專利名稱：具有增強的動力學和功能性表達的突變水解酶蛋白的制作方法
具有增強的動力學和功能性表達的突變水解酶蛋白 對相關申請的交叉參考
本申請要求于2006年10月30日提交的美國申請系列號60/855,237、 和于2007年5月15日提交的美國申請系列號60/930,201的申請日的利益， 將其公開內容引入本文作為參考。
背景
分子的特異性檢測是理解該分子在細胞中作用的重點。標記，例如與 目的分子共價連接的那些，允許在復雜混合物中容易地檢測該分子。標記 可以是由體外化學合成添加的或例如通過重組技術體內附著的標記。例 如，熒光或其他標記附著在蛋白質上傳統上通過在蛋白質純化后進行體外 化學修飾完成(Hermanson, 1996)。對于標記的體內附著，來自水母厶^orea WctoWa的綠色熒光蛋白(GFP)與許多宿主蛋白遺傳性融合，從而產生原 位熒光嵌合體(Tsien, 1998; Chalfie等，1998)。然而，雖然基于GFP的指示 劑目前用在多種測定法中，例如測量pH(Kneen等，1998; Llopis等，1998; Miesenb6ck等，1998)、 Ca2+(Miyawaki等，1997; Rosomer等，1997)、和膜 電位(Siegd等，1997)中，但是標記蛋白諸如GFP固有的熒光性受到蛋白質 結構性質，例如，有限的熒光顏色范圍和相對低的固有亮度的限制(Cubitt 等，1995;Orm6等，1996)。
為了解決原位GFP標記的不足，Griffen等(1998)合成了分子成分的 緊密-結合對由少至6個天然氨基酸組成的小受體結構域和可以與多種光 譜探針或交聯劑連接的小(< 700道爾頓)合成配體。所述受體結構域包 括位于a螺旋的i,i+l，i + 4，和i + 5位置處的四個半胱氨酸，且所述配體 是4',5'-二(l，3,2畫dithioarsolan-2-基)熒光素(FLASH)。 Griffen等公開所述 配體在非轉染哺乳動物細胞中具有相對少的結合位點，是膜-滲透和非熒光 性的，直至其以納摩爾或更低解離常數的高度親和性和特異性結合于重組蛋白質中的四半胱氨酸結構域，從而導致細胞被熒光標記("FLASH"標 記)。然而，關于細胞中的背景結合，Stroffekova等(2001)公開了 FLASH-EDT2非-特異性結合于內源性富含半胱氨酸的蛋白。此外，由 FLASH標記蛋白質受到可以使用的熒光團范圍的限制。
受體-介導的靶向方法使用遺傳編碼的靶向序列將熒光團定位于幾乎 任何細胞位點，條件是靶蛋白能夠正確地折疊。例如，Farinas等(1999) 公開cDNA轉染用于將單-鏈抗體(sFv)靶定于細胞中的特定位點。Farinas 等公開半抗原(4-乙氧基亞甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮，phOx)和熒光探針 (例如，BODIPYFl、四甲基羅丹明、和熒光素)的綴合物以高度親和性(約5 nM)結合于活的中國倉鼠卵巢細胞中的sFv亞細胞位點，說明靶抗體起關 于細胞-滲透性半抗原-熒光團綴合物高親和性受體的功能。然而，在還原 環(huán)境中，功能性sFv表達可能相對較差。
因此，需要的是標記理想分子的改良方法。
發(fā)明概述
雖然某些蛋白有效用于多種體內應用，但是由于它們在大腸桿菌(￡. co/0和無細胞表達系統中功能性表達的水平，它們對于體外應用(例如 破壞(pull downs))可能不是最佳的。本發(fā)明提供突變的水解酶序列，其 在多種系統中表現出如通過改良熒光性極化(FP)信號確定的提高的功能 性表達和如通過活性蛋白(底物標記)和總蛋白測量的增強的蛋白生成。 還描述了導致具有提高的固有結合動力學的突變水解酶蛋白的序列。
本發(fā)明提供用于將一種或多種官能團例如通過共價或另外的穩(wěn)定鍵束 縛(連接)于本發(fā)明的蛋白質或包括本發(fā)明蛋白質的融合蛋白(嵌合體) 的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的蛋白質(突變水解酶)在結構上與野 生型(天然)水解酶有關，但是包括至少一個氨基酸取代，例如，導致提 高的功能性表達或提高的結合動力學的一個氨基酸取代，且在一些實施方 案中包括至少兩個氨基酸取代，例如，導致與水解酶底物形成穩(wěn)定鍵的一 個氨基酸取代和至少一個導致提供的功能性表達、提高的結合動力學或二 者的其他氨基酸取代，均與相應的野生型水解酶有關。上述束縛通過使用 關于水解酶的底物發(fā)生，例如發(fā)生在溶液或混懸液中，在細胞中，在固體支持物上或在溶液/表面界面處，所述水解酶包括反應基且被修飾為包括一 種或多種官能團。
在一個實施方案中，突變水解酶與相應的野生型水解酶具有至少約
80%或更高，例如，至少約85%, 90%, 95%或98%但低于100%的氨基酸序 列同一性，即所述突變水解酶包括許多取代。在一個實施方案中，突變水 解酶與SEQ ID NO:l具有至少約80%或更高，例如，至少約85%， 90%, 95% 或98%但低于100%的氨基酸序列同一性。那些取代包括提供穩(wěn)定鍵形成 和提高的功能性表達和/或結合動力學的那些，以及在耐受取代的區(qū)域，即 不改變本發(fā)明突變水解酶功能的區(qū)域中的那些。因此，在一個實施方案中， 本發(fā)明的突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至少兩個氨基酸取 代，其中一個氨基酸取代導致突變水解酶與底物形成比在相應野生型水解 酶和所述底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵。所述一個取代處在相應的野生型 水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解在相應 野生型水解酶和底物之間形成的鍵，或者處在相應的野生型水解酶中與底 物形成酯中間體的氨基酸殘基處，或者在這兩個殘基處均具有取代。例如， 相對于僅具有導致與底物形成穩(wěn)定鍵的取代的突變水解酶，另一個取代處 在改進突變水解酶功能性表達、結合動力學，或二者的殘基處。
在一個實施方案中，突變水解酶具有導致突變水解酶與底物形成比在 相應野生型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵的一個氨基酸取代, 其中所述取代處在相應野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基 處，所述活化水分子裂解在相應野生型水解酶和底物之間形成的鍵，或者 處在相應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基處。在一個 實施方案中，處在與活化水分子有關的氨基酸殘基處的取代是處在與SEQ IDNO:l中位置272相對應的位置處的取代，所述活化水分子裂解在相應 野生型水解酶和底物之間形成的鍵。在一個實施方案中，處在與底物形成 酯中間體的氨基酸殘基處的取代是處在與SEQ ID NO:l中位置106相對應 的位置處的取代。在一個實施方案中，突變水解酶具有處在對應于SEQ ID NO:l中位置272的位置處和處在對應于SEQ ID NO:l中位置106的位置 處的取代。相對于具有這樣的取代的相應的突變水解酶，所述取代相對于 相應的野生型水解酶提供穩(wěn)定的鍵形成，在突變水解酶中提供提高的表達或結合動力學的取代包括在下列位置中一處或多處的取代與SEQ ID
NO:l的位置5, 11, 20, 30, 32， 47， 58， 60, 65， 78， 80, 87， 88， 94, 109， 113, 117， 118， 124， 128， 134， 136， 150， 151, 155, 157, 160， 167, 172, 175， 176, 187, 195, 204, 221， 224， 227, 231， 250, 256, 257， 263, 264, 273, 277, 282， 291或292相 對應的位置。突變水解酶因此可以具有多個取代，包括處在與SEQ ID NO:l 的位置5， 11, 20, 30， 32, 47, 58, 60， 65, 78, 80， 87， 88， 94, 109， 113， 117, 118, 124， 128, 134, 136, 150， 151， 155, 157, 160, 167, 172, 187， 195, 204, 221， 224， 227, 231， 250， 256， 257, 263, 264, 277, 282， 291或292相對應的位置處的多 個取代，至少其中之一賦予提高的表達或結合動力學，并且可以包括在耐 受取代的位置中的其他取代。