專利名稱：內(nèi)化的制作方法
內(nèi)化
本說明書中引用了各種文件。對于包括制造者的手冊在內(nèi)的這些 現(xiàn)有技術的文件的公開內(nèi)容，在此以引用方式將其全部內(nèi)容并入本 文。
背景技術：
通過對健康人和患病的患者的比較和統(tǒng)計分析、尤其是通過分析 來自所述患者的組織和/或血液來源的血漿，已經(jīng)將新的靶標鑒定。
通常，比較分析可以在不同水平進行，例如DNA水平、RNA水平、 蛋白質(zhì)水平和翻譯后水平。 一種常用的技術基于基因差異性表達分 析。簡單來說，對來自患病細胞和健康細胞的mRNA都進行標記， 隨后與基因芯片雜交并量化。從量化信號得出的不同mRNA的上調(diào) 或下調(diào)揭示了潛在的新靶標?，F(xiàn)有技術中公知的另一種方法是基于對 來源自健康人和患病的患者的DNA分子的DNA甲基化模式的鑒定 和比較。
然而，在上文中應該注意的是DNA修飾(即DNA甲基化模式) 和基因差異性表達分析(即細胞中表達的mRNA的水平)均不一定反 映出由相應DNA或相應mRNA編碼的特定蛋白是否真正得到表達。 因而，差異性表達水平的鑒定，即健康細胞與患病細胞相比的蛋白表 達模式的定量和定性分析還是一個挑戰(zhàn)。
鑒定蛋白差異性表達水平的方法是基于所述蛋白的差示二維凝 膠分析以及經(jīng)由質(zhì)譜的后續(xù)分析，這是本領域技術人員所公知的技 術。此外，基于蛋白質(zhì)分級的方法，可以提及的少數(shù)幾種例如有基于 蛋白質(zhì)芯片的應用的技術、HPLC和FPLC相關的技術，這些均是本 領域技術人員所公知的。
噬菌體展示技術提供了例如這樣一種可能性:在諸如源自例如健 康供體的組織或細胞等樣品上排除(deplete)大型文庫如結合部分
4(binding member)的表達文庫，并且在諸如源自例如患病供體的組織 或細胞等樣品上使用該文庫的剩余群體(residual population)。通過排 除分析所追蹤到的結合部分，即與患病組織/細胞而不是健康組織/細 胞的(多)肽靶標或配對物(counterpart)結合的結合部分，通常被認為可 與靶標細胞(例如患病細胞)上獨特地(或至少是高得多地)表達的靶標 結合。隨后，結合部分/(多)肽靶標復合體可以通過例如本領域技術人 員公知的質(zhì)譜或蛋白質(zhì)分析方法來進行鑒定。
尤其有趣的是可在與其耙標結合時內(nèi)化的結合部分。本領域技術 人員知曉的是所述結合部分能夠例如隨后與可能對細胞有毒的任何 物質(zhì)或任何小分子融合，從而觸發(fā)對表達所述耙標的(優(yōu)選患病的)細 胞的殺滅，所述細胞優(yōu)選為患病的。同樣在本領域中公知的是， 一旦 可內(nèi)化的感興趣的靶標被鑒定為例如患病細胞或癌細胞，就可以確定 其它結合部分，所述其它結合部分可具有例如對該靶標的較高親和力 和/或觸發(fā)所述革E標的內(nèi)化的較高潛力。因而可以考慮將所述經(jīng)改善 的結合部分作為例如用于治療如表達一個或多個所述靶標的患病細 胞的藥物。
為了有效地確定在與其相應結合部分結合時就已經(jīng)內(nèi)化到細胞 中的潛在耙標，理想的是將已內(nèi)化的復合體與未內(nèi)化的復合體分離。 然而，在現(xiàn)有技術中，還不能以滿足定性和定量的方式實現(xiàn)所述分離， 從而使技術人員面臨用以確定結合部分和可內(nèi)化的耙標的耗時且復 雜的技術。
因而一直存在的需求是進一步開發(fā)并且改進使得可實現(xiàn)已內(nèi)化 的復合體與未內(nèi)化的復合體之間的有效分離的方法和工藝。


圖1顯示了 Fab結合時靶標內(nèi)化的效率。
百分比(％)內(nèi)化是由4。C時的細胞表面的細胞外信號對37。C時的 細胞表面的細胞外信號的比率而計算的；熒光的恢復是通過4匸時細 胞外加細胞內(nèi)染色對37。C時細胞外加細胞內(nèi)染色的比率而測定的， 顯示在內(nèi)化過程、皂草素(saporin)處理和/或染色期間沒有或僅少量噬菌體顆粒丟失。Fab A顯示80。/。的內(nèi)化，F(xiàn)abB僅顯示20。/。的內(nèi) 化，而FabC根本未顯示結合。
