專利名稱：：經(jīng)修飾的藍(lán)細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域。在某些方面，本發(fā)明涉及具有被過量表達(dá)的、被下調(diào)的、被導(dǎo)入的、被缺失的或被修飾的目的基因以產(chǎn)生期望的產(chǎn)物的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌。期望的產(chǎn)物可加工成生物燃料、生物塑料、動(dòng)物詞料添加劑、營養(yǎng)品(nutraceutical)、食品添加劑、肥料等。
背景技術(shù)：
：目前世界面臨的兩大挑戰(zhàn)，一是二氧化碳不斷污染環(huán)境造成全球變曖，二是世界的自然能源如化石燃料日益被消耗。存在著這樣一個(gè)很成問題的循環(huán)，即化石燃料消耗的增加與二氧化碳空氣污染的增加相關(guān)聯(lián)。例如，己估計(jì)到美國每年因燃燒化石燃料產(chǎn)生17億噸的二氧化碳(參見美國2002/0072109號(hào)出版物)。這與全球每年因消耗化石燃料產(chǎn)生70-80億噸的二氧化碳相比還是小巫見大巫(Marland等人，2006)。二氧化碳空氣污染的增加會(huì)導(dǎo)致全球變暖的增加，進(jìn)而會(huì)增加諸如洪水、干旱、熱浪、颶風(fēng)、龍巻風(fēng)等的極端天氣事件的發(fā)生頻率和強(qiáng)度。全球變暖的其他后果可包括農(nóng)業(yè)收成的改變、物種的滅絕、疾病媒介物種類的增加。已提出了二氧化碳整治(remediation)方法。例如，美國2002/0072109號(hào)出版物公開了原位生物固定系統(tǒng)(biologicalsequestrationsystem),該系統(tǒng)能降低以化石燃料為動(dòng)力的發(fā)電機(jī)組的排放物中的含碳化合物的濃度。該系統(tǒng)使用光合作用微生物如藻類和藍(lán)細(xì)菌，這些微生物附著于布置在密封箱(containmentchamber)中的被太陽光子照射的生長表面。藍(lán)細(xì)菌會(huì)吸收和利用以化石燃料為動(dòng)力的發(fā)電機(jī)組所產(chǎn)生的二氧化碳。就第二個(gè)挑戰(zhàn)來說，全球能源需要持續(xù)增加，這對非可再生的化石燃料能源供應(yīng)提出了更高的需求。最近已開發(fā)處替代能源。例如，目前正在種植諸如玉米、大豆、亞麻籽、油菜籽、甘蔗和棕櫚油的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，以用于生產(chǎn)生物燃料。各種產(chǎn)業(yè)如農(nóng)業(yè)、住宅業(yè)和林業(yè)產(chǎn)生的可生物降解副產(chǎn)物也可用來生產(chǎn)生物能源。例如，稻草、木材、牲畜糞、稻米、殼皮、污水、生物可降解廢物和食品殘余物可通過厭氧消化轉(zhuǎn)化成生物氣。但是，植物因?yàn)樵谝荒戤?dāng)屮在C02擴(kuò)散和固定、生長季節(jié)和太陽能收集方面的限制，光能向生物質(zhì)和生物燃料轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)率低。更高的太陽能轉(zhuǎn)化效率是通過藻類和藍(lán)細(xì)菌來實(shí)現(xiàn)。使用生物生產(chǎn)乙醇的方法也已有描述。例如，Muller等人的4,242,455號(hào)美國專利描述了一個(gè)連續(xù)工藝，該工藝是用強(qiáng)無機(jī)酸對諸如淀粉顆粒和/或纖維素碎片、纖維等的碳水化合物高分子顆粒的含水漿液進(jìn)行酸化，以形成可發(fā)酵糖。可發(fā)酵糖然后用酵母菌屬CSacc/wra"y;c^)的至少兩個(gè)菌株發(fā)酵生成乙醇。Chibata等人的4,350,765號(hào)美國專利描述了通過使用間定化的酵母菌屬或發(fā)酵單胞菌屬(Z7mo附OM",力細(xì)菌和含有可發(fā)酵糖的營養(yǎng)培養(yǎng)肉湯來生產(chǎn)高濃度乙醇的方法。Arcuri等人的4,413,058號(hào)美國專利描述了用來生產(chǎn)乙醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z;wwo"aywo6/fo)菌株，生產(chǎn)方法是將該菌株放在連續(xù)反應(yīng)柱中，并使含水糖液流流過該柱。Hartley等人的PCT中請WO/88/09379描述了兼性厭氧嗜熱細(xì)菌菌株的用途，所述菌株能通過發(fā)酵包括纖維二糖和戊糖在內(nèi)的多種糖類生產(chǎn)乙醇。這些細(xì)菌菌株在乳酸脫氫酶中含有突變。因此，這些在厭氧條件下通常產(chǎn)生乳酸的臠株改為生產(chǎn)乙醇。美國2002/0042111號(hào)出版物公開了可用來生產(chǎn)乙醇的經(jīng)遺傳修飾的藍(lán)細(xì)菌。該藍(lán)細(xì)菌包括這樣的構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含獲自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌質(zhì)粒pL01295的編碼丙酮酸脫羧酶(p&)和醇脫氫酶(at/;0的DNA片段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過提供經(jīng)修飾以引入、缺失和/或改變目的基因的序列或表達(dá)水T從而提高期望產(chǎn)物的產(chǎn)量的光能自養(yǎng)細(xì)菌，克服了本領(lǐng)域的不足。期望的產(chǎn)物可加工成幾種有用的產(chǎn)品，如生物燃料、生物塑料、動(dòng)物飼料添加劑、貴重色素或抗氧化劑、或者有機(jī)肥料。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌包含一個(gè)或多個(gè)其表達(dá)己被改變和/或其基因產(chǎn)物功能己被改變的目的基因，改變的結(jié)果是導(dǎo)致該細(xì)菌中的一種或多種選自由脂肪酸、脂質(zhì)類胡蘿卜素、其他類異戊二烯、碳水化合物、蛋白質(zhì)、生物氣或它們的組合所構(gòu)成的群組的產(chǎn)物的產(chǎn)量，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌屮的所述一種或多種產(chǎn)物的量而言得到了增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將多個(gè)改變導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)基因中，其中所述多個(gè)改變共同增加期望的產(chǎn)物的產(chǎn)量。經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌可以是能吸收和固定二氧化碳的類型。在某些方面，經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能fi養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳吸收和固定量而言，其二氧化碳吸收和固定量得到了增加?？蓪δ康幕虻谋磉_(dá)加以改變，以造成該基因被上調(diào)或下調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過改變內(nèi)源基因、缺失內(nèi)源基因或修飾內(nèi)源基因的控制序列來改變表達(dá)。在又一個(gè)實(shí)施方案屮，可通過將一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因序列添加到一個(gè)或多個(gè)未經(jīng)修飾的基因中，來改變目的基因的表達(dá)。本說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語"天然光能自養(yǎng)細(xì)菌"，指在自然界中存在的、不具有按木發(fā)明公開的方式發(fā)生改變的基因功能的光能s養(yǎng)細(xì)菌。但是，當(dāng)然可以通過獲得之前已作改變以增加期望產(chǎn)物的產(chǎn)量的細(xì)菌，來實(shí)施本發(fā)明。這些之前的改變可包括對該細(xì)菌作出的任何操作。本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌可以是最初作出改變的細(xì)菌，或者可以是任何一代的后代，只要該能導(dǎo)致這樣的結(jié)果的改變被傳遞到后代，所述結(jié)果是該細(xì)菌中的一種或多種期望的產(chǎn)物的產(chǎn)量，相對于其巾所述一個(gè)或多個(gè)冃的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌中的所述一種或多種產(chǎn)物的量而言，得到了增加?？捎糜诒景l(fā)明的情形的光能自養(yǎng)細(xì)菌的非限制性實(shí)例，包括藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、螺桿菌(heliobacteria)、光合酸桿菌(photosyntheticacidobacteria)、紫色硫細(xì)菌或紫色非硫細(xì)菌。在某些方面，經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌。藍(lán)細(xì)菌可以是屬于色球藻目(C7zraococca/e力、念珠藻目(jVaWoca/^)、顫藻目(ara〃atoha/^)、寬球藻目(尸/ewracap似/w)、原綠藻目(iVoc/2/ora//^w)或真枝藻目(S/'gcwe/wato/e^o色球藻目可包括選自由v4//wwra/w"(隱球藻屬)、J/^朋f涵ece(隱桿藻屬)、C72(2州"w)/2o"(管孢藻屬)、C7/raococ""'(色球藻屬)、Crac(w'/7/^era、藍(lán)細(xì)菌、C，"o/^w、藍(lán)絲菌屬(Qy朋W/^ce)、藍(lán)纖維藻屬(Da外/ococcci戸',sO、G76^o/"citer(粘桿菌屬)、G7oeoc竿ra(粘球藻屬)、G/oeoAece(粘桿藻屬)、五w/cr/oif/7ece、//Gf/o/e"、J(9/w朋e's'/)a77〃'幼'a、Mera腳/Wa(平裂藻屬)、M/cra，to'(微囊藻屬)、(棒條藻屬)、S少"ec/wacciw(聚球藻屬)、Sy^c/wc，to(集胞藻屬)和嗜熱聚球藻屬(T/^rwa^"ec/wcoca^)構(gòu)成的群組的藻種(species)。念珠藻目可包括選自由CWeoifesw/'mw、Fre附;^〃a、Af/crac/we/e(，敦毛藻屬)、7&t/'o、S/7,.n'n^to、7'o/_y/7c^///lx:(單歧藻屬)、ylwa6"eM"(魚腥藻屬)、J""Z)"e脂/ms'(項(xiàng)圈藻屬)、J;/2纖.zo膨wow(束絲藻屬)、*/as*/ra(管鏈藻屬)、C卿，zra、Qy""(ims/7er脂/9^(柱胞藻屬)、Cy"dmv/^附應(yīng)(筒孢藻屬)、AWw/譜.a(節(jié)球藻屬)、M)'Woc(念珠藻屬)、i/c/e/,a(植生藻屬)、G7/W/nx(眉藻屬)、G/o"W〃c//a(膠刺藻屬)和&j^o"e"7fl(偽枝藻屬)構(gòu)成的群組的藻種。顫藻目可包括選自由爿W/^as/^ra(節(jié)螺藻屬)、Ge/77emewo、Ha/朋"'crawemfl、//a/ay/z>7//z>7a(鹽蟲累方定》菓屬)、A^tog"少附e"e、丄epfc((ywg^vfl(，夷革肖i纟藻-屬)、、湖生藍(lán)絲藻屬(丄/附"W/^/x)、Aywg"(鞘絲藻屬)、A^craa/oM'(微鞘藻屬)、Ov"〃ato"'a(顫藻屬)、尸/onm'(i,ww(席藻屬)、P/awAt6^n'cw(^,s'(擬浮絲藻屬)、P/a""W/m'x(浮絲藻屬)、尸/e"owewa(織線藻屬)、L/附朋Z/2ra:(湖生藍(lán)絲藻屬)、尸A'ei^awW"朋a(假魚腥藻屬)、Sc/HzW/^/;c(裂須藻屬)、Sp/nJ/力fl(螺方定藻屬)、^Sy附/7/oca(束f菓屬)、7>/c//o<i&s'w/ww(束毛藻屬)禾口7>c//o""wfir構(gòu)成的群組的藻種。寬球藻目可包括選自由O/raococcwf/o/ww'(擬色球藻屬)、Z)enwoc"r;"(皮果藻屬)、De/woca/7e〃a(小皮果藍(lán)細(xì)菌屬)、A《v義ararcwa(泰S囊藻屬)、P/e"raca戸a(寬球藻屬)、Sto"&n'a(斯塔尼爾氏菌屬)和Xewococcw,s'(異球藻屬)構(gòu)成的群組的藻種。原綠藻目可包括選自由PracWora"(原綠藻屬)、尸racWoracocc船(原綠球藻屬)和Prac//ora&ra:(原綠發(fā)藻屬)構(gòu)成的群組的藻種。真枝藻目可包括選自由0;w仍/ra(蒴鏈藻屬)、CMorag/o戸"'(擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬)、/^c/^e〃a(費(fèi)氏藻屬)、7f"戸/o^/7朋(軟管藻屬)、Mo^z'goda^戸:51、Moy"gocto(iMS(鞭枝藻屬)、M加cZ/，w(擬念珠藻屬)、5V/gcwe附cf(.真枝'/巢屬)、5yw//y^"e附G(聚線f巢屬)、S少附p/y^"e附(9/M'/,y、f/w"aybo和『e幼W/o/ww構(gòu)成的群組的藻種。在某些方時(shí)，藍(lán)細(xì)菌是集胞藻fS拜c/jo，tosp,)PCC6803或嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻(T/ew腐拜c/20cocowe/cwg油"')BP-I藻株。在其中目的基因被改變表達(dá)水平、被缺失或被導(dǎo)入的一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其屮所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的脂質(zhì)產(chǎn)量而由'，其一種或多種脂質(zhì)的產(chǎn)量得到了增加。經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌可被進(jìn)--步定義為，相對于其中所述-個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的脂質(zhì)含量而言，其脂質(zhì)含量得到了增加。脂質(zhì)含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100%或更大，或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)百分?jǐn)?shù)。此外，脂質(zhì)含量可占通過技術(shù)人員公知的方法計(jì)算出的該生物理論干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)百分?jǐn)?shù)?？杀贿^量表達(dá)和可導(dǎo)致脂質(zhì)產(chǎn)量或脂質(zhì)含量增加的目的基因，可包括質(zhì)體1中小泡誘導(dǎo)蛋白(vesicle-inducmgproteminplastids1，VIPPl)基因Cs'〃6^7)，類似的p,^4型基因sir1188，與對類囊體膜形成和組成重要的少WC和oxa/相似的*基因，乙酰-CoA羧化酶基肉O〃072S、sWWS5、禾nW/0W6)，轉(zhuǎn)乙酰酶基閑，脂肪酸生物合成基因力6D0/WW3)、(,W/川仰和s/W332)、/0/>(0/0朋0、/MZ('s'〃M05)和/^>/(*/05/)，編碼覆蓋與原纖或類囊體膜相關(guān)的疏水實(shí)體(hydrophobicentity)的蛋G質(zhì)的質(zhì)體球蛋「二|(plastoglobulin)/原纖蛋白基因0WW4和，s'〃756S)，去飽和酶基因，編碼1-200780046148.7?；视?3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶的W〃Wc9，或者磷脂甘油?；D(zhuǎn)移酶基因如WW0仰。膜的脂質(zhì)含量還可通過如下方式來提高通過能識(shí)別膜中的蛋白質(zhì)的蛋白酶(包括/"http://基因W〃463、WW"S、sW3卯和5/W6似，c/pi基因W/W56和s/廠7"7，c/p尸基因WW542、s朋534和Wr0765)的過量表達(dá)；和通過代謝丄程增加用于脂質(zhì)生產(chǎn)的固定碳(fixedcarbon)的量(例如通過W/MM、PEP羧化酶基因、W/似W、檸檬酸合酶基因的下調(diào)和/或參與貯藏化合物Cstoragecompound;)的合成的基因的缺失來增加，所述參與貯藏化合物的合成的基因包括參與糖原牛物合成的5/W776、參與聚羥基丁酸形成和代謝的's'WS""W0和參與藻青素形成和代謝的^2^//，W)。此外，生物所產(chǎn)生的脂質(zhì)的類型可通過引入如下基因來改變使y汕三酯得以形成的基因(如來自酵母(LR01)或擬南芥(TAG1)的二?；视王；D(zhuǎn)移酶)，或者能定性或定量改變糖酯、硫脂和磷脂的形成或脂肪酸飽和度的基因。集胞藻中的脂肪酸去飽和是通過DesA(Slrl350)、DesB(S111441)、DesC(S110541)和DesD(S110262)來催化，對相應(yīng)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，可調(diào)節(jié)脂肪酸去飽和水平，進(jìn)而調(diào)整細(xì)胞的溫度耐受性。參與途徑的調(diào)節(jié)或類囊體膜形成的調(diào)節(jié)的基因的差異表達(dá)，也會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)含量的增加或生物燃料值(biofuelvalue)的增加。在某勝實(shí)施方案中，目的基因包括集胞藻PCC6803的W廳6、虛71W〃柳、x歸氛*2歸、s艦〃、'*/47/、W〃柳、,*0，、,y譜24、*7，、*7<504、,W"56、,s膨仏s緒。'、*,5、W鵬3、*2亂s緒"、s〃/,、s/W33入*,6、W歸5、*術(shù)/、*〃76、、'W湖、*7,、W〃備、i甜9、i膽、*H's7W(W入s/r"50、W〃"/、W/65W、K^<52、"/0926、'"/似W和s〃05W。木領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在其他光能自養(yǎng)細(xì)菌中存在著這些基因的同源物(homologue)。這些同源物也可在那些菌(藻)種中進(jìn)行改變、引入或缺失。此外，可通過引入能使得可以迸行三?；视秃铣傻幕?，來對細(xì)胞中的脂質(zhì)的類型進(jìn)行修飾。三?；视瓦^量產(chǎn)生可導(dǎo)致細(xì)胞中合成出可進(jìn)行收獲和分離的脂質(zhì)小體。不囿于任何具體的理論，三?；ビ褪菑牧字?S111848產(chǎn)物)通過除去磷酸產(chǎn)生二?；视停缓笸ㄟ^二?；视王；D(zhuǎn)移酶加入另一個(gè)?；鶊F(tuán)而形成的。負(fù)責(zé)從磷脂酸除去磷酸的酶是可能由集胞藻中的17編碼的磷脂酸磷酸酶。這個(gè)基因可從高甘油三酯菌株(如混濁紅球菌(朋O^COCC船0戸C—)過量表達(dá)，從而過量表達(dá)磷脂酸磷酸酶。為形成甘油三酯，可引入來自酵母的丄^9/或來自其他體系的重要的二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶。丄WC^類似于真核生物中的卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶基因，能介導(dǎo)酵母指數(shù)生長過程中的甘油三酯合成的大部分。同源物存在于油料種子植物中，這個(gè)酶的酰基供體可為磷脂。另外，也口j'引入來自擬南芥(來自7MG7基因座的cDNA)的、很可能用乙酰-CoA作為?；w的二?；视鸵阴＾D(zhuǎn)移酶。這樣，集胞藻中的甘油三酯形成可得以最大化。在原核生物中，所產(chǎn)生的甘油三酯通常作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體貯藏，內(nèi)含體類似于植物油料種子中的油體，即被蛋A質(zhì)/磷脂單層包圍的脂質(zhì)小滴。它們是含少量(1-2%)磷脂和蛋白質(zhì)的基本上純的甘油三酯，在膜處形成。在其中目的基因被改變表達(dá)水平、被缺失或被導(dǎo)入的一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類胡蘿卜素或其他類異戊二烯的產(chǎn)量而言，其一種或多種類胡蘿卜素或其他類異戊二烯的產(chǎn)量得到了增加。經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌可被進(jìn)一歩定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類胡蘿卜素或其他類異戊二烯含量而言，其類胡蘿卜素或其他類異戊二烯含量得到了增加。類胡蘿卜素的非限制性實(shí)例包括P-胡蘿卜素、玉米黃素、藍(lán)溪藻黃素乙、myxol、海膽酮和它們的生物合成中間體。其他類異戊二烯的非限制性實(shí)例包括異戊二烯、生育酚和它們的生物合成中間體。類胡蘿卜素含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100%或更大白分?jǐn)?shù)，或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。此外，類胡蘿卜素含量可占通過技術(shù)人員公知的方法計(jì)算出的該生物理論干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。該生物中的任何其他類異戊二烯的含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100%或更大百分?jǐn)?shù)，或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。另外，一些在天然生物中可能不被產(chǎn)生的類異戊二烯可通過本文公開的方法在經(jīng)修飾的生物中產(chǎn)生。任何類異戊二烯的含量可占通過技術(shù)人員公知的方法計(jì)算出的該生物理論干重的l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。可進(jìn)行修飾和可導(dǎo)致類胡蘿卜素產(chǎn)量或類胡蘿卜素含量的表達(dá)發(fā)生改變的目的基因，可為能表達(dá)或調(diào)節(jié)作為類胡蘿卜素前體的C5化合物IPP和DMAPP的產(chǎn)生的基岡(例如集胞藻PCC6803的5WU必)；能表達(dá)或調(diào)節(jié)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶的產(chǎn)生的基因(例如集胞藻PCC6803的W〃55^);crtP基因(例如集胞藻PCC6803的s/W250;crtQ基因(例如集胞藻PCC6803的士0W。；crtD基因(例如集胞藻PCC6803的crtLd皿基因(例如集胞藻PCC6803的W/02W)和crtR基因(例如集胞藻PCC6803的《//WM)。為給集胞藻提供合成異戊二烯的潛力，目的基因可以是被導(dǎo)入集胞藻中置于強(qiáng)啟動(dòng)子下的來自植物如楊樹品種的異戊二烯合酶基因或其同源物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在其他光能自養(yǎng)細(xì)菌中存在著這些基因的同源物。這些同源物也可在那些菌C藻)種中進(jìn)行過量表達(dá)或改變。在其巾目的基因被改變表達(dá)水平、被缺失或被導(dǎo)入的一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其屮所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的碳水化合物產(chǎn)量而言，其-種或多種碳水化合物的產(chǎn)量得到了增加。經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌可被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的碳水化合物含量向'言，其碳水化合物含量得到了增加。該生物中的碳水化合物的含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100%或更大百分?jǐn)?shù)，或者在任何這些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。另外，一些在天然生物中可能不被產(chǎn)生的碳水化合物可通過本文公開的方法在經(jīng)修飾的生物屮產(chǎn)生。該生物中產(chǎn)生的碳水化合物中的任何一種或多種的含量，可單獨(dú)占或與其他碳水化合物共同占通過技術(shù)人員公知的方法計(jì)算出的該生物理論干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99。/?；蛘咴谌魏芜@些點(diǎn)之間可得出的任何范圍或整數(shù)的百分?jǐn)?shù)。碳水化合物的非限制性實(shí)例包括單糖和磷酸單糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、赤蘚糖-4-磷酸、景天庚酮糖二磷酸和果糖二磷酸)、二糖(例如蔗糖)、寡糖(例如果寡糖和甘露寡糖)和多糖(例如糖原及其衍牛物)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以以使得碳水化合物不能被轉(zhuǎn)化成糖原而是被轉(zhuǎn)化成聚乳酸(PLA)、聚-3-羥基丁酸(PHB)或別的聚羥基垸酸(PHA)或脂質(zhì)或其他生物燃料的方式，對糖原合成酶和糖原分支酶的基因進(jìn)行突變(例如插入或缺失)?；蛘?，基因可以是參與中心碳代謝的基因。在某些方面，目的基因與組成型啟動(dòng)子可操作地連接。組成型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括psbDII啟動(dòng)子、psbA3啟動(dòng)子和psbA2啟動(dòng)子。目的基因可與可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接。可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括啟動(dòng)子、^L46啟動(dòng)子、；e伍啟動(dòng)子、酷WS啟動(dòng)子、w&4議了Z)啟動(dòng)子和m偽F3啟動(dòng)子。可將多個(gè)基因?qū)胫糜谕粏?dòng)子的控制之下。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案公開了增加光能自養(yǎng)細(xì)菌的期望產(chǎn)物的產(chǎn)量的方法。所述方法可包括改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能，從而導(dǎo)致光能自養(yǎng)細(xì)菌屮一種或多種產(chǎn)物或者一個(gè)或多個(gè)目的基因的產(chǎn)量的增加，其中所述改變導(dǎo)致所述一種或多種產(chǎn)物的產(chǎn)量，相對于其中所述個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌所產(chǎn)生的所述產(chǎn)物的量而言，得到了增加。所述方法還可包括在合適的條件下生長光能自養(yǎng)細(xì)菌，以產(chǎn)生出其量得到增加的期望產(chǎn)物。這可包括對以下各方面的優(yōu)化溫度(包括溫度的時(shí)空變化)、氮水平(包括氮的具體化學(xué)組成，如硝酸鹽、亞硝酸鹽、有機(jī)胺、氨等)、二氧化碳水平、光強(qiáng)度、光暴露時(shí)間(或者更一般來說是光強(qiáng)度的時(shí)間調(diào)節(jié))、光波長(光強(qiáng)度的光譜調(diào)節(jié))、光分布(光強(qiáng)度的空間調(diào)節(jié))、磷水平、硫水平(包括不同形式的硫如有機(jī)硫、硫酸鹽等的具體水平)、礦物質(zhì)水平(包括每種單獨(dú)金屬如鐵、鎂、錳、鋅等的具體水平)、混合速度(包括依時(shí)間或位置進(jìn)行的混合調(diào)節(jié))、細(xì)菌密度(多快收獲細(xì)菌才能得到特定的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞密度)、營養(yǎng)物流入(碳、氮、硫、磷、礦物質(zhì)等)的速度和時(shí)間調(diào)節(jié)以及環(huán)境的對于細(xì)菌生長速度和組成重要的其他方面。光能自養(yǎng)細(xì)菌可以是能吸收和固定二氧化碳的類型。調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)水平和/或缺失天然基因和/或引入外來基因，能增加二氧化碳的吸收和固定，這個(gè)增加是相對于沒有改變目的基因農(nóng)達(dá)水平和/或缺失天然基因和/或引入外來基因的光能自養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳吸收和固定量而言。期望的產(chǎn)物可以是(但不限于)某種脂質(zhì)(或各種脂質(zhì)的混合物)、某種碳水化合物(或各種碳水化合物的混合物)、碳水化合物的糖成分、類胡蘿卜素(或各種類胡蘿卜素的混合物，例如|3-胡蘿卜素、玉米黃素、藍(lán)溪藻黃素乙、myxol、海膽酮和它們的生物合成中間體)、別的某種類異戊二烯(或各種類異戊二烯的混合物)、蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)的混合物)、蛋白質(zhì)的氨基酸成分或者貯藏產(chǎn)物藻青素(及相關(guān)化合物)。在蛋白質(zhì)的情況中，可產(chǎn)生出各種蛋白質(zhì)的特定混合物，該混合物用于動(dòng)物飼料、生產(chǎn)疫苗或其他有價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的目的來進(jìn)行優(yōu)化。還有，各種特定的蛋白質(zhì)如果它們會(huì)污染或降低期望產(chǎn)物的收率的話，可對它們在細(xì)胞中的水平進(jìn)行下調(diào)。所述方法還可包括將期望的產(chǎn)物加工成生物燃料。生物燃料的非限制性實(shí)例包括生物柴油、牛物醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)和牛物氣(氫氣、異戊二烯、甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)。在其他方面，所述方法可包括將期望的產(chǎn)物加工成生物塑料。生物塑料的非限制性實(shí)例包括聚乳酸(PLA)、聚-3-羥基丁酸(PHB)或聚-3-羥基烷酸(PHA)。期望的產(chǎn)物可加工成動(dòng)物飼料添加劑或者有機(jī)肥料。光能自養(yǎng)細(xì)菌的合適生長條件包括本說明書中描述的條件和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的條件。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的生長條件包括給該細(xì)菌提供二氧化碳源。二氧化碳源可有多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，來源獲自煙道氣。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二氧化碳源可以是大氣。合適生長條件可包括給該細(xì)菌提供固定氮源。固定氮源可有多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，來源獲自地下水、氨、硝酸鈉或硝酸銨。提供給光能自養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳的量可在O.Ol、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%或更大百分?jǐn)?shù)之間，其中y。指C02在提供給培養(yǎng)物的氣體中的分21壓。