在一個實施方案中，突變水解酶可以因此具 有多個取代，包括處在與位置5， 7, 11， 12, 20, 30, 32, 47， 54, 55, 56， 58， 60, 65， 78, 80， 82， 87， 88， 94， 96， 109, 113， 116, 117， 118， 121, 124， 128, 131， 134, 136, 144, 147， 150, 151， 155， 157, 160, 161， 164， 165, 167, 172, 175， 176， 180， 182， 183, 187， 195， 197, 204， 218, 221， 224, 227, 231， 233， 250， 256, 257， 263, 264, 273, 277， 280, 282, 288， 291， 292,和/或294相對應的位置處的多個取 代。在一個實施方案中，突變水解酶是具有多個取代，例如至少5、 10、 15但少于60，例如，50個或更少個取代的突變脫鹵素酶，其包括處在與 SEQ IDN0:1中位置106和/或272相對應的位置處的取代，所述取代導致 突變脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成比在相應的野生型脫鹵素酶和該底物 之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，并且包括多個取代，例如，至少5、 10、 15但 少于60個取代，其可以包括與SEQ ID N0:1的位置5， 11, 20， 30， 32， 47， 58, 60, 65, 78， 80, 87, 88, 94， 109， 113， 117, 118， 124, 128, 134， 136， 150, 151, 155， 157， 160, 167， 172， 175， 176， 187， 195, 204， 221, 224， 227， 231， 250, 256， 257, 263， 264， 273, 277， 282, 291或292相對應的多個取代，至少其中之一 賦予提高的表達或結合動力學，例如，位置5,11,20， 30, 32， 47, 58， 60， 65, 78， 80， 87， 88, 94， 109, 113， 117， 118， 124, 128， 134, 136, 150， 151, 155, 157， 160， 167, 172, 187， 195， 204, 221, 224, 227, 231, 250， 256, 257, 263, 264， 277, 282， 291或292的一處或多處，以及耐受取代的其他位置。
在一個實施方案中，突變水解酶相對于相應野生型水解酶具有至少三 個氨基酸取代。兩個氨基酸取代導致突變水解酶與底物形成比在相應的野生型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，其中一個取代處在相應的 野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解 在相應野生型水解酶和底物之間形成的鍵，且另一個取代處在相應的野生 型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基處。至少一個其他取代處在
與SEQ ID NO:l的位置5, 11， 20, 30, 32, 47, 58, 60, 65, 78, 80, 87, 88, 94， 109, 113, 117， 118, 124， 128, 134， 136， 150, 151, 155, 157, 160， 167, 172, 175， 176, 187， 195, 204， 221, 224， 227， 231， 250, 256， 257， 263， 264， 273, 277, 282, 291或292相對應的位置處。在一個實施方案中，突變水解酶具有多個取 代，例如，至少5， 10, 15但少于60個，例如，少于25個或少于50個取代 的突變脫鹵素酶，其包括處在與SEQ ID NO:l中位置106和/或272相對 應位置處的取代，所述取代導致突變脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成比在相 應的野生型脫鹵素酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵。在一個實施方 案中，突變水解酶可以因此具有多個取代，包括與位置5, 7, 11, 12, 20, 30, 32， 47， 54, 55, 56， 58， 60, 65, 78, 80， 82, 87, 88， 94, 96， 109， 113, 116, 117, 118， 121, 124， 128, 131, 134, 136, 144， 147, 150， 151, 155, 157, 160, 161， 164， 165， 167, 172, 175, 176， 180， 182, 183, 187, 195， 197， 204， 218， 221， 224, 227, 231, 233， 250, 256， 257， 263， 264， 273, 277, 280， 282, 288， 291， 292，和/或294 相對應位置處的多個取代。突變脫鹵素酶也包括多個取代，例如，至少5, 10， 15但少于25個，例如，少于20個取代，其相應于SEQ ID NO:l的位 置5, 11, 20,30, 32， 47, 58， 60,65, 78， 80， 87， 88, 94, 109， 113， 117， 118, 124， 128, 134, 136, 150， 151， 155, 157， 160, 167, 172， 175, 176， 187， 195, 204， 221, 224, 227, 231， 250, 256, 257, 263, 264， 273， 277， 282, 291或292,至少其中 之一賦予提高的表達或結合動力學，例如，SEQ ID NO:l的位置5， 11, 20， 30, 32, 47, 58， 60， 65， 78, 80， 87, 88， 94， 109， 113, 117， 118， 124, 128, 134， 136, 150， 151, 155， 157, 160, 167， 172， 187, 195， 204， 221, 224, 227, 231, 250, 256, 257， 263， 264， 277, 282， 291或292中的一處或多處。
本發(fā)明的突變水解酶可以包括處在N-端處的一個或多個氨基酸取代, 例如，由改變核苷酸序列以具有某些限制性位點產生的那些，或包括處在 C-端的一個或多個氨基酸取代和一個或多個額外的殘基("尾部")，例如， 由改變核苷酸序列以具有某些限制性位點或選擇以相對于相應野生型水解酶提高表達產生的那些。例如,尾部可以包括多至70或80個氨基酸殘 基，只要具有該尾部的突變水解酶的活性基本不變，例如，相對于不具有
尾部的相應突變水解酶，活性降低不超過10%, 25%或50%。
突變水解酶可以是融合蛋白，例如，由編碼突變水解酶和至少一種 目的蛋白質的重組DNA表達的融合蛋白或通過化學合成形成的融合蛋 白。例如，融合蛋白可以包括突變水解酶和目的酶，例如，螢光素酶，RNA 酶抑制劑或RNA酶，和域通道蛋白，例如，離子通道蛋白，受體，膜蛋白, 胞質蛋白，核內蛋白，結構蛋白，磷蛋白，激酶，信號傳導蛋白，代謝蛋白, 線粒體蛋白，受體相關蛋白，熒光蛋白，酶底物，轉錄因子，可選擇的標記 蛋白，核酸結合蛋白，胞外基質蛋白，分泌蛋白，受體配體，血清蛋白，具 有反應性半胱氨酸的蛋白，轉運蛋白和/或耙向序列，例如，肉豆蔻酰化序 列，線粒體定位序列，或細胞核定位序列，其將突變水解酶導向，例如，到 特定位置。目的蛋白可以與突變水解酶的N-端或C-端融合。在一個實施 方案中，融合蛋白包括位于突變水解酶N-端的目的蛋白，和另一種蛋白， 例如，位于C-端的不同蛋白。例如,目的蛋白可以是熒光蛋白或抗體。
任選地，在融合體中的蛋白質通過連接體序列，例如，優(yōu)選地具有至 少2氨基酸殘基的連接體，諸如具有13和多至40或50個氨基酸殘基的 連接體分開。相對于每種單獨蛋白質的功能，在本發(fā)明的融合蛋白中存在 連接體序列基本不改變該融合體中各種蛋白質的功能，這可能歸因于連接 體序列為通過該融合體中的每種蛋白提供靈活性(自主性)。例如，對于具 有至少一個導致與底物和/ em7/"螢光素酶形成穩(wěn)定鍵的取代的突變脫鹵 素酶融合體，連接體序列的存在基本不改變突變脫鹵素酶和其底物之間形 成鍵的穩(wěn)定性或螢光素酶的活性。而且，在一個實施方案中,連接體序列基 本不降低，并可以增高，融合體中各種或兩種蛋白質的功能性表達或結合 動力學。對于在融合體中的任何特殊蛋白質組合，可以使用廣泛種類的連 接體序列。在一個實施方案中，連接體序列是酶識別的序列或是可光致斷 裂的。在一個實施方案中,連接體序列包括蛋白酶識別位點。