圖2顯示噬菌體耙標復合體內(nèi)化的效率和通過DDT的表面結合 噬菌體的排除。
所顯示的是經(jīng)由二硫鍵而展示針對占優(yōu)內(nèi)化的抗原的Fab A的 噬菌體的內(nèi)化，與經(jīng)由二硫鍵而展示針對非占優(yōu)內(nèi)化的抗原的FabB 的噬菌體的內(nèi)化的比較。
百分比(°/。)內(nèi)化是由4"C時細胞表面的細胞外信號對37'C時細胞 表面的細胞外信號的比率而計算的；熒光的恢復是通過4'C時細胞外 加細胞內(nèi)染色對37'C時細胞外加細胞內(nèi)染色的比率而測定的。
具體實施例方式
本發(fā)明在一個方面涉及編碼內(nèi)化到細胞中的復合體的結合部分 的核酸分子的回收方法，所述方法包括如下步驟(a)使細胞與噬菌體 顆粒的多樣性集合接觸，其中每個或基本上所有的所述噬菌體顆粒均 在其表面上展示結合部分，其中所述結合部分被展示為具有所述噬菌 體顆粒的噬菌體衣殼蛋白的非融合(多)肽并且其中每個或基本上所 有的所述噬菌體顆粒均包含編碼所展示的結合部分的核酸分子，(b) 使噬菌體顆粒上所展示的結合部分與其靶標結合，從而使得形成至少 一種復合體，所述復合體中每一種均包含帶有其所展示的結合部分的 噬菌體顆粒和其靶標，(c)在可以使至少一種所述復合體內(nèi)化到細胞中 的條件下培養(yǎng)細胞，(d)在基本不發(fā)生細胞裂解的條件下洗脫未內(nèi)化 的編碼結合部分的核酸分子，(e)使包含內(nèi)化復合體的細胞裂解，和(f) 從裂解的細胞中回收源自至少一種的內(nèi)化復合體的編碼結合部分的 核酸分子。
術語"細胞"是指任何真核或原核細胞。與本發(fā)明相關的優(yōu)選是 哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可以包括健康細胞以及患病細胞。
在本發(fā)明的情況中，術語"多樣性集合"是指在其組成、性質(zhì)和 /或序列的至少一部分上有所不同的至少兩個顆?；蚍肿拥募稀?br> 結合本發(fā)明而使用的術語"噬菌體顆粒的多樣性集合"是指多個噬菌體顆粒。這樣的多個噬菌體顆粒中每個或基本上所有成員均展示不同的結合部分。噬菌體顆粒的多樣性集合的產(chǎn)生方法是本領域普通技術人員所公知的。
結合本發(fā)明而使用的術語"噬菌體"應以其最廣泛的含義來解釋。
在本發(fā)明的情況中，術語"噬菌體"因而涉及可形成包裝(package)的任何細菌病毒，所述包裝具有包含噬菌體復制所需的核酸的蛋白衣殼。所述核酸可以是DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈、線狀或環(huán)狀。本領域普通技術人員所公知的有諸如噬菌體A或絲狀噬菌體(如M13、 fd或fl)等噬菌體。
在本發(fā)明的情況中優(yōu)選的是絲狀噬菌體，例如M13噬菌體。更優(yōu)選的是絲狀噬菌體VCSM 13。
在本發(fā)明的情況中，術語"噬菌體顆粒"是指根據(jù)本發(fā)明的顆粒，即展示(多)肽/蛋白的顆粒。
在上文中，可以認為噬菌體顆粒的多樣性集合的每個或基本上所有的成員均展示結合部分，其中每個結合部分優(yōu)選在它們的序列的至少一個氨基酸位上有所不同。
本發(fā)明的術語"結合部分"是指能夠與特定配對物或靶標結合從而形成復合體的任何(多)肽。所述術語在與本發(fā)明相關時應被理解為此外還包含本領域技術人員已知的任何構架(scaffold)。與本發(fā)明相關的"構架"是指具有通用框架和至少一個可變區(qū)的(多)肽的任何集合。本領域技術人員已知的構架是例如基于纖連蛋白的構架或基于錨蛋白重復蛋白的構架。本文所用的術語"(多)肽"描述了一組分子，包括肽組以及多肽組。所述肽組由具有至多30個氨基酸的分子組成，所述的多肽或蛋白組由具有多于30個的氨基酸的分子組成。與本發(fā)明相關的術語"(多)肽"應被解釋為還包括抗體或抗體片段或者其衍生物。所述抗體應被理解為包含本領域技術人員已知的任何免疫球蛋白。"免疫球蛋白"(Ig)是屬于類別IgG、 IgM、 IgE、 IgA或IgD(或者其任何亞類)的蛋白，并且包括所有通常已知的抗體和其功能片段?？贵w/免疫球蛋白的"功能片段"因而被限定為保持抗原結合區(qū)域的抗體/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可變區(qū))。術語"抗體片段或其衍