提供給光能自養(yǎng)細(xì)菌的同定氮的量可在培養(yǎng)基中在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mM或更大mM之間。合適生長條件可包括在如下溫度范圍生長細(xì)菌1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、80、90()C或更高溫度或者可從中得到的任何范圍或整數(shù)。在某些方面，溫度范圍是在10-55°C之間。合適生長條件還可包括使光能自養(yǎng)細(xì)菌暴露于光(例如日光)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括從光能自養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生期望的產(chǎn)物的方法。所述方法可包括獲得本發(fā)明的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌或者獲得通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能會(huì)導(dǎo)致光能自養(yǎng)細(xì)菌中的一種或多種產(chǎn)物或者一個(gè)或多個(gè)目的基因的產(chǎn)量的增加，從而導(dǎo)致期望產(chǎn)物的產(chǎn)量相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌所產(chǎn)生的期望產(chǎn)物的量而言得到了增加；在合適條件下生長該光能自養(yǎng)細(xì)菌以產(chǎn)生期望的產(chǎn)物；和分離期望的產(chǎn)物。光能自養(yǎng)細(xì)菌可以是能吸收和固定二氧化碳的類型。調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)水平和/或缺失天然基因和/或引入外來基因，能增加二氧化碳的吸收和固定，這個(gè)增加是相對于目的基因表達(dá)水平?jīng)]有被修飾和/或沒有攜帶天然基因的缺失和/或外來基因的引入的光能自養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳吸收和固定量而言。期望產(chǎn)物的非限制性實(shí)例包括脂質(zhì)、碳水化合物、類胡蘿卜素、其他類異戊二烯、色素、抗氧化劑、其他次級(jí)代謝物、蛋白質(zhì)或者它們的混合物。分離步驟的非限制性實(shí)例包括本說明書中描述的分離步驟和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的分離步驟。非限制性實(shí)例包括用有機(jī)溶劑提取、用無害化學(xué)品(例如C02或水)在超臨界條件下提取或者通過兩相分配提取。所述方法還可包括通過本說明書中描述的方法和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法將期望的產(chǎn)物加工成生物燃料、生物塑料、類胡蘿卜素、動(dòng)物飼料或肥料。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括同定二氧化碳的方法。所述方法可包括獲得本發(fā)明的能夠吸收和固定二氧化碳的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌或者獲得通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的能夠吸收和固定二氧化碳的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能會(huì)導(dǎo)致二氧化碳吸收和固定的增加，這個(gè)增加是相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳吸收和固定量而言；在合適條件下生長該光能自養(yǎng)細(xì)菌以吸收和固定二氧化碳；和給該經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌提供二氧化碳來源，其中該來源的至少一部分二氧化碳被該經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌固定。非限制性的二氧化碳來源可以是煙道氣、大氣C02或其他C02來源。所述方法還可包括固定煙道氣中的至少一部分二氧化碳?？梢岳斫獾氖?，本說明書討論的任何實(shí)施方案可用本發(fā)明的任何方法或組合物來實(shí)施，反之本發(fā)明的任何方法或組合物可在本說明書討論的任何實(shí)施方案中實(shí)施。此外，本發(fā)明的組合物可用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。權(quán)利要求書和/或說明書中宇.數(shù)形式的名詞的使用可意指"一個(gè)"，但也指"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)"和"一個(gè)或超過一個(gè)"的含義。權(quán)利要求書禾fV或說明書中出現(xiàn)的詞語"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"定義為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)(種)或更多個(gè)(種)。詞語"一種或多種產(chǎn)物"可以是單個(gè)類別中的多種產(chǎn)物(即兩種或更多種脂質(zhì)；兩種或更多種生物氣)，多個(gè)類別中的單種產(chǎn)物(即1種脂質(zhì)、1種脂肪酸、]種碳水化合物等)，或者它們的組合。例如涉及基因表達(dá)的術(shù)語"(被)改變(的)"包括任何類型的改變，所述任何類型的改變包括(a)表達(dá)的上調(diào)或下調(diào);(b)天然基因的改變(例如通過可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)建物等進(jìn)行的改變)；(c)內(nèi)源基因中的突變；通過轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建物(即轉(zhuǎn)基因)(在不同的生物中天然存在的，或者突變的)進(jìn)行的改變；(d)以上改變的組合；等等。在本申請中，術(shù)語"約"和"大約"表示某數(shù)值包括裝置、用以測定該數(shù)值的方法的固有誤差變化，或者研究對象當(dāng)中存在的變化。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，這兩個(gè)術(shù)語定義為10%內(nèi)，優(yōu)選5%內(nèi)，更優(yōu)選1%內(nèi)，最優(yōu)選0.5%內(nèi)。術(shù)語"或"在權(quán)利要求書中的使用是用來意指"和/或"，雖然本公開內(nèi)容對于指僅僅兩選項(xiàng)之一和"和/或"的定義是支持的，但是除非明確指出，僅僅是指兩選項(xiàng)(alternatives)之一或者說兩選項(xiàng)是互相排斥的。本說明書和權(quán)利要求書中使用的詞語"包含"(及其任何語法變體形式)、"具有"(及其任何語法變體形式)、"包括"(及其任何語法變體形式)或"含有"(及其任何語法變體形式)是包涵式的(inclusive)或幵放式的(open-ended),并不將另外的未述及的要素或方法步驟排除在外。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)由以下詳細(xì)說明將變得顯而易見。但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到，詳細(xì)說明和具體的實(shí)施例雖然指出了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但僅僅是以舉例說明的方式給出，因?yàn)楦鞣N落入本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的變化和修改由這個(gè)詳細(xì)說明將變得對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，納入這些附圖是旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。結(jié)合本文給出的具體實(shí)施方案的詳細(xì)說明參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖，可更好地理解本發(fā)明。圖1.糖磷酸標(biāo)準(zhǔn)品和集胞藻提取物的LC/MS。LC洗脫時(shí)間在X軸上，代表具體糖磷酸的糖磷酸質(zhì)量在Y軸上。Z軸表示MS信號(hào)的強(qiáng)度。A.濃度為20的糖磷酸標(biāo)準(zhǔn)品。B.對來自光能混合營養(yǎng)生長的(photomixotrophicallygrown)集胞藻野生型培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物的LC/MS，監(jiān)測具體糖磷酸的質(zhì)量。注意，有些中間體在提取物中以顯著濃度存在，而其他中間體則幾乎不可檢測。圖2.MS/MS驗(yàn)證LC/MS峰的實(shí)例。259m/z峰是在第一次MS后選擇，這個(gè)圖中顯示的信號(hào)是第二次MS后的97m/z(磷酸)信號(hào)的強(qiáng)度。LC洗脫時(shí)間在X軸上繪出。圖3.對光能混合營養(yǎng)生長的集胞藻培養(yǎng)物進(jìn)行130葡萄糖標(biāo)記時(shí)3-磷酸甘油酸(3PG)同位素體(isotopomer)的動(dòng)態(tài)分布。在時(shí)間0，加入0.5mM"C-葡萄糖。在不同的時(shí)間采集樣品，分析3PG(未標(biāo)記質(zhì)量(185)、質(zhì)量+1、質(zhì)量+2、質(zhì)量+3)的質(zhì)量分布。圖4.代謝物濃度對MS信號(hào)面積的校準(zhǔn)。向細(xì)胞提取物加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。提取物中相應(yīng)代謝物的濃度是與橫坐標(biāo)的截距(intersect)的絕對值。G6P:空心圓圈；3PG:實(shí)心圓圈；PEP:空心三角形。圖5.細(xì)胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)庫(po01)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)庫、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)庫和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)庫的同位素分布與加入標(biāo)記葡萄糖后在光能混合營養(yǎng)條件下的生長時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。在時(shí)間0，加入0.5mM"C-葡萄糖。各同位素體在X軸上按質(zhì)量分離(從左到右未標(biāo)記質(zhì)量、質(zhì)量+1、質(zhì)量+2等)。數(shù)據(jù)是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差分析顯示相對強(qiáng)度變化超過5%是顯著的。圖6.細(xì)胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)庫、磷酸甘油酸(3PG+2PG)庫、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)庫和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)庫的同位素分布與加入標(biāo)記碳酸氫鹽后在光能混合營養(yǎng)條件下的生長時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。在時(shí)間0，加入0.5mM未標(biāo)記葡萄糖和5mMNaH13C03。各同位素體在X軸上按質(zhì)量分離(從左到右未標(biāo)記質(zhì)量、質(zhì)量+1、質(zhì)量+2等)。數(shù)據(jù)是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差分析顯示相對強(qiáng)度變化超過5%是顯著的。圖7.細(xì)胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)庫、磷酸甘油酸(3PG+2PG)庫、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)庫和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)庫的同位素分布與25阿特拉津存在下在光能異養(yǎng)條件下的生長時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。在時(shí)間0，加入0.5mMBC-葡萄糖。各同位素體在X軸上按質(zhì)量分離(從左到右未標(biāo)記質(zhì)量、質(zhì)量+1、質(zhì)量+2等)。數(shù)據(jù)是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差分析顯示相對強(qiáng)度變化超過約5%是顯著的。圖8:野生型非分裂期(圖8A)和分裂期(圖8B)集胞藻PCC6803藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的透射電子顯微鏡照片。在這兩個(gè)時(shí)期，最外圍的一批類囊體膜對(白色無柄箭頭)匯聚在鄰近細(xì)胞質(zhì)膜的部位。標(biāo)出了羧酶體(黑色無柄箭頭)、PHA顆粒(星號(hào))、脂質(zhì)小體(白色有柄箭頭)和隔膜(黑色有柄箭頭)。圖8C-F是過量表達(dá)編碼涉及類囊體膜生物發(fā)生的蛋白質(zhì)的VTPP1基因的集胞藻PCC6803藍(lán)細(xì)菌突變株的電子顯微鏡照片。圖8C顯示類囊體膜的數(shù)量顯著增加，緊貼的各張膜(白色星號(hào))似乎脫離成單張類囊體薄片(白色有柄箭頭)。圖8D.圖8C的放大。圖8E顯示這一突變株所獨(dú)有的與類囊體膜(黑色無柄箭頭)緊密結(jié)合的薄層結(jié)構(gòu)(黑色星號(hào))的存在。圖8F.圖8E的放大。標(biāo)尺=200nm。圖9:用0.04%尼羅藍(lán)(圖9A)活體染色12小時(shí)后的集胞藻PCC6803細(xì)胞。各照片是用在488nm處激發(fā)和在560-620nm之間檢測的共聚焦激光掃描顯微鏡(圖9A-D)或用落射熒光顯微鏡(epi-fluorescentlightmicroscope)(圖9E-F)獲得的。圖9A.在標(biāo)準(zhǔn)BG-ll培養(yǎng)基中培養(yǎng)的處于對數(shù)期早期的野生型細(xì)胞。圖9B.在N限制培養(yǎng)基(1.67mM硝酸鹽)中培養(yǎng)的穩(wěn)定期野生型細(xì)胞。圖9C.在其中用10mMNH4Cl代替NaNO.;(16.7mM)的改良BG-ll培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對數(shù)期早期野生型細(xì)胞。圖9D.對數(shù)期中期的PS1I缺失/氧化酶缺失(PSIWess/oxidase-less)細(xì)胞。圖9E.對數(shù)期屮期的氧化酶缺失細(xì)胞。圖9F.對數(shù)期屮期的NDH-I缺失細(xì)胞。除了PSII缺失/氧化酶缺失的培養(yǎng)物外，所有的培養(yǎng)物都進(jìn)行光能自養(yǎng)生長。標(biāo)尺大小1jim。圖10.在光能自養(yǎng)條件下生長的處于對數(shù)期早期的集胞藻PCC6803各藻株的超微結(jié)構(gòu)，但PSn缺失/氧化酶缺失藻株的生長是個(gè)例外，在5mM葡萄糖存在下進(jìn)行光能混合營養(yǎng)生長。圖IOA.野生型；圖IOB.氧化酶缺失藻株；圖10C.PSII缺失/氧化酶缺失藻株；圖10D.N饑餓后的野牛型。較大的白色空間是山薄切片制備過程中洗出的PHA所致。標(biāo)尺大小200證。圖ii.從在光能混合營養(yǎng)條件下生長的psn缺失/氧化酶缺失藻株分離并通過GC/MS分析的全細(xì)胞甲醇分解產(chǎn)物(methanolysisproduct)(圖11A)。檢測到兩個(gè)主要的峰。峰1和峰2的GC/MS指紋分別在圖11B和C中顯示。峰1的質(zhì)譜碎片圖與PHB的甲醇分解產(chǎn)物即3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜碎片圖匹配(圖IIB)，而峰2的質(zhì)量譜圖提小了在長時(shí)間的甲醇分解作用后葡萄糖或糖原的可能降解產(chǎn)物即乙酰丙酸甲酯的形成(圖UC)。圖12.代表被擴(kuò)增的集胞藻基岡、occ6基肉、flccC基岡和accD基因的PCR產(chǎn)物，這些基因一起編碼ACC復(fù)合物。圖13.含有所有""基因的質(zhì)粒構(gòu)建物，其中側(cè)翼區(qū)是設(shè)計(jì)來插入到集胞藻基因組的/w/^2基因座中。旁邊的凝膠圖說明有多個(gè)轉(zhuǎn)化子攜帶期望的質(zhì)粒。26圖14.用來產(chǎn)生集胞藻的VTPP-I過量表達(dá)藻株的構(gòu)建物的質(zhì)粒圖。這個(gè)拷貝的VIPP-I基因被插入置于;^^43啟動(dòng)子之下。具體實(shí)施例方式如上所述，二氧化碳污染環(huán)境一直是個(gè)問題。全球因消耗化石燃料產(chǎn)牛的二氧化碳估計(jì)每年有70-80億噸(Marland等人，2006)。另外，統(tǒng)計(jì)顯示世界化石燃料資源的消耗日益增加。盡管目前有降低二氧化碳污染量和使用替代能源的方法存在，但這些方法往往費(fèi)用高和效率低。本申請人的發(fā)明克服了本領(lǐng)域當(dāng)前的不足。例如，本發(fā)明公開了光能自養(yǎng)細(xì)菌和使用這些細(xì)菌的相應(yīng)方法，這些細(xì)菌已經(jīng)過修飾，包括這樣的目的基因，即其序列或表達(dá)水平已被修飾，和/或已被缺失和/或已從外部來源導(dǎo)入，其中目的基因的序列或表達(dá)水平修飾或者導(dǎo)入或者缺失能增加期望的產(chǎn)物(例如脂質(zhì)、類胡蘿卜素、別的類異戊二烯如異戊二烯或生育酚、別的次級(jí)代謝物、碳水化合物、藻青素或蛋白質(zhì))的產(chǎn)量，所述增加是相對于不被修飾以改變目的基因的光能自養(yǎng)細(xì)臠中的期望產(chǎn)物的量而言。經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌可以是能吸收和固定二氧化碳的類型。在某些方面，改變目的基因的表達(dá)或序列或者缺失或引入目的基因還可增加一.氧化碳的吸收和固定，所述增加是相對于不被修飾以改變目的基因的光能自養(yǎng)細(xì)菌中的二氧化碳吸收和固定量而言。木發(fā)明的這些和其他的方面在以下各段節(jié)內(nèi)容中作更詳細(xì)的描述。A.光能自養(yǎng)細(xì)菌光能白養(yǎng)細(xì)菌包括能夠用光作為能源合成食物的細(xì)菌。光能白養(yǎng)細(xì)菌還能夠利用二氧化碳作為其主要碳源?？捎糜诒景l(fā)明的情形的光能自養(yǎng)細(xì)菌的非限制性實(shí)例，包括藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)—l萄、螺桿菌(heliobacteria)、光合酸桿菌(photosyntheticacidobacteria)、紫色硫l細(xì)菌或紫色非硫細(xì)菌。在具體的實(shí)施方案中，光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌。1.藍(lán)細(xì)菌一般來說，藍(lán)細(xì)菌可在世界上的幾種棲息地找到。例如，已在海洋、淡水、裸石和土壤中找到這類細(xì)菌。通常，藍(lán)細(xì)菌包括宇.細(xì)胞形式、菌落形式和絲狀形式。一些絲狀菌落顯小出分化成營養(yǎng)細(xì)胞和光合作用細(xì)胞的能力。在一些情況下，當(dāng)固定氮濃度低時(shí)，會(huì)有問氮酶的厚壁異形囊胞形成。能形成異形囊胞的菌種是為固氮而發(fā)生特化的，能夠?qū)⒌獨(dú)夤潭榘?NH3)、亞硝酸鹽(NOO或硝酸鹽(N03—)，這些物質(zhì)隨后可被轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)和核酸。藍(lán)細(xì)菌通常包括厚的革蘭氏染色陰性的細(xì)胞壁。對藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、構(gòu)造、功能和生物化學(xué)的研究已成為許多研究工作的主題。二十世紀(jì)六十年代初到八十年代的研究工作使人們認(rèn)識(shí)了許多藍(lán)細(xì)菌菌種的胞內(nèi)一般構(gòu)造，并鑒定出幾種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如捕光天線、藻膽蛋白體(Gantt和Conti1969;Edwards和Gantt1971;Bryant等人，1979)，多磷酸鹽小體、藻青素顆粒、聚羥基烷酸(PHA)顆粒(Jensen和Sicko1971)，羧酶體/多面體、脂質(zhì)小體、類囊體中心、含.DNA區(qū)域(Asato和Ginoza1973;Roberts和Koths1976)和核糖體(Ris和Singh1961)。例如，藍(lán)細(xì)菌包括高度組織化的內(nèi)膜系統(tǒng)，這些內(nèi)膜在光合作用中起作用。藍(lán)細(xì)菌中的光合作用通常用水作為電子供體，產(chǎn)生氧氣作為副產(chǎn)物。藍(lán)細(xì)菌能吸收二氧化碳并將它還原成碳水化合物、脂質(zhì)和其他含碳副產(chǎn)物。在大多數(shù)藍(lán)細(xì)菌中，光合作用機(jī)制(machinery)嵌入在內(nèi)膜系統(tǒng)(即類囊體膜)中。已知有超過一千種不同的藍(lán)細(xì)菌。例如，藍(lán)細(xì)菌可分類成至少以下各目色球藻目(O/raococca/M)、念珠藻目(Mx咖ca/t力、顫藻目((9,sc/〃她由/e,s')、寬球藻目(P/eMrac,ra/e,s')、原綠藻目或真枝藻目(幼g朋e歸to/w)。色球藻目的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括々/7fif"OC，'"(隱球藻屬)、^p/7""C^/^Cg(隱桿藻屬)、C7腦""7》/7朋(管孢藻屬)、CZ/raococcws(色球藻屬)、Cracav/toera、Qyawo^cfe〃'謂(藍(lán)細(xì)菌)、C，"oZ)/扁、藍(lán)絲菌屬(Cyanothece)、藍(lán)纖維藻屬(Dac(y/ococco戸'v)、G7oe66ac'ter(粘桿菌屬)、G7"eoo/;ira(粘5求藻屬)、G7(9W力e('e(粘桿藻屬)、iiW/a/of/2ece、H"(a/o血ce、Jo/(3朋e's力豐她(7、她〃:'彌o/W(2(平裂藻屬)、M/cra，to(微囊藻屬)、朋"M。(ier層(棒條藻屬)、S拜'c/20C(9ca^(聚球菌屬)、5y"ec/oc少,",',s'(集胞藻屬)禾口嗜熱聚球藻(772erwm;;wec/20Coca/,s')。念珠藻冃的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括Co/eo血s'聰ww、Fm"，〃a、M/cracZ/a她(微毛藻屬)、7axza、S/7,V/:A^to、7b/>/70//7r/;c(單歧藻屬)、/lwc^"e/M(魚月星藻屬)、JwaZ^ewo^^(項(xiàng)圈藻屬)、4f^""'zow^w"(束絲藻屬)、y4w/as'/ra28(管f連藻屬)、C>YOTOs//:ra、Cy/wt/raspe/TMO/wA(柱月包藻屬)、Cyz'/Wras7^〃m/附(筒孢藻屬)、M^/arw(節(jié)球藻屬)、(念珠藻屬)、化c/^/,a(植生藻屬)、C"/W/2m(眉藻屬)、G/oe^77c/2/:a(膠刺藻屬)和&J^"，a(偽枝藻屬)。顫藻目的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括^W/2m^,ra(節(jié)螺藻屬)、Ge"/e/7"e/w"、Z/(7/o777/cTowewa、//a/as//n//z>c7(j^蟲累方定藻屬)、火atog7i少wewe、^epto(y"g/)ya(瘦鞘絲藻屬)、丄wwo/Z/ra:(湖生藍(lán)絲藻屬)、丄，g/)少"(鞘絲藻屬)、Af/:craco/ds'(穩(wěn)女-鞘藻屬)、6^C/〃"A9^"C顫藻屬)、尸/2W7W'(i/:W,M(.席'藻iS)、尸/(37^/C^/7r/CO/:Jw(擬浮絲藻屬)、尸/aitoi^^r(浮絲藻屬)、尸/ecto"em"(織線藻屬)、/j"wW/w/jc(湖生藍(lán)絲藻屬)、fte^"w^ae""(假魚腥藻屬)、(裂須藻屬)、S/H>M//wa(螺方定藻屬)、Sjwp/oca(束藻屬)、JWc/0(ie,s7m力w(束毛藻屬)禾口7>c/("ewa。寬球藻目的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括C/zraococc;J/，,s7.s(擬色球藻屬)、Z)e/7wocOT7a(皮果藻屬)、De，ocw7e//a(小皮果藍(lán)細(xì)菌屬)、Mymvwc/"a(黏囊藻屬)、尸/ewraa2pra(寬球藻屬)、，l乂,y^次/^7,羼"/朋訂wJ和(異球藻屬)。構(gòu)成的群組的藻種。原綠藻目的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括PracWww2(原綠藻屬)、Prac/z/ora"xx雙s'(原綠球藻屬)和尸rac//ora^7Jc(原綠發(fā)藻屬)。真枝藻目的藍(lán)細(xì)菌屬的非限制性實(shí)例包括Q^TO^ra(蒴鏈藻屬)、CWoragtoe，,ra(擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬)、H's'c/m;〃a(費(fèi)氏藻屬)、//a尸o/(7沖/朋(軟管藻屬)、Ma'W'gw/a<io/,vz,s'、A/"幼goc7a^/5(鞭枝藻屬)、WaWoc/zo/w,;v(擬念珠藻屬)、5^,g朋e附"(真枝藻屬)、5yw/7/7^wew(3(聚線藻屬)、5^附//y/cwewo/ww、〖7wez<7&,a禾口ffeWe/Zo/w"'。本說明書中所確定的藍(lán)細(xì)菌菌種和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的藍(lán)細(xì)菌菌種，認(rèn)為可用于本發(fā)明的情形。以下兩段落僅以舉例方式提供了集胞藻PCC6803和嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻(r/jenwa^"ec/2ococa"^.)BP-I這兩種具體藍(lán)細(xì)菌菌種的詳細(xì)說明。2.集胞藻PCC6803集胞藻PCC6803是一種單細(xì)胞生物，它顯示出非常合乎需要的分子遺傳特性、生理特性和形態(tài)特性的獨(dú)特組合。例如，這個(gè)菌種能自發(fā)轉(zhuǎn)化，能通過雙同源重組將外來DNA并入其基因組中，能在許多不同的生理?xiàng)l件下生長(例如光能自養(yǎng)生長/光能混合營養(yǎng)生長/光能異養(yǎng)生長)，且相對較小(:直徑約1.5pm)(VandeMeene等人，2005，通過引用并入本文)。已對其完整基因組進(jìn)行了測序(Kaneko等人，1996)，且己發(fā)現(xiàn)了很高比例的在其他細(xì)菌菌群中沒有同源物的開放讀框。集胞藻PCC6803可獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，檢索號(hào)為ATCC27184(Rippka等人，1979，通過引用并入本文)。3.嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-1嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-I是一種單細(xì)胞嗜熱藍(lán)細(xì)菌，棲息在溫泉中，最適生長溫度大約為55。C(Nakamura等人，2002，通過引用并入本文)。這種細(xì)菌的完整基因組已被測序?；蚪M包括2,593,857個(gè)堿基對的環(huán)狀染色體。預(yù)測了總共2,475個(gè)潛在的蛋白質(zhì)編碼基閑、一組rRNA基閑，42個(gè)代表42種tRNA的tRNA基因和4個(gè)小結(jié)構(gòu)RNA的基因。B.目的基因在本發(fā)明的優(yōu)選方面，目的基因包括那些當(dāng)其序列或表達(dá)水平被改變時(shí)、當(dāng)被缺失時(shí)或者當(dāng)被導(dǎo)入時(shí)能夠增加該細(xì)菌中的期望產(chǎn)物(例如脂質(zhì)、別的燃料如氫或醇類、類胡蘿卜素、別的類異戊二烯如異戊二烯或生育酚、碳水化合物、藻青素或蛋白質(zhì))的產(chǎn)量的基因，所述增加是相對于在目的基因方面沒有被修飾的細(xì)菌中的期望產(chǎn)物的產(chǎn)量而言。在某些方面，目的基因當(dāng)其序列或表達(dá)水平被改變時(shí)、當(dāng)被缺失時(shí)或者當(dāng)被導(dǎo)入時(shí)還能增加二氧化碳的吸收和同定，所述增加是相對于在目的基因方面沒有被修飾的細(xì)菌中的二氧化碳吸收和固定量而言。在某些方面，目的基因包括那些當(dāng)其序列或表達(dá)水平被改變時(shí)、當(dāng)被缺失時(shí)或者當(dāng)被導(dǎo)入時(shí)，所述改變的表達(dá)水平、缺失或者導(dǎo)入能增加該細(xì)菌細(xì)胞中的脂質(zhì)的產(chǎn)量的基因。所述改變的表達(dá)水平、缺失或者導(dǎo)入能增加該細(xì)菌細(xì)胞中的脂質(zhì)含量。這種基因的非限制性實(shí)例包括質(zhì)體l中小泡誘導(dǎo)蛋白(VIPP1)基因0訓(xùn)6/7)，類似的/7,S7^4型基因sir1188，與對類囊體膜形成和組成重要的和oxo/相似的*"7/基因，乙酰-CoA羧化酶基岡O〃072S、，yWMS5、s//^53禾ns//033(5)，脂肪酸生物合成基肉力W)0〃7605)和/a/)/0/r川5/)，編碼覆蓋與原纖或類囊體膜相關(guān)的疏水實(shí)體的蛋白質(zhì)的質(zhì)體球蛋0/原纖蛋0基因(i川W和a'/〃5M)，編碼1-?；视?3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶的W〃SW，或者磷脂甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因如Wr，仰。膜的脂質(zhì)含量還可通過如下方式來提高通過能識(shí)別膜中的蛋白質(zhì)的蛋白酶(包括/fef/基因s〃"63、sW3卯和A'/rM似，c/pB基因WW"6和WrMW，c/pP基因WW5"/入W/05W和A'W/65)的過量表達(dá)；和通過代謝工程增加用于脂質(zhì)生產(chǎn)的固定碳的量(例如通過W/MW、PEP羧化酶基因、s〃似W、擰檬酸合酶基因的下調(diào)和/或參與貯藏化合物的合成的基因的缺失來增加，所述參與貯藏化合物的合成的基因包括參與糖原生物合成的s/W/7(5、參與聚羥基丁酸形成和代謝的，sWS29/MM和參與藻青素形成和代謝的W"M//2M2)。雖然以上指定是對于集胞藻而言，但在其他的藍(lán)細(xì)菌中存在著同源物，這些同源物被認(rèn)為可用于本發(fā)明的情形。在其他方面，可對目的基因進(jìn)行修飾，以顯示出細(xì)菌細(xì)胞中的類胡蘿卜素或其他類異戊二烯的水平發(fā)生改變。該修飾可增加細(xì)菌細(xì)胞的類胡蘿卜素或其他類異戊二烯的含量。類胡蘿卜素的非限制性實(shí)例包括(3-胡蘿卜素、玉米黃素、藍(lán)溪藻黃素乙、myxol、海膽酮和它們的生物合成中間體。其他類異戊二烯的非限制性實(shí)例包括異戊二烯、生會(huì)酚和它們的生物合成中間體。