那不勒斯棲熱袍菌
<400>15
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gactggctgt tctggccgtc aatgggttac atctgttttg tcatggacac cagggggcag360
ggaagcggct ggatgaaggg agacacaccg gattaccctg agggtccagt cgatccacag420
taccccggat tcatgacgag gggcattctg gatccgggaa cctattacta caggcgagtc480
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ctatttgagg aaggctag 978
<210>16
<211>325
<212>PRT
<213>那不勒斯棲熱袍菌
<400>16
Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu
20 25 30
Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp
35 40 45
Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu
65 70 75 80
Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys
100 105 110
Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp
115 120 125
Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe
130 135 140
Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val
145 150 155 160
Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg
165 170 175
Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly
180 185 190
Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu
195 200 205
Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg
225 230 235 240
Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val
245 250 255
Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu
260 265 270
Met Asp Thr Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His
275 280 285
Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg
305 310 315 320
Leu Phe Glu Glu Gly
325
<210>17
<211>978
<212>DNA
<213>海棲熱袍菌MSB8
<400>17
atggccttct tcgatttacc actcgaagaa ctgaagaaat atcgtccaga gcggtacgaa 60
gagaaagact tcgatgagtt ctgggaagag acactcgcag agagcgaaaa gttcccctta 120
gaccccgtct tcgagaggat ggagtctcac ctcaaaacag tcgaagcgta cgatgtcacc 180
ttctccggat acaggggaca gaggatcaaa gggtggctcc ttgttccaaa actggaagaa 240
gaaaaacttc cctgcgttgt gcagtacata ggatacaacg gtggaagagg attccctcac 300
gactggctgt tctggccttc tatgggttac atatgtttcg tcatggatac tcgaggtcag 360
ggaagcggct ggctgaaagg agacacaccg gattaccctg agggtcccgt tgaccctcag 420
tatccaggat tcatgacaag aggaatactg gatcccagaa cttactacta cagacgagtc 480
ttcacggacg ctgtcagagc cgttgaagct gctgcttctt ttcctcaggt agatcaagaa 540
agaatcgtga tagctggagg cagtcagggt ggcggaatag cccttgcggt gagcgctctc 600
tcaaagaaag caaaggctct tctgtgcgat gtgccgtttc tgtgtcactt cagaagagca 660
gtacagcttg tggatacgca tccatacgcg gagatcacga actttctaaa gacccacaga 720
gacaaggaag aaatcgtgtt caggactctt tcctatttcg atggagtgaa cttcgcagcc 780
agagcgaaga tccctgcgct gttttctgtg ggtctcatgg acaacatttg tcctccttca 840
acggttttcg ctgcctacaa ttactacgct ggaccgaagg aaatcagaat ctatccgtac 900
aacaaccacg agggaggagg ctctttccaa gcggttgaac aggtgaaatt cttgaaaaaa 960
ctatttgaga aaggctaa978
<210>18
<211>325
<212>PRT
<213>海棲熱袍菌MSB8
<400>18
Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu
20 25 30
Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu
35 40 45
Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys
100 105 110
Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp
115 120 125
Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe
130 135 140
Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val
145 150 155 160
Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln
165 170 175
Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly
180 185 190
Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu
195 200 205
Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg
225 230 235 240
Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val
245 250 255
Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu
260 265 270
Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr
275 280 285
Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys
305 310 315 320
Leu Phe Glu Lys Gly
325
<210>19
<211>963
<212>DNA
<213>熱厭氧芽孢桿菌屬
<400>19
atgggacttt tcgacatgcc attacaaaaa cttagagaat acactggtac aaatccatgc 60
cctgaagatt tcgatgagta ttggaatagg gctttagatg agatgaggtc agttgatcct 120
aaaattgaat tgaaagaaag tagctttcaa gtatcctttg cagaatgcta tgacttgtac 180
tttacaggtg ttcgtggtgc cagaattcat gcaaagtata taaaacctaa gacagaaggg 240
aaacatccag cgttgataag atttcatgga tattcgtcaa attcaggcga ctggaacgac 300
aaattaaatt acgtggcggc aggcttcacc gttgtggcta tggatgtaag aggtcaagga 360
gggcagtctc aagatgttgg cggtgtaact gggaatactt taaatgggca tattataaga 420
gggctagacg atgatgctga taatatgctt ttcaggcata ttttcttaga cactgcccaa 480
ttggctggaa tagttatgaa catgccagaa gttgatgaag atagagtggg agtcatggga 540
ccttctcaag gcggagggct gtcgttggcg tgtgctgcat tggagccaag ggtacgcaaa 600
gtagtatctg aatatccttt tttatctgac tacaagagag tttgggactt agaccttgca 660
aaaaacgcct atcaagagat tacggactat ttcaggcttt ttgacccaag gcatgaaagg 720
gagaatgagg tatttacaaa gcttggatat atagacgtta aaaaccttgc gaaaaggata 780
aaaggcgatg tcttaatgtg cgttgggctt atggaccaag tatgtccgcc atcaactgtt 840
tttgcagcct acaacaacat acagtcaaaa aaagatataa aagtgtatcc tgattatgga 900
catgaaccta tgagaggatt tggagattta gcgatgcagt ttatgttgga actatattca 960
taa963
<210>20
<211>320
<212>PRT
<213>熱厭氧芽孢桿菌屬.