還提供分離的核酸分子(多核苷酸)，其包括編碼水解酶，例如,本發(fā) 明的突變水解酶的核酸序列。還提供包括編碼融合蛋白的核酸序列的分離 核酸分子，所述融合蛋白包括本發(fā)明的突變水解酶和位于所述突變水解酶N-端和/或C-端的一個或多個氨基酸殘基。在一個實施方案中，編碼的融合 蛋白包括至少2個不同的融合配偶體，其中一個可以是用于純化的序列, 意欲改變融合蛋白其余部分的性質的序列，例如,蛋白質去穩(wěn)定序列、或具 有可區(qū)分的性質的序列。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包括最 適合于在至少一種選擇的宿主中表達的核酸序列。最適序列包括作為最優(yōu) 化的密碼子的序列，最優(yōu)化的密碼子，即，相對于另一種生物體，例如關 系遠的生物體，在一種生物質中更頻繁使用的密碼子，以及包括修飾，用
以添加或修飾Kozak序列和/或內含子,和/或用于去除不需要的序列，例如， 潛在的轉錄因子結合位點。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼脫 鹵素酶的核酸序列，所述核酸序列最適合于在選擇的宿主細胞中表達。在 一個實施方案中，最適合的多核苷酸不再與相應的非適合的序列雜交，例 如,在中等或高度嚴格條件下不與非適合的序列雜交。在另一個實施方案中: 所述多核苷酸與相應的非適合序列具有少于卯％,例如少于80%的核酸序 列同一性，并任選地，編碼與由非適合序列編碼的多肽具有至少80%，例 如，至少85%、 90%或更高的氨基酸序列同一性的多肽。核酸序列的最適 化在本領域中已知，見，例如W0 02/16944。所述分離的核酸分子，例如, 本發(fā)明的最適合多核苷酸可以引入到體外轉錄/翻譯反應中或宿主細胞中, 從而表達所述編碼的蛋白質。
還提供包括所述分離的核酸分子，例如最適合的多核苷酸的構建體，例 如表達盒，和載體，以及具有所述構建體的宿主細胞，和包括所述分離的 核酸分子或一種或多種構建體或載體的試劑盒。宿主細胞包括原核細胞或 真核細胞諸如植物或脊椎動物細胞，例如，哺乳動物細胞，包括但不僅限 于人，非-人靈長類動物，狗，貓，牛，馬，綿羊或嚙齒動物(例如，兔，大 鼠，貂或小鼠)細胞。優(yōu)選地，所述表達盒包括啟動子，例如,組成型或可調 控的啟動子，其與核酸分子操作性地相連接。在一個實施方案中，所述表 達盒包含可誘導的啟動子。在一個實施方案中，本發(fā)明包括載體，所述載 體包括編碼包括突變脫鹵素酶的融合蛋白的核酸序列。
有效用于本發(fā)明的底物是這樣的底物，即其被突變水解酶特異性結合， 并優(yōu)選地導致與突變水解酶的氨基酸，例如，反應性殘基形成鍵，所述鍵 比在該底物和野生型水解酶的相應氨基酸之間形成的鍵更穩(wěn)定。盡管突變水解酶特異性結合可以由相應的野生型水解酶特異性結合的底物，但是在 一個實施方案中，在通過相應的野生型水解酶和底物之間的反應導致產物 形成的條件下，由突變水解酶和底物之間的相互作用不形成產物或形成充 分少的產物，例如，少2-， 10-， 100-,或1000-倍。在一個實施方案中，在本發(fā) 明的突變水解酶和底物之間形成的鍵具有這樣的半衰期(即，t。，所述半 衰期比相應野生型水解酶和底物之間在由該相應的野生型水解酶導致產
物形成的條件下形成的鍵的t'力高至少2-倍，和更優(yōu)選地，至少4-或甚至10-倍，和多至100-， 1000-或10,000-倍。優(yōu)選地，在突變水解酶和底物之間形 成的鍵具有至少30分鐘和優(yōu)選至少4小時，和多至至少10小時的&,且對由 洗滌、蛋白質變性劑、和/或高溫引起的破壞具有抗性，例如，所述鍵對在 SDS中煮沸是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，所述底物是脫鹵素酶，例如,鹵 烷脫鹵素酶或裂解脂肪族或芳香族鹵化底物中的碳-鹵鍵的脫鹵素酶的底 物，諸如紅球菌屬(7 /20cbcoc價)、葡萄球菌屬(S鄉(xiāng)/^/ococ，)、假 單胞菌屬(i^eMcfomo"os)、伯克氏菌屬(BwA/20WeWa) 、 土壤桿菌屬 "gra6a"en'wm)或黃色桿菌屬(Xa"Ao6acfer)脫卣素酶的底物，或絲氨 酸卩-內酰胺酶的底物。
在一個實施方案中，本發(fā)明的底物任選地包括將底物中一個或多個官 能團與反應基物理分開的連接體。例如，對于一些突變水解酶，即，具有 深催化口袋的那些，本發(fā)明的底物可以包括這樣的連接體，其具有充足 的長度和結構，從而使本發(fā)明底物的一個或多個官能團不干擾水解酶(野 生型或突變型)的3-D結構。
本發(fā)明還包括組合物和試劑盒，其包括針對包含連接體的水解酶的底 物，針對包含一個或多個官能團和任選地連接體的水解酶的底物，包含一 個或多個官能團的連接體，針對缺乏一個或多個官能團和任選地包含連接 體的水解酶的底物，連接體，或突變水解酶，或其任意組合。例如，本發(fā)明 包括包含突變水解酶底物的固體支持物、包含本發(fā)明的突變水解酶或其融 合體的固體支持物、包含編碼本發(fā)明的突變水解酶或其融合體的載體的試 劑盒。
本發(fā)明的底物和突變水解酶有效用于分離、檢測、識別、成像、展示、 或定位目的分子、標記細胞，包括活細胞成像，或在體外和/或在體內標記蛋白質。例如，與固體支持物結合的突變水解酶的底物、或與固體支持物 結合的突變水解酶可以用于生成蛋白質陣列、細胞陣列、囊泡/細胞器陣列、 基因陣列、和/或細胞膜陣列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于分離目 的分子的方法。所述方法包括提供包括一種或多種融合蛋白的樣品，至少 其中之一包括本發(fā)明的突變水解酶和任選地與目的分子預結合的蛋白質， 并且提供具有一種或多種水解酶底物的固體支持物。然后使所述樣品和固 體支持物相接觸，從而分離目的分子。
還提供表達本發(fā)明的突變水解酶的方法。所述方法包括向宿主細胞或 體外轉錄/翻譯反應引入編碼本發(fā)明的突變水解酶的重組核酸分子，從而表 達所述突變水解酶。在一個實施方案中，突變水解酶可以由所述細胞或反 應分離。突變水解酶可以瞬時地或穩(wěn)定地、組成型地或在組織-特異性或藥 物-調控的啟動子下、和類似地表達。還提供分離的宿主細胞，其包括編碼 本發(fā)明的突變水解酶的重組核酸分子。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測或確定突變水解酶的存在或 量的方法。所述方法包括使本發(fā)明的突變水解酶與包括一個或多個官能團 的水解酶底物相接觸。檢測或確定所述官能團的存在或量，由此檢測或確 定突變水解酶的存在或量。在一個實施方案中，突變水解酶位于細胞表面 中或之上。在另一個實施方案中，突變水解酶處于細胞裂解產物中。在另 一個實施方案中，突變水解酶是體外轉錄/翻譯反應的產物。
還提供用于分離蛋白質或目的分子的方法。在一個實施方案中，所述 方法包括提供包含一種或多種融合蛋白的樣品，至少其中之一包括突變水 解酶和目的蛋白，和提供包含一種或多種水解酶底物的固體支持物。突變 水解酶相對于相應的野生型水解酶具有至少2個氨基酸取代，其中一個氨 基酸取代導致突變水解酶與底物形成比在相應的野生型水解酶和該底物 之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且所述取代處在相應的野生型水解酶中與活化 水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解在相應的野生型水解酶 和底物之間形成的鍵，或處在相應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體 的氨基酸殘基處。在一個實施方案中，突變水解酶具有處在導致突變水解 酶與底物形成比在相應的野生型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的 鍵的氨基酸處的取代，所述取代處在相應的野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解相應的野生型水解酶和底物之 間形成的鍵，或處在相應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸
殘基處。突變水解酶還包括處在與SEQIDN0:1的位置5， 11, 20， 30, 32， 47， 58, 60， 65, 78, 80， 87， 88， 94， 109， 113， 117, U8， 124， 128， 134， 136， 150, 151， 155, 157, 160, 167, 172, 187, 195, 204， 221, 224, 227, 231, 250, 256, 257， 263， 264, 277, 282, 291或292相對應的一處或多處位置處的取代。在一個實施方 案中，突變水解酶可以因此具有多個取代，包括處在與位置5，7，11,12,20， 30, 32， 47, 54, 55, 56， 58， 60， 65, 78， 80， 82, 87， 88, 94, 96， 109， 113, 116, 117, 118, 121， 124， 128， 131， 134， 136, 144, 147, 150， 151, 155， 157, 160， 161, 164， 165, 167， 172, 175, 176， 180, 182, 183， 187, 195， 197， 204, 218, 221, 224， 227, 231, 233, 250, 256, 257， 263, 264, 273， 277, 280, 282, 288, 291, 292，和/或294 相對應的位置處的多個取代。使所述樣品和固體支持物相接觸，從而分離 目的蛋白。在一個實施方案中，樣品中的目的蛋白在與固體支持物接觸前 與目的分子結合。在另一個實施方案中，在所述樣品和固體支持物接觸后， 加入懷疑具有與目的蛋白結合的分子的混合物。