7生物"涉及單鏈抗體或其片段、合成抗體、抗體片段(如Fab、 a F(ab2)'、Fv或scFv等片段)、單域抗體等，或者這些中任何的化學修飾衍生物?？梢允褂帽绢I域中已知的常規(guī)技術來對要根據(jù)本發(fā)明而采用的抗體或它們相應的免疫球蛋白鏈在基序外進一步修飾，例如通過單獨或組合使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重組和/或本領域中已知的任何其它修飾(例如翻譯后化學修飾，如糖基化和磷酸化)。在以免疫球蛋白鏈的氨基酸序列為基礎的DNA序列中引入所述修飾的方法是本領域技術人員公知的；例如見Sambrook等；Molecular Cloning:A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年第2版和2001年第3版。
所述抗體分子的片段或衍生物是指作為上述抗體分子的部分的和/或通過化學/生物化學或分子生物學方法修飾的(多)肽。這在加以必要變更的情況下同樣適用于任何構架。相應的方法在本領域中是已知的，此外在實驗室手冊中也有所描述(見Sambrook等，同上;Gerhardt等；Methods for General and Molecular Bacteriology; ASMPress, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: TheComprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997;Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002)。
在本發(fā)明的情況中術語"展示為非融合的(多)肽"是指不經(jīng)由本領域技術人員已知的任何常規(guī)融合技術來展示的任何(多)肽。常規(guī)展示可以通過例如基因融合來實現(xiàn)，其中由優(yōu)選2個基因的融合產(chǎn)生作為表達產(chǎn)物的融合蛋白。本領域的技術人員知曉的是所述融合蛋白在現(xiàn)有技術中有時稱作雜合蛋白或嵌合蛋白，其通過遺傳工程學制成的雜合基因的表達而產(chǎn)生，并且其中組合了優(yōu)選2個的單獨的基因序列。
與本發(fā)明相關的術語"噬菌體衣殼蛋白"可以被看作不僅包括源自本領域技術人員公知的任何噬菌體的噬菌體衣殼蛋白，還包括源自其的片段，其中所述片段能夠被引入到噬菌體顆粒的蛋白衣殼中。
結合本發(fā)明而使用的術語"靶標"是指(i)細胞上所表達的能夠與結合部分結合的任何(多)肽或者(ii)能夠被內(nèi)化到細胞中并且能夠與
結合部分結合的任何分子。優(yōu)選的是任何細胞表面受體，更優(yōu)選的是受體酪氨酸激酶。所述靶標包括不為本領域的技術人員所知且有待鑒定的任何靶標或者可能本身是已知的但在其內(nèi)化能力方面還未知的任何靶標。在與本發(fā)明相關的情況中，表達至少一種潛在靶標的細胞也被稱為"靶標細胞"。
術語"使至少一種所述復合體內(nèi)化到細胞中"是指本領域技術人員公知的、可觸發(fā)復合體內(nèi)化到細胞中的任何技術。優(yōu)選的是依賴溫
度變換(temperature shift)的技術，例如將溫度從4。C升高到37°C 。
結合本發(fā)明所用的短語"在基本上不發(fā)生細胞裂解的條件下洗脫未內(nèi)化的編碼結合部分的核酸分子"中的術語"基本上不發(fā)生細胞裂解"應被解釋為不超過約50%、優(yōu)選約40%、更優(yōu)選約30%、更優(yōu)選約20%、優(yōu)選不超過約10%、更優(yōu)選不超過約5%、進而更優(yōu)選不超過約1%的細胞被裂解并且最優(yōu)選沒有細胞被裂解。
結合本發(fā)明而使用的術語"使包含內(nèi)化的復合體的細胞裂解"包括本領域技術人員已知的任何裂解細胞的技術。對于哺乳動物細胞，優(yōu)選由于三乙胺(triethylamin)的存在而導致的裂解。