<400>20
Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly
1 5 10 15
Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asn Arg Ala Leu
20 25 30
Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Glu Leu Lys Glu Ser Ser
35 40 45
Phe Gln Val Ser Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val
50 55 60
Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Lys Pro Lys Thr Glu Gly
65 70 75 80
Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly
85 90 95
Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val
100 105 110
Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly
115 120 125
Val Thr Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp
130 135 140
Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln
145 150 155 160
Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Val Asp Glu Asp Arg Val
165 170 175
Gly Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala
180 185 190
Ala Leu Glu Pro Arg Val Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu
195 200 205
Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr
210 215 220
Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg
225 230 235 240
Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu
245 250 255
Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp
260 265 270
Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln
275 280 285
Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met
290 295 300
Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser
305 310 315 320
<210>21
<211>1023
<212>DNA
<213>芽孢桿菌屬NRRL B-14911
<400>21
atgaggacgg ttcctgctcc tgtttttttg gagaggagtg gggagatgaa cctttttgat 60
atgccccttg aggagctgca gcattacaag cctgcccaga ccaggcagga tgattttgag 120
tcattctgga aaaagcggat tgaggagaac agtcaatatc cgctgaatat agaagtaatg 180
gagcgggttt atccggttcc gggagtgaga gtatatgata tttattttga cgggttccgg 240
aattcccgca tccatggggt gtatgttact ccagaaactc cgggagcgga cactcctgcg 300
gcagtgattt ttcacggcta taactggaac acgctgcagc cgcattacag cttcaagcac 360
gtgattcagg ggattcctgt actgatggtg gaggtgcggg gacaaaatct cttgtctcca 420
gatagaaatc attatgggaa tggaggtccg ggaggctgga tgacactcgg cgtgatggat 480
cccgatcaat attattacag cctggtatat atggactgct tccgcagcat tgatgctgtc 540
agggaactgt cgaggaagag aagtgtgttt gtggaaggcg gaagccaggg aggtgcactg 600
gcgattgccg cagccgccct gcaggatgac atcctgcttg cactcgccga catccctttt 660
ctcacccatt tcaagcgttc cgtggagctt tcctcggatg gaccgtatca ggagatttcc 720
cactacttca aagttcatga tcctcttcat caaacggaag agcaggtata tcagacgctc 780
agctatgtgg actgcatgaa catggccagc atggttgaat gtccagtcct tctttcagcc 840
ggtctggaag acatcgtttg tcccccgtcc agtgcatttg cactgttcaa ccatctcggc 900
gggccaaaag aaatacgggc ctatccggaa tacgcccatg aagtaccggc tgtccatgaa 960
gaggaaaagc tgaagtttat atcttcaagg ctaaaaaata gagaaaagag gtgccggcca 1020
tga1023
<210>22
<211>340
<212>PRT
<213>芽孢桿菌屬NRRL B-14911
<400>22
Met Arg Thr Val Pro Ala Pro Val Phe Leu Glu Arg Ser Gly Glu Met
1 5 10 15
Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro Ala
20 25 30
Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile Glu
35 40 45
Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val Tyr
50 55 60
Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe Arg
65 70 75 80
Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly Ala
85 90 95
Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr Leu
100 105 110
Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val Leu
115 120 125
Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn His
130 135 140
Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met Asp
145 150 155 160
Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg Ser
165 170 175
Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val Glu
180 185 190
Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu Gln
195 200 205
Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His Phe
210 215 220
Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile Ser
225 230 235 240
His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln Val
245 250 255
Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met Val
260 265 270
Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys Pro
275 280 285
Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys Glu
290 295 300
Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His Glu
305 310 315 320
Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu Lys
325 330 335
Arg Cys Arg Pro
340
<210>23
<211>960
<212>DNA
<213>喜鹽芽孢桿菌C-125
<400>23
ttagagatca gataaaaatt gaaaaatccg atcacgatgg cctggcaaat cttcgtgagc 60
aaagtctgga tataactcga tactttttgt cgtcgtgagt ttgttataca tggcaaattg 120
tgtagacggc gggcaaaccg tatccattaa cccaacagca agtaagactt ctccctttac 180
gagtggagca agatgctgaa tatcaatata gcctagcttc gtaaagattt cagcctcacg 240
tcggtgctgt ggatcaaagc gacgaaaata cgtttgcaat tcgtcataag ctttctcggc 300
taaatccatc tcccatacgc gttggtaatc gctaaggaaa ggataaacag gagctacctt 360
tttaattttc ggttccaaag ccgcacaagc aatcgctaag gcccctcctt gtgaccaacc 420
tgtcactgcc acgcgctctt catcgacttc aggaaggttc atcacaatgt tggcaagctg 480
agccgtatca agaaacacat gacggaacaa taattgatca gcattatcat cgagtccgcg 540
tattatatga ccggaatgag tattcccctt cacgcctcct gtgtcttcag acaagcctcc 600
ttgcccgcga acgtccattg caagaacaga atatccgagg gctgcgtaat gaagtaaacc 660
cgtccattcc cccgcattca tcgtatatcc gtgaaaatga ataaccgccg ggtgtgtccc 720
gctcgtgtgt cttgggcgca cgtattttgc gtgaattcta gcacccctaa cccctgtaaa 780
atataggtgg aagcattctg catacgtggt ttgaaaatca ctcggtatga gctctacgtt 840
tggatttacc tttctcatct cttgtaaagc acgatcccaa tactcagtaa agtcatctgg 900
ctttggatta cgtcccatgt actcttttaa ttcggttaac ggcatgtcta ttagtggcat 960
<210>24
<211>319
<212>PRT
<213>喜鹽芽孢桿菌C-125
<400>24
Met Pro Leu Ile Asp Met Pro Leu Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Met Gly
1 5 10 15
Arg Asn Pro Lys Pro Asp Asp Phe Thr Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Met Arg Lys Val Asn Pro Asn Val Glu Leu Ile Pro Ser Asp
35 40 45
Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Glu Cys Phe His Leu Tyr Phe Thr Gly Val
50 55 60
Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Val Arg Pro Arg His Thr Ser
65 70 75 80
Gly Thr His Pro Ala Val Ile His Phe His Gly Tyr Thr Met Asn Ala
85 90 95
Gly Glu Trp Thr Gly Leu Leu His Tyr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Val
100 105 110
Leu Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Glu Asp Thr Gly
115 120 125
Gly Val Lys Gly Asn Thr His Ser Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp
130 135 140
Asp Asn Ala Asp Gln Leu Leu Phe Arg His Val Phe Leu Asp Thr Ala
145 150 155 160
Gln Leu Ala Asn Ile Val Met Asn Leu Pro Glu Val Asp Glu Glu Arg
165 170 175
Val Ala Val Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Cys
180 185 190
Ala Ala Leu Glu Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Pro Val Tyr Pro Phe
195 200 205
Leu Ser Asp Tyr Gln Arg Val Trp Glu Met Asp Leu Ala Glu Lys Ala
210 215 220
Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln His Arg
225 230 235 240
Arg Glu Ala Glu Ile Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Ile Gln His
245 250 255
Leu Ala Pro Leu Val Lys Gly Glu Val Leu Leu Ala Val Gly Leu Met
260 265 270
Asp Thr Val Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Met Tyr Asn Lys Leu
275 280 285
Thr Thr Thr Lys Ser Ile Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Glu Asp
290 295 300
Leu Pro Gly His Arg Asp Arg Ile Phe Gln Phe Leu Ser Asp Leu
305 310 315
<210>25
<211>954
<212>DNA
<213>克勞氏芽孢桿菌KSM-K16
<400>25
atgccattag tcgatatgcc gttgcgcgag ttgttagctt atgaaggaat aaaccctaaa 60
ccagcagatt ttgaccaata ctggaaccgg gccaaaacgg aaattgaagc gattgatccc 120
gaagtcactc tagtcgaatc ttctttccag tgttcgtttg caaactgtta ccatttctat 180
tatcgaagcg ctggaaatgc aaaaatccat gcgaaatacg tacagccaaa agcaggggag 240
aagacgccag cagtttttat gttccatggg tatggggggc gttcagccga atggagcagc 300
ttgttaaatt atgtagcggc gggtttttct gttttctata tggacgtgcg tggacaaggt 360
ggaacttcag aggatcctgg gggcgtaagg gggaatacat ataggggcca cattattcgc 420
ggcctcgatg ccgggccaga cgcacttttt taccgcagcg ttttcttgga caccgtccaa 480
ttggttcgtg ctgctaaaac attgcctcac atcgataaaa cacggcttat ggccacaggg 540
tggtcgcaag ggggcgcctt aacgcttgcc tgtgctgccc ttgttcctga aatcaagcgt 600