這種基因的非限制性實(shí)例包括能表達(dá)或調(diào)節(jié)作為類胡蘿卜素前體的C5化合物IPP和DMAPP的產(chǎn)生的基因(例如集胞藻PCC6803的.S/W34S;);能表達(dá)或調(diào)節(jié)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶的產(chǎn)生的基因(例如集胞藻PCC6803的W〃550;crtP基因(例如集胞藻PCC6803的,士/254);crtQ基因(例如集胞藻PCC6803的,sW^W);crtD基因(例如集胞藻PCC6803的s/W"3);crtL^x基因(例如集胞藻PCC6803的s〃OZW)和crtR基因(例如集胞藻PCC6803的5/〃46》。雖然上述指明是對于集胞藻而由'，但在其他的藍(lán)細(xì)菌中存在著同源物，這些同源物被認(rèn)為可用于本發(fā)明的情形。同樣，來自其他生物如植物的基因(例如異戊二烯合酶)也被認(rèn)為可用丁木發(fā)明的情形。在另外的方面，改變S的基因的序列或表達(dá)和/或缺失或者導(dǎo)入基因，能人大改變細(xì)l萄細(xì)胞中的碳水化合物產(chǎn)量和水平。所述基岡的改變的表達(dá)和/或缺失或者導(dǎo)入，能改變該細(xì)菌細(xì)胞的碳水化合物含量。這種基因包括那些當(dāng)過量表達(dá)時(shí)能改變該細(xì)菌細(xì)胞的碳水化合物產(chǎn)量或碳水化合物含量的基因，所述碳水化合物例如單糖和磷酸單糖(例如葡萄糖、果糖、木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景31天庚酮糖-7-磷酸、赤蘚糖-4-磷酸、景天庚酮糖二磷酸和果糖二磷酸)、二糖(例如蔗糖)、寡糖(例如果寡糖和甘露寡糖)和多糖(例如糖原及其衍生物)。這種基因的非限制性實(shí)例包括表達(dá)糖原合成酶的基因和表達(dá)糖原分支酶的基因。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以以使得碳水化合物被轉(zhuǎn)化成聚乳酸(PLA)、聚-3-羥基丁酸(PHB)、聚羥基烷酸(PHA)或脂質(zhì)而不是作為糖原被儲(chǔ)藏的方式，對糖原合成酶和糖原分支酶的基因進(jìn)行突變(例如插入或缺失)。技術(shù)人員會(huì)知道，本發(fā)明所描述的基因及其編碼的蛋白質(zhì)可在GenBank數(shù)據(jù)庫和CyanoBase數(shù)據(jù)庫獲得，這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫通過網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez禾口http:〃bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/進(jìn)行訪問。在本說明書中，描述了集胞藻PCC6803這種生物(藻株P(guān)CC6803)的各種基因，例如,s/WW7。這個(gè)術(shù)語例如'W/0677"是指各自毎個(gè)基因的替用別名(altematealias)或基因座標(biāo)簽(locustag),可用來通過上述數(shù)據(jù)庫獲得完全基因序列。例如，可將術(shù)語"^M77"結(jié)合術(shù)語"集胞藻PCC6803"在可通過上述NCBI網(wǎng)站訪問的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行查詢，以獲得基因信息和獲得完全基因序列的鏈接。有完全注解的集胞藻基因組，包括其開放讀框在內(nèi)，可通過上述CyanoBase網(wǎng)站訪問。這個(gè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員一點(diǎn)即通的。C.調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)本發(fā)明的實(shí)施方案包括用以調(diào)節(jié)本發(fā)明光能自養(yǎng)細(xì)菌當(dāng)中的某些目的基因的表達(dá)水平的方法和組合物。目的基因可被修飾其序列或表達(dá)水平，和/或被缺失和/或被從外部來源引入。這可導(dǎo)致相應(yīng)的期望基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或酶)的產(chǎn)生得到調(diào)節(jié)和/或與這種基因產(chǎn)物有關(guān)的途徑得到調(diào)節(jié)(例如增加或過量表達(dá)目的基因，以獲得其數(shù)量得到增加的相應(yīng)基因產(chǎn)物和/或與該基因產(chǎn)物有關(guān)的代謝途徑各成分)。本發(fā)明的實(shí)施方案可包括被引入到一個(gè)或多個(gè)基岡中的多個(gè)改變，其中所述多個(gè)改變共同增加期望產(chǎn)物的1.重組表達(dá)系統(tǒng)在某些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物和/或與該基因產(chǎn)物有關(guān)的代謝途徑各成分是用重組表達(dá)系統(tǒng)(例如本發(fā)明的重組光能自養(yǎng)細(xì)菌)來合成。通常，這涉及到將編碼期望基因產(chǎn)物的DNA(例如導(dǎo)致脂質(zhì)、碳水化合物、類胡蘿卜素或藻青素的形成)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)域的控制之下，和在本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌(即宿主)中表達(dá)表達(dá)蛋白質(zhì)，并且如果期望的話分離出被表達(dá)的基因產(chǎn)物或與該基因產(chǎn)物有關(guān)的途徑的產(chǎn)物。這使得基因所編碼的蛋白質(zhì)能夠以提高的數(shù)量被農(nóng)達(dá)。這可通過增加該基因在宿主中的拷貝數(shù)、增加宿主中的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合強(qiáng)度或者通過啟動(dòng)子置換來實(shí)現(xiàn)。艽他的基因改變機(jī)制包括減少基因表達(dá)、缺失基因、插入別的生物的基因或者改變其序列或調(diào)節(jié)蛋白。通常，會(huì)將基肉產(chǎn)物的DNA序列進(jìn)行克隆或亞克隆到含有啟動(dòng)子的載體(例如質(zhì)粒)中，然后將該載體轉(zhuǎn)化到該細(xì)菌中，導(dǎo)致適當(dāng)DNA區(qū)域的整合和造成該細(xì)菌表達(dá)該基因產(chǎn)物。還可將調(diào)節(jié)序列插入到本發(fā)明細(xì)菌的基因組中(例如被可操作地連接到(operativelycoupled)編碼目的基因產(chǎn)物的基因的異源調(diào)節(jié)序列)?；蛘?，可通過使宿主暴露于能通過剌激自然調(diào)節(jié)過程增加蛋白質(zhì)表達(dá)的特定條件或特定物質(zhì)，來刺激內(nèi)源啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)機(jī)制。常用的進(jìn)行藍(lán)細(xì)菌的基因/表達(dá)插入的方法，包括將構(gòu)建物通過雙同源重組整合到基因組中(參見例如Li等人，(1993);Williams(1998);Grigorieva等人,(1982)，通過引用并入本文)。在某些實(shí)施方案中，可采用雙同源重組，使用這樣的構(gòu)建物導(dǎo)入基因中斷(geneinterruption)或缺失，該構(gòu)建物中有兩個(gè)區(qū)域與藍(lán)細(xì)菌基因組有序列一致性。a.核酸采用本說明書提供的信息，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，制備出被本發(fā)明光能自養(yǎng)細(xì)菌過量表達(dá)的核酸。例如，可通過體外方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，對蛋白質(zhì)編碼核酸進(jìn)行克隆或擴(kuò)增。有多種克隆和體外擴(kuò)增方法為技術(shù)人員所熟知。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行體外擴(kuò)增方法的技術(shù)的實(shí)例，可在以下文獻(xiàn)中找到Berger、Sambrook禾BAusubel，以及4,683,202號(hào)美國專利；Innis(1990);TheJournalofNIHResearch(1991);Kwoh等人，(1989);Guatelli等人，(1990);Lomell等人，(1989);Laiidegren等人，(1988);VanBrunt(1990);Wu和Wallace,(1989);andBarringer等人(1990)。編碼本發(fā)明的期望產(chǎn)物的核酸，還可通過適當(dāng)序列的克隆和限制酶切(restriction)來制備，或者通過用諸如以下的方法進(jìn)行直接化學(xué)合成來制備Narang等人，(1979)的磷酸三酯方法；Brown等人,(1979)的磷酸二酯方法；Beaucage等人，(1981)的二乙基亞磷酰胺方法；和4,458,066號(hào)美國專利的固相載體方法。核酸可用DNA擴(kuò)增方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來克隆。因此，例如，用含有一個(gè)限制位點(diǎn)的正義引物和含有另一個(gè)限制位點(diǎn)的反義引物，對核酸序列或亞序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這會(huì)產(chǎn)牛出具有末端限制位點(diǎn)的、編碼期望序列或亞序列的核酸。然后容易地可將這個(gè)核酸連接到含有這樣的核酸的載體中，該核酸編碼第二分子且具有適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)限制位點(diǎn)。合適的PCR引物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用本文提供的序列信息和代表性引物進(jìn)行確定。適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)還可通過定點(diǎn)誘變加入到編碼期望的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞序列的核酸中。含有期望的序列或亞序列的質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶進(jìn)行切割，然后按標(biāo)準(zhǔn)的方法連接到編碼第二分子的載體中?；瘜W(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈的核酸。這可通過與互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交來轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA，或者通過以該單鏈為模板用DNA聚合酶進(jìn)行聚合來轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，DNA的化學(xué)合成是有限度的，更長的序列可通過將較短的各序列連接在一起來獲得?；蛘?，可克隆出亞序列并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶切割適當(dāng)?shù)膩喰蛄?。然后將各片段連接在一起產(chǎn)生期望的DNA序列。b.載體術(shù)語"載體"用以指這樣的攜帶核酸分子，其中可插入核酸序列以便導(dǎo)入到木發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌中，在該光能6養(yǎng)細(xì)菌中該核酸序列可被整合到基因組中、被復(fù)制和/或被過量表達(dá)。核酸序列可以是"外源的(exogenous)",意思是該序列對于導(dǎo)入載體的細(xì)菌來說是外來的，或者是該序列與該細(xì)臠中的某序列同源，但它在該細(xì)菌細(xì)胞核酸當(dāng)中所處的位置是通常不存在它的位置。載體包括質(zhì)粒、黏粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如YACs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)有良好的裝備來通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)構(gòu)建載體(參見例如Maniatis等人，1989和Ausubel等人,1994，兩篇文獻(xiàn)都通過引用并入本文)。術(shù)語"表達(dá)載體"指任何類型的包含編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸的遺傳構(gòu)建物。在一些情況中，RNA分子任何可被翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其他情況中，這些序列不被翻譯，例如在反義分子或核酶的生產(chǎn)中。表達(dá)載體可含有多個(gè)"控制序列"，控制序列是指被可操作地連接的(operablylinked)編碼序列在特定細(xì)菌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄所必需和可能還有翻譯所必需的核酸序列。除了支配轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列外，載體和表達(dá)載體也可含有還起到其他功能的核酸序列，這些核酸序列在下文進(jìn)行描述。如上所述，可將編碼要表達(dá)的期望產(chǎn)物的核酸與每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的適當(dāng)表達(dá)控制序列可操作地連接。這可包括調(diào)節(jié)序列如本說明書中描述的那些調(diào)節(jié)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。Z.靜顏本發(fā)明重組光能自養(yǎng)細(xì)菌的設(shè)計(jì)會(huì)決定于諸如所要轉(zhuǎn)染的細(xì)菌和/或所要表達(dá)的具體蛋白質(zhì)的選擇的因素。適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的使用可使得多肽在木發(fā)明的多種宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平得到改變。調(diào)節(jié)序列是木領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如Goeddel(1990);Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif;Sambrook等人，(1989))。例如，可將期望產(chǎn)物的基因與組成型啟動(dòng)子可操作地連接，以進(jìn)行高水平、連續(xù)表達(dá)。或者，可采用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和/或組織特異性啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明情形的這種啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例，包括諸如戸W/啟動(dòng)子、/wZ)vO啟動(dòng)子和p似2啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子。例如Lagarde等人，(2000)提供了有關(guān)在集胞藻PCC6803藻株中使用"^42啟動(dòng)子來過量表達(dá)參與類胡蘿卜素生物合成的基因的詳細(xì)描述，在He等人，(1999)中有關(guān)于使用啟動(dòng)子的詳細(xì)描述。這些參考文獻(xiàn)中的信息通過引用并入本文。可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括"z'M啟動(dòng)子、/,s'L4B啟動(dòng)子、pe壓啟動(dòng)子、wraA4CD啟動(dòng)子、"nv46啟動(dòng)子和wW7^啟動(dòng)子(參見Aichi等人，(2001);Vinnemeier等人，(1998);Zhang等人(1994);Lopez-Maury等人，(2002);McGi皿等人，(2003)，這些文獻(xiàn)都通過引用并入本文)。"啟動(dòng)子"是這樣的控制序列，它是核酸序列中的某個(gè)區(qū)域，在該區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始和速度得到控制。它可含有這樣的遺傳兀件，即調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)和35分子如RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子會(huì)在這些遺傳元件處進(jìn)行結(jié)合，以引發(fā)核酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。詞語"可操作地定位(operative]ypositioned)"、"可操作地連接(operativelylinked)"、"置于(在)……控制下"和"置于(在)......轉(zhuǎn)錄控制下"意指啟動(dòng)子相對于核酸序列處在正確的功能位置和/或方向，以控制該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或農(nóng)達(dá)。啟動(dòng)子通常包含起到定位RNA合成的起始位點(diǎn)的作用的序列。另外的啟動(dòng)子元件能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率。通常，這些元件位于起始位點(diǎn)上游最多100bp的區(qū)域，不過有許多啟動(dòng)子己證實(shí)在起始位點(diǎn)下游也含有功能元件。為使編碼序列"置于啟動(dòng)子的控制下"，將轉(zhuǎn)錄讀框的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5'末端定位在選定啟動(dòng)子的"下游"(即選定啟動(dòng)子的3'端)。該"上游"啟動(dòng)子會(huì)刺激DNA的轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)被編碼的RNA的表達(dá)。各啟動(dòng)子元件之間的間距常常是靈活的，使得當(dāng)各元件發(fā)生倒轉(zhuǎn)或者發(fā)生相對移動(dòng)時(shí)啟動(dòng)子功能可得到保持。視啟動(dòng)子而定，似乎各個(gè)啟動(dòng)子能協(xié)同地或獨(dú)立地起到激活轉(zhuǎn)錄的作用。啟動(dòng)子可以或可不與"增強(qiáng)子"協(xié)同使用，增強(qiáng)子是指參與核酸序列的轉(zhuǎn)錄激活的順式作用調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子可以是天然伴隨核酸序列的啟動(dòng)子，這可通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5'非編碼序列來獲得。這種啟動(dòng)子可稱為是"內(nèi)源的"。同樣，增強(qiáng)子可以是天然伴隨核酸序列的增強(qiáng)子，位于該序列的下游或上游?；蛘?，通過將編碼核酸區(qū)段置于重組或異源啟動(dòng)子的控制下，會(huì)獲得某些優(yōu)點(diǎn)，重組或異源啟動(dòng)子是指通常不伴隨其自然環(huán)境屮的核酸序列的啟動(dòng)子。同樣，重組或異源增強(qiáng)子、操縱基因(operator)或其他調(diào)節(jié)序列是指通常不伴隨其自然環(huán)境中的核酸序列的增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列。這種啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列可包括其他基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列，從任何其他病毒或者原核細(xì)胞或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列，和"不天然存在的"即含有另外轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的另外元件和/或能改變表達(dá)的突變的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列。當(dāng)然，重要的是應(yīng)用能有效指導(dǎo)DNA區(qū)段在本發(fā)明光能自養(yǎng)細(xì)菌巾的表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列。分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員一般都知道啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因或其他調(diào)節(jié)序列用于蛋白質(zhì)表達(dá)的用途(參見例如Sambrook等人，2001)。所應(yīng)用的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子、條件特異性啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，和/或在適當(dāng)條件下可用于指導(dǎo)所引入DNA區(qū)段的改變的表達(dá)(alteredexpression),象這樣在期望的產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)中是有利的。啟動(dòng)子可以是異源啟動(dòng)子或內(nèi)源啟動(dòng)子。仏志糸/f專編碼序列的有效翻譯可能需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG或GTG起始密碼子和鄰近序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)?？赡苄枰峁┩庠捶g控制信號(hào)，包括ATG或GTG起始密碼子和鄰近序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)能夠容易確定這一點(diǎn)并提供必要的信號(hào)。眾所周知，起始密碼子必須與期望編碼序列的讀框同框(in-framewith)，以確?；虻恼麄€(gè)編碼區(qū)域的翻譯。外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是天然的或合成的。表達(dá)的效率可通過并入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件來增強(qiáng)。說多雄敲載體可包括多克隆位點(diǎn)(MCS)，這是含有多個(gè)限制酶位點(diǎn)的核酸區(qū)域，任何一個(gè)限制酶位點(diǎn)都可與標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)協(xié)同使用來消化該載體(參見例如Carbonelli等人，1999;Levenson等人，1998和Cocea,1997，通過引用并入本文)。"限制酶消化"是指用只在核酸分子中的特定位置起作用的酶對核酸分子進(jìn)行催化切割。許多這些限制酶可市售獲得。這種酶的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，使用在MCS當(dāng)巾進(jìn)行切割的限制酶將載體線性化或片段化，以使外源序列能夠被連接到該載體。"連接"是指在兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，這兩個(gè)核酸片段相互間可以或可不毗鄰。涉及限制酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員公知的。'.v.,接敲大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄的真核生物RNA分子會(huì)經(jīng)歷RNA剪接，以從初級(jí)轉(zhuǎn)錄物除去內(nèi)含子。含有真核生物的序列的載體通常會(huì)含有轉(zhuǎn)錄物的cDNA(mRNA的拷貝)以進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)(參見例如Chandler等人，1997，通過引用并入本文)。v.射信號(hào)本發(fā)明的載體或構(gòu)建物可包含至少一個(gè)終止信號(hào)。"終止信號(hào)"或"終止子"由參與RNA聚合酶對RNA轉(zhuǎn)錄物的特異性終止的DNA序列組成。因此，在某些實(shí)施方案中，可以理解的是能結(jié)束RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生的終止信號(hào)。終止子可在體內(nèi)使用以達(dá)到合乎需要的信息水平。設(shè)想用于本發(fā)明的終止子，包括本文所述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的任何已知的轉(zhuǎn)錄終止子，包括但不限于例如基因的終止序列，如rho依賴性終止子和rho非依賴性終止子。在某些實(shí)施方案中，終止信號(hào)可能是可轉(zhuǎn)錄序列或可翻譯序列的缺乏，這例如因?yàn)樾蛄薪囟趟隆?,縦產(chǎn)為了使載體在本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增，載體可含有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)位點(diǎn)(常稱為"ori")，這是復(fù)制在其處起始的特定核酸序列。V//.輕;^，Y嚴(yán)遂》說在本發(fā)明的某些實(shí)施方案屮，含有本發(fā)明核酸構(gòu)建物的細(xì)菌細(xì)胞可通過在表達(dá)載體中包括標(biāo)記得以在體外或體內(nèi)進(jìn)行鑒定。這種標(biāo)記會(huì)給細(xì)胞賦予可鑒定的變化，使得含有該表達(dá)載體的細(xì)胞容易進(jìn)行鑒定。通常，可選擇標(biāo)記是能賦予便于進(jìn)行選擇的特性的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記是其存在便于對其的選擇的標(biāo)記，而陰性可選擇標(biāo)記是其存在防止對其的選擇的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例是藥物抗性標(biāo)記。通常，藥物選擇標(biāo)記的并入有助于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如，能賦予對氯霉素、紅霉素、慶大霉素(gentimycin)、壯觀霉素、鏈霉素、博萊霉素(zeocm)和卡那霉素的抗性的基因是有用的可選擇標(biāo)記。還使用互補(bǔ)方法(complementation叩proach)，該方法是營養(yǎng)缺陷體用其所缺乏的基因進(jìn)行功能互補(bǔ)。除了賦予便于根據(jù)條件的實(shí)施對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行辨別的表型的標(biāo)記外，還可以理解的是了基于比色熒光分析的其他類型的標(biāo)記，包括諸如GFP和YFP的可篩選標(biāo)記在內(nèi)。此外，應(yīng)用螢光素酶的標(biāo)記可被用作報(bào)道基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)知道如何應(yīng)用免疫標(biāo)記，很可能是與FACS分析聯(lián)用。我們認(rèn)為使用什么標(biāo)記并不重要，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)被表達(dá)即可。可選擇標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的更多實(shí)例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。v說菱沐鮮銜継實(shí)激在某些實(shí)施方案中，可以理解的足將質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞。通常，使用自殺質(zhì)粒載體，其中攜帶目的基因或構(gòu)建物的期望質(zhì)粒序列不在光能自養(yǎng)細(xì)菌宿主中復(fù)制，而是通過雙同源重組被迫整合到宿主基因組中。質(zhì)粒載體不會(huì)在大腸桿菌中復(fù)制。載體通常攜帶有在大腸桿菌中能被識(shí)別的復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在大腸桿菌和光能自養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。另外，含有與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體，也可用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可利用X噬菌體GEM，-11來制備可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重組噬菌體載體。更多的有用質(zhì)粒載體包括適合于蛋白質(zhì)過量表達(dá)的pET載體，以及包含與親和標(biāo)簽所成的翻譯融合體的載體，所述親和標(biāo)簽包括His標(biāo)簽和Strep標(biāo)簽，供進(jìn)行后續(xù)的純化和分離或切割。其他合適的融合蛋白是與P-半乳糖苷酶、遍在蛋白等所成的融合蛋白。c.將核酸導(dǎo)入光能自養(yǎng)細(xì)菌中盡管集胞藻PCC6803是天然可轉(zhuǎn)化的，不需要進(jìn)行處理來使DNA有效吸收和整合到基因組中，但是供進(jìn)行核酸遞送以轉(zhuǎn)化木發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌的合適方法，可包括兒乎任何本文所述的或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知道的據(jù)以將核酸(例如DNA)導(dǎo)入到這種細(xì)菌中的方法。這種方法包括但不限于通過自發(fā)轉(zhuǎn)化或通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行的DNA直接遞送(Sambrook等人，2001);先體外后體內(nèi)轉(zhuǎn)染(exvivotransfection)方法(Wilson等人，1989,Nabel等人，1989);注射方法(美國專利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通過弓I用并入本文)，包括微注射方法(Harland和Wemtraub,1985;美國專利5,789,215，通過引用并入本文)在內(nèi)；電穿孔方法(美國專利5,384,253，通過引用并入木文；Tur-Kaspa等人，1986;Potter等人，1984);磷酸鈣沉淀方法(Graham和VanDerEb,1973;Chen和Okay腿,1987;Rippe等人，1990);使用DEAE-葡聚糖接著使用聚乙二醇的方法(Gopal,1985);直接超聲裝載(directsonicloading)方法(Fechheimer等人，1987);脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法(Nicolau和Sene,1982;Fraley等人，1979;Nicolau等人,1987;Wong等人，1980;Kaneda等人，1989;Kato等人，1991)和受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法(Wu和Wu,1987;Wu和Wu,1988);微粒轟擊方法(PCT申請WO94/09699和95/06128;關(guān)國專利5,610,042;5,322,7835,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，各自通過引用并入本文)和這些方法的任何組合。