如以上所列出的并換而言之，本發(fā)明通過提供使本領域技術人員可靠且有效地區(qū)分內(nèi)化的復合體和未內(nèi)化的復合體的方法從而解決了所述技術問題。通過基于融合蛋白的展示技術，通常只有通過應用以適當?shù)木彌_液進行的相當嚴格的洗脫步驟(如通過使用pH梯度或鹽梯度)從而也能排除高親和力結合部分才能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)化的復合體和未內(nèi)化的復合體的分離。會產(chǎn)生無法預測的細胞裂解事件，導致內(nèi)化的復合體和未內(nèi)化的復合體的混合，使得復雜化或者甚至阻礙了所有進一步的分析。本發(fā)明通過將非融合展示系統(tǒng)的優(yōu)勢(例如，溫和的洗脫條件和不依賴結合部分與耙標之間的特異性親和力)引入到內(nèi)化復合體的領域中從而克服了上述情況。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法進一步包括確定內(nèi)化的復合體的耙標的序列的步驟。本領域技術人員知曉確定內(nèi)化的復合體的靶標的序列的技術。優(yōu)選的是，打算使用確定(多)肽靶標的氨基酸序列的技術。還可以參考下文中的實施方式。
在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實施方式中，所述展示為非融合的(多)肽的特征是噬菌體衣殼蛋白與結合部分之間的非肽鍵。
在本發(fā)明的方法的更優(yōu)選實施方式中，所述非肽鍵為二硫鍵。
在本發(fā)明的最優(yōu)選實施方式中，所述二硫鍵生成于所述噬菌體衣殼蛋白中所包含的第一半胱氨酸殘基與所述結合部分中所包含的第二半胱氨酸殘基之間。
在本發(fā)明的方法的另一個最優(yōu)選實施方式中，所述洗脫未內(nèi)化的編碼結合部分的所述核酸分子是在使所述二硫鍵斷裂的還原性條件下進行的。
這一實施方式和此前的實施方式涉及其中由二硫鍵負責連接的
情況。上述系統(tǒng)的細節(jié)公開于專利申請WO 01/05950，在此特將其內(nèi)容以引用方式并入本文。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式中，所述從裂解的細胞中回收編碼結合部分的所述核酸分子通過PCR實現(xiàn)。在這一優(yōu)選實施方式的情況中，可以使用例如能夠擴增感興趣的結合部分的PCR引物。以特定引物為基礎通過聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增核酸分子的技術是本領域技術人員公知的。
在本發(fā)明的方法的另一實施方式中，所述確定內(nèi)化的復合體的靶標的序列的步驟通過質(zhì)譜實現(xiàn)。
本領域技術人員知曉從裂解的細胞中回收核酸分子的技術和確定復合體中(多)肽的序列的技術。
本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的方法而獲得的靶標和/或結合部分。
最后，本發(fā)明涉及向細胞中輸送有毒物質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟:(a)獲得由權利要求1所述的回收的核酸分子編碼的(多)肽，
(b)將所述有毒物質(zhì)與由權利要求1所述的回收的核酸編碼的所述(多)
肽結合，和(c)對細胞施用從步驟(b)得到的有毒物質(zhì)，從而觸發(fā)所述
有毒物質(zhì)向細胞內(nèi)的內(nèi)化。
如上所述并且換而言之，本發(fā)明能夠被用于鑒定具有內(nèi)化到細胞中的潛力的結合部分和/或靶標。優(yōu)選的是，如以上所說明的，可以 將所述結合部分和/或靶標應用到例如殺滅患病細胞如癌細胞的方 面。然而應該注意的是，應該理解到無論怎樣為本領域技術人員所熟 知并且基于能夠內(nèi)化到細胞中的結合部分和/或靶標的鑒定的任何應 用均被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
以下的實施例是用來闡釋本發(fā)明而不應被理解為是對其的限制。
實施例
實施例1:
應用本發(fā)明的方法來鑒定內(nèi)化靶標的實驗程序 耙標和對照細胞的制備
1. 用5。/。FCSVPBSZ或如果細胞會固定就用PBS(見2,2.3)將靶標 細胞(經(jīng)轉(zhuǎn)染或抗原陽性)和對照細胞(經(jīng)mock轉(zhuǎn)染或抗原陰性)洗滌3 次。如果必須在所有緩沖液中添加Ca2+，應使用TBS或HBS(見第 1.3部分；在磷酸鹽存在時鈣沉淀為磷酸鈣)。
1 FCS:胎牛血清，0.1 無菌過濾，經(jīng)支原體檢測。PAN BiotechGmbH, Aidenbach， # 3302-P971610。(或來自其它供應商的經(jīng)支 原體檢測的FCS)
2 PBS Dulbecco's:無l丐和鎂以及無碳酸氫鈉，Gibco BRL Life Technologies, # 14190-094。
2. 對靶標細胞計數(shù)并在2mL微離心管中調(diào)整為lmL的5% FCS/PBS中有5乂106個 1乂107個細胞以用于每次選擇。
3. 在4"C的高架旋轉(zhuǎn)器(over head rotator)上將所有后續(xù)步驟保持 在冰上的4'C的適當溫度2小時以用于封閉(blocking)。
4. 將組合文庫噬菌體的噬菌體滴度調(diào)整為1 ml的5% FCS/PBS (+補充劑)中有1 X 1013 2X 1013個噬菌體。在高架旋轉(zhuǎn)器上于fC溫 育2小時從而封閉噬菌體。
耙標細胞上的選擇
5. 將經(jīng)封閉的耙標細胞在2000 rpm離心2分鐘并在0.5 ml l ml的預吸附噬菌體的溶液(pre-adsorbedphage-solution)中重懸。
6. 于4。C在搖床(rocker)上溫育2小時。
li7. 將細胞在2000rpm離心2分鐘。
8. 小心地吸出上清液并丟棄。
9. 第一次洗滌使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的5°/。 FCS/PBS (+補充劑)中。
10. 在4'C溫育5分鐘。
11. 將細胞在2000rpm離心2分鐘。
12. 小心地吸出上清液并丟棄。
13. 第二次洗滌使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的 5°/。 FCS/PBS (+補充齊lJ)中。
14. 對于活細胞于4。C在搖床上溫育5分鐘，對于固定的細胞于 2(TC在搖床上溫育5分鐘。
15. 將細胞在2000rpm離心2分鐘。
16. 小心地吸出上清液并丟棄。
17. 第三次洗滌使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的 5% FCS/PBS (+補充齊i」)中。將細胞轉(zhuǎn)移到已經(jīng)用5%FCS/PBS封閉的 新的無菌2ml管中3。
3該步驟有助于避免與選擇用管非特異性結合的噬菌體的再次富
IS.對于活細胞于4。C在搖床上溫育5分鐘，對于固定的細胞于 2(TC在搖床上溫育5分鐘。
19. 將細胞在2000 rpm離心2分鐘。
20. 小心地吸出上清液并丟棄。 噬菌體的內(nèi)化
21. 使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的5% FCS/PBS (+
補充劑)中。
22. 將溫度升高至37匸并溫育30分鐘。
未內(nèi)化噬菌體的排除
23. 向細胞中加入300 pl pH8.0的處于10 mM Tris/HCl中的20 mMDTf并在RT (室溫)溫育10分鐘5，在2000 rpm離心2分鐘，
丟棄上清液。4 pH8.0的處于10 mM Tris/HCl中的20 mM DTT:應始終將該 DTT溶液儲存于-2CTC。避免該溶液的多次凍融。
5替代DTT洗脫，這對于HuCALGOLD⑧文庫是推薦的，也可以 使用常規(guī)洗脫方法(例如見Krebs等,2001)
24. 第四次洗滌使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的 5% FCS/PBS (+補充劑)中。
25. 于4。C溫育5分鐘。
26. 將細胞在2000rpm離心2分鐘。