cttgctccag tatacccgtt tttaagcgat tacaagcgag tgtggcaaat ggatttagcg 660
gttcgttcgt ataaagaatt ggctgattat ttccgttcat acgatccgca acataaacgc 720
catggcgaaa tttttgaacg ccttggctac atcgatgtcc agcatcttgc tgaccggatt 780
caaggagatg tcctaatggg agttggttta atggatacag aatgcccgcc gtctacccaa 840
tttgctgctt ataataaaat aaaggctaaa aaatcgtatg agctctatcc tgattttggc 900
catgagcacc ttccaggaat gaacgatcat atttttcgct ttttcactag ttga954
<210>26
<211>317
<212>PRT
<213>克勞氏芽孢桿菌KSM-K16
<400>26
Met Pro Leu Val Asp Met Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ala Tyr Glu Gly
1 5 10 15
Ile Asn Pro Lys Pro Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Trp Asn Arg Ala Lys
20 25 30
Thr Glu Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Ser
35 40 45
Phe Gln Cys Ser Phe Ala Asn Cys Tyr His Phe Tyr Tyr Arg Ser Ala
50 55 60
Gly Asn Ala Lys Ile His Ala Lys Tyr Val Gln Pro Lys Ala Gly Glu
65 70 75 80
Lys Thr Pro Ala Val Phe Met Phe His Gly Tyr Gly Gly Arg Ser Ala
85 90 95
Glu Trp Ser Ser Leu Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Ser Val Phe
100 105 110
Tyr Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr Ser Glu Asp Pro Gly Gly
115 120 125
Val Arg Gly Asn Thr Tyr Arg Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Ala
130 135 140
Gly Pro Asp Ala Leu Phe Tyr Arg Ser Val Phe Leu Asp Thr Val Gln
145 150 155 160
Leu Val Arg Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Ile Asp Lys Thr Arg Leu
165 170 175
Met Ala Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Thr Leu Ala Cys Ala
180 185 190
Ala Leu Val Pro Glu Ile Lys Arg Leu Ala Pro Val Tyr Pro Phe Leu
195 200 205
Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Gln Met Asp Leu Ala Val Arg Ser Tyr
210 215 220
Lys Glu Leu Ala Asp Tyr Phe Arg Ser Tyr Asp Pro Gln His Lys Arg
225 230 235 240
His Gly Glu Ile Phe Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Asp Val Gln His Leu
245 250 255
Ala Asp Arg Ile Gln Gly Asp Val Leu Met Gly Val Gly Leu Met Asp
260 265 270
Thr Glu Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Ala Tyr Asn Lys Ile Lys
275 280 285
Ala Lys Lys Ser Tyr Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Gly His Glu His Leu
290 295 300
Pro Gly Met Asn Asp His Ile Phe Arg Phe Phe Thr Ser
305 310 315
<210>27
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
taactgcagt aaggaggaat aggacatgcaactattcgat ctgccgctc49
<210>28
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
tgatctagat tatcagcctt taagatgctg cttaa 35
<210>29
<211>994
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>29
taactgcagt aaggaggaat aggacatgca actattcgat ctgccgctcg accaattgca 60
aacatataag cctgaaaaaa cagcaccgaa agatttttct gagttttgga aattgtcttt120
ggaggaactt gcaaaagtcc aagcagaacc tgatttacag ccggttgact atcctgctga180
cggagtaaaa gtgtaccgtc tcacatataa aagcttcgga aacgcccgca ttaccggatg 240
gtacgcggtg cctgacaagc aaggcccgca tccggcgatc gtgaaatatc atggctacaa 300
tgcaagctat gatggtgaga ttcatgaaat ggtaaactgg gcactccatg gctacgccgc 360
attcggcatg cttgtccgcg gccagcagag cagcgaggat acgagtattt cactgcacgg 420
tcacgctttg ggctggatga cgaaaggaat tcttgataaa gatacatact attaccgcgg 480
tgtttatttg gacgccgtcc gcgcgcttga ggtcatcagc agcttcgacg aggttgacga 540
aacaaggatc ggtgtgacag gaggaagcca aggcggaggt ttaaccattg ccgcagcagc 600
gctgtcagac attccaaaag ccgcggttgc cgattatcct tatttaagca acttcgaacg 660
ggccattgat gtggcgcttg aacagccgta ccttgaaatc aattccttct tcagaagaaa 720
tggcagcccg gaaacagaag tgcaggcgat gaagacactt tcatatttcg atattatgaa 780
tctcgctgac cgagtgaagg tgcctgtcct gatgtcaatc ggcctgattg acaaggtcac 840
gccgccgtcc accgtgtttg ccgcctacaa tcatttggaa acagagaaag agctgaaggt 900
gtaccgctac ttcggacatg agtatatccc tgcttttcaa acggaaaaac ttgctttctt 960
taagcagcat cttaaaggct gataatctag atca 994
<210>30
<211>994
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>30
taactgcagt aaggaggaat aggacatgca actattcgat ctgccgctcg accaattgca 60
aacatataag cctgaaaaaa cagcaccgaa agatttttct gagttttgga aattgtcttt 120
ggaggaactt gcaaaagtcc aagcagaacc tgatttacag ccggttgact atcctgctga 180
cggagtaaaa gtgtaccgtc tcacatataa aagcttcgga aacgcccgca ttaccggatg 240
gtacgcggtg cctgacaagg aaggcccgca tccggcgatc gtgaaatatc atggctacaa 300
tgcaagctat gatggtgaga ttcatgaaat ggtaaactgg gcactccatg gctacgccac 360
attcggcatg cttgtccgcg gccagcagag cagcgaggat acgagtattt caccgcacgg 420
tcacgctttg ggctggatga cgaaaggaat tcttgataaa gatacatact attaccgcgg 480
tgtttatttg gacgccgtcc gcgcgcttga ggtcatcagc agcttcgacg aggttgacga 540
aacaaggatc ggtgtgacag gaggaagcca aggcggaggt ttaaccattg ccgcagcagc 600
gctgtcagac attccaaaag ccgcggttgc cgattatcct tatttaagca acttcgaacg 660
ggccattgat gtggcgcttg aacagccgta ccttgaaatc aattccttct tcagaagaaa 720
tggcagcccg gaaacagaag tgcaggcgat gaagacactt tcatatttcg atattatgaa 780
tctcgctgac cgagtgaagg tgcctgtcct gatgtcaatc ggcctgattg acaaggtcac 840
gccgccgtcc accgtgtttg ccgcctacaa tcatttggaa acaaagaaag agctgaaggt 900
gtaccgctac ttcggacatg agtatatccc tgcttttcaa actgaaaaac ttgctttctt 960
taagcagcat cttaaaggct gataatctag atca 994
<210>31
<211>960
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 29233
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(960)
<400>31
atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat cta cag ccg gtt gac144
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc192
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc240
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat288
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca336
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att384
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
tca ccg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att crt gat432
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg480
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt528
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg576
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc624
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa672
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag720
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga768
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg816
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
ccg cca tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa864
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt912
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa960
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>32
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌ATCC 29233
<400>32
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
atgcagcagc cttatgatgt gccg24
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
ttatttcaga tgctttctca gaaac 25
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
atggcacaat tatatgatat gcctttg 27
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ttacggattc agctcatcca taagtatc 28
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
atgcagctgt ttgacctgag cctg 24
<210>38
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ttaggtggac agcagcaggt gcttttg27
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
atggctttct ttgacatgcc gctg24
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
ttagccttct tcgaacaggc gtttcag 27
<210>41
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>41
atggctttct ttgacatgcc gctggaagaa ctgaaaaagt accgtccgga acgttacgag 60
gaaaaagact ttgacgaatt ttggcgcgaa accctgaaag aatccgaggg tttcccactg120
gacccggtat ttgaaaaagt tgacttccac ctgaagaccg tcgaaactta cgacgtcacc180
ttcagcggtt atcgtggcca gcgtatcaaa ggttggctgc tggtaccgaa actggcggaa240
gagaaactgc cgtgtgttgt tcagtacatt ggttacaacg gtggccgtgg tttcccgcac300
gactggctgt tctggccgtc tatgggttac atctgcttcg ttatggacac ccgtggtcag360
ggtagcggtt ggatgaaggg tgatactccg gactacccgg aaggtccggt ggacccgcag420
tacccgggct tcatgacgcg cggcatcctg gatcctggca cctattacta ccgtcgtgtg480
tttgtcgatg ccgtgcgcgc cgttgaagcc gctatcagct tcccacgcgt cgattctcgt540
aaagtggtag ttgctggtgg ctctcaaggt ggcggcattg cactggcagt ttccgcgctg600
tccaaccgtg ttaaagccct gctgtgcgat gttccgttcc tgtgccactt ccgtcgtgcg660
gtacagctgg tggacaccca cccgtacgta gaaattacga acttcctgaa aacccatcgt720