通過應(yīng)用諸如這些技術(shù)，本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌可得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。2.誘變對于基因的表達(dá)的剖析和工程改造來說，誘變可能是強(qiáng)有力的工具。它還可用來減輕基因的反饋調(diào)節(jié)和/或消除或下調(diào)競爭性途徑等。在應(yīng)用誘變的情況下，可通過多種標(biāo)準(zhǔn)的誘變程序來實(shí)現(xiàn)誘變。突變是一個(gè)據(jù)以使生物的數(shù)量或結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化的過程。突變可涉及到單個(gè)基因、成批基因或整個(gè)染色體的核苷酸序列的修飾。單個(gè)基因的變化，可能是涉及到DNA序列當(dāng)中單核苷酸堿基的去除、添加或置換的點(diǎn)突變的結(jié)果，或者可能是涉及到大量核苷酸的插入或刪除的變化的結(jié)果。突變可以是通過使用特定的靶向方法進(jìn)行的定點(diǎn)突變。突變也可因?yàn)橹T如以下的事件而自發(fā)產(chǎn)生DNA復(fù)制的保真度出現(xiàn)錯(cuò)誤，或者基因組當(dāng)中的可轉(zhuǎn)座遺傳元件(轉(zhuǎn)座子)發(fā)生移動(dòng)。在暴露于化學(xué)或物理誘變劑后，也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生突變。這種突變誘導(dǎo)劑包括電離輻射、紫外光和多種化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)例如烷基化劑和多環(huán)芳烴，它們(通常在一些代謝生物轉(zhuǎn)化后)都能夠與核酸發(fā)生直接或間接的相互作用。由這種環(huán)境媒介物(environmentalagent)引起的DNA損傷當(dāng)在受影響的DNA被復(fù)制或修飾時(shí)可導(dǎo)致堿基序列的修飾，從而導(dǎo)致出現(xiàn)突變。a.定點(diǎn)誘變對于基因的表達(dá)的剖析和工程改造來說，結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變(structure-guidedsite-specificmutagenesis)代表著強(qiáng)有力的工具。該技術(shù)是通過向選定的DNA中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列變化，來使序列變體得以制備和測試。位點(diǎn)特異性誘變使用到編碼期望突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足夠數(shù)量的鄰近的未經(jīng)修飾核苷酸。這樣，提供出具有足夠大小和復(fù)雜度的引物序列，以在被橫跨的缺失接點(diǎn)(deletionjunction)的兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體。優(yōu)選長度約17-25個(gè)核苷酸的引物，其中序列的接點(diǎn)的兩側(cè)有約5-10個(gè)殘基被改變。該技術(shù)通常采用以單鏈形式和雙鏈形式兩種形式存在的噬菌體載體。可用于定點(diǎn)誘變的載體包括諸如M13噬菌體的載體。這些噬菌體載體可市售獲得，它們的用途通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在定點(diǎn)誘變中還例行采用雙鏈質(zhì)粒，這可取消將目的基因從噬菌體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒的步驟。一般來說，首先是獲得單鏈質(zhì)粒，或者使雙鏈載體的兩條鏈解鏈，所述單鏈載體或雙鏈載體在其序列當(dāng)中包括編碼期望蛋白質(zhì)或遺傳元件的DNA序列。然后使合成法制備的帶有期望突變序列的寡核昔酸引物與單鏈DNA制品進(jìn)行退火，當(dāng)選擇雜交條件時(shí)要考慮到錯(cuò)配的程度。使雜交產(chǎn)物經(jīng)受DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)處理，以完成帶有突變的鏈的合成。因此形成出異源雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的非突變序列，另一條鏈帶有期望的突變。然后用這個(gè)異源雙鏈體載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞?？蛇x擇出包含帶有突變的序列排列(mutatedsequencearrangement)的重組載體的克隆。有關(guān)給定蛋白質(zhì)殘基的功能重要性和信息含量的全面信息，最好可通過飽和誘變來獲得，在飽和誘變中對所有19個(gè)氨基酸置換都進(jìn)行了研究。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是多殘基飽和誘變(組合誘變)的后勤工作(bgistics)令人生畏(Warren等人，1996,1996;Zeng等人，1996;Burton和Barbas,1994;Yelton等人，1995;1995;Hilton等人,1996)。必須研究數(shù)百個(gè)、或許甚至數(shù)千個(gè)的位點(diǎn)特異性突變株。但是，有改進(jìn)的技術(shù)使得突變株的產(chǎn)牛和快速篩選更加直接了當(dāng)，特別是如果存在著對具有期望特性的突變株的嚴(yán)格功能選擇方案的話。另參見美閨專利5,798,208和5,830,650關(guān)于"預(yù)排(walk-through)"誘變的描述。其他的定點(diǎn)誘變方法在美國專利5,220,007、5,284,760、5,354,670、5,366,878、5,389,514、5,635,377和5,789,166中公開。b.隨機(jī)誘變插入誘變是基于通過已知DNA片段的插入使基因發(fā)生的失活。由于它涉及到某種類型的DNA片段的插入，所產(chǎn)生的突變通常是功能損失型突變而不是功能獲得型突變。但是，產(chǎn)生功能獲得型突變的插入也有數(shù)例(Oppenheimer等人，1991)。插入誘變在細(xì)菌和果蠅CDmw/^z7a)巾已非常成功(Cooley等人，1988)，巳在諸如玉米(Schmidt等人，1987)、擬南芥G4ra^6fo;ira)(Marks等人，1991;Koncz等人，1990)和金魚草(y^^r/Hm/w)41的植物中成為強(qiáng)有力丁.具?？蛇M(jìn)行基因剔除，己產(chǎn)生遺傳丁程改造的細(xì)菌。"剔除"基因應(yīng)作廣泛解釋為包括減少或消除被編碼的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，基因剔除可例如通過定點(diǎn)突變、插入誘變、移碼突變或者控制該基因的表達(dá)的該基因或調(diào)節(jié)區(qū)域的全部或部分的缺失來作出?？赊D(zhuǎn)座遺傳元件是能從細(xì)胞基因組中的-個(gè)位置移動(dòng)(轉(zhuǎn)座)到另一個(gè)位置的DNA序列。第一個(gè)別識(shí)別的可轉(zhuǎn)座元件是玉米(Z加wa")的Activator/Dissociation元件。此后在多種生物中也鑒定出可轉(zhuǎn)座元件，這些生物既有原核生物也有真核生物。基岡組中的可轉(zhuǎn)座元件其特征是側(cè)接有短DNA序列的同向重復(fù)序列(directrepeat),該短DNA序列是在轉(zhuǎn)座過程中得到復(fù)制的，稱為耙標(biāo)位點(diǎn)復(fù)制。幾乎所有的可轉(zhuǎn)座元件無論其類型和轉(zhuǎn)座機(jī)制如何，都在它們的插入位點(diǎn)作出這種復(fù)制。在一些情況中，被復(fù)制的堿基的數(shù)目是恒定的，在其他情況中，每次轉(zhuǎn)座事件的被復(fù)制堿基數(shù)不同。大多數(shù)可轉(zhuǎn)座元件在其末端具有反向重復(fù)序列。這些末端反向重復(fù)序列其長度可為幾個(gè)堿基到幾百個(gè)堿基，在許多情況中已知它們是轉(zhuǎn)座所必需的。原核生物可轉(zhuǎn)座元件在大腸桿菌和革蘭氏陰性細(xì)菌中研究得最多，但在革蘭氏陽性細(xì)菌中也存在。它們?nèi)绻L度小于約2kbp，通常稱為插入序列，如果更長則稱為轉(zhuǎn)座子。通過轉(zhuǎn)座進(jìn)行復(fù)制的噬菌體如mu和D108構(gòu)成了可轉(zhuǎn)座元件的第三種類型。每種類型的元件都編碼至少一個(gè)多肽即它們自身轉(zhuǎn)座所必需的轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座子往往還包括編碼與轉(zhuǎn)座無關(guān)的功能的基因，例如抗生素抗性基因。轉(zhuǎn)座子可按其結(jié)構(gòu)分成兩類。第一類即混合或復(fù)合轉(zhuǎn)座子在每個(gè)末端具有插入序列的拷貝，通常處于反向方向。這些轉(zhuǎn)座子需耍它們末端IS元件之一所編碼的轉(zhuǎn)座酶。第二類轉(zhuǎn)座子具有約30個(gè)堿基對的末端重復(fù)序列，不含有來自IS元件的序列。轉(zhuǎn)座通常要么是保守型轉(zhuǎn)座，要么是復(fù)制型轉(zhuǎn)座，不過在一些情況中可同時(shí)為這兩種轉(zhuǎn)座。在復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座元件保留在供體位點(diǎn)，另一個(gè)拷貝則插入在靶標(biāo)位點(diǎn)。在保守型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座元件從一個(gè)位點(diǎn)切除并在另一個(gè)位點(diǎn)插入。通過RNA中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)座的元件往往稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，它們最典型的特征是它們編碼據(jù)認(rèn)為具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。有兩種類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。一些反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與反轉(zhuǎn)錄病毒的被整合前病毒DNA(integratedproviralDNA)相似之處在于，它們在每個(gè)末端具有長的同向重復(fù)序列即長末端重復(fù)序列(LTRs)。這些反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與原病毒之間的相似性延伸到它們的編碼能力。它們含有與反轉(zhuǎn)錄病毒的基因和基因相關(guān)的序列，這提示它們是通過與反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期有關(guān)的機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座。第二種類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不含末端重復(fù)序列。它們也編碼g"g樣多肽和/^/樣多肽，和通過RNA中間體的反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行轉(zhuǎn)座，但通過與反轉(zhuǎn)錄病毒樣元件的機(jī)制不同的機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座。通過反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的轉(zhuǎn)座是一個(gè)復(fù)制過程，不需要將元件從供體位點(diǎn)切除。可轉(zhuǎn)座元件是自發(fā)突變的重要來源，已影響了基因和基因組進(jìn)化的方式。它們可通過插入在基因當(dāng)中來使基因失活，且可通過它們的轉(zhuǎn)座酶活性直接造成整個(gè)染色體重排(grosschromosomalrearrangement)，或者因?yàn)榉稚⒃诨蚪M周圍的某元件各拷貝之間的重組間接造成整個(gè)染色體重排。會(huì)發(fā)生切除的可轉(zhuǎn)座元件往往不嚴(yán)密地發(fā)生切除，且如果所添加或刪除的堿基數(shù)是三的倍數(shù)的話，可產(chǎn)生出編碼發(fā)生了改變的基因產(chǎn)物的等位基因。可轉(zhuǎn)座元件本身可通過不尋常的方式進(jìn)化。如果它們象其他DNA序列一樣進(jìn)行遺傳，則某元件在一個(gè)物種中的各拷貝與緊密相關(guān)物種中的各拷貝的相似程度，大于與較遠(yuǎn)緣物種屮的各拷貝的相似程度。但情況并非總是如此，這提示可轉(zhuǎn)座元件偶而從一個(gè)物種橫向傳輸?shù)搅硪粋€(gè)物種。z7.眾學(xué)誘變化學(xué)誘變能提供某些優(yōu)點(diǎn)，例如能夠找到具有不同程度的表型嚴(yán)格性(phenotypicseverity)的一整套突變等位基因，且執(zhí)行起來容易和費(fèi)用低。大部分的化學(xué)致癌物都能在DNA中產(chǎn)生突變。苯并[a]芘、N-乙酰氧基-2-乙酰氨基芴和黃曲霉毒素Bl會(huì)在細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中造成GC向TA的顛換。苯并[a]芘還會(huì)產(chǎn)生堿基置換，如AT置換成TA。N-亞硝基化合物會(huì)引起GC向AT的轉(zhuǎn)換。因暴露于n-亞硝基脲所引起的胸腺嘧啶的04位置的烷基化，會(huì)導(dǎo)致TA向CG的轉(zhuǎn)換。43誘變性和致癌性之間的高相關(guān)性是Ames試驗(yàn)的基礎(chǔ)性假設(shè)(McCann等人，1975)，Ames試驗(yàn)結(jié)合所加入的大鼠肝臟均漿能快速測定細(xì)菌系統(tǒng)中的突變株，該大鼠肝臟均漿含有微粒體細(xì)胞色素P450，以在需要的情況下提供誘變劑的代謝激活。在脊椎動(dòng)物中，已發(fā)現(xiàn)有幾種致癌物能在ras原癌基因中產(chǎn)生突變。N-業(yè)硝基-N-甲脲會(huì)在大鼠中引發(fā)乳腺癌、前列腺癌和其他的癌，其中大多數(shù)的腫瘤在Ha-ras癌基因的密碼子12的第二個(gè)位置處顯示G向A的轉(zhuǎn)換。苯并[a]芘引發(fā)的皮膚腫瘤在Ha-ras基因的第二個(gè)密碼子中含有A向T的轉(zhuǎn)化。說威浙誘,生物分子的完整性會(huì)被電離輻射所降解。入射能的吸附(adsorption)會(huì)導(dǎo)致離子和自由基的形成和一些共價(jià)鍵的斷裂。對輻射損害的易感性似乎隨不同的分子和同一分子的不同晶型而大為不同。它取決于總積累劑量，還取決于劑量速率(doserate)(因?yàn)?旦自由基存在，它們所引起的分子損害取決于它們的自然擴(kuò)散速率，因此取決于實(shí)際時(shí)間)。通過使樣品盡可能冷凍，損害可得到降低和控制。電離輻射會(huì)造成DNA損害和細(xì)胞殺滅，這通常與劑量速率成比例。已提出電離輻射是通過與DNA直接相互作用或者通過形成自由基物質(zhì)導(dǎo)致DNA損害，來引發(fā)多種生物效應(yīng)(Hall,1988)。這些效應(yīng)包括基因突變、惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞殺滅。盡管已證明電離輻射會(huì)在一些原核生物細(xì)胞和低等真核生物細(xì)胞中引發(fā)某些DNA修復(fù)基因的表達(dá)，但對于電離輻射對哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的作用卻知之甚少(Borek,1985)。有幾個(gè)研究描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞受輻射后所觀察到的蛋白質(zhì)合成模式的變化。例如，人惡性黑素瘤細(xì)胞的電離輻射處理與兒種未鑒定的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)有關(guān)(Boothman等人，1989)。細(xì)胞周期蛋白和共調(diào)節(jié)多肽的合成在大鼠REF52細(xì)胞中受到電離輻射的抑制，但在癌基岡轉(zhuǎn)化的REF52細(xì)胞系中卻沒有受到抑制(Lambert和Borek,1988)。其他的研究已證明，某些生長因子或細(xì)胞因子可能參與X射線引發(fā)的DNA損害。在這點(diǎn)上，在輻射后血小板衍生生長因子從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放出來(Witte,等人，1989)。"電離輻射"包括包含顆?；蚬庾拥妮椛?，所述顆?；蚬庾泳哂凶銐虻哪芰炕蛘吣芡ㄟ^核相互作用產(chǎn)生足夠的能量來產(chǎn)生電離(電子的獲得或失去)。示例性的和優(yōu)選的電離輻射是X射線輻射。給定細(xì)胞中所需的電離輻射的量通常取決于該細(xì)胞的性質(zhì)。通常，有效的表達(dá)誘導(dǎo)劑量小于造成細(xì)胞損害或直接造成死亡的電離輻射的劑量。測定有效輻射量的方法是本領(lǐng)域公知的。Zv.絲據(jù)被還可使用易錯(cuò)PCR引入隨機(jī)誘變(Cadwell和Joyce,1992)?？赏ㄟ^用模板的多個(gè)稀釋物在多個(gè)管子中進(jìn)行PCR，提高誘變的速度。一個(gè)特別有用的誘變技術(shù)是丙氨酸掃描誘變，其中用丙氨酸這個(gè)氨基酸對多個(gè)殘基逐個(gè)進(jìn)行置換，使得可確定出失去側(cè)鏈相互作用所產(chǎn)生的效應(yīng)，同時(shí)還使得造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的大規(guī)模攪亂的風(fēng)險(xiǎn)減至最低(Cunningham等人，1989)。在最近幾年，已開發(fā)出用極少量的蛋白質(zhì)估計(jì)配體結(jié)合的平衡常數(shù)的技術(shù)(Blackbum等人，1991;美國專利5,221,605和5,238,808)。這一用少量材料就能進(jìn)行功能試驗(yàn)的能力，可被利用來開發(fā)進(jìn)行抗體的飽和誘變的高效體外方法。由于用這個(gè)方式能高效率地產(chǎn)生所有19個(gè)氨基酸置換并加以分析，現(xiàn)在有可能在多個(gè)目的殘基上進(jìn)行飽和誘變，這個(gè)方法可稱為體外掃描飽和誘變(Burks等人，1997)。體外掃描飽和誘變提供了獲得大量的結(jié)構(gòu)-功能信息的快速方法，包括(i)鑒定能調(diào)節(jié)配體結(jié)合特異性的殘基，(ii)基于對那些在給定位置保持活性的氨基酸和那些在給定位置廢除活性的氨基酸的鑒定，更好地理解配體結(jié)合，(m)評(píng)估活性位點(diǎn)或蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)域的總體可塑性，(1V)鑒定到導(dǎo)致結(jié)合增加的氨基酸置換。V.縦#虔眾贈(zèng)鄉(xiāng)遂嫌祈誘,在美國專利5,380,721中描述了產(chǎn)生被展示多肽的文庫的方法。該方法包括獲得多核苷酸文庫成員，將各多核苷酸集合并進(jìn)行片段化，從中重新組成(reform)片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而將各片段進(jìn)行同源重組，形成出經(jīng)洗牌的一批(ashuffledpoolof)重組多核苷酸。D.監(jiān)測代謝流代謝流即材料被加工通過代謝途徑的速率，是細(xì)胞代謝的基本度量。對通向例如脂肪酸生物合成途徑的代謝流與通向檸檬酸循環(huán)的代謝流進(jìn)行比較測量，有助于確定具體途徑的相對重要性，并提供對于生物反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)分析和代謝工程來說必需的關(guān)鍵定量數(shù)據(jù)(Fernie等人，2005;Kl叩a等人,2003;Sauer，2004)。碳水化合物代謝是生物生理的關(guān)鍵所在，因?yàn)樘妓衔锬芙o包括脂肪酸生物合成途徑在內(nèi)的大多數(shù)其他途徑提供前體代謝物，并且是主要的能源(White,2000)。諸如集胞藻PCC6803的藍(lán)細(xì)菌具有特別復(fù)雜的中央代謝途徑，閑為它們具有通過糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑進(jìn)行葡萄糖降解的基因(Nakamura等人，1998)，并通過具有許多與戊糖磷酸途徑共同的步驟的Calvin-Benson-Bassham循環(huán)進(jìn)行C02固定。通過跟蹤穩(wěn)定的最終產(chǎn)物中的同位素分布，己確定了集胞藻PCC6803的異養(yǎng)培養(yǎng)物(黑暗，5mM葡萄糖)和光能混合營養(yǎng)培養(yǎng)物(光照，5mM葡萄糖)中流通中央碳水化合物代謝途徑的總代謝流(Yang等人，2002a;Yang等人，2002b;Yang等人，2002c)。加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的底物，從氨基酸的標(biāo)記譜圖推導(dǎo)出胞內(nèi)代謝物庫(metabolitepool)的最終同位素富集情況，氨基酸的標(biāo)記譜圖可通過質(zhì)譜(MS)或核磁共振(NMR)光譜進(jìn)行檢測。所得的數(shù)據(jù)提供了大量的用來計(jì)算胞內(nèi)代謝流的信息。雖然這個(gè)分析能使得可以對許多速率同時(shí)進(jìn)行佔(zhàn)計(jì)，但這種分析具有幾個(gè)缺點(diǎn)(i)它是在穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物上使用，沒有獲得動(dòng)態(tài)通量率(fluxrate);(ii)分析要求所有的被分析物和途徑/反應(yīng)是確切知道的；和(iii)數(shù)據(jù)處理繁雜，要求作出一些不可能在所有實(shí)驗(yàn)調(diào)價(jià)下都有效的假設(shè)。這可導(dǎo)致產(chǎn)生假象，特別是如果對錯(cuò)綜復(fù)雜的途徑進(jìn)行模擬的話(vanWinden等人，2005)。鑒于這些潛在的缺點(diǎn)，期望有簡單和客觀方法來分析中央碳水化合物代謝的各部分。因此，本發(fā)明人開發(fā)出了一個(gè)方法，在該方法中能更直接地隨時(shí)間推移對各個(gè)反應(yīng)進(jìn)行檢測。胞內(nèi)中央代謝的代謝物如糖磷酸可用多種技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測，例如酶學(xué)測定、HPLC(Bhattacharya等人，1995;Groussac等人，2000)、CE/MS(Soga等人，2002)、GC/MS(Fiehn等人，2000;;Roessner等人，2000)和LC/MS(Buchholz等人，2001;Buchholz等人，2002;Mashego等人，2004;vanDam等人，2002)。Buchholz等人，(2001)開發(fā)出了用LC-EST-MS對大腸桿菌K12中的糖酵解中間體的胞內(nèi)濃度進(jìn)行定量的方法。通過這個(gè)方法，有可能以小的樣品體積平行鑒定和定量不同的糖磷酸。對于代謝流的分析，MS檢測方法的最決定性的優(yōu)點(diǎn)是它們使得能夠進(jìn)行13C跟蹤，通過該跟蹤可確定胞內(nèi)代謝物的標(biāo)記譜圖。最近，vanWmden等人(2005)通過LC/MS直接測量了大腸桿菌培養(yǎng)物的未經(jīng)標(biāo)記的和經(jīng)1^標(biāo)記的中央代謝中間體。本發(fā)明人使用LC/MS方法和13C跟蹤方法的組合，來直接測量經(jīng)"C標(biāo)記的代謝中間體隨時(shí)間的富集情況。這個(gè)方法使得本發(fā)明人能夠獲得有關(guān)代謝流網(wǎng)絡(luò)和代謝流動(dòng)態(tài)學(xué)的詳細(xì)信息，閑為它使得可以對不同生長條件下各種糖磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化速度進(jìn)行深入分析。D.期望的產(chǎn)物的回收在一些情況下，需要回收所表達(dá)的期望產(chǎn)物。期望的產(chǎn)物一旦得到表達(dá)，可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳、溶劑提取、分子篩等等(主要參見R.Scopes,(1982)ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.;Deutsclier(1990)MethodsinEnzymologyVol.182:GuidetoProteinPurification.,AcademicPress,Inc.N.Y.)。在某些方面，期望產(chǎn)物的回收的初始步驟可包括使細(xì)胞裂解或破碎?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的適當(dāng)?shù)牧呀夥椒ǎ@些方法包括熱處理、超聲處理、機(jī)械磨蝕、加壓和突然降壓、在加入的惰性介質(zhì)幫助下進(jìn)行的磨蝕和破碎、電穿孔以及堿或酸處理。細(xì)胞破碎后，可將細(xì)胞裂解物進(jìn)行直接溶劑或超臨界C02提取以獲得脂質(zhì)基(lipid-based)產(chǎn)物(參見例如Serrano-Carreon等人，(2002);Nobre等人，(2006);T叩al等人，(2006)，均通過引用并入本文)?；蛘?，可通過兩相分配系統(tǒng)分離期望的產(chǎn)物(參見例如Rito-Palomares(2004);Cisneros等人，(2004);Serrano-Carreon等人,(2002)，均通過引用并入本文)。E.用以測定改變了的表達(dá)的測定法可以理解的是，本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌通過使用本說明書中描述的方法會(huì)顯示出改變了的期望產(chǎn)物水平。"改變了的(己被改變的)"或"經(jīng)修飾的"包括相對于期望產(chǎn)物在細(xì)菌中的天然表達(dá)來說的不同水平的表達(dá)。目的基因可以在其序列或表達(dá)水平上是經(jīng)修飾的，和/或可以是被缺失的和/或從外部來源被引入的。這可導(dǎo)致相應(yīng)的期望基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或酶)的產(chǎn)生受到調(diào)節(jié)，和/或與這種基因產(chǎn)物有關(guān)的途徑受到調(diào)節(jié)(例如增加或過量表達(dá)目的基因，以使相應(yīng)的基因產(chǎn)物和/或與該基因產(chǎn)物有關(guān)的代謝途徑各成分的獲得量增加)。這種改變可通過多種方法進(jìn)行評(píng)估，包括放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記、染色、質(zhì)譜、酶活性測量和/或蛋白質(zhì)純化。簡單和直接的方法包括那些在SDS/PAGE和蛋白質(zhì)染色或蛋白質(zhì)印跡后進(jìn)行定量分析的方法，所述定量分析例如對所得凝膠或印跡的光密度掃描。期望產(chǎn)物的水平與天然細(xì)菌中的水平相比出現(xiàn)明確的增加則表明是過量表達(dá)，過量表達(dá)是特定期望產(chǎn)物相對于細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生并例如在凝膠十.可見的其他蛋白質(zhì)的相對豐度。F.光能自養(yǎng)細(xì)菌的生長/培養(yǎng)條件通過生長本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行的期望產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)，可通過分批培養(yǎng)方法或連續(xù)培養(yǎng)方法來進(jìn)行。典型的分批培養(yǎng)方法是這樣的密閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在培養(yǎng)開始時(shí)設(shè)定好，在培養(yǎng)過程中不進(jìn)行人工改變。因此，在培養(yǎng)過程的開始時(shí)，用期望的(一種或多種:i生物接種培養(yǎng)基，然后讓生長或代謝活性進(jìn)行，而不向系統(tǒng)加入什么東西。但是通常來說，"分批"培養(yǎng)是就碳源的添加而言是分批的，往往試圖對諸如pH和氧濃度的因素進(jìn)行控制。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物組成和生物質(zhì)組成持續(xù)變化，直到培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束為止。在分批培養(yǎng)當(dāng)中，細(xì)胞緩慢通過(moderatethrough)靜止延遲期進(jìn)入高生長對數(shù)期，最后進(jìn)入生長速度減少或停止的穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細(xì)胞如果不經(jīng)處理會(huì)最終死亡。一些系統(tǒng)中，往往是對數(shù)期的細(xì)胞導(dǎo)致最終產(chǎn)物或中間體的大量產(chǎn)生。在其他系統(tǒng)中則可在穩(wěn)定期或?qū)?shù)期后期獲得所述產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一個(gè)改進(jìn)是補(bǔ)料分批系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括典型的分批系統(tǒng)，例外是底物隨著培養(yǎng)的進(jìn)行遞增地加入。當(dāng)分解代謝物阻遏易于抑制細(xì)胞的代謝時(shí)，和在需要在培養(yǎng)基中具有有限數(shù)量的底物的情況中，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。分批培養(yǎng)方法和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是普通的和本領(lǐng)域公知的，它們的實(shí)例可在以下文獻(xiàn)中找至ll:ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,48Mass.，或者Deshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36,227,(1992)，這些文獻(xiàn)通過引用并入本文?；蛘呤褂眠B續(xù)培養(yǎng)，這是一個(gè)開放系統(tǒng)，其中向生物反應(yīng)器連續(xù)加入確定成分培養(yǎng)基，同時(shí)移取等量的經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基(conditionedmedmm)進(jìn)行加丄。連續(xù)培養(yǎng)通常將細(xì)胞維持在恒定的高液相密度，其中細(xì)胞主要處在對數(shù)生長期?；蛘?，可用固定化細(xì)胞來實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)，其中連續(xù)加入碳和營養(yǎng)物，并將有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢產(chǎn)物連續(xù)從細(xì)胞團(tuán)(cellmass)中移取出來。