27. 小心地吸出上清液并丟棄。
28. 第五次洗滌使用移液器將細胞沉淀小心地重懸在1 ml的 5% FCS/PBS (+補充齊U)中。
29. 對于活細胞于4匸在搖床上溫育5分鐘，對于固定的細胞于 2(TC在搖床上溫育5分鐘。
30. 將細胞在2000 rpm離心2分鐘。
31. 小心地吸出上清液并丟棄。 內(nèi)化的噬菌體的回收
32. 加入500 (il的100 mM三乙胺(140 (il的TEA在10 ml PBS 中)并在RT溫育10分鐘(細胞將立即裂解)。加入400 ^ pH 7,0的1M Tris用于中和。中和后以pH指示劑棒(pH-indicator stick)檢測pH。
33. 使用洗脫物來感染TG1 (DWCP)。
34. 以標準程序來將表達Fab的克隆體鑒定并表示。
實施例2:
檢測抗原A、B和C在細胞上的流行性(prevalence)并檢測Fab A、 B、 C的內(nèi)化性質(zhì)。 材料與方法 所測試的Fab:
-Fab_C_FH (溶菌酶結合物，陰性對照) -Fab—B_FS (ICAM結合物，未內(nèi)化對照) -Fab—A—FH(抗原A，內(nèi)化)-以1嗎/ml來測試的Fab
細胞
-NCIH226:肺癌細胞 -lxl()5個細胞/測試
其它材料
-10%的皂苷將lg皂苷溶解于10ml的PBS中，0.5。/。皂苷/PBS， 儲存于4°C
-4%PFA:將16%的儲備溶液以1:4稀釋在PBS中。儲備溶液 16% (重量/體積)A〗phaAesar,LotE0S015
-FACS緩沖液(FB): PBS/3% FCS，儲存于4°C
-羊抗人IgG (H+L)-PE, Jackson Dia麗a, 109-116掘,以1:200 稀釋于FACS緩沖液(PBS/3。/。 FCS)中。
程序
1. 向處于FACS緩沖液中的2.5 X 106個NCI H226細胞的沉淀加 入100 (il Fab (1 )ig/ml)并在冰上溫育1小時。使用200}il的FACS緩沖 液洗滌細胞2次，離心(2000rpm)并重懸于200^1培養(yǎng)基中。
2. 將100^1轉(zhuǎn)移到96孔板并在4。C溫育1小時，進而在冰上溫 育10分鐘。
3. 使用20(V1的FACS緩沖液洗漆2次細胞；200rpm。
4. 重懸于200jil的FACS緩沖液中，分為2X100nl并在1200rpm
離心2分鐘。
對于未內(nèi)化狀況(4°。) 對于細胞外染色
5. 以lOOpl羊抗人IgG-PE重懸細胞并在4'C溫育1小時，并以 200)^1的FACS緩沖液洗滌2次；200rpm。
6. 重懸于lOOpl的FACS緩沖液中。
7. 隨后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上進 行FACS的測定。
對于細胞內(nèi)染色
8. 將來自步驟(4)的細胞重懸于100[il的4。/。PFA， 4°C 30分鐘。
149. 以20(V1的FACS緩沖液洗滌細胞2次；2000rpm。
10. 將細胞重懸于0.5%的皂草素中，IO分鐘RT。
11. 加入lOO(il抗人IgG-PE并于RT溫育1小時。
12. 以0.5%皂草素洗滌細胞2次，200rpm。
13. 重懸于100pl的FACS緩沖液中。
14. 隨后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上進 行FACS的測定。
對于內(nèi)化狀況(37'C):
對于細胞外染色
15. 將來自步驟(4)的細胞用lOOjil羊抗人IgG-PE重懸并在37°C 溫育1小時，并以200^d的FACS緩沖液洗滌2次；200rpm。
16. 重懸于100|il的FACS緩沖液中。
17. 隨后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上進 行FACS的測定。
對于細胞內(nèi)染色
18. 將來自步驟(4)的細胞重懸于100jil的4°/。PFA， 4°C 30分鐘。
19. 以200[il的FACS緩沖液洗滌細胞2次；2000rpm。
20. 將細胞重懸于0.5。/。的皂草素中，IO分鐘RT。
21. 加入抗人IgG-PE并于RT溫育1小時。