gataaagaag agatcgtatt ccgtaccctg tcttactttg atggcgttaa ttttgcggct780
cgtgcaaaag taccggcgct gttcagcgta ggtctgatgg acactatttg tccgccgtct840
accgtattcg cagcctacaa ccactacgct ggtccgaaag aaatccgcat ctacccgtac900
aacaaccacg aaggtggtgg ttctttccag gcaatcgaac aggttaaatt cctgaaacgc960
ctgttcgaag aaggctaa 978
<210>42
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt780
gacgagttct tctaa 795
<210>43
<211>3434
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒pKD13
<400>43
agattgcagc attacacgtc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta 60
tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac 120
tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 180
acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac 240
gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag 300
cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc 360
tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga 420
tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc 480
tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc 540
cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 600
agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg 660
tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg 720
tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc 780
tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 840
tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca 900
atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag 960
atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag1020
ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat1080
cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc1140
cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc1200
tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt1260
caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga1320
cggatccccg gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc1380
gatgacgcat cctcacgata atatccgggt aggcgcaatc actttcgtct ctactccgtt1440
acaaagcgag gctgggtatt tcccggcctt tctgttatcc gaaatccact gaaagcacag1500
cggctggctg aggagataaa taataaacga ggggctgtat gcacaaagca tcttctgttg1560
agttaagaac gagtatcgag atggcacata gccttgctca aattggaatc aggtttgtgc1620
caataccagt agaaacagac gaagaagcta gctttgcact ggattgcgag gctttgccat1680
ggctaattcc catgtcagcc gttaagtgtt cctgtgtcac tgaaaattgc tttgagaggc1740
tctaagggct tctcagtgcg ttacatccct ggcttgttgt ccacaaccgt taaaccttaa1800
aagctttaaa agccttatat attctttttt ttcttataaa acttaaaacc ttagaggcta1860
tttaagttgc tgatttatat taattttatt gttcaaacat gagagcttag tacgtgaaac1920
atgagagctt agtacgttag ccatgagagc ttagtacgtt agccatgagg gtttagttcg1980
ttaaacatga gagcttagta cgttaaacat gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt2040
agtacgtact atcaacaggt tgaactgcgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag2100
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat2160
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc2220
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat2280
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag2340
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg2400
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc2460
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 2520
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 2580
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 2640
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 2700
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 2760
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 2820
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 2880
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 2940
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 3000
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 3060
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 3120
ccgaaaagtg ccacctgcat cgatggcccc ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga 3180
gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 3240
cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 3300
gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 3360
gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtggccagtg 3420
ccaagcttgc atgc3434
<210>44
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag60
gtgtaggctg gagctgcttc80
<210>45
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
taacagcagg tcgaaacggt cgaggttcat cactttcacc catgccgcca cgaagtcttt60
attccgggga tccgtcgacc tg 82
<210>46
<211>1424
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>46
taacagcagg tcgaaacggt cgaggttcat cactttcacc catgccgcca cgaagtcttt60
attccgggga tccgtcgacc tgcagttcga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 120
tcagagcgct tttgaagctc acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg 180
aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc 240
tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt 300
gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg 360
ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc 420
ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga 480
tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 540
aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 600
cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 660
aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 720
gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 780
ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 840
gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 900
aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 960
ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 1020
atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 1080
gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1140
tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 1200
gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1260
cgccttcttg acgagttctt ctaataaggg gatcttgaag ttcctattcc gaagttccta 1320
ttctctagaa agtataggaa cttcgaagca gctccagcct acacctgatg gaacgggcat 1380
ttgccagtgg ctgtggtgtt atggatatcg tctgacgtgc tcat 1424
<210>47
<211>2181
<212>DNA
<213>大腸桿菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2181)
<400>47
atg agc acg tca gac gat atc cat aac acc aca gcc act ggc aaa tgc 48
Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys
1 5 10 15
ccg ttc cat cag ggc ggt cac gac cag agt gcg ggg gcg ggc aca acc 96
Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr
20 25 30
act cgc gac tgg tgg cca aat caa ctt cgt gtt gac ctg tta aac caa144
Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln
35 40 45
cat tct aat cgt tct aac cca ctg ggt gag gac ttt gac tac cgc aaa192
His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys
50 55 60
gaa ttc agc aaa tta gat tac tac ggc ctg aaa aaa gat ctg aaa gcc240
Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala
65 70 75 80
ctg ttg aca gaa tct caa ccg tgg tgg cca gcc gac tgg ggc agt tac288
Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr
85 90 95
gcc ggt ctg ttt att cgt atg gcc tgg cac ggc gcg ggg act tac cgt336
Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
tca atc gat gga cgc ggt ggc gcg ggt cgt ggt cag caa cgt ttt gca384
Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala
115 120 125
ccg ctg aac tcc tgg ccg gat aac gta agc ctc gat aaa gcg cgt cgc 432
Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg
130 135 140
ctg ttg tgg cca atc aaa cag aaa tat ggt cag aaa atc tcc tgg gcc 480
Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala
145 150 155 160
gac ctg ttt atc ctc gcg ggt aac gtg gcg cta gaa aac tcc ggc ttc528
Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe
165 170 175
cgt acc ttc ggt ttt ggt gcc ggt cgt gaa gac gtc tgg gaa ccg gat576
Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp
180 185 190
ctg gat gtt aac tgg ggt gat gaa aaa gcc tgg ctg act cac cgt cat624
Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His
195 200 205
ccg gaa gcg ctg gcg aaa gca ccg ctg ggt gca acc gag atg ggt ctg672
Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu
210 215 220
att tac gtt aac ccg gaa ggc ccg gat cac agc ggc gaa ccg ctt tct720
Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