還提供使用本發(fā)明的突變水解酶和針對包括一個或多個官能團的相 應水解酶的底物，例如，分離分子或檢測或確定細胞中某些分子的存在或 量，位置例如胞內、亞細胞或胞外位置，或運動的方法。例如，將編碼與 目的蛋白融合的突變脫鹵素酶的載體引入細胞、細胞溶解產物、體外轉錄 /翻譯混合物、或上清液中，并向其中加入由官能團標記的水解酶底物。例 如,使細胞與載體相接觸，所述載體包括啟動子，例如,可調節(jié)的啟動子，和 編碼與同目的分子相互作用的蛋白質融合的突變水解酶的核酸序列。在一 個實施方案中，在啟動子誘導所述融合體的瞬時表達的條件下培養(yǎng)轉染的 細胞，，并然后檢測與官能團有關的活性。
本發(fā)明因此提供用于監(jiān)測細胞中蛋白質表達、位置和/或運動(運輸)以 及用于監(jiān)測樣品，例如，細胞中微環(huán)境變化的方法。在另一個實施方案中， 使用2對突變水解酶/底物允許進行多重通道、同時檢測，和基于FRET或 BRET的測定法。其他應用包括檢測或標記細胞。因此，使用本發(fā)明的突變水解酶和本發(fā) 明的相應底物允許進行細胞檢測，例如，用于檢測細胞體外遷移(例如， 血管發(fā)生/趨化性測定，等等)，和或細胞成像后的免疫細胞化學法。
.在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于標記細胞的方法。所述方法包括 使具有包括突變水解酶的細胞或其溶解產物的樣品與包括一個或多個官 能團的水解酶底物相接觸。相對于相應野生型水解酶，突變水解酶具有至 少2個氨基酸取代，其中一個氨基酸取代導致突變水解酶與底物形成比在 相應的野生型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且所述取代處 在相應野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水 分子裂解相應的野生型水解酶和底物之間形成的鍵，或處在相應野生型 水解酶中與底物形成酯中間體的氨基酸殘基處。在一個實施方案中，第二
個取代處在與SEQ ID NO:l的位置5, 11, 20, 30, 32， 47， 58, 60, 65， 78, 80， 87, 88， 94, 109， 113， 117, 118, 124, 128, 134， 136， 150， 151， 155, 157， 160, 167， 172, 187， 195, 204， 221， 224, 227， 231， 250, 256, 257， 263, 264， 277, 282, 291或292相對應的位置處。在一個實施方案中，突變水解酶具有多個取代， 例如，除處在，例如，位置106或272處之外,處在與SEQ ID N0:l的位置5， 7, 11, 12， 20, 30, 32, 47, 54， 55, 56， 58, 60, 65， 78, 80, 82， 87, 88, 94， 96， 109, 113, 116, 117, 118, 121， 124, 128， 131, 134， 136, 144, 147, 150, 151, 155, 157, 160, 161, 164, 165, 167, 172, 175, 176, 180， 182, 183, 187, 195, 197， 204， 218, 221， 224, 227, 231， 233， 250， 256， 257, 263， 264， 273, 277, 280, 282， 288, 291， 292，和/或294相對應的位置的處取代。檢測或確定樣品中官能團的存在或
附圖簡述
圖lA顯示DhaA.H272F蛋白的分子模型。螺旋帽結構域顯示為淡藍 色。a/(3水解酶核心結構域(深藍色)包含催化三聯體殘基。所述帽和核 心結構域界面附近的帶紅色的殘基代表H272F和D106親核體。帶黃色的 殘基表示位置E130和鹵化物-螯合殘基W107。


圖1B顯示紫紅紅球菌(i /70(iococcztf Ao必c/woztf)脫鹵素酶(DhaA) 蛋白(Kulakova等，1997)的序列(SEQIDNO:l)。下劃線標記催化三聯體殘基Asp(D)，Glu(E)和His(H)。以斜體顯示構成帽結構域的殘基。能夠與鹵 烷底物形成共價鍵的DhaA.H272F和DhaA,D106C蛋白突變體分別包含將 催化三聯體His (H)和Asp (D)殘基替換為Phe (F)和Cys (C)。
圖lC舉例說明由DhaA.H272F和卣烷底物引起的共價中間體形成機 制。由Aspl06親核替代鹵素基團，然后形成共價酯中間體。用Phe殘基替 換His272防止水活化和捕獲(trap)共價中間體。
圖10描述由011".0106(:和鹵垸底物引起的共價中間體形成的機制。 由Cysl06硫醇酯親核替代鹵素而產生對水解穩(wěn)定的硫醚中間體。
圖1E描述具有處于活性位點活性的共價附著的羧基四甲基羅丹明 -CK)H2,N02-Cl配體的DhaA.H272F變體的結構模型。所述帽和核心結構 域界面附近的帶紅色的殘基代表H272F和D106親核體。帶黃色的殘基表 示位置E130和卣化物-螯合殘基W107。
圖1F顯示DhaA.H272F底物結合通道的結構模型。
圖2A-B顯示處在DhaA.H272F位置175, 176和273處的取代的序列(圖 A)和處在DhaA,D106C位置175和n6處的取代的序列(圖B)。
圖3提供本發(fā)明范圍內突變脫鹵素酶的示范性序列(SEQ ID Nos. 12-16)。作為克隆的結果，在3'末端編碼2個額外的殘基(Gln-Tyr)。具有 關于那兩個額外殘基的密碼子的突變脫鹵素酶編碼核酸分子以類似于或 高于不具有那些殘基的突變脫鹵素酶的水平表達。
圖4顯示HT2的核苷酸(SEQ ID NO:20)和氨基酸(SEQ ID N0:21)序 列。引入列出的限制性位點，以促進功能性N-和C-端融合體的產生。C-端殘基Ala-Gly可以被替換為Val。
圖5提供額外的取代，所述取代改善具有那些取代的DhaA突變體在
大腸桿菌中的功能性表達。
圖6顯示關于在大腸桿菌中作為N-端融合體表達的突變脫鹵素酶 "V7" (SEQIDN0:19，其具有與SEQ ID NO:16，艮P"V6"相同的序列，區(qū)別 是SEQIDNO:17中的C-端殘基不同于SEQIDNO:16中的那些；見圖8)的 TMR配體標記和動力學。
圖7提供關于兔網織紅細胞轉錄/翻譯反應中V7的表達數據。
圖8提供HT和V7的C-端的對比(SEQ ID NO:2)。圖9顯示麥芽轉錄/翻譯反應中V7的功能性表達。
圖10顯示HeLa細胞的體內標記。 圖11總結V7相對于HT2的性質。 圖I2顯示來自破壞測定的結果。
圖13總結利用純化的蛋白質的TMR-配體和FAM-配體的二級速率常 數數據。該數據是通過利用FP隨時間追蹤標記產生的。
圖14顯示選擇的蛋白在不同溫度下的殘余活性。使蛋白暴露于指定 溫度30分鐘并然后通過FP分析FAM-配體結合。將數據表述為殘余活性，
針對每種蛋白在不暴露于升高的溫度下具有的活性量進行標準化。
圖15舉例說明不同DhaA突變體(320 nM)在存在尿素(A)或鹽酸胍(B)
的條件下室溫下過夜的穩(wěn)定性.
圖16舉例說明具有TMR配體的不同DhaA突變體的標記動力學。 圖17舉例說明具有FAM配體的不同DhaA突變體的標記動力學。 圖18提供兩種DhaA突變體標記率的比較。
圖19顯示不同DhaA突變體的核苷酸和氨基酸序列，所述DhaA突變體 包括在C-端具有尾部的(N融合體)或在N-端位置1或2處具有取代(C融合體) 的那些(HT2， SEQ ID N0:18由SEQ ID NO:17編碼；V2n, SEQ ID NO:22 由SEQ ID NO:32編碼；V3n， SEQ ID NO:23由SEQ ID NO:33編碼；V4n, SEQ ID NO:24由SEQ ID NO:34編碼；V5n, SEQ ID NO:25由SEQ ID NO:35編碼；V6n， SEQ ID NO:26由SEQ ID NO:36編碼；V7n, SEQ ID NO:27 由SEQ ID NO:37編碼;V2c， SEQ ID NO:42由SEQ ID NO:52編碼;V3c, SEQ ID NO:43由SEQ ID NO:53編碼；V4c, SEQ ID NO:44由SEQ ID NO:54 編碼；V5c， SEQ ID NO:45由SEQ ID NO:55編碼；V6c, SEQ ID NO:46由SEQ ID NO:56編碼；V7n， SEQ ID NO:47由SEQ ID NO:57編碼)。SEQ ID NOs: 48， 49， 28和29是代表性的連接體序列。SEQ ID NOs: 60-65表示最小(無尾部) 突變DhaA序列的殘基l-293，且SEQ ID NOs:66-71表示具有C-端取代和尾 部的突變DhaA序列。