22. 以0.5%皂草素洗滌細胞2次，200rpm。
23. 重懸于lOOjil的FACS緩沖液中。
24. 隨后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yelow 420上進 行FACS的測定。
結果
如圖1所示，80。/o的Fab耙標A被內(nèi)化，相比之下只有20%的 Fab靶標B復合體被內(nèi)化。內(nèi)化過程、細胞透過性和染色不影響總的 噬菌體數(shù)目。
實施例3:
細胞外結合的噬菌體的經(jīng)DTT切割的內(nèi)化噬菌體的富集 材料與方法
15所測試的噬菌體
將編碼Fab A、 B、 C的基因(見實施例l)亞克隆到Cys-Display 載體pMORPH23中并按照標準程序生產(chǎn)VCSM 13來源的噬菌體。 -噬菌體一FabC(溶菌酶結合物，陰性對照) -噬菌體-Fab—B_(ICAM結合物，未內(nèi)化對照) -噬菌體—Fab-AJ抗原A，內(nèi)化)
-各使用ixiow個噬菌體
剝離
-pH 8.0的處于10nM Tris/HCl中的20mM DTT， Roche目錄號 1583786
抗體
-抗M13的mab: Amersham Biosciences, 27-9420-01 ， 1 mg/ml， 在FACS緩沖液FB (PBS/3% FCS)中稀釋為1 |ig/ml
-羊抗鼠IgG Fc 7片段特異性PE， Jackson Dianova， 115-116-071 ， R14，以1:200稀釋在FACS緩沖液(PBS/3。/。 FCS)中
細胞
-NCIH226:肺癌細胞 -1乂105個細胞/測試 其它材料
-10%的皂苷將1 g皂苷溶解于10ml的PBS中，0.5。/。皂苷/PBS -4%PFA:將16%的儲備溶液以1:4稀釋在PBS中。儲備溶液 16% (重量/體積)AlphaAesar，LotE10S015 -FACS緩沖液(FB): PBS/3% FCS
-羊抗鼠IgG Fc y片段特異性PE, Jackson Dianova, 115-116-07， R14,以1:200稀釋在FACS緩沖液(PBS/3。/。FCS)中 程序
1.向FACS緩沖液中的5X1()4個NCI H226細胞的沉淀加入1 Xl(T個噬菌體并在4'C溫育1小時。使用400^1的FACS緩沖液洗 滌細胞2次，離心(2000 rpm)并重懸于600pl培養(yǎng)基中。
對于未內(nèi)化狀況(4'C):2. 將2xl00pl轉(zhuǎn)移到96孔板中并于4'C溫育1小時，進而在冰 上溫育5分鐘。
3. 以20(Hd的FACS緩沖液洗滌細胞2次；200rpm。
4. 重懸于200nl的FACS緩沖液，并在2000rpm離心2分鐘
5. 將一個對照等分試樣重懸于100pl的DDT中，另一個重懸于 50|al的DDT中。
6. 將細胞在冰上存放5分鐘并以下述方式洗滌2次200^1的 FACS緩沖液和1200rpm。
7. 將細胞重懸于50|il的抗Ml3抗體(5嗎/ml的FACS緩沖液)中。 S.將細胞在4"C溫育45分鐘。
9. 將細胞用200^1 FACS緩沖液洗滌2次。
10. 將細胞重懸于100^1的羊抗鼠IgG Fc Y片段特異性PE中 (1:100)。
11. 以200^1FACS緩沖液洗滌細胞2次。
12. 在BD FACSARRAY FSC 10; SSC335; Yellow 330上進行 FACS的測定。
對于內(nèi)化狀況(37'C):
13. 將2xl00W轉(zhuǎn)移到96孔板中并于37X:溫育1小時，進而在 冰上溫育5分鐘。
14. 以200[il的FACS緩沖液洗滌細胞2次；200rpm。
15. 重懸于200iil的FACS緩沖液中，并在2000rpm離心2分鐘
16. 將一個對照等分試樣重懸于100(il的DDT中，另一個重懸 于50(il的DDT中。
17. 將細胞在冰上存放5分鐘并以下述方式洗滌2次200(^1的 FACS緩沖液和1200rpm。
18. 將細胞重懸于50)il的抗M13抗體(5pg/ml的FACS緩沖液)中。
19. 將細胞在4。C溫育45分鐘。
20. 將細胞用200|il FACS緩沖液洗滌2次。