細(xì)胞固定化可用多種由天然和/或合成材料構(gòu)成的固相載體來進(jìn)行。G.光能自養(yǎng)細(xì)菌的生長和加工系統(tǒng)在本發(fā)明的某些方面，光能自養(yǎng)細(xì)菌可在大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)屮生長。一種這樣的系統(tǒng)描述于WillemF丄Vermaas和BruceE.Rittmann的、在2006年10月20日當(dāng)天或當(dāng)天前后提交的、題為《生長細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的60/862,366號(hào)美國臨時(shí)專利申請，及WillemFJ.Ve腿as和BruceE.Rittmann的、在2007年10月20日當(dāng)人或當(dāng)人前后提交的、題為《生長光合作用細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的—號(hào)PCT申請，這兩個(gè)專利申請通過引用并入本文。H.期望的產(chǎn)物的加工在某些方面，期望的產(chǎn)物(例如脂質(zhì)、類胡蘿卜素、碳水化合物或藻青素)可如下來獲得(i)獲得其屮一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)的水平已被改變的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)基因的改變了的表達(dá)能增加所述.種或多種期望產(chǎn)物的產(chǎn)量，所述增加是相對于其中所述.個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的水平不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌所產(chǎn)物的所述一種或多種期望產(chǎn)物的量而言；(ii)在合適的條件K生長該光能自養(yǎng)細(xì)菌以產(chǎn)生期望的產(chǎn)物；和(iii)分離該期望的產(chǎn)物。分離出的該產(chǎn)物可進(jìn)一步加工成幾種不同的產(chǎn)品。非限制性實(shí)例包括生物燃料、生物塑料、動(dòng)物飼料添加劑和有機(jī)肥料。在生物燃料方面，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂質(zhì)和碳水化合物可進(jìn)一步加工成生物柴油和生物氣。生物柴油足一種使用方式類似于石油基柴油燃料的液體燃料來源。生物柴油可通過用短鏈醇如甲醇或乙醇在稱為酯交換的步驟中替代甘油來合成生產(chǎn)。酯交換過程通常涉及在室溫下將甲醇(50%過量)與NaOH(100%過量)混合，然后與脂質(zhì)/油劇烈混合和讓甘油沉淀(約占生物柴油混合物的15%)。上清液是生物柴油，含有甲基化脂肪酸和甲醇的混合物，NaOH催化劑保持溶解在甘油部分。在工業(yè)上，可將酯送到清理(clean-up)或純化丄藝，該丄藝由水洗、真空干燥和過濾組成。酯交換可用甲醉、乙醇、異丙醇或丁醇來進(jìn)行。催化劑nj以是氫氧化鈉或氫氧化鉀。已證明甲醇/油摩爾比會(huì)在很大程度上影響反應(yīng)的效率，對于甲酯設(shè)備(methylesterplants)的最佳大小具有重要的關(guān)系。另選的方法包括超臨界流體甲醇方法或者使用超聲波反應(yīng)器和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的其他方法(參見例如Aresta(2005);Saka等人，(2006)，通過引用jf入本文)。生物氣可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法用通過本發(fā)明方法獲得的碳水化合物來制備。例如，這種方法和方案的非限制性實(shí)例在Gong等人,(1999)中有說明。僅以舉例方式來說，采用葡萄糖氧化來形成還原當(dāng)量(reducingequivalent),后者可用來在藍(lán)細(xì)菌中通過氫化酶將質(zhì)子還原成氫(Nandi等人，(1998)，通過引用并入本文)。另一個(gè)非限制性實(shí)例包括光生物氫生產(chǎn)(photobiohydrogenproduction)(Prince等人，(2005)，通過引用并入本文)。生物塑料可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法用通過本發(fā)明方法獲得的碳水化合物來制備。例如，藍(lán)細(xì)菌(PHB)在轉(zhuǎn)移到還原條件時(shí)其巾的PHA水平增加7倍，加入葡萄糖會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的增加。有關(guān)生物塑料生產(chǎn)的非限制性實(shí)例在Taroncher等人，(2000)中有描述。另外，盡管藍(lán)細(xì)菌天然不會(huì)產(chǎn)生聚乳酸，但可用遵循為大腸桿菌開發(fā)的原理的正確的酶對它們進(jìn)行修飾以產(chǎn)生聚乳酸(Zhou等人,(2005)，通過引用并入木文)。另外可只將木發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌用來固定被供應(yīng)給它的二氧化碳而不是為了加工期望的產(chǎn)物，或者除了加工期望的產(chǎn)物外，本發(fā)明的光能自養(yǎng)細(xì)菌還可用來固定被供應(yīng)給它的二氧化碳。這例如在從二氧化碳來源減少或除去二氧化碳(例如減少煙道氣中的二氧化碳的量)方面是有利的。非限制性的可用來執(zhí)行這一點(diǎn)的系統(tǒng)描述于WillemFJ.Vermaas和BruceE.Rittmann的、在2006年10月20日當(dāng)天或當(dāng)天甜后提交的、題為《生長細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的60/862,366號(hào)美國臨時(shí)專利申請，及WillemFJ.Ve腿as和BruceE.Rittmann的、在2007年10月20日當(dāng)天或當(dāng)天前后提交的、題為《生長光合作用細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的—號(hào)PCT申請，這兩個(gè)專利申請通過引用并入本文。實(shí)施例納入以下實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的某些非限制的方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表著本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的能在本發(fā)明的實(shí)施中很好地發(fā)揮作用的技術(shù)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容會(huì)認(rèn)識(shí)到，可不背離本發(fā)明的精神和范圍，對所公開的具體實(shí)施方案作出許多修改方案，而這些修改方案仍能獲得相同或類似的結(jié)果。實(shí)施例1用以增加脂質(zhì)含量的經(jīng)修飾集胞藻PCC6803藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803這一藍(lán)細(xì)菌被修飾成能過量表達(dá)VIPP1基因W/M77。為實(shí)現(xiàn)v0;7/基因(W/0W7)的高表達(dá)水平，將它克隆置于集胞藻戸M3基因C^/M67;)的組成型天然啟動(dòng)子之下。將v/p/7基岡克隆在pA31hcgA3質(zhì)粒的壯觀霉素類似物中的天然戸M3基因的上游(287bp)和下游(394bp)區(qū)域之間(He等人，1999);所得的質(zhì)粒命名為Highvippl，在圖14屮示出。v/，/W膨77)基因的序列獲自CyanoBase，構(gòu)建了兩個(gè)引物來擴(kuò)增集胞藻基因組的對應(yīng)于804bp的v,pp/基因、v/pp/基因起始密碼子上游的15bp和v,pp/基因終止密碼子下游的18bp的837bp片段。引物的序列為5'-GAGGATAAGTAAGtCATGaGATTATTTGAC和5'-CTGGCTGAGTTAAtgCAtTTACAGATTATTTAACC。小寫字母表示為分別給第一引物和第二引物導(dǎo)入5^///和Ww/的單一限制位點(diǎn)所作的核苷酸堿基修飾。將擴(kuò)增的vz如7片段和pA31hcgA3的壯觀霉素抗性盒(cassette)分別用(fi^///,7VwT)和(Wc0/，PW/)進(jìn)行消化。連接后，通過電穿孔進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后將細(xì)胞在室溫下進(jìn)行涂平板；只有當(dāng)在電穿孔之后的所有步驟屮將細(xì)胞在室溫下(而不是37"C)進(jìn)行溫育時(shí)，才能成功獲得經(jīng)質(zhì)粒測序表明具有全長w;^/基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。集胞藻PCC6803的轉(zhuǎn)化按照(Vermaas等人，1987)，用Highvippl質(zhì)粒(圖14)轉(zhuǎn)化集胞藻。通過壯觀霉素抗性選擇出攜帶嵌合v^/7基因的集胞藻轉(zhuǎn)化子，在之后再對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線時(shí)，采用增加壯觀霉素濃度來獲得單菌落的完全分離。為驗(yàn)證全長v^;^基因在集胞藻基因組的期望位點(diǎn)處的基因組整合，用聚合酶鏈反應(yīng)來擴(kuò)增戸M3基因的末端上游序列和T1T2終止子序列的開端之間的片段。上游/^'M3基因的末端序列為5'-GACAAATACATAAGGAATTATAACc，定位到(mapto)T1T2終止子序列的開端的引物的序列為5'-GCCAAAACAGCCAAGCTTGGC。第一引物用來進(jìn)行正向DNA測序，后一引物用來進(jìn)行擴(kuò)增的嵌合w/7/^基閑的反向DNA測序。如下文所說明和如表1和圖8所示，這個(gè)基因的過量表達(dá)使集胞藻PCC6803藍(lán)細(xì)菌屮的脂質(zhì)含量增加到占干重的幾乎50%。s/W677基因被置于，^43啟動(dòng)子之下。集胞藻細(xì)胞是在50微摩爾光子m—V1下30()C生L<:。脂質(zhì)提取是通過標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行(參見例如Tasaka等人，1996)。表l倍增時(shí)間01)和脂質(zhì)占干重的％，淡水，非脅迫條件。藻株為野生型，除非另有指明<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>"因?yàn)檫^程中的損失，很可能被低估2)因?yàn)楣卜蛛x的雜質(zhì)，很可能被高估Sato等人，BBA572(1979)19-28[2]Vermaas實(shí)驗(yàn)室，未發(fā)表Ben-Amotz等人，J.Phycol.21(1985)72-81實(shí)施例2通過集胞藻PCC6803的中央碳水化合物代謝途徑對代謝流進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，和通過accABCD過量表達(dá)進(jìn)行脂肪酸生物合成的增強(qiáng)1.材料和方法化學(xué)物質(zhì)。用作標(biāo)準(zhǔn)物的化學(xué)物質(zhì)(葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、果糖-1，6-二磷酸(FBP)、甘油醛-3-磷酸(GAP)、磷酸二羥丙酮(DHAP)、3-磷酸廿油酸(3PG)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、6-磷酸葡萄糖酸(6PG)、核糖-5-磷酸(R5P)、核酮糖-5-磷酸(Ru5P)、核酮糖-1,5-一磷酸(11118)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P))購自(St.Louis,MO)。均勻地進(jìn)行13C-標(biāo)記的D-葡萄糖(U-13C6-D-葡萄糖)獲自CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.(Andover,MA)。所有的溶液都使用Milli-Q級(jí)別的水(Millipore,VanNuys,CA)。主長殺/f浙"C-憲f鎵^^參記。將集胞藻PCC6803株野生型和缺乏磷酸果糖激酶和/或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的突變株在用5mMTES[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]-NaOH(pH8.0)緩沖的BG-11中，在空氣中3(^C進(jìn)行培養(yǎng)。對于光能混合營養(yǎng)生長和光能異養(yǎng)生長，生長培養(yǎng)基補(bǔ)加5mM葡萄糖。對于光能異養(yǎng)生長，向培養(yǎng)基加入25pM的除草劑阿特拉津，該除草劑阻斷通過PSII的電子傳遞。將培養(yǎng)物用強(qiáng)度為50pmol光子m—2s—1的白光進(jìn)行照射，在120rpm的攪拌速度下進(jìn)行搖動(dòng)。通過用ShimadzuUV-160分光光度計(jì)在730nm處測量光密度，監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況。為進(jìn)行13C標(biāo)記，將處于對數(shù)生長期后期的細(xì)胞(OD73(尸1.0)在補(bǔ)加1mM葡萄糖的BG-ll培養(yǎng)基中稀釋40倍。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD73Q=0.5曰寸，向培養(yǎng)物加入0.5mM13C葡萄糖或5mM13CNaHC03(標(biāo)記的碳酸氫鹽與0.5mM未標(biāo)記的葡萄糖起加入)，將培養(yǎng)物在通常的生長條件下繼續(xù)進(jìn)行溫育。在時(shí)間O時(shí)加入標(biāo)記的葡萄糖或碳酸氫鹽后的不同時(shí)間，采集樣It叩o^/^虔y吝。在加入標(biāo)記后的各確定時(shí)間，從標(biāo)記的集胞藻PCC6803(0073。=0.5)培養(yǎng)物移取100ml等分試樣。培養(yǎng)物等分試樣是通過濾過玻璃微纖維濾器(FG/B,Whatman)進(jìn)行快速收集，并用35ml水洗滌除去殘余培養(yǎng)基。將帶細(xì)胞的濾器立即投入20ml冷(-4(^C)甲醇屮，并在這些條件下溫育30分鐘以猝滅反應(yīng)。然后將甲醇/濾器/細(xì)胞混合物在70"C下溫育6分鐘，進(jìn)行代謝物提取。棄去濾器后，將甲醇在N2下4t蒸發(fā)。最后，將剩余的粉末溶于0.25ml水中。在OptimaTLX120超離心機(jī)(Beckman)中280,000g(80,000rpm)下進(jìn)行超離心1小時(shí)后，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到新的管子并在-7(^C下保藏?！ㄊ?:C分庸。用多孔石墨碳Hypercarb柱(100x2.1mm,5mm,Thermo-Electronic,Bellefonte,PA)進(jìn)行HPLC。另外，應(yīng)用Hypercarb保護(hù)柱(10x2.1mm)來保護(hù)主柱。使用BeckmanHPLC系統(tǒng)，施加流速為0.125mlmin"的二元梯度。注射體積為5CUi1。溶劑A為12mM乙酸銨水溶液，溶劑B為水。施加來進(jìn)行分離的梯度是在最初20分鐘溶劑B從60%線性增54加到100%。保持這個(gè)100%水平5分鐘，然后在接著的2分鐘內(nèi)再降低到60%B。保持這個(gè)60%水平IO分鐘，以使柱子再平衡。用柱后T型分流器以0.125mlmin—1的流速泵送甲醇與HPLC洗脫液匯合，然后將該混合物通過ESI界面引導(dǎo)到質(zhì)譜儀中。^譜分叛。質(zhì)譜(MS)分析是用AB1365二重四極桿質(zhì)譜儀(AppliedBiosystems/MDSSciex)來進(jìn)行。氮?dú)饧扔米髑蕷?sheathgas)也用作碰撞氣(collisiongas)。數(shù)據(jù)采集和分析是用Analyst軟件(AppliedBiosystems/MDSSciex)進(jìn)行。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的最佳參數(shù)是通過用注射泵以10^min"的速度直接注射不同的標(biāo)準(zhǔn)物以全掃描模式進(jìn)行測定。將用G6P(5G6P的甲醇:12mM乙酸銨(50:50%,v/v)溶液)進(jìn)行調(diào)整(tuning)獲得的調(diào)整參數(shù)(tuneparameter),進(jìn)行MS和MS艇S檢測。應(yīng)用以下ESI參數(shù)加熱的毛細(xì)管的溫度300"C;電噴霧毛細(xì)管電壓4.2kV;簾氣(curtamgas):8psi;聚焦電壓100V。所有其他參數(shù)通過自動(dòng)調(diào)整進(jìn)行確定。使用Ql多重離子模式(QlMultipleIonmode)來定量中間體和它們的同位素體的濃度。使用MS/MS模式來鑒定或確認(rèn)化學(xué)物質(zhì)的身份。/e薪^0^:^^^7;^著。樣品中的代謝物按它們的保留時(shí)間、m/z、特異性片段化模式進(jìn)行鑒定，且如果需要的話通過給提取物摻入濃度為10-50的代謝物標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行鑒定。"C-標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了代謝物的鑒定。代謝物的定量是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的加入方法通過[M-H]—離子來完成(Skoog和Leary，1992)。制備了僅含有一種已知濃度的被分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過給細(xì)胞提取物摻入遞增數(shù)量的這、標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得了峰面積對濃度的線性回歸曲線。"C分漆，。在加入"C標(biāo)記后0、0.33、1.5、5、20和60分鐘，收集130-標(biāo)記的從光能混合營養(yǎng)培養(yǎng)物和光能異養(yǎng)培養(yǎng)物收集的樣品。細(xì)胞提取物通過HPLC進(jìn)行分離并通過MS以MIM模式進(jìn)行測量，該模式能同時(shí)跟蹤各種中間體的不同質(zhì)量同位素體。從不同質(zhì)量同位素體的峰面積計(jì)算它們的含量和分布。2.結(jié)果分蓐微定層中離通過HPLC分離代謝中間體，這不僅對于MS檢測靈敏度的改進(jìn)是必需的，而且對于中間體的鑒定和定量也是必需的。HypercarbHPLC柱適合分離其保留時(shí)間范圍寬的各種糖磷酸和相關(guān)化合物(圖1A)。結(jié)合MS的質(zhì)量分離，碳水化合物代謝中間體的所有可供利用的(available)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物都明確地得到分離，20M溶液容易地得到檢測。,標(biāo)準(zhǔn)物如S7P和SBP并非可市售獲得，盡管這些化合物根據(jù)它們的質(zhì)量可在細(xì)胞提取物中得到鑒定(圖1B)。如圖1A所示，不同標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間在5-25分鐘之間。即使一匙標(biāo)準(zhǔn)物如R5P(質(zhì)量229，第一個(gè)峰)和G6P(質(zhì)量259，第一個(gè)峰)在LC卜.互相重疊，它們因?yàn)橘|(zhì)量的不同可通過MS來區(qū)分。相反，質(zhì)量169(GAP，峰1(洗脫時(shí)間最短)；DHAP，峰2(洗脫時(shí)間較長))、229(R5P，峰1;Ru5P，峰2)和259(G6P，峰1;F6P，峰2)的異構(gòu)體被LC分離，但不被MS分離。LC和/或MS對各化合物之間的明確分離使得能夠定量這些中央代謝中間體。既然已證實(shí)各標(biāo)準(zhǔn)物通過這個(gè)方法在M濃度下可檢測到，因此對集胞藻提取物進(jìn)行分析。為使MS靈敏度最大化，應(yīng)盡可能將顆粒物從杼品中除去，使得離子抑制減至最低。為此，在進(jìn)行LC/MS分析前將樣品在超離心機(jī)中以80,000rpm(280,000g)進(jìn)行離心。如所預(yù)期，當(dāng)通過LC/MS以掃描模式分析細(xì)胞提取物時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多對應(yīng)于細(xì)胞中大量的不同代謝物的峰(數(shù)據(jù)未顯示)。在這里，本發(fā)明人完全關(guān)注于屮央碳水化合物代謝屮間體。圖1B顯示以MIMMS模式測量的糖磷酸，其中只監(jiān)測選定的w/z值。鑒定出的峰包括對應(yīng)于質(zhì)量167(PEP)、185(2PG，峰l;3PG，峰2)、229(R5P，峰l;Ru5P，峰2)、259(G6P，峰1;F6P,峰2)、289(S7P)、309(RuBP)和369(SBP)的峰；"峰l"是相對于峰2而言洗脫時(shí)間較短的峰。當(dāng)掃描m/z169、199、275和339時(shí)沒有峰被發(fā)現(xiàn)(圖1B)，盡管標(biāo)準(zhǔn)物給出大的信號(hào)(圖1A)。這一點(diǎn)連同標(biāo)準(zhǔn)物在提取程序的過程中沒有顯著降解的這個(gè)觀察結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，表明GAP(質(zhì)量167)、DHAP(質(zhì)量167)、E4P(質(zhì)量199)、6PG(質(zhì)量275)和FBP(質(zhì)量339)沒有在細(xì)胞巾積累。給各樣品摻入20pM標(biāo)準(zhǔn)物(未顯示)，以便定量各峰和檢査各化合物是否得到正確鑒定。此外，還使用MS/MS模式來驗(yàn)證各化合物的正確確定。后一點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例在圖2中提供，其中各峰是通過在第二MS中對第一MS中質(zhì)量為259(G6P和F6P的離子的質(zhì)量)的各分子的典型磷酸片段(97m/z)進(jìn)行選擇性監(jiān)測來獲得。在這個(gè)模式中，259m/z的離子通過第一四極(quadrupole)并在碰撞室(collisioncell)中被打碎；只有97附/z片段被選擇通過第二四極并被檢測器計(jì)數(shù)。圖2中顯示的結(jié)果證實(shí)圖1中的兩個(gè)259w々峰的確含冇磷酸基團(tuán)。其他的糖磷酸峰也被l正實(shí)在MS/MS中產(chǎn)生磷酸片段。4^^箱攻激^;^>^泣#沐#_#^7;^#在被鑒定的糖磷酸當(dāng)中，尤其是G6P、F6P、PEP、3PG、2PG和S7P在對集胞藻提取物進(jìn)行LC/MS時(shí)一貫地產(chǎn)生顯著和可再現(xiàn)的MS峰，它們被用來在用"C-D-葡萄糖或碳酸氫鹽標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行同位素體分布分析。作為同位素體隨時(shí)間推移的標(biāo)記情況的一個(gè)實(shí)例，圖3顯示了在從光能混合營養(yǎng)生長的細(xì)胞制備的集胞藻提取物中，在"C-葡萄糖標(biāo)記開始后的不同時(shí)間時(shí)3PG標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)。在'力-葡萄糖標(biāo)記開始吋(t=0)，大部分的3PG分子含有三個(gè)12C碳(質(zhì)量185)。該質(zhì)量+1同位素在t=0時(shí)的豐度為約3.6%，這與13C的人然豐度一致，而質(zhì)量187或188的3PG分子(攜帶兩個(gè)或三個(gè)標(biāo)記的碳)的豐度非常小。在130葡萄糖的存在下牛長20秒后，標(biāo)記的3PG開始出現(xiàn)，而在1.5min時(shí)，可見明顯的188(二個(gè)標(biāo)記的碳)3PG峰。這之后，具有兩個(gè)13C原子的3PG分子開始增加和變成主要的標(biāo)記同位素體。加入標(biāo)記葡萄糖一小時(shí)后，3PG的同位素體分布圖譜包括大量的所有同位素體并顯然達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)；溫育更長時(shí)間各峰的大小和比例也沒有顯著變化(未顯示)。在理論上，信號(hào)的LC/MS峰面積應(yīng)與該化合物的濃度成線性關(guān)系。為驗(yàn)證集胞藻細(xì)胞提取物中的中央代謝中間體的我們的檢測范圍的線性，在向細(xì)胞提取物加入己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物后，測定G6P、3PG和PEP的MS信號(hào)的峰面積。G6P、3PG和PEP在原始提取物中的濃度從這些曲線(圖4)獲得，對應(yīng)于橫坐標(biāo)的負(fù)值。雖然S7P濃度肉為沒有標(biāo)準(zhǔn)物不能以這種方式計(jì)算出來，但它的峰面積與所荷載的細(xì)胞提取物的體積線性相關(guān)。G6P和F6P的比例和標(biāo)記譜圖及3PG和2PG的比例和標(biāo)記譜圖在這里研究的所有實(shí)驗(yàn)條件下是相似的，這提示這些異構(gòu)體之間的交換速度非常高。為簡化數(shù)據(jù)采集和處理，將G6P和F6P并入同一組即G6P+F6P，3PG和2PG并入同一組即3PG+2PG。^^巖^"C-》天記譜^^動(dòng)力學(xué)本發(fā)明人比較了集胞藻提取物中G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和S7P同位素體的分布隨細(xì)胞生長模式(光能混合營養(yǎng)生長對光能異養(yǎng)生長)的變化和隨加入13C后的吋間的變化，以了解這個(gè)藍(lán)細(xì)菌中的中央代謝流。即使當(dāng)細(xì)胞在相同生長模式下(光能混合營養(yǎng)生長或光能異養(yǎng)生長)生長時(shí)被測量的各中間體的同位素體分布是完全可再現(xiàn)的，從細(xì)胞提取到的這些化合物的總濃度在各實(shí)驗(yàn)間有顯著變化(表2)。用以下參數(shù)和假設(shè)，將提取物中的被測量濃度回算到細(xì)胞中的內(nèi)部濃度(l)若用ShimadzuUV-160分光光度計(jì)監(jiān)測，對數(shù)生長期的集胞藻培養(yǎng)物具有10H個(gè)細(xì)胞/OD7iW升；(2)細(xì)胞的平均直徑為2nm;(3)代謝物提取效率為100%;對加到冷的細(xì)胞/甲醇混合物與加到用于MS的最終提取物的可供利用標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定量比較表明，提取過程沒有造成任何顯著的定量損失(數(shù)據(jù)未顯示)。目前不清楚是什么原因造成細(xì)胞中代謝物濃度的波動(dòng)；不能完全進(jìn)行控制和估計(jì)的參數(shù)是化合物在冷甲醇中從細(xì)胞提取的效率。表2.集胞藻PCC6803在光能混合營養(yǎng)生長條件和光能異養(yǎng)牛長條件下的胞內(nèi)代謝中間體濃度。生長條件光能混合營養(yǎng)牛長光能異養(yǎng)生長化合物濃度(G6P+F6P913±5001544±6723PG+2PG1139±7151588±920PEP376±137737士208S7Pb1±0.35b2.61±1.12bR5P80±3272±30RuBP112±33UDCSBPb1±0.35bUDa數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。胞內(nèi)濃度是在假設(shè)提取效率為100%、球形細(xì)胞平均半徑為的lm的前提下計(jì)算。b提供S7P和SBP的相對濃度而不是絕對濃度，因?yàn)闆]有純的標(biāo)準(zhǔn)物。eUD:不可檢測。在任何情況中，G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和R5P各自在光能混合營養(yǎng)生長模式和光能異養(yǎng)生長模式這兩種模式下的濃度相差兩倍以內(nèi)。而RuBP禾BSBP這兩種Calvin-Benson-Bassliam循環(huán)特有的化合物在光能異養(yǎng)生長條件下不可檢測，但在光能混合營養(yǎng)生長條件下存在。S7P水平在光能異養(yǎng)生長條件下增加約兩倍。薪€靜薪^^虔凝合,#1/《游智'#欽圖5中示出了得自光能混合營養(yǎng)生長的培養(yǎng)物的提取物中的同位素體分布隨加入130葡萄糖后的時(shí)間的關(guān)系。產(chǎn)生圖5的實(shí)際數(shù)據(jù)在表3中列出。在光能混合營養(yǎng)生長的培養(yǎng)物中，在加入"C-葡萄糖20秒后，標(biāo)記的G6P+F6P就占總G6P+F6P庫(pool)的約40y。，這表明葡萄糖在集胞藻中的吸收和轉(zhuǎn)化非常快速。不足為奇的是，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，完全標(biāo)記的G6P+F6P是最豐富的同位素體(265wZ》。但是，在G6P+F6P庫中質(zhì)量比未標(biāo)記質(zhì)量多1、2、3或4的分子的快速出現(xiàn)是明顯的(它們各自在標(biāo)記20秒后占總庫的約6%)。質(zhì)量+2、+3和+4的峰的快速出現(xiàn)表明碳原子通過容易地可逆的轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)而非?？焖俚刂匦路峙?。具有一個(gè)"C原子的G6P+F6P分子的快速形成，可由部分標(biāo)記的G6P+F6P(例如1,2-"C2或3,4,5,6-"C4G6P+F6P)通過反應(yīng)10和11發(fā)生脫羧，然后通過反應(yīng)12和16再形成G6P+F6P向?qū)е?，或者由部分?biāo)記的G6P+F6P(例如3,4,5,6-"C4G6P+F6P)通過反應(yīng)3和4發(fā)生分裂，然后與未標(biāo)記的二羥基丙酮3-磷酸或甘油醛3-磷酸分子重組而導(dǎo)致。進(jìn)行標(biāo)記20分鐘后，對應(yīng)于未標(biāo)記的G6P+F6P的峰減少到占全體約15M，這表明在有加入的葡萄糖可供利用的情況下，細(xì)胞巾沒有大批(amajorbufferorreservoirof)未標(biāo)記糖聚合物被轉(zhuǎn)化成單體。表3.