gcg gca gca gct atc cgc gcg acc ttc ggc aac atg ggc atg aac gac768
Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp
245 250 255
gaa gaa acc gtg gcg ctg att gcg ggt ggt cat acg ctg ggt aaa acc816
Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr
260 265 270
cac ggt gcc ggt ccg aca tca aat gta ggt cct gat cca gaa gct gca864
His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala
275 280 285
ccg att gaa gaa caa ggt tta ggt tgg gcg agc act tac ggc agc ggc912
Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly
290 295 300
gtt ggc gca gat gcc att acc tct ggt ctg gaa gta gtc tgg acc cag960
Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln
305 310 315 320
acg ccg acc cag tgg agc aac tat ttc ttc gag aac ctg ttc aag tat1008
Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr
325 330 335
gag tgg gta cag acc cgc agc ccg gct ggc gca atc cag ttc gaa gcg1056
Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala
340 345 350
gta gac gca ccg gaa att atc ccg gat ccg ttt gat ccg tcg aag aaa1104
Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys
355 360 365
cgt aaa ccg aca atg ctg gtg acc gac ctg acg ctg cgt ttt gat cct1152
Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro
370 375 380
gag ttc gag aag atc tct cgt cgt ttc ctc aac gat ccg cag gcg ttc1200
Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe
385 390 395 400
aac gaa gcc ttt gcc cgt gcc tgg ttc aaa ctg acg cac agg gat atg1248
Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met
405 410 415
ggg ccg aaa tct cgc tac atc ggg ccg gaa gtg ccg aaa gaa gat ctg1296
Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu
420 425 430
atc tgg caa gat ccg ctg ccg cag ccg atc tac aac ccg acc gag cag1344
Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln
435 440 445
gac att atc gat ctg aaa ttc gcg att gcg gat tct ggt ctg tct gtt1392
Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val
450 455 460
agt gag ctg gta tcg gtg gcc tgg gca tct gct tct acc ttc cgt ggt1440
Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly
465 470 475 480
ggc gac aaa cgc ggt ggt gcc aac ggt gcg cgt ctg gca tta atg ccg1488
Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro
485 490 495
cag cgc gac tgg gat gtg aac gcc gca gcc gtt cgt gct ctg cct gtt1536
Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val
500 505 510
ctg gag aaa atc cag aaa gag tct ggt aaa gcc tcg ctg gcg gat atc1584
Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile
515 520 525
ata gtg ctg gct ggt gtg gtt ggt gtt gag aaa gcc gca agc gcc gca1632
Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala
530 535 540
ggt ttg agc att cat gta ccg ttt gcg ccg ggt cgc gtt gat gcg cgt1680
Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg
545 550 555 560
cag gat cag act gac att gag atg ttt gag ctg ctg gag cca att gct1728
Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala
565 570 575
gac ggt ttc cgt aac tat cgc gct cgt ctg gac gtt tcc acc acc gag1776
Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu
580 585 590
tca ctg ctg atc gac aaa gca cag caa ctg acg ctg acc gcg ccg gaa1824
Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu
595 600 605
atg act gcg ctg gtg ggc ggc atg cgt gta ctg ggt gcc aac ttc gat1872
Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Ala Asn Phe Asp
610 615 620
ggc agc aaa aac ggc gtc ttc act gac cgc gtt ggc gta ttg agc aat1920
Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn
625 630 635 640
gac ttc ttc gtg aac ttg ctg gat atg cgt tac gag tgg aaa gcg acc1968
Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr
645 650 655
gac gaa tcg aaa gag ctg ttc gaa ggc cgt gac cgt gaa acc ggc gaa2016
Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu
660 665 670
gtg aaa ttt acg gcc agc cgt gcg gat ctg gtg ttt ggt tct aac tcc2064
Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser
675 680 685
gtc ctg cgt gcg gtg gcg gaa gtt tac gcc agt agc gat gcc cac gag2112
Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu
690 695 700
aag ttt gtt aaa gac ttc gtg gcg gca tgg gtg aaa gtg atg aac ctc2160
Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu
705 710 715 720
gac cgt ttc gac ctg ctg taa2181
Asp Arg Phe Asp Leu Leu
725
<210>48
<211>726
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>48
Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys
1 5 10 15
Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln
35 40 45
His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala
65 70 75 80
Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr
85 90 95
Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala
115 120 125
Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg
130 135 140
Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala
145 150 155 160
Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe
165 170 175
Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp
180 185 190
Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His
195 200 205
Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu
210 215 220
Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp
245 250 255
Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr
260 265 270
His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly
290 295 300
Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln
305 310 315 320
Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr
325 330 335
Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala
340 345 350
Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys
355 360 365
Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro
370 375 380
Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe
385 390 395 400
Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met
405 410 415
Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu
420 425 430
Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln
435 440 445
Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val
450 455 460
Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly
465 470 475 480
Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro
485 490 495
Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val
500 505 510
Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile
515 520 525
Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala
530 535 540
Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg
545 550 555 560
Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala
565 570 575
Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu
580 585 590
Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu
595 600 605
Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Ala Asn Phe Asp
610 615 620
Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn
625 630 635 640
Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr
645 650 655
Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu
660 665 670
Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser
675 680 685
Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu
690 695 700
Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu
705 710 715 720
Asp Arg Phe Asp Leu Leu
725
<210>49
<211>6329
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒pKD46
<400>49
catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60
ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120
cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180
gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240
ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300
tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360
tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420
caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480
tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540
tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600
aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660
ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720
ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780
cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840
cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900
tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960
tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt1020
aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca1080
gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat1140
ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat1200
acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga1260
aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc1320
atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat1380
tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga1440
gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc1500
gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt1560
tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac1620
cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc1680
gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa1740
ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc1800
gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc1860
tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc1920
atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca1980
tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa2040
tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg2100
catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga2160
tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact2220
gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt2280
aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc2340
cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa2400
gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca2460
ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc2520
acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc2580
gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg2640
tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg2700
agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga 2760
tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg2820
gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg2880
gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga2940
cgcgaaaaaatgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000
attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg3060
agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat3120
ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt3180
tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca3240
gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt3300
gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg3360
ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg3420
taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca3480
agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg3540
ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact3600
caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt3660
ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc3720
attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc3780
aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt3840
gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa3900
ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat3960
atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat4020
agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa4080
ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa4140
cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc4200
cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct4260
actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct4320
tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc4380
atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa caactaattc4440
agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag4500
tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac4560
ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg4620
tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag aataaaaaaa4680
gataaaaagaatagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag ttccgcagta 4740
ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa4800
aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata4860
ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc4920
gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg4980
attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt5040
tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc5100
tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa5160
tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc5220
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa5280
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta5340
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt5400
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5460
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5520
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5580
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5640
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5700
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5760
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5820
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5880
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5940
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6000
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6060
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6120
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6180
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6240
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6300
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg6329
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
aacaatatgt aagatctcaa ctatc25
<210>51
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
cagacatgag agatccagtg tgtag25
<210>52
<211>9332
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒pCP20
<400>52
gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca60
cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact 120
ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg 180
gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc 240
acaggtgcgg ttgctggcgc taaccgtttt tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat 300
catatcgtca attattacct ccacggggag agcctgagca aactggcctc aggcatttga 360
gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata 420
agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt 480
ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc aaccaggcgt ttaagggcac 540
caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat 600
tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc 660
agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg 720
aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg 780
gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg 840
taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca 900
ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca 960
ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc 1020
atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg 1080
gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact 1140
gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat 1200
ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa 1260
aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga 1320
tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca 1380
ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg 1440
tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt 1500
ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg1560
caaaagcacc gccggacatc agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg1620
ccgggggact gttgggcgcc tgtagtgcca tttaccccca ttcactgcca gagccgtgag1680
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ctgactaaag tagtgagtta tacacagggc tgggatctat tctttttatc tttttttatt1920
ctttctttat tctataaatt ataaccactt gaatataaac aaaaaaaaca cacaaaggtc1980
tagcggaatt tacagagggt ctagcagaat ttacaagttt tccagcaaag gtctagcaga2040
atttacagat acccacaact caaaggaaaa ggactagtaa ttatcattga ctagcccatc2100
tcaattggta tagtgattaa aatcacctag accaattgag atgtatgtct gaattagttg2160
ttttcaaagc aaatgaacta gcgattagtc gctatgactt aacggagcat gaaaccaagc2220