圖20顯示p65-突變DhaA融合蛋白在轉染后不同時間的檢測(細胞-到-凝膠分析)。用p65-HT2 (綠色)、p65-V3 (粉色)、p65-V7 (藍色/白色)、p65-V7F (黃色)瞬時轉染HeLa細胞不同的時期，用TMR配體標記(5pM， 15分鐘)，裂解并在熒光成像儀Typhoone-9400上進行分析。注意到V7t是具有V7序列 的突變DhaA ， 所述V7具有63個氨基酸的尾部 (eisggggsggggsggggenlyfqaielgtrgssrvdlqacklirlltkperklswllpplsnn; SEQ ID NO: 72)。
圖21顯示p65-突變DhaA融合蛋白在轉染后不同時間的檢測(蛋白質 印跡分析).用p65-HT2 (綠色)、p65-V3 (粉色)、p65-V7 (藍色/白色)、 p65-V7F (黃色)瞬時轉染HeLa細胞不同的時期，裂解并用p65 AB (上圖) 禾口IkB AB (下圖)探測。
圖22舉例說明鹽中標記動力學的依賴性。在20 mM HEPES pH 7.2 + 0-2MNaCl中測量和計算V7(16.5nM)對FAM配體(7.5 nM)的標記速率。 在鹽濃度和標記速率之間存在正相關性。
圖23顯示pH對標記動力學的影響。緩沖液包括25 mM乙酸鈉(有效 緩沖范圍pH 3.6-5.6), 25 mM MES (pH 5.5-6.7)， 50 mM Tris (pH 7.0-9.0)和 50mMNaCl。酸性調節(jié)乙酸，堿性調節(jié)四甲基氫氧化銨。
圖24顯示DTT對標記動力學的影響。濃度< 1 mM的DTT對標記動力 學沒有影響，而濃度〉lmM的DTT抑制標記動力學。
圖25顯示毛地黃皂苷對標記動力學的影響。
圖26顯示非離子型去污劑對標記動力學的影響。
圖27顯示陽離子去污劑對標記動力學的影響。 '圖28顯示離子型去污劑對標記動力學的影響。
圖29顯示兼性離子去污劑對標記動力學的影響。
發(fā)明詳述
.用于本文中時，"底物"包括具有反應基和任選地一個或多個官能團的 底物。包括一個或多個官能團的底物一般在本文中稱為本發(fā)明的底物。底
物，例如，本發(fā)明的底物，還可以任選地包括連接體，例如，可裂解的連接體: 其在底物中物理上將一個或多個官能團與反應基分開，且在一個實施方案
中，所述連接體優(yōu)選為12-30個原子長。所述連接體可以不一定存在于本發(fā)
明的底物中，然而，在一些實施方案中，可能需要將反應基和官能團的在 物理上分開，以便使反應基可以與突變水解酶中的反應性殘基互相作用，從而形成共價鍵。優(yōu)選地，當存在時，相對于缺乏所述連接體的相應底物 與野生型或突變水解酶的特異性或反應性，所述連接體基本不改變，例如， 削弱，具有所述連接體的底物與野生型或突變水解酶的特異性或反應性。此 外，所述連接體的存在優(yōu)選地基本不改變，例如，削弱，官能團的一種或 多種性質，例如,功能。例如，對于一些突變水解酶，即，具有深催化口袋的 那些，本發(fā)明的底物可以包括這樣的連接體，其具有充足的長度和結構， 從而使本發(fā)明的底物的一個或多個官能團不干擾水解酵(野生型或突變
型)的3-D結構。底物可以具有2個或更多不同的官能團。
當用于本文中時，"官能團"是可檢測的或能夠檢測的分子，例如，可 通過直接或間接方式測量的分子(例如，可光活化的分子，洋地黃毒苷，鎳
NTA (氨三乙酸)，生色團，熒光團或發(fā)光團)，可以結合或附著于第二分子 (例如，生物素，半抗原，或交聯基團)，或可以是固體支持物。官能團可以具 有多于一種性質諸如能夠檢測和能夠結合于另一種分子。
當用于本文中時，"反應基"是底物中由特殊野生型或本發(fā)明的突變水 解酶特異性識別的最少原子數。底物中反應基和野生型水解酶的相互作用 導致產物和野生型水解酶的再生。
當用于本文中時，術語"異源"核酸序列或蛋白質指相對于參考序列 具有不同來源的序列，例如，源自外源物種，或，如果源自相同物種，則 其可以是由原始形式充分修飾的。
術語"融合多肽"當用于本文中時指包含與不同蛋白如突變水解酶連 接的目的蛋白(例如,螢光素酶、親合標記物或靶向序列)的嵌合蛋白。
"親核體"是提供電子的分子。
當用于本文中時，"標記基因"或"報道基因"是這樣的基因，其授予表 達該基因的細胞不同的表型并因此允許具有該基因的細胞與不具有該基 因的細胞區(qū)分開。所述基因可以編碼可選擇的或可篩選的標記，其依賴于 該標記是否賦予可通過化學方式，即通過使用選擇性試劑(例如，除草劑, 抗生素,等等)"選擇"的特性，或是否僅是人們能夠通過觀察或測試，即 通過"篩選"識別的"報道"特性。本公開內容的原理通過使用具體的標記 基因詳細示范。當然，合適的標記基因或報道基因的許多實例在本領域中 已知，其可以用于實施本發(fā)明。因此，應該理解下列討論是示范性的而非
22窮舉的。根據本文中公開的技術和本領域中已知的一般重組技術，本發(fā)明 使得任何基因的改變成為可能。示范性修飾的報道蛋白由包括修飾的報道 基因的核酸分子編碼，所述修飾的報道基因包括但不僅限于下列各項的修 飾MO基因、卩-gal基因、g^基因、CW基因、gj^基因、 g基因、/^￡>
基因、We基因、m/7W基因、6w基因、腈水解酶基因、吡喃半乳糖苷基 因、木糖苷酶基因、胸苷激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突變乙酰乳酸 合酶基因(ALS)或乙酰酸合酶基因(AAS)、甲氨蝶呤-抗性rf/ 斤基因、茅草 枯脫鹵素酶基因、賦予針對5-甲基色氨酸抗性的突變鄰氨基苯甲酸合酶基 因(WO 97/26366)、 R-基因座基因、J3-內酰胺酶基因、x少氾基因、a-淀粉 酶基因、酪氨酸酶基因、螢光素酶(/"c)基因(例如、海洋腔腸(Z em7/a "m/0rm&)螢光素酶基因、螢火蟲熒光素酶基因,或叩頭蟲熒光素酶 (尸,o; /zomsp/ag/o; M^/ami )基因、水母發(fā)光蛋白基因、紅色熒光蛋白基 因，或綠色熒光蛋白基因。屬于該術語范圍的可選擇或可篩選標記基因還是 編碼"可分泌標記"的基因，所述"可分泌標記"的分泌可以檢測，作為鑒 定或選擇轉化的細胞的方法。實例包括編碼可以由抗體相互作用鑒定的可 分泌抗原，或甚至可以由它們的催化活性檢測的可分泌酶的標記。可分泌 蛋白分成許多類，包括，例如可由ELISA檢測的小的、可擴散蛋白和插入 或陷入細胞膜中的蛋白。
"可選擇的標記蛋白"編碼賦予細胞在缺乏另外是必需營養(yǎng)物(伊丄如—，— 酵母細胞中的TRP1基因)的培養(yǎng)基中或在具有抗生素或其他藥物的培養(yǎng) 基中生長的能力的酶活性，即相對于不具有該基因的相應細胞，編碼可選 擇的標記蛋白的基因在細胞中的表達賦予該細胞針對抗生素或藥物的抗 性。當宿主細胞必須表達可選擇的標記以在選擇性培養(yǎng)基中生長時，認為 所述標記是陽性選擇標記(例如，賦予在適當的抗生素存在下生長能力的 抗生素抗性基因)?？蛇x擇的標記還可以用于針對包含特殊基因(例如,^cB 基因，其如果表達，則殺死在包含5%蔗糖的培養(yǎng)基中生長的細菌宿主細胞) 的宿主細胞進行選擇；以這種方式使用的可選擇的標記稱為陰性選擇的標 記或相反-選擇的標記。普通的可選擇的標記基因序列包括對抗抗生素例如 氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、嘌呤霉素、博來霉素、鏈霉素、潮霉素、 新霉素、ZeocinTM,等等的那些?？蛇x擇的營養(yǎng)缺陷型基因序列包括，例如hisD，其容許在組氨醇存在下在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長。合適的可選 擇的標記基因包括博來霉素-抗性基因、金屬硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸
轉移酶基因、AURI基因、腺苷脫氨酶基因、氨基糖苷磷酸轉移酶基因、
二氫葉酸還原酶基因、胸苷激酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基 因，等等。
"核酸"，用于本文中時，是共價連接的核苷酸序列，其中一個核苷酸的