光能混合營養(yǎng)生長的集胞藻PCC6803中在"C-葡萄糖標(biāo)記后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的動(dòng)態(tài)同位素體分布a59標(biāo)記時(shí)間Cmin)00.331.552060化合物質(zhì)量IDbSDbIDSDIDSDIDSDIDSDIDSDG6P+F6P2591003.257.3■7.824.56.822.67.415.02.312.51.82600.00.26.62.810.83.45.40.46.41.46.22.02610.01.48.01.512.20.99.72.611.10.610.63.92620.00.15.51.312.10.69.41.511.31.913.00.72630.02.25.81.69.91.316.05.614.60.815.53.52640.00.11.31.28.12.010.13.517.13.016.01.52650.01.415.46.622.43.626.92.924.53.826.12.23PG+2PG1851000.695.42.2■75.64.745.58.642.64.039.34.41860.00.50.91.12.92.314.64.016.31.216.91.71870.00.02.00.77.31.323.70.525.01.024.70.61880.01.01.71.314.23.516.24.216.12.219.12.1PEP1671000.097.23.972.99.245.78.541.46.434.82.21680.00.70.40.51.91.614.64.715.12.416.32.51690.00.01.11.58.73.624.30.428.41.530.93.31700.00.01.40.616.45.415.45.115.11.418.04.6S7P2891003.038.82.611.95.58.31.08.52.06.51.12900.00.510.32.011.34.47.63.27.30.36.41.72910.00.123.54.820.42.315.04.114.41.313.51.52920.00.09.71.015.51.515.21.214.90.515.61.22930.00.08.21.715.31.317.00.517.71.217.90.62940.00.04.71.611.82.015.62.116.10.418.32.12950.00.03.23.37.81.213.03.313.41.214.22.32960.02.01.52.16.13.48.23.47.81.57.81.5數(shù)據(jù)是二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。ID，同位素體分布同位素體相對于化合物總量的百分?jǐn)?shù)。SD，標(biāo)準(zhǔn)偏差。3PG+2PG和PEP的13C分布圖譜相似，但這些化合物的標(biāo)記進(jìn)行得比G6P和F6P慢得多。20秒后，3PG+2PG和PEP幾乎沒有得到標(biāo)記(圖5)，這些C3中間體中的一半攜帶卜.至少--個(gè)標(biāo)記碳花掉了約5分鐘時(shí)間。在1.5分鐘時(shí)，3PG+2PG和PEP的主要標(biāo)記峰是源自完全標(biāo)記的G6P+F6P的其屮所有三個(gè)碳都被標(biāo)記的峰。5分鐘時(shí)及以后，3PG+2PG和PEP的主要標(biāo)記峰含有兩個(gè)標(biāo)記碳。3PG+2PG和PEP的標(biāo)記譜圖在后面的時(shí)間點(diǎn)沒有很大變化，在加入標(biāo)記后約20分鐘吋為止"C-標(biāo)記的同位素體分布已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。每分子具有兩個(gè)13C的3PG+2PG庫占優(yōu)勢，這提示在光能混合營養(yǎng)條件下，相當(dāng)部分的3PG是通過Calvin-Benson-Bassham循環(huán)來合成，每兩個(gè)合成的3PG摻入一個(gè)未標(biāo)記的C02，而另外的部分標(biāo)記的3PG60源自轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)中的同位素混雜(isot叩escmmbling)。在光能混合營養(yǎng)條件下，S7P庫快速地和部分地被標(biāo)記，更類似G6P+F6P標(biāo)記譜圖，而不是3PG+2PG或PEP的標(biāo)記譜圖。用"C-葡萄糖標(biāo)記20秒后，對應(yīng)于未標(biāo)記的S7P的峰己減少到50%以下，因此在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)有一-半以上的S7P分子含有一個(gè)或多個(gè)13C碳。在20秒時(shí)間點(diǎn)時(shí)標(biāo)記的與未標(biāo)記的S7P分子的比例甚至比G6P+F6P的還高。這表明轉(zhuǎn)酮醇酶/轉(zhuǎn)醛醇酶反應(yīng)的速度非常高，因?yàn)檫@些反應(yīng)將F6P的標(biāo)記直接或間接地轉(zhuǎn)移到S7P和其他化合物。在這些標(biāo)記的S7P同位素體當(dāng)中，在標(biāo)記開始后20秒時(shí)最豐富的一個(gè)含有兩個(gè)13C碳。這種分子可通過完全標(biāo)記的F6P與未標(biāo)記的GAP反應(yīng)形成具有兩個(gè)標(biāo)記碳的木酮糖-5-磷酸(X5P)，然后X5P與未標(biāo)記的R5P反應(yīng)產(chǎn)生具有兩個(gè)13C的S7P和產(chǎn)生GAP來形成。完全標(biāo)記的F6P和未標(biāo)記的E4P直接轉(zhuǎn)化成S7P和PGA會(huì)在S7P中產(chǎn)生三個(gè)13。S7P在標(biāo)記開始進(jìn)行后不久豐度較低(圖5)，這提示在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，通過轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)進(jìn)行的分子交換比通過轉(zhuǎn)醛醇酶進(jìn)行的分子交換更快速。更長的標(biāo)記時(shí)間以后，所有的S7P同位素體以可觀的數(shù)量(占總數(shù)的6-20%)存在，這表明標(biāo)記在S7P中幾乎完全混雜(scrambling)。在任何情況中，各糖磷酸之間的分子交換似乎比向磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化要快得多，這提示甘油醛-3-磷酸和磷酸甘油酸之間的步驟進(jìn)行得比較慢。^7\^^09;標(biāo)記^虔凝合,養(yǎng)#長游潛孝激。圖6顯示了用5mMNaH^C03標(biāo)記光能混合營養(yǎng)生長的培養(yǎng)物的結(jié)果；培養(yǎng)物屮還加入0.5mM未標(biāo)記的葡萄糖。這些數(shù)據(jù)在表4中定量給出。由于光合作用的C02固定導(dǎo)致3PG的形成，不足為奇的是，源自碳酸氫鹽的"C最快速地被摻入到3PG+2PG和PEP庫中在標(biāo)記開始進(jìn)行后20秒，已可顯示出明顯可測量數(shù)量的具有一個(gè)標(biāo)記13C的3PG+2PG和PEP，而在該時(shí)間標(biāo)記G6P+F6P極少被檢測至lj(圖6)。五分鐘后，3PG+2PG和PEP庫中有一半以上的分子含有至少一個(gè)13C。具有一個(gè)以上的13C的3PG+2PG分子的形成是預(yù)期到的，因?yàn)橐恍?PG再次被用于Calvin-Benson-Bassham循環(huán)的反應(yīng)中。在更長的標(biāo)記時(shí)間后，3PG+2PG和PEP的標(biāo)記譜圖沒有很大變化，這表明13C標(biāo)記譜圖已接近穩(wěn)態(tài)，摻入的標(biāo)記的量接近于通過Calvin-Benson-Bassham循環(huán)固定的碳的量，和源自(未標(biāo)記的)葡萄糖的量。表4.光能混合營養(yǎng)生長的集胞藻PCC6803a中進(jìn)行13C-NaHC03標(biāo)記后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇xi:丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的動(dòng)態(tài)同位素體分布。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>a數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。bID，同位素體分布同位素體相對于化合物總量的百分?jǐn)?shù)。SD，標(biāo)準(zhǔn)偏差。具有中.個(gè)i3C的G6P+F6P(質(zhì)量259)在標(biāo)記開始進(jìn)行后1.5分鐘才開始出現(xiàn)，而雙重標(biāo)記的G6P+F6P在標(biāo)記開始進(jìn)行后5分鐘大量存在。"C-標(biāo)記的S7P出現(xiàn)得比3PG+2PG和PEP慢，但比G6P+F6P快。這與符合以下方面S7P在Calvin-Benson-Bassham循環(huán)中(相對于C02固定)晚于3PG，大部分的從C02固定接受碳的F6P+G6P是經(jīng)S7P和其他Calvin-Benson-Bassham循環(huán)巾間體而形成，而不是經(jīng)通過逆糖酵解發(fā)生的糖異生而形成。即使在加入標(biāo)記的碳酸氫鹽后1小時(shí)，在標(biāo)記的S7P分子當(dāng)中，最豐富的同位素體只有單一13c，隨著質(zhì)量的增加，較重的同位素體的存在快速減少。這主要是有未標(biāo)記的葡萄糖存在以及轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶催化的交換的速度高的結(jié)果，并支持這樣的觀點(diǎn)在光能混合營養(yǎng)生長條件下，葡萄糖代謝和C02固定兩者都對碳代謝有顯著貢獻(xiàn)。^薪裔教#記^虔#泰主長游禁泰激。當(dāng)集胞藻在光能異養(yǎng)條件下生長時(shí)(即在PSII抑制劑阿特拉津及固定碳源如葡萄糖的存在下)，凈C02固定是可忽略的，因?yàn)榧词乖诩尤隢aH"C03后兩小時(shí)，3PG+2PG庫保持未被標(biāo)記(數(shù)據(jù)未顯示)。的確，如圖7所示，光能異養(yǎng)生長條件至今為止是本研究中所研究的三個(gè)條件中用130葡萄糖快速標(biāo)記所有中間體最為有效的一個(gè)條件。標(biāo)記進(jìn)行20秒后，G6P+F6P庫有一半以上已經(jīng)被標(biāo)記，且與光能混合營養(yǎng)條件下的情況形成對比的是，完全標(biāo)記的糖磷酸最為普遍。由于光能異養(yǎng)培養(yǎng)物中的G6P+F6P的庫大小類似于光能混合營養(yǎng)生長的細(xì)胞的G6P+F6P的庫大小(表2)，在光能異養(yǎng)條件下葡萄糖利用得比在光能混合營養(yǎng)條件下要快。在本研究監(jiān)測到的所有時(shí)間，完全標(biāo)記的G6P+F6P最為豐富，這表明與光能混合營養(yǎng)條件形成對比的是，在中央代謝中極少發(fā)生C02固定或者其他化合物向糖磷酸的代謝。如同在其他生長條件下觀察到的那樣，3PG+2PG和PEP具有類似的標(biāo)記譜圖。盡管最豐富的同位素體是完全標(biāo)記的化合物，具有兩個(gè)標(biāo)記的C的同位素體相對于完全標(biāo)記的同位素體來說也是豐富的，特別是在1.5-20分鐘的標(biāo)記時(shí)間范圍。對3PG+2PG和PEP進(jìn)行的標(biāo)記發(fā)生得比對G6P+F6P進(jìn)行的標(biāo)記或?qū)7P進(jìn)行的標(biāo)記要慢，這進(jìn)一步支持了對在光能混合營養(yǎng)條件下作出的觀察結(jié)果的解釋即，通過轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)容易發(fā)生相互交換，而與磷酸甘油酸的相互交換則慢得多。雖然完全標(biāo)記的3PG、2PG或PEP可通過糖酵解途徑或戊糖磷酸途徑形成，但這些僅攜帶兩個(gè)13C標(biāo)記的分子的形成要求糖酵解途徑或戊糖磷酸途徑的酶類共同作出貢獻(xiàn)。衍自戊糖磷酸途徑反應(yīng)的具有2-5個(gè)130標(biāo)記碳的部分標(biāo)記F6P，可通過糖酵解產(chǎn)生攜帶兩個(gè)13C標(biāo)記碳的3PG和2PG。在光能異養(yǎng)條件下用130葡萄糖進(jìn)行標(biāo)記20秒后，標(biāo)記的S7P分子特別是摻入了2、4或7個(gè)13C原子的那些S7P分子，其總數(shù)超過未標(biāo)記的S7P分子。僅摻入一個(gè)"C的S7P分子基本上不存在。隨著標(biāo)記時(shí)間的增加，具6個(gè)"C原子的分子的庫也增加，而具有較少13C原子的庫通常隨吋間推移而減少，這反映出未被標(biāo)記的中間體的庫被損耗。在進(jìn)行標(biāo)記60分鐘后，大部分的S7P完全被標(biāo)記，一些具有1個(gè)未被標(biāo)記的C。圖5-7所示的結(jié)果表明，同位素體分布模式取決于生長模式和所加入的同位素的種類。同位素體分布模式在每個(gè)條件下都十分可再現(xiàn)，這表明視具體的生長條件而定，集胞藻中流向中央糖磷酸途徑的代謝流是確定的(well-defmed)。因此，各中間體的測量濃度的變動(dòng)(表2)很可能反映的是提取效率的變動(dòng)，而不是在相同條件下生長的不同集胞藻培養(yǎng)物的代謝能力的大變動(dòng)。#記。為更直接地確定標(biāo)記隨時(shí)間推移摻入到中央代謝物中的量，對不同生長條件下隨時(shí)間推移G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和S7P中13C的量和總碳的量進(jìn)行了計(jì)算對比。結(jié)果在表5中總結(jié)，證實(shí)了之前章節(jié)內(nèi)容中作出的較為定性的觀察結(jié)果，即G6P+F6P和S7P在光能混合營養(yǎng)條件和光能異養(yǎng)條件這兩個(gè)條件下用13<:-葡萄糖作為標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記都比3PG+2PG和PEP要快，而當(dāng)用碳酸氫鹽進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，標(biāo)記出現(xiàn)在3PG+2PG和PEP中要比出現(xiàn)在G6P+S7P中快得多，因?yàn)槿冀黹g體更接近于初級(jí)C02固定產(chǎn)物(3PG)。相似的標(biāo)記比例大概暗示著快速的代謝相互聯(lián)系(metabolicinterconnection)。但是，即使當(dāng)對標(biāo)記的葡萄糖與碳酸氫鹽中的碳數(shù)目加以校正時(shí)，3PG+2PG和PEP中的標(biāo)記的量在用碳酸氫鹽標(biāo)記時(shí)也比在用葡萄糖標(biāo)記時(shí)出現(xiàn)得更慢。其原因可能在于葡萄糖和碳酸氫鹽/C02之間吸收速度的差異、Calvin-Benson-Bassham循環(huán)的動(dòng)力學(xué)與葡萄糖代謝的動(dòng)力學(xué)的差異和/或在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)未標(biāo)記的碳庫的大小的差異。將標(biāo)記比例對標(biāo)記時(shí)間作圖后，每個(gè)化合物在開始進(jìn)行標(biāo)記后的無窮時(shí)間(infinitetime)時(shí)的標(biāo)記比例(即最終穩(wěn)態(tài)標(biāo)記比例)可通過回歸分析來外推斷(表5)。在供給UC-葡萄糖的光能異養(yǎng)培養(yǎng)物中，糖磷酸和三碳磷酸中的碳有90%可被標(biāo)記，這與在這些條件下C02固定被抑制相符合中央碳代謝途徑中幾乎所有的碳都衍自葡萄糖。但是，當(dāng)培養(yǎng)物進(jìn)行光能混合營養(yǎng)生長時(shí)，3PG+2PG庫中的總碳只有一半被"C-標(biāo)記，不管提供的是標(biāo)記的葡萄糖還是碳酸氫鹽(表5)。這表明當(dāng)細(xì)胞在光能混合營養(yǎng)條件下生長時(shí)，3PG+2PG和PEP水平上的碳有約一半來自碳酸氫鹽，另一半來自葡萄糖。但是，在光能混合營養(yǎng)條件下，G6P+F6P和S7P被葡萄糖標(biāo)記比被碳酸氫鹽標(biāo)記更強(qiáng)烈；這大概是因?yàn)檫@個(gè)事實(shí)這些糖磷酸離葡萄糖只有幾個(gè)代謝步驟，而3PG是通過Calvin-Benson-Bassham循環(huán)進(jìn)行的C02固定的產(chǎn)物。在任何情況中，有趣的是，表5中的每個(gè)化合物的"C-葡萄糖標(biāo)記分?jǐn)?shù)(fraction)加13C-碳酸氫鹽標(biāo)記分?jǐn)?shù)在達(dá)到穩(wěn)態(tài)標(biāo)記時(shí)接近于90%,這提示在光能混合營養(yǎng)條件下葡萄糖代謝途徑和C02固定途徑完全互補(bǔ)。表5.集胞藻PCC6803在光能混合營養(yǎng)(PM)和光能異養(yǎng)(PH)生長條件下用BC-葡萄糖(G)或13C碳酸氫鹽(B)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，藻體中的動(dòng)態(tài)標(biāo)記比例a"C標(biāo)記時(shí)間(mm)生長_模式標(biāo)記代謝物00.331.5-52060最終bPMGG6P+F6P0士0.426.3±2.848.0±3.854.9±3.058.9士1.360.7±2.3643PG+2PG0士0.53.1±0.920.2±2.737.3±5.038.2士2.34L.2士1.945PEP0士0.33.8±2.222.6±4.636.8±5.639.1士2.344.1±2.045S7P0±0.224.8±2.244.2±3.652.2±1.752.4±0.854.6±1.361PMBG6P+F6P0±0.40.9±0.61.5±0.29.5±1.38.0±2.116.8±0.5243PG+2PG0±0.23.9±0.36.6±0531.3±3.228.3±1.241.7±1.042.5PEP0±0.33.3±0.97.2±0.231.6±2.226.8土1.638.9±1.142.5S7P0±0.21.2±0.41.7±0.313.7±1.911.2±0.619.9±1.426PHGG6P+F6P0±0.361.5±0.474.0士O.l72.2±4.079.6±2.283.7±3.1903PG+2PG0±0.59.7±1.341.9±2.966.2±3.578.4±0.383.0±0.9卯PEP0±0.49.0±1.643.6士0.766.5±3.677.2士3.282.7±2.890S7P0±0.447.2±0.366.7士3.063.9±5.282.7±4.288.6±1.490a標(biāo)記比例定義為標(biāo)記的總量占化合物(包括它所有的同位素體)的所有碳的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)是二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。65h標(biāo)示"最終"的那一列代表穩(wěn)態(tài)時(shí)的標(biāo)記比例，是從本表的數(shù)據(jù)外推到"無窮"時(shí)間時(shí)的標(biāo)記比例。這提供了新的方法，來分析集胞藻中的中央代謝流，從而監(jiān)測13c-標(biāo)記的代謝中間體在加入標(biāo)記碳源后隨時(shí)間的推移的動(dòng)態(tài)分布。在集胞藻中，流向中央代謝途徑的代謝流相對于中間體的庫大小是快的，因?yàn)橹虚g體的標(biāo)記譜圖在20秒到1.5分鐘的時(shí)間尺度上發(fā)生顯著變化。當(dāng)將13C葡萄糖加到培養(yǎng)物時(shí)，它容易被細(xì)胞吸收并被磷酸化。從G6P+F6P庫，分子可用于戊糖磷酸途徑或糖酵解，或者通過轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成其他的糖磷酸。當(dāng)用均勻標(biāo)記的^C-葡萄糖來標(biāo)記光能混合營養(yǎng)培養(yǎng)物或光能異養(yǎng)培養(yǎng)物時(shí)(圖5和7)，一個(gè)意想不到的特征是部分標(biāo)記的G6P+F6P分子的快速形成，這表明標(biāo)記發(fā)生快速混雜，從而G6P+F6P庫和部分標(biāo)記的具有不同碳原子數(shù)的分子的庫之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。G6P+F6P庫中的標(biāo)記的混雜情況類似于S7P，這提示這兩類糖磷酸之間發(fā)生直接或間接的但動(dòng)力學(xué)上快速的相互作用。這個(gè)快速混雜的方式可能是多樣的，每種同位素體通過數(shù)個(gè)反應(yīng)的組合而形成。對標(biāo)記譜圖的詳細(xì)分析可揭示出不同生長條件下的一般代謝流。具體的說，涉及F6P的轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶反應(yīng)在同位素體的快速混雜中起到主要作用。轉(zhuǎn)醛醇酶反應(yīng)的速度(F6P+E4P生成S7P+GAP，反之亦然M以乎沒有和轉(zhuǎn)酮醇酶反應(yīng)的速度一樣高，因?yàn)樵诠饽芑旌蠣I養(yǎng)條件下加入"C-葡萄糖20秒后具有3個(gè)或7個(gè)標(biāo)記碳的S7P沒有占優(yōu)勢(圖5)。此外，具有5個(gè)13C的S7P同位素體水平低但具有2個(gè)13C的S7P同位素水平高的這一事實(shí)提示，從Ru5P流向R5P的通量相對較低；與之成對比的是，Ru5P和X5P之間的通量快得多，以確保CalvinCalvin-Benson-Bassham循環(huán)和戊糖磷酸途徑的自由流動(dòng)。在G6P+F6P的光能異養(yǎng)標(biāo)記譜圖中，在標(biāo)記后的所有時(shí)間點(diǎn)最豐富的同位素體是質(zhì)量+6，這與這些生長條件下葡萄糖的快速流入一致。和在光能混合營養(yǎng)條件中一樣，G6P+F6P的質(zhì)量+2和質(zhì)量+4的快速標(biāo)記表明反應(yīng)16出現(xiàn)且是可逆的。與在光能混合營養(yǎng)條件下的生長相比，在20秒后具有5個(gè)標(biāo)記C的G6P+F6P同位素體豐富，而具有一個(gè)標(biāo)記C的G6P+F6P同位素體不豐富。這個(gè)差異很n丄能是因?yàn)镋4P在光能異養(yǎng)條件下容易被標(biāo)記所致，這可提示E4P庫較小或者與源自葡萄糖的碳的交換較快速。具有3個(gè)標(biāo)記碳的G6P+F6P同位素體，很可能是在標(biāo)記的S7P與未標(biāo)記的GAP發(fā)生轉(zhuǎn)醛醇酶反應(yīng)(反應(yīng)15)后衍自標(biāo)記的S7P。S7尸庫源自攜帶至少兩個(gè)13C的完全標(biāo)記R5P和X5P的完全標(biāo)記S7P同位素體，在生長在光能異養(yǎng)條件下的細(xì)胞中開始進(jìn)行標(biāo)記后20秒就己大量存在，遠(yuǎn)早于標(biāo)記的3PG+2PG的增加，這表明S7P的下游有限速步驟。具有兩個(gè)標(biāo)記碳的S7P同位素體~~~大概是通過未標(biāo)記的R5P與標(biāo)記的X5P的反應(yīng)(反應(yīng)14)而形成——只是短暫的，在開始進(jìn)行標(biāo)記后1.5分鐘基本上消失(圖7)，這表明糖磷酸庫被快速標(biāo)記。其他的部分標(biāo)記的S7P同位素體庫(例如具有4個(gè)或5個(gè)nC的同位素體)隨時(shí)間的消失進(jìn)一步支持這個(gè)論斷。3PG+2PG/〃P/P岸。在130葡萄糖情況下，3PG+2PG峰中的標(biāo)記的量直到1.5分鐘時(shí)間點(diǎn)為止都保持非常小，不管細(xì)胞是在光能混合營養(yǎng)條件下還是在光能異養(yǎng)條件下生長(表5)。在集胞藻中，GAP庫小(圖1B)，標(biāo)記到達(dá)3PG+2PG和PEP庫的延遲提示，從GAP到3PG的通量相對于各糖磷酸之間的通量是慢的。在集胞藻中，有兩個(gè)GAP脫氫酶，一個(gè)(GAP-1)顯然催化正向反應(yīng)(從GAP到二磷酸甘油酸)，另一個(gè)(GAP-2)則催化反向反應(yīng)(從二磷酸甘油酸到GAP)(Koksharova等乂，1998)。編碼GAP-1的基因的表達(dá)是弱的(Figge#"乂，2000)，因此這個(gè)步驟可能是限速的，以使碳從糖磷酸庫的損失減至最低。如果的確GAP-1是限速的，由于戊糖磷酸途徑和糖酵解都利用這個(gè)步驟，這些途徑哪個(gè)對藍(lán)細(xì)菌的糖代謝最重要的這個(gè)問題(Yang等乂，2002a)可能已失去了其重要性的大部分。GAP脫氫酶在調(diào)節(jié)糖磷酸代謝網(wǎng)絡(luò)中的重要性，在其他光合作用系統(tǒng)中也有報(bào)道(Ihlenfeldt和Gibson,1975;Tamoi寧乂，2005;Wedel和Soil,1998)。在光能混合營養(yǎng)條件下，3PG通過碳固定的形成(不涉及GAP-1)似乎是主要途徑。這可與這個(gè)觀點(diǎn)相一致RuBisCO活性本身不是藍(lán)細(xì)菌屮的光合作用流的主要瓶頸(Marcus等乂，2005)。如圖6和表5中所示，在光能混合營養(yǎng)條件下用標(biāo)記的碳酸氫鹽對3PG+2PG和PEP庫進(jìn)行的標(biāo)記，要比對糖磷酸庫進(jìn)行的標(biāo)記多得多，這表明從3PG到PEP的通量非?？欤珿6P+F6P庫從糖異生的流入與其從葡萄糖的流入相比不占優(yōu)勢。高標(biāo)記比例還提示，Calvin-Benson-Bassham循環(huán)在對固定的(302進(jìn)行循環(huán)中是非?？斓?。由于C02只能給3PG+PEP庫提供大約一半的碳源(表5)，通過Calvin-Benson-Bassliam循環(huán)產(chǎn)生的3PG有二分之二需要流回糖磷酸，包括F6P在內(nèi)。集胞藻巾GAP-2的mRNA和蛋A質(zhì)表達(dá)水平在光能混合營養(yǎng)條件下比在光能異養(yǎng)條件下增加約兩倍(Yang#Vl，2002b)。反應(yīng)16(GAP+S7P生成F6P+E4P)除了從糖異生的流入和葡萄糖利用外，還涉及G6P+F6P庫的再生，同吋，被消耗的S7P還得到更新。值得注意的是，在RuBP再生過程中，碳流的主流是從3PG到GAP、X5P、Ru5P和RuBP，這些中間體庫因?yàn)樘妓衔锎x網(wǎng)絡(luò)的特性所致的化學(xué)反應(yīng)屏障，與其他中間體如G6P+F6P、E4P和S7P相對分隔。J^^^^/7/^^^^^^遂徑。有幾篇文章指出，在光能異養(yǎng)條件下，大部分的G6P是通過戊糖磷酸途徑(涉及6-磷酸葡萄糖酸的脫羧)被利用，極少數(shù)是通過糖酵解代謝(例如(Pelroy等乂，1972;Yang^X，2002a))。的確，S7P在光能異養(yǎng)條件下非?？焖俚乇煌耆珮?biāo)記(圖7)，這表明所有的糖磷酸庫(包括E4P、X5P等)都被快速標(biāo)記，符合活性戊糖磷酸循環(huán)。在光能混合營養(yǎng)條件下沒有觀察到S7P被完全標(biāo)記(圖5)，這表明存在著大量的未標(biāo)記糖磷酸庫，和G6P向磷酸葡萄糖酸的轉(zhuǎn)化可能較少。但是，Knowles和Plaxton(Knowles和Plaxton,2003)報(bào)道說，在集胞藻中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的活性(以及磷酸果糖激酶的活性)在光能混合營養(yǎng)生長條件下和光能異養(yǎng)條件下保持不變，這提示糖酵解和戊糖磷酸途徑的大多數(shù)反應(yīng)主要在底物水平上被調(diào)節(jié)。但是，G6P+F6P庫(表l)以及G6P/F6P分布(數(shù)據(jù)未顯示)在兩個(gè)生長條件之間沒有很大變化。而且，在黑暗中在葡萄糖的存在下，G6PDH活性據(jù)報(bào)道增加lO倍以上(Kurian#X，2006)，G6PDH被無細(xì)胞提取物中的RuBP和NADPH高度抑制(Pelroy等乂1972;Pelroy#X，1976)。因此，在至少光能異養(yǎng)條件下，通過戊糖磷酸途徑的重要流是顯而易見的，這一點(diǎn)與觀察結(jié)果完全一致。在光能混合營養(yǎng)條件下，被13C葡萄糖--碳標(biāo)記的G6P+F6P的峰揭示G6PDH仍具有功能性，不過這個(gè)通量會(huì)非常小，因?yàn)樵谶@些條件下3PG+2PG庫不被快速標(biāo)記。然而，在一些研究巾(Shasri和Morgan,2005;Yang^^乂，2002a)，這個(gè)通量被忽視。這個(gè)不一致更可能是因?yàn)閷λ麄兊臄?shù)據(jù)的闡釋而造成，盡管生長條件也有差異，主要是光強(qiáng)度和無機(jī)碳源的差異。雖然戊糖磷酸途徑和Calvin-Benson-Bassham循環(huán)主要是逆過程(reverseprocess),但Calvin-Benson-Bassham循環(huán)在混合營養(yǎng)條件下占優(yōu)勢并不排除G6PDH仍具有功能性的可能性。我們的通量圖(fluxmap)與之前的(Yang寧乂，2002a)相比的另一主要差異是，在我們構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)中，DHAP、GAP和3PG+2PG庫由于它們在中央代謝網(wǎng)絡(luò)中的角色和在13C標(biāo)記測量中的可區(qū)別行為而被單獨(dú)考慮?；贑13碳酸氫鹽對3PG+2PG的標(biāo)記譜圖，發(fā)現(xiàn)在光能混合營養(yǎng)條件下，要求G6P+F6P從循環(huán)的3PG再生。這里給出的結(jié)果表明，對隨時(shí)間推移的穩(wěn)定同位素標(biāo)記情況進(jìn)行的直接檢測，提供了測定各化合物之間的代謝關(guān)系和速度的直接方式。這個(gè)工作目前是第一步，對化合物的建模(modeling)以及更靈敏的檢測會(huì)有助于更詳細(xì)的分析。應(yīng)用另外的標(biāo)記，可進(jìn)行更為靈敏的代謝物檢測，且結(jié)合突變分析，可進(jìn)行還更詳細(xì)的體內(nèi)代謝流分析。這個(gè)方法可容易地應(yīng)用到容易吸收特定固定碳化合物的微生物，以直接和快速測量艽代謝流，甚至代謝網(wǎng)絡(luò)尚未完全了解的微生物也可應(yīng)用這個(gè)方法。表6.光能異養(yǎng)生長的集胞藻PCC6803中進(jìn)行130葡萄糖標(biāo)記后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的動(dòng)態(tài)同位素體分布a。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>a數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。bID，同位素體分布同位素體相對于化合物總j:的百分?jǐn)?shù)。SD，標(biāo)準(zhǔn)偏差(通向fledBCD過量表達(dá)代謝工程中通向脂質(zhì)生物合成增加的第一步，是過量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶AccABCD的各成分。對集胞藻PCC6803的acc乂基因、aco8基因、accC基因和occD基因的編碼區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增(圖12)，用以使這些基因在集胞藻基因組中聯(lián)合表達(dá)的質(zhì)粒在圖13中顯示。實(shí)施例3用以增加PHB(生物塑料)含量的經(jīng)修飾藍(lán)細(xì)菌1.材料和方法潘^"^^^^^^姿斧..為了解PHB合成在集胞藻PCC6803中的生理角色，在不同培養(yǎng)條件下比較了代謝途徑發(fā)生改變從而導(dǎo)致PHB含量顯著不同的一系列突變株。己描述了缺乏三個(gè)末端氧化酶(細(xì)胞色素""3型細(xì)胞色素c氧化酶(CtaI)、推定的細(xì)胞色素型醌醇氧化酶(CtaII)和細(xì)胞色素k/型醌醇氧化酶(Cyd))的突變株(Howitt等「乂，1998)。之后通過另外缺失編碼光合系統(tǒng)II的CP47蛋白的戸/^，建立了缺乏光合作用氧釋放和呼吸氧耗的PSII缺失/氧化酶缺失的突變株(Howitt等Vl，2001)。藍(lán)螺藻(CyanoRubmm)這個(gè)由MichaelGurevitz博士(以色列特拉維夫大學(xué))惠贈(zèng)的突變株，其中的原始藍(lán)細(xì)菌RuBisCO基因用來自深紅紅螺菌(朋06fo^w7〃wwn^n/w)的相應(yīng)基因進(jìn)行了替代，深紅紅螺菌是一種進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的微生物(Amichay等乂，1992)。由于兄n//>n^RuBisCO的氧合-羧化活性比相對較高，該突變株只能在增高的C02濃度下生長。缺乏偏好I型NADPH的脫氫酶(NDH-1)的菌株——這個(gè)菌株由TeruoOgawa博士(之前在日本名古屋大學(xué))惠贈(zèng)一也因?yàn)閐轉(zhuǎn)運(yùn)受削弱而要求富含C02的空氣來生長(Ogawa,1991)。通過缺失集胞藻PCC6803中存在的三個(gè)相應(yīng)基因("必乂、"必S/〃m必C)，構(gòu)建了缺乏NADH氧化性II型脫氫酶(NDH-2)的菌株(Howitt爭乂，1999)。