taattttatg ctgtgtggca ctactcaacc ccacgattga aaaccctaca aggaaagaac2280
ggacggtatc gttcacttat aaccaatacg ttcagatgat gaacatcagt agggaaaatg2340
cttatggtgt attagctaaa gcaaccagag agctgatgac gagaactgtg gaaatcagga2400
atcctttggt taaaggcttt gagattttcc agtggacaaa ctatgccaag ttctcaagcg2460
aaaaattaga attagttttt agtgaagaga tattgcctta tcttttccag ttaaaaaaat2520
tcataaaata taatctggaa catgttaagt cttttgaaaa caaatactct atgaggattt2580
atgagtggtt attaaaagaa ctaacacaaa agaaaactca caaggcaaat atagagatta2640
gccttgatga atttaagttc atgttaatgc ttgaaaataa ctaccatgag tttaaaaggc2700
ttaaccaatg ggttttgaaa ccaataagta aagatttaaa cacttacagc aatatgaaat2760
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gacaaatgga tctcgtaacc gaacttgaga acaaccagat aaaaatgaat ggtgacaaaa 2880
taccaacaac cattacatca gattcctacc tacataacgg actaagaaaa acactacacg2940
atgctttaac tgcaaaaatt cagctcacca gttttgaggc aaaatttttg agtgacatgc3000
avaagtaagta tgatctcaat ggttcgttct catggctcac gcaaaaacaa cgaaccacac3060
tagagaacat actggctaaa tacggaagga tctgaggttc ttatggctct tgtatctatc3120
agtgaagcat caagactaac aaacaaaagt agaacaactg ttcaccgtta catatcaaag3180
ggaaaactgt ccatatgcac agatgaaaac ggtgtaaaaa agatagatac atcagagctt3240
ttacgagttt ttggtgcatt taaagctgtt caccatgaac agatcgacaa tgtaacagat3300
gaacagcatg taacacctaa tagaacaggt gaaaccagta aaacaaagca actagaacat3360
gaaattgaac acctgagaca acttgttaca gctcaacagt cacacataga cagcctgaaa3420
caggcgatgc tgcttatcga atcaaagctg ccgacaacac gggagccagt gacgcctccc3480
gtggggaaaa aatcatggca attctggaag aaatagcgcc tgtttcgttt caggcaggtt3540
atcagggagt gtcagcgtcc tgcggttctc cggggcgttc
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)
1.由羧酸酯生產(chǎn)過氧羧酸的方法，所述方法包括
a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括
1)選自下列的底物
i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及
iii)選自乙酰化單糖、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?；
2)過氧源；以及
3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，所述酶包含使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序；和
b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此產(chǎn)生過氧羧酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ IDNO2比對時，所述酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶包含由在嚴格條件下雜交的核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列的核酸分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ IDNO16，和SEQ ID NO32。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
8.權(quán)利要求1的方法，其中過氧羧酸在將反應(yīng)成分組合后約5分鐘至約2小時內(nèi)以至少20ppm的濃度生成。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述乙酰化糖選自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖
10.權(quán)利要求1的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所生成的過氧羧酸是過乙酸。
12.使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物消毒硬質(zhì)表面或無生命物體的方法，所述方法包括
a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括
1)選自下列的底物
i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；
iii)選自乙?；瘑翁恰⒁阴；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?；
2)過氧源；以及
3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包含使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序；
b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此形成過氧羧酸產(chǎn)物；
a)任選將所述過氧羧酸產(chǎn)物稀釋；以及
b)使所述硬質(zhì)表面或無生命物體與在步驟b)或步驟c)中所產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，由此將所述表面或所述無生命物體消毒。
13.權(quán)利要求12的方法，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQID NO2比對時，酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ IDNO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述酶包含由核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子在嚴格條件下與具有選自下列的序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述酶選自SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
19.權(quán)利要求12的方法，其中過氧羧酸在將反應(yīng)成分組合后約5分鐘至約2小時內(nèi)以至少20ppm的濃度生成。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述乙?；沁x自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛、和三-O-乙?；?葡萄烯糖。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所生成的過氧羧酸是過乙酸。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體選自罐、傳送機、地板、排水溝、管道、冷卻器、致冷機、設(shè)備表面、墻壁、閥、帶、接頭、窗戶、水處理設(shè)施、池、礦泉、發(fā)酵罐、藥物或生物藥物制造設(shè)備、藥物或生物藥物成分、藥物或生物藥物賦形劑、衣服、醫(yī)療設(shè)備、牙科設(shè)備、外科手術(shù)設(shè)備、內(nèi)窺鏡、腹腔鏡、刷、鞋、烹飪表面、食品制備表面、浴室表面、盥洗室、家畜、牛、奶牛、羊、馬、豬、牛肉、家禽、豬肉、蔬菜、水果、海鮮、以及它們的組合。
24.權(quán)利要求12的方法，其中所述甘油酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它們的混合物。
25.權(quán)利要求12的方法，其中所述乙?；沁x自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙?；揪厶?、乙?；揪厶瞧巍ⅵ?D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙?；?葡萄烯糖。
26.權(quán)利要求12的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述過氧羧酸是過乙酸。
28.權(quán)利要求12的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約168小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中所生成的過氧羧酸接觸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約48小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中所生成的過氧羧酸接觸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約2小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中所生成的過氧羧酸接觸。
31.權(quán)利要求12的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體上的存活生物污染物的濃度降低至少3-log。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體上的存活生物污染物的濃度降低至少5-log。
33.權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的方法，其中所述酶催化劑是選自微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化的酶、和純化的酶的形式。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述酶催化劑是缺乏過氧化氫酶活性的重組大腸桿菌菌株。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述重組大腸桿菌菌株包含破壞的選自下列的催化劑基因katE、katG以及katE和katG兩者。
37.通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的消毒劑或漂白組合物。
38.過氧羧酸生成系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
a)選自下列的底物
1)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
2)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及
3)選自乙?；瘑翁?、乙?；恰⒑鸵阴；嗵堑囊阴；牵灰约?br>
b)過氧源；以及
c)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，所述酶具有使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序。
39.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
40.權(quán)利要求39的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
41.權(quán)利要求38或權(quán)利要求37的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
42.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶包含由核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子在嚴格條件下與具有選自下列的序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
43.權(quán)利要求42的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶選自SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
45.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中將該組反應(yīng)成分在含水反應(yīng)條件下組合以原位形成過氧羧酸。
46.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)成分還包含一種或多種選自下列的成分一種或多種螯合劑、一種或多種潤濕劑、一種或多種腐蝕抑制劑、以及它們的組合。
47.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述過氧羧酸是過乙酸。
48.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)成分在試劑盒中提供。
49.制劑，所述制劑包含
a)包含酶催化劑和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化劑包含具有CE-7特征基序的過氧化水解酶，所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物；所述第一混合物任選包含選自下列的另外組分無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、潤濕劑、以及它們的組合；以及
b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選還包含螯合劑。
50.權(quán)利要求49的制劑，其中所述酶催化劑呈固體顆粒形式。
51.權(quán)利要求49的制劑，其中所述制劑包括用于分開貯存和組合所述第一混合物與所述第二混合物的裝置。
52.權(quán)利要求51的制劑，其中所述用于分開貯存的裝置包括容器，所述容器在單個容器或兩個分開的容器中包含兩個分開的隔室。
53.權(quán)利要求51的制劑，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
54.通過將權(quán)利要求49的第一混合物與第二混合物組合生成過氧羧酸而產(chǎn)生的消毒制劑。
55.權(quán)利要求54的消毒制劑，其中所述消毒制劑還包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
56.制劑，所述制劑包含
a)包含酶催化劑和乙?；堑牡谝换旌衔铮雒复呋瘎┌哂蠧E-7特征基序的過氧化水解酶，所述乙?；沁x自乙?；瘑翁?、乙酰化二糖、乙酰化多糖、以及它們的組合，所述第一混合物任選還包含無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、和潤濕劑；以及
b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選包含螯合劑。
57.權(quán)利要求56的制劑，其中所述第一混合物呈固體片或粉末的形式。
58.權(quán)利要求56的制劑，其中所述制劑包括用于分開貯存和組合所述第一混合物與所述第二混合物的裝置。
59.權(quán)利要求58的制劑，其中所述用于分開貯存的裝置包括容器，所述容器在單個容器或兩個分開的容器中包含兩個分開的隔室。
60.權(quán)利要求59的制劑，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
61.通過將權(quán)利要求56的第一混合物與第二混合物組合生成過氧羧酸而產(chǎn)生的消毒制劑。
62.權(quán)利要求61的消毒制劑，其中所述消毒制劑還包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
63.重組大腸桿菌細胞，所述細胞包含katE中的破壞和katG中的破壞，條件是所述宿主細胞不是大腸桿菌UM2。
64.權(quán)利要求63的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述細胞來源于大腸桿菌菌株MG1655。