戊糖的3'位置通過磷酸二酯基團與下一個核苷酸的戊糖的5'位置相連接， 且其中核苷酸殘基(堿基)以特定的順序連接，即核苷酸的線性順序，且 包括其類似物，諸如具有一個或多種修飾堿基、糖和/或磷酸酯骨架的那些。 "多核苷酸"，用于本文中時，是包含長度大于約100個核苷酸的序列的 核酸。"寡核苷酸"或"引物"，用于本文中時，是短多核苷酸或多核苷酸 的一部分。術語"寡核苷酸"或"寡"用于本文中時，定義為由2個或更 多脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優(yōu)選地多于3個，和通常多于10個，但 少于250個，優(yōu)選地少于200個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的分子。 所寡核苷酸可以通過任何方式生成，所述方式包括化學合成，DNA復制, 擴增，例如，聚合酶鏈反應(PCR)，反轉錄(RT),或其組合。"引物"是能 夠在處于起始引物延伸的條件下起核酸合成起始點作用的寡核苷酸。選擇 引物在其3，末端具有與靶標(模板)的特定序列基本互補的區(qū)域。引物必 須是充分互補的，以使得與靶標雜交，從而發(fā)生引物的延伸。引物序列不 需要反映靶標的準確序列。例如，非-互補的核苷酸片段可以附著于引物的 5，末端，其中該引物序列的剩余部分與所述靶標基本互補。非-互補的堿基 或較長序列可以散置在引物中，條件是該引物序列與靶標序列具有足以雜 交的互補性，并由此形成復合物用以合成引物的延伸產物。引物與基因序 列的匹配或互補性可以用于擴增反應、RT-PCR等。
認為核酸分子具有"5，-端"(5'末端)和"3'-端"(3'末端)，因為核 酸磷酸二酯鍵出現在取代單核苷酸的戊糖環(huán)的5'碳和3'碳處。新鍵將出現 在其5'碳處的多核苷酸的末端是其5'端核苷酸。新鍵將出現在其3'碳處的 多核苷酸的末端是3'端核苷酸。末端核苷酸，用于本文中時，是在3'-或5'-端末端位置的核苷酸。
認為DNA分子具有"5'末端"和"3'末端"，因為單核苷酸以這樣的方式反應從而形成寡核苷酸，所述方式是一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸通 過磷酸二酯鍵以一種方向附著于其相鄰的3'氧。因此，如果其5，磷酸不與
單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧相連接，則寡核苷酸的末端稱為"5'末端"，并且 如果其3'氧不與隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸相連接，則稱為"3'末端"。
用于本文中時，核酸序列，即使在較大寡核苷酸或多核苷酸內部，也 可以認為具有5'和3'末端。在線性或環(huán)形DNA分子中，離散元件稱為"下 游"或3，元件的"上游"或5，。該術語反映這樣的事實，即轉錄沿著DNA 鏈以5'到3'方式進行。典型地，指導連接的基因(例如，開放閱讀框或編 碼區(qū))轉錄的啟動子和增強子元件通常位于編碼區(qū)的5，或上游。然而，增 強子元件甚至在位于啟動子元件和編碼區(qū)的3'時發(fā)揮其作用。轉錄終止和 多聚腺苷化信號位于編碼區(qū)的3'或下游。
術語"密碼子"用于本文中時，是基本遺傳編碼單位，由三個核苷酸 的序列組成，所述三個核苷酸指定結合到多肽鏈中的特定氨基酸、或起始 或終止信號。術語"編碼區(qū)"當關于結構基因使用時，指編碼在作為mRNA 分子翻譯的結果產生的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。典型地， 所述編碼區(qū)在5，側結合編碼起始密碼子甲硫氨酸的核苷酸三聯體"ATG"， 并且在3，側結合終止密碼子(例如，TAA,TAG,TGA)。在一些情形中，還已 知所述編碼區(qū)由核苷酸三聯體"TTG"起始。
用于本文中時，術語"分離的"指體外制備、分離和/或純化核酸分子、 多肽、肽或蛋白質，以使其與體內物質無關。因此，術語"分離的"在關 于核酸使用時，如在"分離的寡核苷酸"或"分離的多核苷酸"中，指從 在其來源中一般有關的至少一種污染物中鑒定和分開的核酸序列。分離的 核酸處于與天然存在不同的形式或配制中。相反，非-分離的核酸(例如 DNA和RNA)以它們天然存在的狀態(tài)存在。例如，發(fā)現給定的DNA序 列(例如，基因)以接近相鄰基因的方式存在于宿主細胞染色體上；發(fā)現 RNA序列(例如，編碼特定蛋白的特定mRNA序列)作為與編碼多種蛋 白質的許多其他mRNA的混合物存在于細胞中。因此，關于"分離的核 酸分子"，其包括基因組、cDNA、或合成來源的多核苷酸或其一些組合， 所述"分離的核酸分子"(1)與天然存在所述"分離的核酸分子"的多核 苷酸的全部或一部分無關，(2)與天然不相連的多核苷酸操作性地連接，或(3)天然不作為較大序列的一部分出現。分離的核酸分子可以以單鏈 或雙鏈形式存在。當使用核酸分子表達蛋白質時，該核酸最少包括有義鏈 或編碼鏈(即該核酸可以是單鏈的)，但是可以包括有義和反義鏈二者(即， 該核酸可以是雙鏈的)。
術語"分離的"當關于多肽使用時，如在"分離的蛋白質"或"分離 的多肽"中，指從在其來源中一般有關的至少一種污染物中鑒定和分開的 多肽。因此，分離的多肽(1)與天然存在的蛋白質無關，(2)不含來自 相同來源的其他蛋白質，例如不含人蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表
達，或(4)天然不存在。因此，分離的多肽以與天然存在不同的形式或
配制存在。相反，非-分離的多肽(例如蛋白質和酶)以它們天然存在的狀 態(tài)存在。術語"分離的多肽"、"分離的肽"或"分離的蛋白質"包括由包
含一個合成起點的cDNA或重組RNA編碼的多肽、肽或蛋白質，或其一 些組合。
術語"野生型"用于本文中時，指具有由天然存在的來源分離的基因 或基因產物的特征的基因和基因產物。野生型基因是種群中最頻繁觀察到 的基因，并因此任意地命名為基因的"野生型"形式。相反，術語"突變 型"指當與野生型基因或基因產物比較時，在序列和/或功能性特性中展示 變化(即，改變的特征)的基因或基因產物。注意可以分離天然-存在的突 變體；這些是通過這樣的事實鑒定的，即當與野生型基因或基因產物比較 時，它們具有改變的特征。
術語"基因"指這樣的DNA序列，其包括編碼序列和任選地對于從 該DNA序列生成多肽所必需的調控序列。
已知核酸包含不同類型的突變。"點"突變指核苷酸序列中在單堿基 位置處與野生型序列不同的變化。突變還可以指插入或缺失一個或多個堿 基，以使核酸序列與參考，例如野生型序列不同。
術語"重組DNA分子"意指雜交DNA序列，其包括天然通常不一起 存在的至少兩種核苷酸序列。術語"載體"關于這樣的核酸分子使用，在 所述核酸分子中，可以插入或克隆DNA片段，并且可以用于將DNA片斷 轉移到細胞中，并能夠在細胞中復制。載體可以源自質粒、噬菌體、病毒、 黏端質粒，等。
26術語"重組載體"、"表達載體"或"構建體"用于本文中時，指包含
理想編碼序列的DNA或RNA序列和在特定宿主生物體中表達操作連接的 編碼序列所必需的合適的DNA或RNA序列。原核表達載體包括啟動子、 核糖體結合位點、用于在宿主細胞中自主復制的復制起點和可能地其他序 列，例如任選的操縱子序列、任選的限制性酶位點。啟動子定義為指導 RNA聚合酶結合于DNA和起始RNA合成的DNA序列。真核表達載體包 括啟動子，任選地多聚腺苷化信號和任選地增強子序列。
具有"編碼肽、蛋白質或多肽"的核苷酸序列的多核苷酸意指包括基 因編碼區(qū)的核酸序列或其片段，所述片段編碼與相應的全長肽、蛋白質或 多肽具有基本相同活性的基因產物。所述編碼區(qū)可以以cDNA、基因組 DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，寡核苷酸可以是單鏈的 (即，有義鏈)或雙鏈的。如果需要，合適的調控元件諸如增強子/啟動子， 剪接接頭、多聚腺苷化信號等可以置于基因編碼區(qū)的緊密接近處，以允許 適當起始轉錄和/或正確處理初級RNA轉錄物。備選地，本發(fā)明的表達載 體中使用的編碼區(qū)可以包含內源增強子/啟動子、剪接接頭、間插序列、多 聚腺苷化信號等。在其他實施方案中，編碼區(qū)可以包含內源和外源控制元 件的組合。
術語"轉錄調節(jié)元件"或"轉錄調節(jié)序列"指控制核酸序列表達的一 些方面的遺傳元件或序列。例如，啟動子是促進操作連接的編碼區(qū)轉錄起 始的調節(jié)元件。其他調節(jié)元件包括，但不限于，轉錄因子結合位點、剪接 信號、多聚腺苷化信號、終止信號和增強子元件，且包括增加或減少連接 序列轉錄的元件，例如在反式-作用元件的存在下。