21. 將細胞重懸于lOOpl的羊抗鼠IgG Fc y片段特異性PE中(1:100)。
22. 以200filFACS緩沖液洗滌細胞2次。
23. 在BD FACSARRAY FSC 10; SSC335; Yellow 330上進行 FACS的測定。
結果
在本實驗的條件(具有/不具有DTT， 4匸或37'C)下，細胞保持完 好。如所預期的，未能檢測到攜帶FabC的噬菌體的細胞結合。
如圖2所示，當溫度由4。C升高至37。C時，約65。/。的噬菌體A 和20%的噬菌體B被內(nèi)化。
通過在4°C以20mM的DTT處理5分鐘可以有效剝離細胞表面 上的噬菌體，且不影響細胞完整性。
內(nèi)化時DTT的加入剝離了表面結合的噬菌體，同時使已內(nèi)化的 噬菌體保持完好從而使得可以富集與內(nèi)化靶標結合的噬菌體。
權利要求
1.一種回收內(nèi)化到細胞中的復合體的編碼結合部分的核酸分子的方法，所述方法包括如下步驟(a)使細胞與噬菌體顆粒的多樣性集合接觸，其中，每個或基本上所有的所述噬菌體顆粒均在其表面上展示結合部分，其中所述結合部分被展示為具有所述噬菌體顆粒的噬菌體衣殼蛋白的非融合的(多)肽并且其中每個或基本上所有的所述噬菌體顆粒均包含編碼所展示的結合部分的核酸分子，(b)使所述噬菌體顆粒上展示的所述結合部分與其靶標結合，從而使得形成至少一種復合體，所述復合體中每一種均包含帶有其所展示的結合部分的噬菌體顆粒和其靶標，(c)在能夠使至少一種所述復合體內(nèi)化到細胞中的條件下培養(yǎng)所述細胞，(d)在基本上不發(fā)生細胞裂解的條件下洗脫未內(nèi)化的所述編碼結合部分的核酸分子，(e)使包含內(nèi)化復合體的所述細胞裂解，和(f)從裂解的細胞中回收源自至少一種的內(nèi)化復合體的所述編碼結合部分的核酸分子。
2. 如權利要求1所述的方法，所述方法進一步包括確定所述內(nèi)化復 合體的靶標的序列的步驟。
3. 如權利要求1所述的方法，其中，所述展示為非融合的(多)肽的 特征是所述噬菌體衣殼蛋白與所述結合部分之間的非肽鍵。
4. 如權利要求3所述的方法，其中，所述非肽鍵為二硫鍵。
5. 如權利要求4所述的方法，其中，所述二硫鍵生成于所述噬菌體 衣殼蛋白中所包含的第一半胱氨酸殘基與所述結合部分中所包含的第二 半胱氨酸殘基之間。
6. 如權利要求4或5所述的方法，其中，所述洗脫未內(nèi)化的所述編 碼結合部分的核酸分子的步驟是在使所述二硫鍵斷裂的還原性條件下進行的。
7. 如權利要求1 6中任一項所述的方法，其中，所述從裂解的細胞中回收所述編碼結合部分的核酸分子通過PCR實現(xiàn)。
8. 如權利要求2所述的方法，其中，所述確定所述內(nèi)化復合體的靶 標的序列的步驟通過質(zhì)譜實現(xiàn)。
9. 能夠通過權利要求1 8中任一項所述的方法而獲得的靶標和/或 結合部分。
10. —種向細胞中輸送有毒物質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟(a) 獲得由權利要求1所述的回收的核酸分子編碼的(多)肽，(b) 將所述有毒物質(zhì)與由權利要求1所述的回收的核酸編碼的所述(多) 肽結合，和(c) 對細胞施用從步驟(b)得到的有毒物質(zhì)，從而觸發(fā)所述有毒物質(zhì)向 細胞內(nèi)的內(nèi)化。
全文摘要
通過以下方式能夠有效地鑒定內(nèi)化到細胞內(nèi)的靶標(和與其特異性結合的結合部分)將編碼所述結合部分的遺傳物質(zhì)與編碼結合到未內(nèi)化的靶標的結合部分的遺傳物質(zhì)分離(或基本分離)。這能夠通過采用結合部分的展示文庫來實現(xiàn)，所述結合部分經(jīng)由非融合蛋白的形式而具有基因型/表型關聯(lián)，從而能夠在不裂解所述細胞的情況下將編碼未內(nèi)化的靶標的遺傳物質(zhì)分離(或基本分離)。隨后能夠?qū)?nèi)化的遺傳物質(zhì)分離并擴增。
文檔編號C12N15/10GK101558156SQ200780045995
公開日2009年10月14日 申請日期2007年12月12日 優(yōu)先權日2006年12月12日
發(fā)明者馬庫斯·恩岑貝格爾 申請人:莫佛塞斯公司