65.權(quán)利要求64的重組大腸桿菌宿主細胞，所述細胞還包含能夠利用或者產(chǎn)生過氧化氫的酶。
66.權(quán)利要求65的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述細胞還包含至少一種具有過氧化水解酶活性的酶。
67.權(quán)利要求66的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述至少一種具有過氧化水解酶活性的酶包含CE-7糖酯酶特征基序。
權(quán)利要求
1.由羧酸酯生產(chǎn)過氧羧酸的方法，所述方法包括
a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括
1)選自下列的羧酸酯
i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及
iii)選自乙?；瘑翁?、乙酰化二糖和乙?；嗵堑囊阴；?；
2)過氧源；以及
3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶包含特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和
b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此產(chǎn)生過氧羧酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ IDNO2比對時，所述酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶包含由在嚴格條件下雜交的核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列的核酸分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ IDNO16，和SEQ ID NO32。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
8.權(quán)利要求1的方法，其中過氧羧酸在將反應(yīng)成分組合后約5分鐘至約2小時內(nèi)以至少20ppm的濃度生成。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述乙酰化糖選自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙?；揪厶?、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛、和三-O-乙?；?葡萄烯糖。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所生成的過氧羧酸是過乙酸。
12.使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物消毒硬質(zhì)表面或無生命物體的方法，所述方法包括
a)提供一組反應(yīng)成分，所述成分包括
1)選自下列的底物
i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；
iii)選自乙酰化單糖、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?；
2)過氧源；以及
3)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶催化劑包含特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；
b)在合適的含水反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)成分組合，由此形成過氧羧酸產(chǎn)物；
c)任選將所述過氧羧酸產(chǎn)物稀釋；以及
d)使所述硬質(zhì)表面或無生命物體與在步驟b)或步驟c)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，由此將所述表面或所述無生命物體消毒。
13.權(quán)利要求12的方法，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQID NO2比對時，酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ IDNO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述酶包含由核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子在嚴格條件下與具有選自下列的序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述酶選自SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQID NO16，和SEQ ID NO32。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述過氧羧酸在將反應(yīng)成分組合后約5分鐘至約2小時內(nèi)以至少20ppm的濃度生成。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述乙?；沁x自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙?；揪厶?、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所生成的過氧羧酸是過乙酸。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體選自罐、傳送機、地板、排水溝、管道、冷卻器、致冷機、設(shè)備表面、墻壁、閥、帶、接頭、窗戶、水處理設(shè)施、池、礦泉、發(fā)酵罐、藥物或生物藥物制造設(shè)備、藥物或生物藥物成分、藥物或生物藥物賦形劑、衣服、醫(yī)療設(shè)備、牙科設(shè)備、外科手術(shù)設(shè)備、內(nèi)窺鏡、腹腔鏡、刷、鞋、烹飪表面、食品制備表面、浴室表面、盥洗室、家畜、牛、奶牛、羊、馬、豬、牛肉、家禽、豬肉、蔬菜、水果、海鮮、以及它們的組合。
24.權(quán)利要求12的方法，其中所述甘油酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它們的混合物。
25.權(quán)利要求12的方法，其中所述乙酰化糖選自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙?；揪厶瞧?、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙?；?D-半乳醛、和三-O-乙?；?葡萄烯糖。
26.權(quán)利要求12的方法，其中所生成的過氧羧酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β-羥基丁酸、以及它們的混合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所生成的過氧羧酸是過乙酸。
28.權(quán)利要求12的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約168小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中生成的過氧羧酸接觸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約48小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中所生成的過氧羧酸接觸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中使所述硬質(zhì)表面或無生命物體在組合所述反應(yīng)成分后約5分鐘至約2小時內(nèi)與步驟b)或步驟c)中所生成的過氧羧酸接觸。
31.權(quán)利要求12的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體上的存活生物污染物的濃度降低至少3-log。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述硬質(zhì)表面或無生命物體上的存活生物污染物的濃度降低至少5-log。
33.權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的方法，其中所述酶催化劑是選自微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化的酶、和純化的酶的形式。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述酶催化劑是缺乏過氧化氫酶活性的重組大腸桿菌菌株。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述重組大腸桿菌菌株包含破壞的選自下列的催化劑基因katE、katG以及katE與katG兩者。
37.通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的消毒劑或漂白組合物。
38.過氧羧酸生成系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
a)選自下列的底物
1)具有以下結(jié)構(gòu)的酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2＝C1-C10直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
2)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
其中R1＝任選被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；以及
3)選自乙?；瘑翁?、乙?；恰⒑鸵阴；嗵堑囊阴；?；以及
b)過氧源；以及
c)具有過氧化水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括酶，當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶具有特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序。
39.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中當(dāng)使用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO2比對時，所述酶的特征基序還包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
40.權(quán)利要求39的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶與SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
41.權(quán)利要求38或權(quán)利要求37的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQID NO32或者通過對所述氨基酸序列取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而衍生的具有過氧化水解酶活性的基本上類似的酶。
42.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶包含由核酸分子編碼的氨基酸序列，所述核酸分子在嚴格條件下與具有選自下列的序列的核酸分子雜交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
43.權(quán)利要求42的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述酶選自SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述酶由核酸分子編碼，所述核酸分子具有選自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
45.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中將該組反應(yīng)成分在含水反應(yīng)條件下組合以原位形成過氧羧酸。
46.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)成分還包含一種或多種選自下列的成分一種或多種螯合劑、一種或多種潤濕劑、一種或多種腐蝕抑制劑、以及它們的組合。
47.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述過氧羧酸是過乙酸。
48.權(quán)利要求38的過氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)成分在試劑盒中提供。
49.制劑，所述制劑包含
a)包含酶催化劑和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化劑包含具有CE-7特征基序的過氧化水解酶，所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物；所述第一混合物任選包含選自下列的另外組分無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、潤濕劑、以及它們的組合；以及
b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選還包含螯合劑。
50.權(quán)利要求49的制劑，其中所述酶催化劑呈固體顆粒形式。
51.權(quán)利要求49的制劑，其中所述制劑包括用于分開貯存和組合所述第一混合物與所述第二混合物的裝置。
52.權(quán)利要求51的制劑，其中所述用于分開貯存的裝置包括容器，所述容器在單個容器或兩個分開的容器中包含兩個分開的隔室。
53.權(quán)利要求51的制劑，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
54.通過將權(quán)利要求49的第一混合物與第二混合物組合生成過氧羧酸而產(chǎn)生的消毒制劑。
55.權(quán)利要求54的消毒制劑，其中所述消毒制劑還包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
56.制劑，所述制劑包含
a)包含酶催化劑和乙?；堑牡谝换旌衔?，所述酶催化劑包含具有CE-7特征基序的過氧化水解酶，所述乙?；沁x自乙?；瘑翁?、乙?；?、乙?；嗵恰⒁约八鼈兊慕M合，所述第一混合物任選還包含無機或有機緩沖劑、腐蝕抑制劑、和潤濕劑；以及
b)包含過氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任選包含螯合劑。
57.權(quán)利要求56的制劑，其中所述第一混合物呈固體片或粉末的形式。
58.權(quán)利要求56的制劑，其中所述制劑包括用于分開貯存和組合所述第一混合物與所述第二混合物的裝置。
59.權(quán)利要求58的制劑，其中所述用于分開貯存的裝置包括容器，所述容器在單個容器或兩個分開的容器中包含兩個分開的隔室。
60.權(quán)利要求59的制劑，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
61.通過將權(quán)利要求56的第一混合物與第二混合物組合生成過氧羧酸而產(chǎn)生的消毒制劑。
62.權(quán)利要求61的消毒制劑，其中所述消毒制劑還包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
63.重組大腸桿菌細胞，所述細胞包含katE中的破壞和katG中的破壞，條件是所述宿主細胞不是大腸桿菌UM2。
64.權(quán)利要求63的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述細胞來源于大腸桿菌菌株MG1655。
65.權(quán)利要求64的重組大腸桿菌宿主細胞，所述細胞還包含能夠利用或者產(chǎn)生過氧化氫的酶。
66.權(quán)利要求65的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述細胞還包含至少一種具有過氧化水解酶活性的酶。
67.權(quán)利要求66的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述至少一種具有過氧化水解酶活性的酶包含CE-7糖酯酶特征基序。
全文摘要
提供了用于由羧酸酯生產(chǎn)過氧羧酸的方法。更具體地講，在具有過氧化水解活性的酶催化劑存在下使羧酸酯與無機過氧化氫例如過氧化氫反應(yīng)。基于保守結(jié)構(gòu)特征，本發(fā)明過氧化水解酶催化劑被歸類為糖酯酶家族7(CE-7)的成員。此外，還提供了包含通過本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的過酸的消毒制劑。
文檔編號C12P7/62GK101558161SQ200780045718
公開日2009年10月14日 申請日期2007年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日
發(fā)明者R·迪科西莫, J·E·加瓦根, M·S·佩恩, F·B·庫林三世 申請人:納幕爾杜邦公司