真核細胞中的轉錄控制信號包括"啟動子"和"增強子"元件。啟動 子和增強子由與參與轉錄的細胞蛋白特異性相互作用的DNA序列的短陣 列組成。啟動子和增強子元件分離自多種真核來源，包括酵母、昆蟲和哺 乳動物細胞中的基因。啟動子和增強子元件還分離自病毒，且類似的控制 元件，諸如啟動子也存在于原核生物中。特定啟動子和增強子的選擇依賴 于用于表達目的蛋白的細胞類型。 一些真核啟動子和增強子具有寬宿主范 圍，而其他在有限的細胞類型子集中起作用。例如，SV40早期基因增強 子在來自許多哺乳動物物種的廣泛多種細胞類型中非?；钴S，并且己經廣泛用于在哺乳動物細胞中表達蛋白。在寬范圍的哺乳動物細胞類型中活躍 的啟動子/增強子的兩種其他實例是來自人延伸因子1基因和勞斯肉瘤病 毒的長末端重復；和來自人巨細胞病毒的那些。
術語"啟動子/增強子"表示包含能夠提供啟動子和增強子功能(即，
由上述啟動子元件和增強子元件提供的功能)的序列的DNA片斷。例如，
反轉錄病毒的長末端重復包含啟動子和增強子功能。增強子/啟動子可以是 "內源的"或"外源的"或"異源的"。"內源"增強子/啟動子是在基因組 中與給定基因天然連接的增強子/啟動子。"外源"或"異源"增強子/啟動 子是通過遺傳操作(即分子生物學技術)置于與基因并列的那種，以使基 因的轉錄受到連接的增強子/啟動子的指導。
表達載體上存在"剪接信號"經常導致重組轉錄物在真核宿主細胞中
更高的表達水平。剪接信號介導從初級RNA轉錄物中去除內含子，并由 剪接供體和接納體位點組成。普遍使用的剪接供體和接納體位點是來自 SV40的16S RNA的剪接接頭。
重組DNA序列在真核細胞中的有效表達需要表達指導由此生成的轉 錄物的有效終止和多聚腺苷化的信號。轉錄終止信號通常存在于多聚腺苷 化信號的下游，并且長度是幾百個核苷酸。術語"多(A)位點"或"多
(A)序列"用于本文中時，表示指導新生RNA轉錄物終止和多聚腺苷化 的DNA序列。重組轉錄物的有效多聚腺苷化是需要的，因為缺乏多(A) 尾部的轉錄物是不穩(wěn)定的，且迅速降解。表達載體中使用的多(A)信號 可以是"異源的"或"內源的"。內源多(A)信號是在基因組中給定基因 編碼區(qū)3'末端天然存在的那種。異源多(A)信號是從一種基因中分離的 并位于另一種基因的3'的那種。普遍使用的異源多(A)信號是SV40多
(A)信號。SV40多(A)信號包含在237bp的BflwHI/Bc/I限制性片段 上并指導終止和多聚腺苷化。
真核表達載體還可以包含"病毒復制子"或"病毒復制起點"。病毒 復制子是容許在表達合適的復制因子的宿主細胞中染色體外復制載體的 病毒DNA序列。包括SV40或多瘤病毒復制起點的載體在表達合適的病 毒T抗原的細胞中復制到高拷貝數(多至104個拷貝/細胞)。相反，包含 來自牛乳頭瘤病毒或埃巴病毒的復制子的載體以低拷貝數(約100個拷貝/細胞)進行染色體外復制。
術語"體外"指人工環(huán)境和人工環(huán)境中發(fā)生的過程或反應。體外環(huán)境 包括，但不限于，試管和細胞裂解產物。術語"原位"指細胞培養(yǎng)。術語 "體內"指天然環(huán)境(例如，動物或細胞)和天然環(huán)境中發(fā)生的過程或反 應。
術語"表達系統"指用于確定(例如，檢測)目的基因表達的任何測 定法或系統。分子生物學領域中的那些技術人員應該理解，可以使用寬泛 種類的表達系統中的任一種。廣闊范圍的適合的哺乳動物細胞可以獲自廣
闊范圍的來源(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockland， MD)。轉化 或轉染的方法和表達媒介物的選擇應該依賴于選擇的宿主系統。轉化和轉 染方法在本領域中已知。表達系統包括體外基因表達測定，其中目的基因 (例如，報道基因)與調控序列連接，且在用抑制或誘導該基因表達的試 劑處理后監(jiān)測該基因的表達?；虮磉_的檢測可以通過任何合適的方式進 行，包括，但不限于，檢測表達的mRNA或蛋白質(例如，報道基因的 可檢測產物)或通過表達目的基因的細胞的表型中可檢測的變化。表達系 統還可以包括檢測裂解事件或其他核酸或細胞改變的測定。
用于本文中時，術語"雜交(hybridize)"和"雜交(hybridization)" 指針對耙核酸的互補序列的退火，即兩種包含互補序列的核酸(多核苷酸) 的多聚體通過堿基配對退火的能力。術語"退火的"和"雜交的"始終互 換使用，并意欲包括互補序列和靶核酸之間的任何特異性和可重復的相互 作用，包括僅具有部分互補性的區(qū)域的結合。天然核酸中通常不存在的某 些堿基可以包括在本發(fā)明的核酸中，并包括，例如，肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。 核酸技術領域中的那些技術人員在考慮許多變量后，所述變量包括，例如， 互補序列的長度、堿基組成和寡核苷酸序列、離子強度和錯配堿基對的出 現，可以通過經驗確定雙鏈體的穩(wěn)定性。核酸雙鏈體的穩(wěn)定性通過解鏈溫 度或"Tm"測量。特定條件下特殊核酸雙鏈體的Tm是平均一半堿基對解 離的溫度。
術語"嚴格"用于指進行核酸雜交的溫度、離子強度，和其他化合物 存在的條件。在"高度嚴格"條件下，核酸堿基配對應該僅發(fā)生在具有高 頻互補堿基序列的核酸片段之間。因此，在希望不完全彼此互補的核酸雜交或退火在一起時，經常需要"中度"或"低度"嚴格條件。本領域公知 許多等價條件可以用于包括中度或低度嚴格條件。雜交條件的選擇對本領
域技術人員通常是顯然的，并且通常受雜交目的、雜交類型(DNA-DNA 或DNA-RNA)、和序列之間理想相關性水平的指導(例如，Sambrook等, 1989;核酸雜交，實踐方法(Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach) ，IRL出版社，華盛頓特區(qū)，1985,用于方法的綜合討論)。
已知核酸雙鏈體的穩(wěn)定性隨著錯配堿基數量的增多而降低，并且取決 于雜交雙鏈體中錯配的相對位置進一步降低至更大或更小的程度。因此， 雜交的嚴格可以用于最大化或最小化所述雙鏈體的穩(wěn)定性。雜交嚴格可以 通過下列各項改變調節(jié)雜交溫度；調節(jié)雜交混合物中螺旋去穩(wěn)定劑，諸 如甲酰胺的百分比；和調節(jié)洗滌溶液的溫度和或鹽濃度。為了過濾雜交， 最終雜交嚴格性經常由用于雜交后洗滌的鹽濃度和/或溫度確定。
當關于核酸雜交使用時，"高度嚴格條件"包括與以下等價的條件 當使用約500個核苷酸長的探針時，在由5X SSPE (43.8 g/1 NaCl， 6.9 g/1 NaH2P04 H20禾t1 1.85 g/1 EDTA，用NaOH將pH調節(jié)到7.4)， 0.5% SDS， 5X Denhardt試劑和100 (ig/ml變性的鮭精DNA組成的溶液中，在42"C 結合或雜交，隨后在包括0.1XSSPE、 1.0。/。SDS的溶液中在42'C洗滌。
當關于核酸雜交使用時，"中度嚴格條件"包括與以下等價的條件 當使用約500個核苷酸長的探針時，在由5X SSPE (43.8 g/1 NaCl, 6.9 g/1 NaH2P04 H20禾t1 1.85 g/1 EDTA，用NaOH將pH調節(jié)到7.4)， 0.5% SDS， 5X Denhardt試劑和100嗎/ml變性的鮭精DNA組成的溶液中，在42°C 結合或雜交，隨后在包括l.OXSSPE、 1.00/。SDS的溶液中在42'C洗滌。
"低度嚴格條件"包括與以下等價的條件當使用約500個核苷酸長 的探針時，在由5X SSPE (43.8 g/1 NaCl, 6.9 g/1 NaH2P04 H20和1.85 g/1 EDTA，用NaOH將pH調節(jié)到7.4), 0.1% SDS， 5X Denhardt試劑[每500 ml 50X Denhardt包含5 g Ficoll (400型，法瑪西亞(Pharmacia)), 5 g BSA (級分V;西格瑪(Sigma))]和100嗎/ml變性的鮭精DNA組成的溶液中， 在42。C結合或雜交，隨后在包括5XSSPE、 0.1%SDS的溶液中在42'C清 洗。
"肽"、"蛋白質"和"多肽"意指任何氨基酸鏈，無論長度或翻譯
30后修飾(例如，糖基化或磷酸化)。除非另外指出，這些術語可互換。本 發(fā)明的核酸分子編碼天然-存在的(野生型)蛋白的變體。優(yōu)選地，所述突
變的蛋白具有與相應的野生型蛋白質氨基酸序列至少80%，例如至少85%, 90%，和95%或99%相同的氨基酸序列。術語"同源性"指互補的程度。 可能存在部分同源或完全同源(即，相同)。同源性通常使用序列分析軟 件(例如，Accdryn公司的序列分析軟件包，圣地亞哥)測量。該軟件通 過對不同的取代、缺失、插入、或其他修飾分配同源度而匹配相似的序列。 在一個實施方案中，突變蛋白相對于相應的野生型蛋白具有多個保守的取 代。保守確定典型地包括下列組中的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇 氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