將集胞藻PCC6803野生型、缺失末端氧化酶突變株、PSII缺失/氧化酶缺失突變株和NDH-2缺失突變株在BG-ll培養(yǎng)基中進(jìn)行生長，在30。C下鼓泡通入空氣；對于藍(lán)螺藻菌株和NDH-1缺失菌株，鼓泡通入富含2%C02的空氣。BG-ll培養(yǎng)基用5mMTES[7V-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]-NaOH(pH8.0)緩沖，例外的是，向PSTI缺失/氧化酶缺失的培養(yǎng)物加入的是10mMTES-NaOH(pH8.0)。由于PSII缺失/氧化酶缺失突變株失去了光能自養(yǎng)生長的能力，在所有條件下給它在培養(yǎng)基中供應(yīng)5mM葡萄糖。當(dāng)指明時(shí)，從BG-ll去掉NaN03，用10mMNH4C1代替("還原型N(N-reduced)")。通過將被沉淀下來的在正常BG-ll培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞洗滌并轉(zhuǎn)移到分別省去了NaN03或K2HP04的BG-ll中，獲得氮饑餓的培養(yǎng)物或磷饑餓的培養(yǎng)物。在氮或磷限制的條件中，培養(yǎng)基中的氮源或磷源各自減少到原始濃度的10%。當(dāng)指明時(shí)，將6-二偶氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)加到BG-ll培養(yǎng)基中至0.5mM終濃度，DON是谷氨酸合酶(也稱谷氨酸合酶-谷氨酰胺-2-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOGAT))的特異性抑制劑。對于在平板上的生長，加入1.5%(w/v)瓊脂和0.3%(w/v)硫代硫酸鈉，給BG-ll補(bǔ)加特定菌株因?yàn)榇嬖谥氲陌殡S基因失活(geneinact冊tion)的抗生素抗性標(biāo)記而能抵抗的抗生素。所用濃度為20pg的博來霉素(zeocin)mr1、25ng的卡那霉素mr1、25ng的紅霉素mr1、25(iig的壯觀霉素m1—1和/或14ng的氯霉素m1—1。各菌株在50pmol光子nT2s—1的光強(qiáng)度下進(jìn)行光能自養(yǎng)生長，除非另有指明。通過用ShimadzuUV-160分光光度計(jì)在730nm處測量培養(yǎng)物的光密度，監(jiān)測生長情況。在OD73。0.5時(shí)獲得對數(shù)期中期培養(yǎng)物；穩(wěn)定期培養(yǎng)物在生長7天后收獲。^學(xué)返激錄辨冶^^徵潔澄產(chǎn).*為通過光學(xué)顯微鏡觀察PHB顆粒，將50^的經(jīng)過濾滅菌的囉嗪染料尼羅藍(lán)A1%水溶液加到集胞藻培養(yǎng)物的2ml等分試樣，在觀察前使細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長12小吋。然后離心沉淀細(xì)胞，用BG-ll培養(yǎng)基洗滌兩次。將細(xì)胞用一薄層的l%(w/v)BG-ll瓊膠固定化在顯微鏡載玻片上，立即用蓋玻片蓋住。將各載玻片在Zeiss落射熒光顯微鏡(Axioskop)或LeicaTCSSP2多光子共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行檢查，在488nm處激發(fā)，在560nm至620nm之間檢測熒光發(fā)射。在染色后，以微分干涉差(DIC)模式或熒光模式監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)(激發(fā)濾光片BP450-490;光束濾光片F(xiàn)T510;屏障濾光片BP515-565)。基本上按之甜的描述(Mohamed等Vl，2005)，進(jìn)行透射電子顯微鏡檢査。細(xì)胞用Balzers高壓冷凍機(jī)進(jìn)行冷凍固定。用1%戊二醛和2%單寧酸的丙酮溶液在-85。C下進(jìn)行冷凍置換(Freeze-substitution)48-72小時(shí)，再在I%0s04的丙酮溶液中進(jìn)一步固定8小時(shí)。將細(xì)胞包埋在Spurrs樹脂中，切成70nm厚的切片；然后將這些切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進(jìn)行后染色。用PhilipsCM12掃描透射電子顯微鏡在80kV下觀察細(xì)胞。P/M分^^7;^量，通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)分析不同菌株的胞內(nèi)PHA含量。將OD73Q=0.5(代表對數(shù)期)或OD73?！?.0(代表穩(wěn)定期；培養(yǎng)了7天)的細(xì)胞培養(yǎng)物通過離心(IOmin,3,200xg,4。C)或者通過1pn孔徑膜過濾進(jìn)行收集，用水洗漆細(xì)胞兩次。將所得的沉淀在液氮中冷凍，在-80。C下保藏，凍干至少24小時(shí)。然后將細(xì)胞在105。C下干燥4小時(shí)。用Mini-BeadBeater(BiospecProducts,Bartlesville,OK)將干燥的細(xì)胞(10-30mg)在1.5ml氯仿屮進(jìn)行破碎(3x60s，各次破碎之間在冰上溫育30秒)。取出1ml等分試樣，與1ml酸化的甲醇(20%HC1v/v)合并，進(jìn)行甲醇分解作用。將樣品和PHB標(biāo)準(zhǔn)物(0.1-10mg/ml)在帶有襯特富龍蓋(Teflon-linedcap)的15mlPyrex試管中95。C下加熱2.5小時(shí)。隨后，通過在冰上溫育5分鐘將樣品冷卻。通過將0.5ml的較濃稠的氯仿相轉(zhuǎn)移到另一含有0.5mlH20的10mlPyrex試管中，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的純化。劇烈振蕩3分鐘并離心(1,500xg，3分鐘)后，將2pl含有PHB甲酯的氯仿相注射到GC柱上進(jìn)行分析。GC/MS分析是在具有DB-5MS柱(30mx0.25nm內(nèi)徑，0.25pm膜厚)的Shimadzu17-A氣相色譜儀和與數(shù)據(jù)處理器(GCMSsolutions軟件；Shimadzu，日本)連接的ShimadzuQP5000質(zhì)譜儀上進(jìn)行。在200。C下，線性速度為20-30cm/s，以氦為載氣。注射口的溫度設(shè)定為210。C，界面溫度設(shè)定為250。C。使用了一下GC爐溫度方案(temperatureprofile):60°C下1分鐘，接著以8。C/分鐘的升溫速度升到160。C，然后在160。C下等溫加熱5分鐘，最后運(yùn)行是在200。C下4分鐘。平衡時(shí)間為60°C下2分鐘。在每次以總離子掃描模式進(jìn)行檢測后，使用單離子監(jiān)測(SIM)模式，以獲得更高的定量準(zhǔn)確性。修改兩個(gè)獨(dú)立的方法以用來分析每個(gè)菌株中的煙酰胺核苷酸水平。首先，通過從(Zhang#乂，2000)改進(jìn)的酶促反應(yīng)方法，分光光度測定NAD和NADP的還原水平。在4。C下離心收獲到大約400-500ml的液體培養(yǎng)物。將所得沉淀用H20洗滌兩次，重懸在1ml含有的0.1MTris-HCl,pH8.0、0.01MEDTA和0.05%(v/v)TritonX-100的提取緩沖液中。加入大約一半體積的玻璃微珠(70-100nm直徑)，用Mini-BeadBeaterTM破碎細(xì)胞(4x30s，在各次振動(dòng)之間在冰上溫育1分鐘)。破碎后，所有步驟均在黑喑中進(jìn)行，以避免吡啶核苷酸的光降解。將所得混合物在Eppendorf微量機(jī)中離心14,000rpm離心3分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新管。將上清液用一半體積的氯仿提取兩次，以除去脂質(zhì)和大部分蛋白質(zhì)。在如下四個(gè)不同條件下獲取340nm處的吸光度讀數(shù)。通過將20pl提取物加到原始提取緩沖液至1ml最終體積，測定總(NADPH+NADH)水平(J7)。通過將另一20pl的提取物加到含有0.1MTris-HCl(pH8.0)、0.01MMgCl2、0.05%(v/v)TritonX-IOO、5mM葡萄糖-6-磷酸和5.0IUNADP特異性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD;SigmaChemicalCo.,G-4134)的1ml反應(yīng)混合物并在37°C下溫育5分鐘，樣品中所有的NADP+都轉(zhuǎn)化成NADPHC42)。將第三等份的20pl提取物在含有O.lM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)、0.05。/0(v/v)TritonX-IOO、5mM谷胱甘肽(GSSG)和5.0IU谷胱甘肽還原酶(GR;Sigma)的反應(yīng)混合物中25°C下溫育5分鐘，使所有NADPH的轉(zhuǎn)化成NADP+03)。第四個(gè)讀數(shù)是在20pl提取物在0.1MTris-HCl,pH8.0、1%(w/v)牛血清白蛋白、7%乙醇、5.0TUNAD特異性醇脫氫酶的1ml混合物中25。C下反應(yīng)5分鐘后讀取，NAD+轉(zhuǎn)化成NADH(乂4)。所有的反應(yīng)混合物都在加入提取物之前在相應(yīng)的溫度下預(yù)溫育5分鐘。4/-^43代表樣品中的NADPH的總量;^42-爿7代表NADP+的總量;^43代表NADH的總量；-^代表NAD+的總量。NAD(P)H的摩爾消光系數(shù)取6.3x103cm—1(Bergmeyer,1975)。從Klaidman等人(1995)的方法改造的基于熒光的高壓液相(HPLC)方法，之前已被描述(Cooley等乂，2001)為可提取和檢測衍生化后的NADP-NADPH和NAD-NADH。首先，將1升的細(xì)胞(00730=0.5)沉淀下來，并重懸于1ml的含有0.06mMKOH、0.2mMKCN和1mM紅菲繞啉二磺酸的混合物中1。在這個(gè)溶液中，氧化形式的NAD和NADP用CN進(jìn)行衍生化，使得該氧化形式通過熒光能以與還原形式的效率幾乎相當(dāng)?shù)男士梢?在330nm處激發(fā)后在460nm處發(fā)射)(Klaidman等人，1995)。加74頁入玻璃微珠至1.5ml的總體積，如上所述破碎細(xì)胞。將樣品在Eppendorf5415微量離心機(jī)中14,000rpm下離心5分鐘除去不溶物，上清液用0.5體積的氯仿提取，以確保除去脂質(zhì)。樣品在荷載前先離心通過0.45卞m孔徑的微量離心濾器(microcentrifugespinfilter)。通過帶熒光檢測的HPLC，用帶Agilent1100熒光檢測器禾口SupelcoSupelcosil5,C18柱(4.6x250mm分析柱，設(shè)計(jì)用于有效分離核苷酸)的HP1100LC監(jiān)測氧化形式的和還原形式的NAD和NADP的濃度和比例。2.結(jié)果戶^4;^^游^^^;^定。用相差光學(xué)顯微鏡術(shù)對PHA顆粒的直接觀察，常被用作細(xì)菌中PHA的可行篩選方法(McCool寧乂，1999)。但是，這個(gè)方法并不適用于藍(lán)細(xì)菌，因?yàn)榇嬖谥惸殷w膜以及諸如藻青素和聚磷酸鹽的內(nèi)含體。為增強(qiáng)PHA顆粒的可見性，用親脂性鵬嗪染料尼羅藍(lán)A對細(xì)胞染色。該染料的鵬嗪酮形式即尼羅粉紅(nilepink)是通過尼羅藍(lán)A在水溶液中自發(fā)氧化形成的。傳統(tǒng)上，尼羅藍(lán)染色包括將細(xì)胞熱固定到載玻片上，這能將細(xì)胞殺死，然后用相對高濃度的染料進(jìn)行染色(Ostle^X，1982)。但是，在藍(lán)細(xì)菌中，由于色素的存在，這個(gè)處理會(huì)導(dǎo)致高背景熒光。相反，活的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞是這樣染色的將0.04n/。(w/v;終濃度)尼羅藍(lán)A水溶液加到對數(shù)生長期前期的2ml培養(yǎng)物等分試樣，使培養(yǎng)物再生長12小時(shí)后才采樣。對照實(shí)驗(yàn)表明，最高達(dá)0.25。/。(w/v)的染料不會(huì)影響細(xì)胞生長的速度或者最大細(xì)胞密度(數(shù)據(jù)未顯示)。在顯微鏡載玻片上包埋在瓊脂屮的細(xì)胞在這些條件下能存活至少3-4小時(shí)，而尼羅藍(lán)/尼羅紅熒光產(chǎn)量沒有很大的減少。在激發(fā)時(shí)，PHA顆粒在集胞藻細(xì)胞的紅色自體熒光背景上可見為明亮的橙色斑點(diǎn)(圖9)。在營養(yǎng)平衡的條件下，在正常的BG-ll培養(yǎng)基中，直到穩(wěn)定期后期為止，在野生型的細(xì)胞中(圖9A)或者藍(lán)螺藻菌株或NDH-2缺失臠株的細(xì)胞中(未顯示)沒有檢測到的PHB顆粒。但是，即使在BG-ll培養(yǎng)基中在對數(shù)生長期過程中，在PSn缺失/氧化酶缺失突變株(圖9D)、氧化酶缺失突變株(圖9E)和NDH-1缺失突變株(圖9F)的細(xì)胞中也觀察到多個(gè)顆粒。在轉(zhuǎn)移到其中氮源減少到原始濃度的10%的氮限制培養(yǎng)基后，野生型幾乎立即積累PHA，在穩(wěn)定期可看到每個(gè)細(xì)胞平均有約4個(gè)顆粒(圖9B)。當(dāng)將還原型氮源如氯化銨供應(yīng)給生長培養(yǎng)基替代硝酸鹽后，光能自養(yǎng)生長的野生型在對數(shù)生長過程中積累PHA(圖9C)。用銨替代硝酸鹽后，培養(yǎng)物以正常速度生長并保持其正常外觀。前一段落給出的結(jié)果提示，減少固定氮源會(huì)導(dǎo)致PHA的積累，這可能是因?yàn)閷τ糜谙跛猁}還原的NADH/NADPH的需求降低所致。但是，另一解釋會(huì)是，可供利用的氮少，這本身就導(dǎo)致PHA積累16.7mM硝酸鹽被10mM銨替代，因?yàn)楦叩匿@濃度是有毒的。為試驗(yàn)這個(gè)可能性，將0.5mM(終濃度)的谷氨酸合酶特異性抑制劑DON加到BG-ll培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期野生型培養(yǎng)物。由于氮同化作用被阻斷，培養(yǎng)物的顏色很快就從藍(lán)綠色變成黃棕色，這反映了藻膽素蛋白的降解。但是，在DON存在和不存在下在野生型屮發(fā)現(xiàn)的PHA顆粒數(shù)非常相似，每個(gè)細(xì)胞為1個(gè)或1個(gè)以下(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，氮同化作用的缺乏本身并不導(dǎo)致PHA積累。^fi錄鏡^^產(chǎn).，為驗(yàn)證尼羅藍(lán)A染色的熒光顆粒的確對應(yīng)于類似PHA顆粒的包含體，對在標(biāo)準(zhǔn)的BG-ll中生長的顯示極少熒光顆粒的對數(shù)期野生型集胞藻PCC6803，以及對兩個(gè)其他菌株(氧化酶缺失突變株和PSII缺失/氧化酶缺失突變株)和對野生型，在N限制后進(jìn)行電子顯微鏡檢査(圖10)。在后三種情況中，觀察到尼羅藍(lán)染色顆粒的水平增加。的確，考慮到用于透射電子顯微鏡檢查的切片的厚度(70nm)小于沿著橫穿細(xì)胞的z軸的熒光焦場的投影(600-800nm)，尼羅藍(lán)A熒光顆粒的數(shù)量很好地對應(yīng)于細(xì)胞當(dāng)中的空白空間(openspace)的數(shù)量。在進(jìn)行電子顯微鏡檢查時(shí)，PHA顆粒通常是作為電子透明內(nèi)含體(electron-transparentinclusion)可見到(Ballard.^乂，1987)，這可能因?yàn)镻HA在樣品制備過程中被洗出。對多個(gè)切片的檢查顯示，在正常條件下生長的野生型中只有約20%的被切片細(xì)胞含有這種顆粒，在每個(gè)被切片細(xì)胞中的數(shù)量只僅僅三個(gè)(表7)。但是，在PSII缺失/氧化酶缺失的突變株中，極大部分的被切片細(xì)胞含有至少一個(gè)顆粒，且顆粒大小(直徑約145nm)比在正常條件下生長的野生型中的顆粒大小(直徑約75nm)大得多。注意，對于直徑超過切片厚度的顆粒，取決于樣品制備過程中顆粒如何被切割，顆粒直徑可能被低估。在氮限制的野生型細(xì)胞中，類囊體結(jié)構(gòu)組織化程度低(圖IOD)，每個(gè)細(xì)胞的平均顆粒數(shù)增加一個(gè)數(shù)量級(jí)。如圖IOC和D所示，在集胞藻中，顆粒通常不被發(fā)現(xiàn)與類囊體或細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，與之相反的是聚球藻MA19中的情況，在這個(gè)菌中已知PHB顆粒被發(fā)現(xiàn)非常接近類囊體膜或被類囊體膜包圍，或者是缺乏糖原生物合成的集胞藻突變株中的情況，在這個(gè)突變株中有時(shí)顆粒被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞質(zhì)膜緊密結(jié)合。表7.集胞藻藻株的電子顯微鏡薄(70nm)切片中見到的PHAf貞粒的平均<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>a該測量是在至少50個(gè)細(xì)胞的切片上進(jìn)行；顆粒數(shù)目代表每個(gè)被切片細(xì)胞的平均顆粒數(shù)。b顆粒直徑是在每個(gè)藻株中計(jì)數(shù)到的所有顆粒的平均值。PHA在其組成上可能不同，用GC/MS來測定這些內(nèi)含體的化學(xué)性質(zhì)。為此，在特定培養(yǎng)階段收獲細(xì)胞，冷凍干燥，然后在105。C下烘焙以除去殘留含水量。將細(xì)胞破碎后，所得材料在氯仿中進(jìn)行甲醇分解作用2.5小時(shí)。其中一個(gè)主要甲醇分解作用產(chǎn)物的質(zhì)量譜圖(圖11A中的峰l)與3-羥基丁酸的甲酯(圖IIB)完全匹配，然而沒有獲得羥基戊酸酯或其他酯類的跡象。所觀察到的第二個(gè)主峰被鑒定為乙酰丙酸的甲酯(圖ric)，之后證實(shí)是干燥細(xì)胞中葡萄糖或糖原的存在所造成的假象(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，集胞藻PCC6803能夠產(chǎn)生的唯一PHA是PHB均聚酯(homopolyester)。如在前面章節(jié)中所示，PHB的積累不僅決定于藻株的基因型，而且與細(xì)胞生長的階段或條件有關(guān)。不同條件下和不同藻株中PHB積累的量在表8中列出。PHB含量是從干燥的細(xì)胞提取PHB并進(jìn)行甲醇分解作用后，以購自Sigma的PHB作為標(biāo)準(zhǔn)物，通過GC/MS測定的。PHB含量(占千重的百分?jǐn)?shù))始終是比從熒光和電子顯微鏡觀察(圖9和10)預(yù)期到的要低。這可能是因?yàn)椴煌耆腜HB提取和/或甲醇分解作用造成的。因此，表8中所列的PHB含量代表了PHB數(shù)量的下限。但是，認(rèn)為提取效率對于所有細(xì)胞和條件都是相似的，因此可在各藻株和條件之間定量比較PHB含量。在具有平衡的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中在正常生長條件下，野生型以及NDH-2缺失藻株和藍(lán)螺藻藻株都合成極少的PHB，PHB含量為0.3。/。或更少。但是，氧化酶缺失突變株和NDH-1缺失突變株在這些條件下積累的PHB多一個(gè)數(shù)量級(jí)，PSn缺失/氧化酶缺失突變株積累的PHB的量甚至是氧化酶缺失突變株和NDH-1缺失突變株的兩倍。表8.集胞藻PCC6803及其突變株在不同生長條件下的PHB積累。各培養(yǎng)物在所列條件下生長7天后進(jìn)行PHB含量分析。所示的結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。PHB含量(占干重的％)培養(yǎng)條件"野生型氧化酶缺失PSII缺失/氧化酶缺失'NDH-11缺失NDH-2缺失藍(lán)螺藻fBG-ll0.1±().O2.2±0.518±0,4U)土(K80.3±0,!()■2±0.1N-限制fc2.S±0,15,9±0,36.5±0.64,7±0,723±0,23.2±0.2N-還原'':")±(),53,8±0,86,2±0.74.6±0.5;2.2±0.2.2,8±(),3乙酸鹽"4.7±0.63,2±0.45.0±0.4NDND:1,2±cu"除非另有規(guī)定，否則各培養(yǎng)物是在補(bǔ)加5mMTES-NaOH(pH8.0)的BG-ll培養(yǎng)基中在50nmol光子m、"下進(jìn)行光能自養(yǎng)生長。6BG-11中的硝酸鹽減少到1.67mM(原始濃度的10%)。eBG-11中的硝酸鹽被10mMNH4C1替代。"BG-ll補(bǔ)加10mM乙酸鈉。eBG-ll補(bǔ)加lOmMTES-NaOH(pH8.0)緩沖液和5mM葡萄糖。^鼓泡通過富含2。/。C02的空氣。ND:未測出。在氮限制的條件下，所有藻株都積累高水平的PHB:數(shù)量與PSII缺失/氧化酶缺失藻株在正常條件下的數(shù)量大體相當(dāng)。當(dāng)以氨的形式給細(xì)胞提供還原型氮源時(shí)，獲得相似的結(jié)果。由于PHB似乎在還原型NADP的條件下積累，且NAD(P)H被用于乙酰乙?；鵆oA還原，PHB可能是再牛NADP的發(fā)酵產(chǎn)物，因此測量在微好氧條件下的生長的幾個(gè)藻株的PHB水平。這些藻株中的PHB水平類似于在正常條件下生長的對照藻株的水平(數(shù)據(jù)未顯示)，因此PHB似乎不是集胞藻屮的發(fā)酵產(chǎn)物。為測定PHB途徑開始前后的代謝物水平是否影響PHB合成，將10mM乙酸鈉加到培養(yǎng)物中。如表8所示，野生型細(xì)胞積累多達(dá)4.7%PHB，這提示細(xì)胞中乙酸鹽(或者衍生代謝物)的水平顯著影響PHB水平。一個(gè)另外要考慮的因素是培養(yǎng)物的生長速度，因?yàn)樵诜峙囵B(yǎng)中，如果在對數(shù)期結(jié)束時(shí)每個(gè)細(xì)胞的PHB含量相似的話，生長速度較高的藻株會(huì)比生長速度較慢的藻株產(chǎn)生更多的PHA。表9中比較了不同藻株在不同條件下的生長。在對照條件下，除氧化酶缺失藻株之外的所有突變株都比野生型生長慢。在氮限制條件下，所有藻株生長的倍增時(shí)間為16-21小時(shí)。在乙酸鹽或銨的存在下，各藻株的生長速度基本上和在標(biāo)準(zhǔn)的BG-11中的相同。因此，不同突變株中和不同條件下PHB積累的巨大差異不能簡單地由生長速度的差異來解釋。79表9.在不同培養(yǎng)條件下生長的集胞藻PCC6803野生型和突變株的倍增時(shí)間。所顯;g的數(shù)據(jù)是至少三個(gè)獨(dú)立測定的平均值。培養(yǎng)條件。倍增時(shí)間(h)野生型氧化酶缺失psii缺失/氧化酶缺失°NDH-lf缺失ndh-2缺失藍(lán)螺藻fBG-ll10.3=J.sll,o土2,517.2±3」15.4±2.116.8±3.2N-限制"19.0±2,521.4±1.221.0±1.3ti，+■4i5,s±2.()18.0±1,7n-還原'10.6=2.115.1±1.716.1±2,116,5±1.513.2±±2,9乙酸鹽''12.2二2力111±l')20,2±1.816.4±2,2i8j±1,7a除非另有規(guī)定，否則各培養(yǎng)物是在補(bǔ)加5mMTES-NaOH(pH8.0)的BG-11培養(yǎng)基中在50)imoI光子m、"下進(jìn)行光能自養(yǎng)生長。^G-11中的硝酸鹽減少到1.67mM(原始濃度的10%)。CBG-11中的硝酸鹽被IOmMNH4C1替代。"BG-ll補(bǔ)加10mM乙酸鈉。eBG-l]補(bǔ)加10mMTES-NaOH(pH8.0)緩沖液和5mM葡萄糖。/遂泡遞過,#2%C02游f氣。ND:未測出。髯眾^^^^^厲f^:f..到目前為止的結(jié)果似乎表明，PHB積累是在特定條件下出現(xiàn)，包括在加入的乙酸鹽存在下在內(nèi)。對于PHB合成重要的一個(gè)其他的可能因素是細(xì)胞中的NADPH水平，肉為NADPH被用于PHB合成，且因?yàn)楦逳ADP還原水平似乎會(huì)抑制TCA循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶(Cooley^X,2000)并因此可能導(dǎo)致高乙酸鹽水平。為確定PHB積累和細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)之間的關(guān)系，測量并比較了還原型/氧化型煙酰胺核苷酸的水平，作為細(xì)胞質(zhì)氧化還原狀態(tài)的指標(biāo)。NADPH/NADP水平和NADH/NAD水平是用兩個(gè)獨(dú)立的方法進(jìn)行測定通過在特定處理后在340nm處進(jìn)行分光光度檢測來測定，和通過帶熒光檢測的HPLC來測定。分光光度方法快速，但可能特異性不夠充分，而HPLC方法較慢(從而使得有更多時(shí)間發(fā)生假象的相互作用)，但特異性更高。所得的兩組數(shù)據(jù)相當(dāng)，差異小于20%(數(shù)據(jù)未顯示)；因此，這里只給出HPLC數(shù)據(jù)(表IO)。對于這些測定，所有的培養(yǎng)物都在對數(shù)期中期收獲，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)前的30分鐘進(jìn)行提取。表10.在BG-11、在氮限制條件和還原型氮(NH4C1)條件下生長的對數(shù)期各藻株中的穩(wěn)態(tài)吡啶核苷酸水平和還原型輔因子/總輔因子比例(濃度單位為HM/OD730)。藻株'l"l乂1條件"輔因子野生型氧化酶缺失PS11缺失/氧化酶缺失fNDH-1缺失gNDH-2缺失藍(lán)螺藻g"(G±1."".0,07二ao20,26±0,03a2±aos0,76±0.07<UJNADH/iNAD+NA[賴0^6±U038=a3tK6(j±1丄J1FR《).68二"'ISNA[》附(NA雨:柳)04J=0,「re(1,07:a"5NAD+NADH(U:M±f"')2ft."±,NDnuND《Ui±",<"0.72士化24.N『)nl>NL>N-限制6ND■NDa力7』幽mad,na瞎醒柳:3化71^t)別±0'—"醇ndn[:)0.17二化05C6士u12賜ndnadp+nadph化；2±(m，("4二ai(i1,15±11"ndndNA匸WiNAD+N.4DHiNDNDNA)附i,NAW+畫:柳)0,75二0,24D.S3±隨NDND。除非另有規(guī)定，否則各培養(yǎng)物是在補(bǔ)加5mMTES-NaOH(pH8.0)的BG-11培養(yǎng)基中在50pmol光子m、"下進(jìn)行光能自養(yǎng)生長。"BG-11中的硝酸鹽減少到1.67mM(原始濃度的10%)。cBG-11中的硝酸鹽被IOmMNH4C1替代。"BG-11補(bǔ)加10mM乙酸鈉。eBG-ll補(bǔ)加10mMTES-NaOH(pH8.0)緩沖液和5mM葡萄糖。7鼓泡通過富含2。/。C02的空氣。FR:完全還原型。ND:未測出。不同集胞藻PCC6803藻株之間NAD(H)和NADP(H)的總量相差最多達(dá)大約10倍。但是，對于每個(gè)藻株，當(dāng)在不同條件下生長時(shí)，NAD(H)和81NADP(H)的量相差最多僅達(dá)3-4倍(表10)。然后所有藻株中的NAD(H)水平相對較低，數(shù)據(jù)中的標(biāo)準(zhǔn)偏差相應(yīng)地較大，NADP庫大小較大，在不同藻株之間相差最高達(dá)IO倍(表IO)。與之前的觀察結(jié)果(Cooley等乂，2001)—致的是，NAD和NADP還原狀態(tài)極大地取決于藻株。NAD在NDH-2缺失藻株中被完全還原，在其他藻株中有35-70。/。的NAD被還原。NDH-1缺失突變體具有實(shí)質(zhì)上完全還原的NADP(H)庫，而在氧化酶缺失突變體中NADP發(fā)生40-70%還原。與之對比，在野生型、藍(lán)螺藻和NDH-2缺失突變株中NADP庫相當(dāng)?shù)乇谎趸?。后一參?shù)(NADP還原狀態(tài))因此似乎與PHB積累的水平相關(guān)。為進(jìn)一步査明NADP還原狀態(tài)和PHB積累量之間的可能相關(guān)性，測定了野生型中以及氧化酶缺失突變株和PS11缺失/氧化酶缺失突變株中，NADP和NAD水平及還原狀態(tài)隨固定氮的限制和還原型氮源(氨)的存在的變化關(guān)系。當(dāng)在具有限制性硝酸鹽水平的BG-11培養(yǎng)基中或者在氨存在下的BG-11培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)吋，NADH/NAD(總)比例在氨存在下或在限制數(shù)量的硝酸鹽下沒有很大變化，但是在這些條件下測試的三個(gè)藻株中，在野生型中NADPH/NADP(總)比例增力B5-6倍，達(dá)到與氧化酶缺失突變株和PS11缺失/氧化酶缺失突變株中的高還原水平相當(dāng)?shù)乃?表10)。將表4報(bào)道的結(jié)果與表2所列的PHB含量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可清楚知道在所有情況中高NADPH/NADP(總)比例都與集胞藻PCC6803中的高PHB含量相關(guān)。NADH/NAD(總)比例和PHB積累之間沒有明顯可見這種相關(guān)性。以下參考文獻(xiàn)通過引用特地并入本文，以提供示例性的程序上的細(xì)節(jié)內(nèi)容或其他的細(xì)節(jié)內(nèi)容，對本文闡述的內(nèi)容加以補(bǔ)充。美國專利4,413,058美國專利4,242,455美國專利4,350,765美國專利4,458,066美國專利4,683,202美國專利5，220,007美國專利5,221,605美國專利5,238,808美國專利5,284,760美國專利5,322,783美國專利5,354,670美國專利5,366,878美國專利5,380,721美國專利5,384,253美國專利5,389,514美國專利5,538,877美國專利5,538,880美國專利5,550,318美國專利5,563,055美國專利5,580,859美國專利5,589,466美國專利5,610,042美國專利5,635,377美國專利5,656,610美國專利5,702,932美國專利5,736,524美國專利5,780,448美國專利5,789,166美國專利5,789,215美國專利5,798,208美國專利5,830,650美國專禾U5,945,100美國專利5,981,274美國專利5,994,624美國公開說明書2002/0042111美國公開說明書2002/0072109Aichi"cr/.，J.183:5840-5847,2001.Allen,v4朋.itev.M/cra/)/o/.,38:1-25,1984.AmichayAMG饑G騰""'，235:247-252,1992.AndersonandDawes,Mcraho/.Hev.,54:450-472,1990.Aresta""/.,&v,ra".C/ze,".丄7KS.,3(3):136陽139,2005.Asadaa/.，/"t/.S/o/.Macromo/.,25:37-42,1999.AsatoandGinoza,M//.TVew5/o/.，244(135):132-133,1973.Ausubel"/.,/w:CWmffV她cr^M/ecw/"r腸/rgy，John,Wiley&Sons,Inc，NY,1994.Ballarda/.,In:Wetx省Wva"cwz'wMec/2"M/幼'ciSywfZ/Wc/IvpectoPo/yme/7za"Vw,FontanilleandGuyot(Eds.),215:293-314,.Reidel(Kl證er)PublishingCo.,Lancaster,U.K,1987.Barringer"a/.，89:117,1990.Beaucage"a/.,T"ra.厶e".,22:1859-1862,1981.BergerandKimmel,In:GWcfetoMo/ecw/orC/固."grec/w/々紙s1，MethodsinEnzymology,152,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CalifBergmeyer,Z.O/e/w.5/oc'/^w.,13:507-508,1975.Blackburn"a/.，丄hp/d32(12):1911-1918,1991.Boocock"a/.,J.爿附.0//Soc.75:1167-1172,1998.Boothman"a/.,C朋ceri^&,49(ll):2871-2878,1989.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Mass.,orDeshpande,MukimdV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36,227,(1992).Borek,C謹(jǐn);r.Swrv.,10:303-316,1985.Brown"a/.，A/eA.^&^y附o/.,68:109-151,1979.BryantWa/.，淑,，279(5716):795-796,1979.Burks"a/.，iVoc.編.y4cW.固，94(2):412-417,1997.BurtonandBarbas,雖/臓,/.,57:191-280,1994.CadwellandJoyce,PCiMt*<i"，/.,2(1):28陽33,1992.Campbelle"/.，./.萬acte"o/.,149:361-363,1982.CarbonelliWa/.，F(xiàn)￡MSA^cto/7/o/.177(1):75陽82,1999.Carr,Biochim.說o///，.爿""，120:308-310,1966.Chandler"<ar/.，尸亂淑/.爿cadSc.〖/&4,94(8):3596掘，1997.ChenandOkayama,嵐Ce〃艦，7(8):2745-2752,1987.Cisneros"a/.，J.C/3ro/w.Tec//.5/c>we<i.丄('/feSc/.，807(1):105-110,2004.Cocea,腺ec—廳，23(5):814-816,1997.CooleyandVermaas,Ji"c&"》/.，183:4251-4258,200].Cooley"a/.，，/.Sa"en》/.，182:714-722,2000.CooleyWa/.,239(4844):1121-1128,1988.CunninghamandWells,S"ewce，244(4908):1081-1085,1989.DahlqvistWa/.,Prac.M/W.Jcat/.〔/&4，2000;97:6487-92.DawesandSenior,j血M/crc^.10:135-266,1973.DePhilippisF五MSM,cra/w/.Wev.,103:187-194,1992.DePhilippisal.,J.G饑Mc油o/.,138:1623-1628,1992.Deutscher,In:A/&//c)<iy/'w￡>7z>wo/ogy,Vol.182,AcademicPress,Inc.NY,1990.EdwardsandGantt,丄CW/S,》/.,50(3):896曙900,1971.Fechheimer,尸racAto/.」cad&/'.W,84:8463-8467,1987.Fraley"a/.，Prac.Ato/.爿cadSc/.V&4，76:3348-3352,]979.GanttandConti，丄B"cfe"o/.，97(3):1486畫1493,1969.Goeddel,In:基因五jc/m"'/朋rec細(xì)6)/ogy:Me仇〖'w￡>z_y,/.，185,AcademicPress,SanDiego,Calif.,1990Gopal,Afo/.Ce〃所o/.,5:1188-1190,1985.GrahamandVanDerEb,K/ra/ogy,52:456-467,1973.GrigorievaandShestakov,FEMSMicrobiol.LETT.,13:367-370,1982.GuatelliWa/.，Mrf/.87:1874,1990.Hallto.,114(3):415-4241988.HarlandandWeintraub,丄Ce〃說o/.,101(3):1094-1099,1985.He"a/.，Ewrap.丄263(2):561-570,1999.HeinWa/.'j/r/.緣油o/.,170:162-170,1998.Herrero"a/.，《/.Bacte〃:o/.,145:175-180,1981.Hilton"a/.,J.S,》/.C/亂,271(9):4699-4708,1996.HowittandVermaas,所oc/eww^y,37:17944-17951,1998.Howitta/.，丄5acter,》/.,181:3994-4003,1999.Howitt"a/.，尸/"虛，214:46-56,2001.Innis,da/.,In:PCW/Woco/,s.jGw/c/eoMeAods'4ff^c如.肌AcademicPress,Inc.SanDiego,1990.InouyeandInouye,AWe/cy4c/<is'Wes.,13:3101-3109,1985.JensenandSicko，J.106(2):683-686,1971.JordanandOgren,291:513-515,1981.JournalofNIHResearch,3:81-94,1991.Kaneda"《Sc,置e,243:375-378,1989.KanekoWa/.，DA^43(3):109扁136,1996.Katoeo/，</.C7ew.,266:3361-3364,1991.IGaidmanefa/.,Xm/.Zzoc/ctm.'228:312-317,1995.Koksharovae/a/.，Ptow/^fo/.36:183-]94,1998.Koncz"a/.，￡Affi<9./.，9(5):1337匿1346,1990.KwohWa/,，Ato/.Jca<i.&/.〖7&4,86:1173,1989.Lagarde"0/.，J///.五謂簡.Mcra6.,66(l):64-72,2000.LamaeZ.a/.，尸/2,c/7ew由/77,42:655-659,1996.LambertandBorek,J.Ca"cer/mt,80(18):1492-1497,1988.Lemoigne,滅Soc.Oz/m.8:770-782,1926.Levenson"a/.，//w附.^^茵772er.,9(8):]233-1236,1998.LiandGolden,Prac.iVa".乂cck/.f/&4，90:11673-11682，1993.Liebergesell"a/.,￡W.丄腸c/e州.，226:71-80，1994.LomellJ.C/肌C/綴，35:1826,1989.Landegrenaa/.，Sc,e騰，241:1077-]080,1988.VanBrunt,jS/o/ec/wo/ogy,8:291-294,1990.needsalphabetizedManchakandPage,140:953—963,1994.Maniatis,Wa/.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989.Marks"a/.,丄Afo/.222:581-597,1991.Marlanda/"G7o6a/,ieg/:owa/，7Va//cwa/CC^五/w:s'、v/om'./"7>6血'/4C/7ewc/if'臓q/7)atooC/朋ge,2006.McCann"a/.'Ato/.OSM，72(3):979-983,1975.McCoolandCannon,St7"(r/0/.，181:585—592,1999.McGinn"a/.，尸/a"fP一油gy,132(1):218-229,2003.M6rida^a/"</.173:4095-4100,1991.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(dǎo)蛋白(VIPP1)基因，戸;^基因，yWC/^a/同源物，質(zhì)體球蛋白基因，乙酰-CoA羧化酶基因，轉(zhuǎn)乙酰酶基因，去飽和酶基因，PEP羧化酶基因，檸檬酸合酶基因，脂肪酸生物合成基因，蛋白酶基因，參與糖原、聚羥基丁酸或藻青素生物合成或降解的基因，磷脂酸磷酸酶基因和?；D(zhuǎn)移酶基因組成的群組。15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因選自由,s'朋336、a'脂72S、s/〃56S、s'/〃SM、Wd0(^、WW<577、,s/W47/、^〃463、s/W"S、WW024、s/W3外人s/rM("、，s'/W"6、WWW7、a'/郝5、A紹5、a儒仏.s'譜"、,s緒//、、、'〃滴9、,v/r"32、劍娜、、v〃/膨、5-/^057、,*777<5、*/服a緒從,W〃柳、,s'W譜、*7柳、*廁/、*廁入s〃"47、W鼎7、'W膨入，91,<〃似67、，s〃0534、，s〃0545、，s'/WJM、，s'〃"56、，W254、，WWWO、's/W"3、5〃025￥和《V/￥M這些基因及它們的同源物組成的群組。16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類胡蘿卜素產(chǎn)量而言，其一種或多種類胡蘿卜素的產(chǎn)量得到了增加。17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類胡蘿卜素含量而言，其類胡蘿卜素含量得到了增加。18.權(quán)利要求16和17中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能異養(yǎng)細(xì)菌，其中所述類胡蘿卜素選自由P-胡蘿卜素、玉米黃素、藍(lán)溪藻黃素乙、myxol、海膽酮和它們的生物合成中間體組成的群組。19.權(quán)利要求16和17中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能異養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因選自由s/03M、W〃556、s/W254、s/r6^/6、，v/W"3、s脂254和,s'/〃WS這些基因和它們的同源物組成的群組。20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一步定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類異戊二烯產(chǎn)量而言，其一種或多種其他類異戊二烯的產(chǎn)量得到了增加。21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一歩定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的類異戊二烯含量而言，其類異戊二烯含量得到了增加。22.權(quán)利要求20和21中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一種或多種其他的類異戊二烯選自由異戊二烯、生育酚和它們的生物合成中間體組成的群組。23.權(quán)利要求20和21中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一種或多種目的基因選自由植物異戊二烯合酶基因、生育酚生物合成基因和它們的同源物組成的群組。24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一歩定義為，相對于其巾所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的碳水化合物產(chǎn)量而言，其一種或多種碳水化合物的產(chǎn)量得到了增加。25.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌被進(jìn)一歩定義為，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌的碳水化合物含量而言，其一種或多種碳水化合物的含量得到了增加。26.權(quán)利要求25的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述碳水化合物選自由單糖、雙糖、寡糖和多糖組成的群組。27.權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述碳水化合物是選自由葡萄糖、半乳糖和果糖組成的群組的單糖。28.權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)臠，其中所述碳水化合物選自由單糖磷酸木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、赤蘚糖-4-磷酸、景天庚酮糖-二磷酸和果糖-二磷酸組成的群組。29.權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述碳水化合物是蔗糖。30.權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述碳水化合物是選自由果寡糖和甘露寡糖組成的群組的寡糖。31.權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述碳水化合物是選自由糖原及其衍生物組成的群組的多糖。32.權(quán)利要求25-31中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因包含編碼糖原合成酶或糖原分支酶的基因或者參與中心碳代謝的基因。33.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因包含至少一個(gè)與組成型啟動(dòng)子可操作地連接的基因。34.權(quán)利要求33的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述組成型啟動(dòng)子選a由pWD//、as'^43禾口/w^42纟R成的群組。35.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)蘭，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因包含至少一個(gè)與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接的基因。36.權(quán)利要求35的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自由"zM、^"萬、/e"、wra7^、"ra5JO)/y7"^FJ組成的群組。37.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、螺桿菌(/化/w^Cte/TO附)、酸桿菌(fl"^6flCtera^)、紫色硫細(xì)菌或紫色非硫細(xì)菌。38.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌。39.權(quán)利要求38的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述藍(lán)細(xì)菌是集胞藻(砂"ec/iwc,to)。40.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述藍(lán)細(xì)菌是集胞藻PCC6803。41.權(quán)利要求38的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述藍(lán)細(xì)菌是嗜熱聚球藻(777e/7wm_yw<c/oc(3dS")。42.權(quán)利要求41的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述藍(lán)細(xì)菌是嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻(7'//6環(huán)0砂"￡<:/20<%)0^e/ogaw's*平)BP-1。43.權(quán)利要求38的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述藍(lán)細(xì)菌屬于以下各個(gè)目色球藻目(O/raococctf/w),念珠藻目(Mas7ocWc々s')，顫藻目((9s"〃"to"'"/w),寬球藻目(尸/ewroc"/Ma/e,力，原綠藻目(Prac/2/0ra尸/y處,s')，或真枝藻目(5Y/g(9"e附"to/e力。44.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述目是色球藻目，藻種選自由隱球藻屬(^/w朋ca/wa)、隱桿藻屬(^/w朋i^ce)、管孢藻屬(C/ama^///76w)、色球藻屬(C7/raococcw力、Cracas7/wera、藍(lán)細(xì)菌(Cy""c>Z>""ent/w)、C)w"c^/力/w、藍(lán)絲]lf屬(QyawoAece)、.藍(lán)纟千纟隹》築J萬(Dac(y/oco(XO/w^1)、粘桿菌屬(G/oe(9/)ac'er)、禾占球藻屬((7/oeoca/wa)、粘桿藻屬(G/oeo^/ece)、￡W"/o,/2ece、T^a/c^ece、Jo/w朋w6豐/勸'a、平裂藻屬(Men.扁0/Wa)、微囊藻屬(M'cra，to)、棒條藻屬(朋GrM6xier顧)、聚球菌屬(5y"￡c//ococa)、集胞藻屬Cec/oc戸to)禾卩嗜熱聚球藻(T77enwos;^ec/2ococcw力組成的群組。45.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述目是念珠藻目，藻禾巾選自由Co/eodw附/mw、Fre州少e〃"、微毛藻屬(M/'crac/aete)、Ww'a、S戸力myto、單歧藻屬(ro/y/wf/mjc)、魚腥藻屬(JwaMewa)、項(xiàng)圈藻屬(v4"(^cre"oi戸力、束絲藻屬(y^/j"m'z麵e"o")、管鏈藻屬(^4w/冊'ra)、C,肌y'ra、柱胞藻屬(Qy//"<imv/7em7，/'s)、筒孢藻屬(C_y/z'"6/ra^^mjwm)、節(jié)球藻屬C/V6^M/aha)、念珠藻屬(7VoWoc)、植生藻屬(i/c/;e/z")、眉藻屬(Q/oAr")、膠刺藻屬(G/oeWr,c/z/:fir)和偽枝藻屬46.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述目是顫藻目，藻禾中選自由節(jié)螺藻屬(y4r//^(w/^ra)、Ge/7/eh"e/wa、//a/cw/cra"e附a、鹽螺旋藻屬(//"/0^/^///>7)、f"tog"_ywee、痩鞘絲藻屬(丄印to/j^g^yo)、湖生藍(lán)絲藻屬(/Jmw)Ahx)、鞘絲藻屬(丄^ga)、微鞘藻屬(Af/cro"/ew)、顫藻屬((9sc/〃"tor/a)、席藻屬(尸/2^附^ftww)、擬浮絲藻屬CP/朋"W/OTC(^fev)、浮絲藻屬(尸/朋hoA〃x)、織線藻屬(尸/ecto"ewa)、湖生藍(lán)絲藻屬(丄/柳"0^〃;0、假魚腥藻屬CPwM^"""/)ae"a)、裂須藻屬(&/^oAnjc)、螺旋藻屬(5^n^/wof)、束藻屬(5^附p/oco)、束毛藻屬(7V/c/0(i&sw/w柳)禾口7^c/oweOT(2組成的群組。47.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述目是寬球藻目，藻種選自由擬色球藻屬(C/zraococcWo/M"')、皮果藻屬(Demwcar/")、小皮果藍(lán)細(xì)菌屬(Z)enwoc(2/7e〃a)、黍&囊藻屬(A<VJraraA:wa)、寬球藻屬CP/ewraa^so)、斯塔尼爾氏菌屬斯塔尼爾氏菌屬Ctom'em^和異球藻屬48.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其巾所述目是原綠藻目，藻種選自由原綠藻屬(尸rac//oraw)、原綠球藻屬(Prac//oracoco^)和原綠發(fā)藻屬(尸rac//ora^nbc)組成的群組。49.權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中所述目是真枝藻目，藻種選自由蒴鏈藻屬(Ca/ms/ra)、擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬(C/j/wYg/oeo/ww)、費(fèi)氏藻屬CF/w/7ere〃a)、軟管藻屬(/f"戸/ftv'》/26i")、A/os77'gw/(2(io戸、'、鞭枝藻屬(Mw"goc/油s)、擬念珠藻屬(M加c/7、真枝藻屬(幼gcw，")、聚線藻屬GSy附p/2^we附")、Sym//^o"e附o/w"'、〖/wez"A7."禾口『e^/e〃o/w,'5組成的群組。50.—種增加來自光能自養(yǎng)細(xì)菌期望的產(chǎn)物的產(chǎn)量的方法，所述方法包括改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能，從而導(dǎo)致光能自養(yǎng)細(xì)菌中一種或多種產(chǎn)物或者一個(gè)或多個(gè)目的基因的產(chǎn)量的增加，其中所述改變導(dǎo)致所述一種或多種產(chǎn)物的產(chǎn)量，相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌所產(chǎn)生的所述產(chǎn)物的量而言，得到了增加。51.權(quán)利要求50的方法，所述方法進(jìn)一步包括在合適的條件下生長光能自養(yǎng)細(xì)菌，以產(chǎn)生出其量得到增加的期望產(chǎn)物。52.權(quán)利要求50和51中任一項(xiàng)的方法，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能包括改變至少兩個(gè)基因的表達(dá)或功能。53.權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)的方法，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基閑產(chǎn)物功能包括通過下調(diào)來改變至少一個(gè)基W的表達(dá)。54.權(quán)利要求50-53中任一項(xiàng)的方法，其中改變--個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能包括改變至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。55.權(quán)利要求50-54中任一項(xiàng)的方法，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能包括通過突變來改變至少一個(gè)基因的表達(dá)。56.權(quán)利要求50-55中任一項(xiàng)的方法，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能包括通過上調(diào)來改變至少一個(gè)基因的表達(dá)。57.權(quán)利要求50-56中任一項(xiàng)的方法，其中所述光能自養(yǎng)細(xì)菌能吸收和固定二氧化碳。58.權(quán)利要求50-57中任一項(xiàng)的方法，其中改變一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物功能能增加二氧化碳的吸收和固定，所述增加是相對于其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)不被改變的光能自養(yǎng)細(xì)菌對二氧化碳的吸收和固定的量而言。59.權(quán)利要求50-58中任-項(xiàng)的方法，其中所述期望的產(chǎn)物包含一種或多種脂質(zhì)。60.權(quán)利要求59的方法，所述方法進(jìn)一歩包括將所述一種或多種脂質(zhì)加工成生物燃料。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述生物燃料是生物柴油。62.權(quán)利要求50-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述期望的產(chǎn)物包含一種或多種碳水化合物。63.權(quán)利要求62的方法，所述方法進(jìn)一步包括將所述一種或多種碳水化合物加工成生物燃料。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述生物燃料是醇或氣體。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述生物燃料是選自由甲醇、乙醇、丙醇和丁醇組成的群組的醇。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述生物燃料是選自由氫氣、異戊二烯、甲烷、乙烷、丙烷和丁烷組成的群組的氣體。67.權(quán)利要求62的方法，所述方法進(jìn)-一步包括將所述一種或多種碳水化合物加工成生物塑料。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述生物塑料包含聚乳酸、聚-3-羥基丁酸或聚-3-羥基烷酸。69.權(quán)利要求50-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述期望的產(chǎn)物包含一種或多種類胡蘿卜素。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述類胡蘿卜素選自由(3-胡蘿卜素、玉米黃素、藍(lán)溪藻黃素乙、myxol、海膽酮和它們的生物合成中間體組成的群組。71.權(quán)利要求50-58中任--項(xiàng)的方法，其中所述期望的產(chǎn)物包含一種或多種藻青素或者相關(guān)化合物或衍生物。72.權(quán)利要求50-71中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括將所述光能自養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生的過量副產(chǎn)物加工成生物塑料、生物燃料、動(dòng)物飼料添加劑或有機(jī)肥料中的一種或多種。73.權(quán)利要求50-72屮任一項(xiàng)的方法，其中合適的生長條件包括給所述光能自養(yǎng)細(xì)菌提供二氧化碳源。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述二氧化碳源是從煙道氣提供。75.權(quán)利耍求73和74中任一項(xiàng)的方法，其中提供給所述光能自養(yǎng)細(xì)菌的二氧化碳的量占煙道氣總體積的0.03-5.0%。76.權(quán)利要求50-75中任一項(xiàng)的方法，其中合適的生長條件包括給所述光能自養(yǎng)細(xì)菌提供氮源。77.權(quán)利要求76的方法，其中所述固定氮源是從地下水、氨或硝酸鹽提供。78.權(quán)利要求76和77中任一項(xiàng)的方法，其中提供給所述光能自養(yǎng)細(xì)菌的氮的量為0.03-5.0mM。79.權(quán)利要求50-78中任一項(xiàng)的方法，其中合適的生長條件包括使所述光能自養(yǎng)細(xì)菌在10-55°C的溫度范圍生長。80.權(quán)利要求50-79中任一項(xiàng)的方法，其中合適的生長條件包括使所述光能自養(yǎng)細(xì)菌照射陽光。81.權(quán)利要求50-80中任一項(xiàng)的方法，其中所述光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、螺桿菌、光合酸桿菌、紫色硫細(xì)菌或紫色非硫細(xì)菌。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述光能自養(yǎng)細(xì)菌是藍(lán)細(xì)菌。83.權(quán)利要求82的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是集胞藻。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是集胞藻PCC6803。85.權(quán)利要求82的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是嗜熱聚球藻。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-1。87.權(quán)利要求50-86中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因中的至少一個(gè)與組成型啟動(dòng)子可操作地連接。88.權(quán)利要求87的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子選自由AAD//、/wM3和/wM2組成的群組。89.權(quán)利要求50-88中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)目的基因中的至少一個(gè)與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接。90.卯.權(quán)利要求89的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自由"^4、wM5、pe^、w^7S、"n'A4CD和/^/^3組成的群組。91.一種從光能自養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種期望的產(chǎn)物的方法，所述方法包括(i)獲得權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌和/或通過權(quán)利要求50-90中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌；禾口(ii)使所述光能自養(yǎng)細(xì)臠在合適的條件下生長以產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。92.權(quán)利要求91的方法，所述方法進(jìn)一步包括分離期望的產(chǎn)物。93.權(quán)利要求91和92中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種期望的產(chǎn)物是脂質(zhì)、碳水化合物、類胡蘿卜素、別的類異戊二烯、蛋白質(zhì)或它們的混合物。94.權(quán)利要求91-93中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種期望的產(chǎn)物是通過用有機(jī)溶劑、用超臨界無毒溶劑如水或C02進(jìn)行提取或者通過兩相分配來分離。95.權(quán)利要求91-94中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括將所述一種或多種期望的產(chǎn)物加工成生物燃料、生物塑料、類胡蘿卜素、動(dòng)物飼料或肥料中的一種或多種。96.—種固定二氧化碳的方法，所述方法包括(i)獲得權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的和/或通過權(quán)利要求50-90屮任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌，所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌能夠吸收和固定二氧化碳；(ii)在合適條件下生長該光能自養(yǎng)細(xì)菌以吸收和固定二氧化碳-,禾口(iii)給所述經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌提供二氧化碳源；其中該二氧化碳源的至少一部分二氧化碳被所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌固定。97.權(quán)利要求96的方法，其中所述二氧化碳源是煙道氣，且其中所述煙道氣中的至少一部分二氧化碳被所述經(jīng)修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌固定。全文摘要公開了包含在表達(dá)和/或編碼區(qū)序列方面被修飾的目的基因的經(jīng)修飾光能自養(yǎng)細(xì)菌，其中對所述目的基因的修飾能增加所述細(xì)菌中的期望產(chǎn)物的產(chǎn)量，所述增加是相對于其中在目的基因方面沒有被修飾的光能自養(yǎng)細(xì)菌中的期望產(chǎn)物的產(chǎn)量而言。文檔編號(hào)C12N1/21GK101617039SQ200780046148公開日2009年12月30日申請日期2007年10月19日優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日發(fā)明者威廉·F·J·弗馬斯申請人:代表亞利桑那大學(xué)的亞利桑那校董會(huì)