認為多肽分子具有"氨基端"(N-端)和"羧基端"(C-端)"，因為肽 鍵存在于第一個氨基酸殘基的主鏈氨基基團和第二個氨基酸殘基的主鏈 羧基基團之間。關于多肽序列的術語"N-端"和"C-端"指分別包括多肽 的N-端和C-端區(qū)的部分的多肽區(qū)域。包括多肽N-端區(qū)部分的序列包括主 要來自多肽鏈N-端一半的氨基酸，但不僅限于這樣的序列。例如，N-端 序列可以包括包含來自該多肽N-端和C-端兩半部分的堿基的多肽序列的 內部部分。同樣適用于C-端區(qū)。N-端和C-端區(qū)可以，但不必須，分別包 括定義多肽最終N-端和C-端的氨基酸。
術語"重組蛋白"或"重組多肽"用于本文中時，指由重組DNA分 子表達的蛋白質分子。相反，術語"天然蛋白質"用于本文中時，表示由 天然存在的(即，非重組)來源分離而來的蛋白質。分子生物學技術可以 用于生成與蛋白質天然形式相比具有相同性質的重組蛋白質形式。
用于本文中時，術語"抗體"指具有一種或多種基本由免疫球蛋白基 因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質。確定的免疫球蛋白基因包 括k、 X、 a、 y、 5、 s、廣恒定區(qū)基因，以及眾多免疫球蛋白可變區(qū)基因。 輕鏈分類為K或X。重鏈分類為Y、 p、 a、 S或s，其依次分別定義免疫球 蛋白種類IgG， IgM, IgA， IgD和IgE。
已知基本的免疫球蛋白(抗體)結構單元包括四聚體。每個四聚體由 兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條"輕"鏈(約25kD)和一條"重"鏈(約50-70kD)。每條鏈的N-端定義主要負責抗原識別的約100-110或 更多氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈(V》和可變主鏈(V^)分布指這些 輕鏈和重鏈。
抗體可以作為完整的免疫球蛋白或作為以多種形式存在的修飾存在， 所述修飾包括，例如，FabFc2， Fab, Fv, Fd, (Fab')2,僅包含輕鏈和重鏈可變 區(qū)的Fv片段，包含可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab)'2片段，單鏈抗體， 例如scFv, CDR-移植的抗體等等。Fv的重鏈和輕鏈可以源自相同的抗體或 不同的抗體，由此生成嵌合Fv區(qū)。抗體可以是動物(特別地，小鼠或大 鼠)或人來源的，或可以是嵌合或人源化的。當用于本文中時，術語"抗 體"包括這些不同的形式。
術語"細胞"、"細胞系"、"宿主細胞"，當用于本文中時，可互換使 用，并且全部所述名稱包括這些名稱的后代或潛在后代。"轉化的細胞" 意指已經向其中(或向其先祖中)引入了本發(fā)明的核酸分子的細胞。任選 地，本發(fā)明的核酸分子可以引入到合適的細胞系中，從而構建能夠生成由 所述核酸分子編碼的蛋白質或多肽的穩(wěn)定轉染細胞系。用于構建所述細胞 系的載體、細胞和方法在本領域中是公知的。詞語"轉化體"或"轉化的 細胞"包括來源于最初轉化的細胞的原代轉化細胞，而不考慮轉移的次數。 由于有意或無意的突變，所有的后代在DNA內容物上可能不準確一致。 但是，具有與在最初轉化的細胞中篩選時的相同功能性的突變后代包括在
轉化體的定義中。
術語"純化的"或"用于純化"意指從目的成分諸如蛋白質或核酸中 去除一些污染物的任何方法的結果。樣品中純化成分的百分比因此增加。
術語"可操作地連接"用于本文中時，指生成以這樣的形式的核酸序 列連接，所述形式是生成能夠指導給定基因轉錄和/或理想蛋白分子合成的 核酸分子。該術語還指以這樣的形式的編碼氨基酸的序列連接，所述形式 是生成功能性(例如，酶活性的、能夠與結合配偶體結合的、能夠抑制的 等)蛋白質或多肽，或其前體，例如所述蛋白質或多肽的前-或前原-形式。
本文中確定的所有氨基酸殘基是以天然L-構型存在。與標準多肽命名 法一致，氨基酸殘基的縮寫如下對應表所示。對應表
1-字母3-字母氨基酸
YTyrL-酪氨酸
GGlyL-甘氨酸
FPheL-苯丙氨酸
MMetL-甲硫氨酸
AAlaL-丙氨酸
SSerL-絲氨酸
IlieL-異亮氨酸
LeuL-亮氨酸
TThrL-蘇氨酸
VValL-纈氨酸
PProL-脯氨酸
KLysL-賴氨酸
HHisL-組氨酸
QGinL-谷氨酰胺
EGIuL-谷氨酸
WTrpL-色氨酸
RArgL-精氨酸
DAspL-天冬氨酸
NAsnL-天冬酰胺
CCysL-半胱氨酸
用于本文中時，術語"多-組氨酸束"或(His標簽)指包括2-10個組 氨酸殘基的分子，例如，5-10個殘基的多-組氨酸束。多-組氨酸束容許在 固定的金屬，例如、鎳、鋅、鈷或銅、.螯合柱或通過與另一種分子的相互 作用(例如與His標記反應的抗體)親合純化共價連接的分子。
"蛋白質去穩(wěn)定序列"或"蛋白質去穩(wěn)定結構域"包括一個或多個氨 基酸殘基，當存在于蛋白質的N-端或C-端時，其將連接的蛋白質的半衰 期相對于缺乏蛋白質去穩(wěn)定序列或結構域的相應的蛋白質，縮短或降低至 少80%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少95%或更多，例如99%。蛋白質去穩(wěn)定序列包括，但不限于，PEST序列，例如來自細胞周期蛋白，例
如有絲分裂細胞周期蛋白、尿嘧啶透性酶或ODC的PEST序列，來自短 命蛋白諸如ODC、早期響應蛋白諸如細胞因子、淋巴因子、原癌基因、 例如c-myc或c-fos、 MyoD、 HMG CoA還原酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶 的C端區(qū)序列，CL序列，細胞周期蛋白破壞盒，N-降解決定子，或在體 內遍在的蛋白質或其片段。
用于本文中時，"純"意指目標種類是存在的主要種類(即，在摩爾 基礎上，其比組合物中其他各個種類更豐富)，且優(yōu)選地，基本純化的組 分是這樣的組合物，其中目標種類包括所有存在的大分子種類的至少約 50% (基于摩爾)。 一般地，"基本純"組合物應該包括組合物中存在的所 有大分子種類的多于約80%，更優(yōu)選地，多于約85%，約90%,約95%,和 約99%。最優(yōu)選地，將目標種類純化為基本均勻的(通過常規(guī)檢測方法不 能在該組合物中檢測出污染種類)，其中所述組合物基本由單一大分子種 類組成。
突變水解酶
本發(fā)明范圍內的突變水解酶包括但不限于通過重組技術，例如，位點 定向誘變或循環(huán)誘變(recursive mutagenesis)制備的那些，并包括一個或 多個氨基酸取代。在一個實施方案中，至少一個所述取代致使突變水解酶 能夠與關于相應的非突變(野生型)水解酶的底物形成穩(wěn)定的鍵，例如，共 價鍵，所述底物包括被修飾為包含一個或多個官能團的野生型底物，所述 鍵比相應的野生型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。在一個實施方案 中，.突變水解酶中的至少一個所述取代導致提高的功能性表達或結合動力 學，或二者。本發(fā)明范圍內的水解酶包括，但不僅限于，例如， http:〃www.expasv.ch/enzvme/nzyme-byclass.html中公開的那些,并包括肽 酶、酯酶(例如，膽固醇酯酶)、糖苷酶(例如，葡糖淀粉酶)、磷酸酶(例 如，堿性磷酸酶)等等。例如，水解酶包括，但不限于，在酯鍵上起作用的 酶，諸如羧酸酯水解酶，硫酯水解酶，磷酸單酯水解酶，磷酸二酯水解酶， 三磷酸單酯水解酶，硫酸酯水解酶，二磷酸單酯水解酶，磷酸三酯水解酶, 生成5'-磷酸單酯的外切脫氧核糖核酸酶，生成5'-磷酸單酯的外切核糖核酸酶，生成3'-磷酸單酯的外切核糖核酸酶,對核糖核酸或脫氧核糖核酸起 作用的外切核酸酶，對核糖核酸或脫氧核糖核酸起作用的外切核酸酶，生 成5'-磷酸單酯的內切脫氧核糖核酸酶，生成除5'-磷酸單酯外的內切脫氧 核糖核酸酶，特異于改變的堿基的位點-特異性內切脫氧核糖核酸酶，生成
5'-磷酸單酯的內切核糖核酸酶，生成除5'-磷酸單酯外的內切核糖核酸酶，
對核糖核酸或脫氧核糖核酸起作用的內切核糖核酸酶，對核糖核酸或脫氧
核糖核酸糖基化酶起作用的內切核糖核酸酶；糖基化酶；糖苷酶，例如，水 解O-和S-糖基、以及水解N-糖基化合物的酶；作用于醚鍵諸如三垸基锍 水解酶或醚水解酶；作用于肽鍵的酶(肽水解酶)諸如氨基肽酶，二肽酶， 二肽基-肽酶和三肽基-肽酶，肽基-二肽酶，絲氨酸-型羧肽酶，金屬羧肽酶， 半胱氨酸-型羧肽酶，co肽酶，絲氨酸內肽酶，半胱氨酸內肽酶，天冬氨酸 內肽酶，金屬內肽酶，蘇氨酸內肽酶，和未知催化機制的內肽酶；作用于 除肽鍵外的碳-氮鍵的酶，諸如線性酰胺、環(huán)酰胺、線性脒、環(huán)脒、腈、或 其他化合物中的那些碳-氮鍵;作用于酸酐的酶，諸如包含磷的酐和包含磺 酰的酐中的那些；作用于酸酐的酶(催化跨膜運動)；作用于酸酐或參與細 胞和亞細胞運動的酶；作用于碳-碳鍵的酶(例如，在酮底物中);作用于卣 素鍵的酶(例如，在C-鹵化化合物中)，作用于磷-氮鍵的酶；作用于硫-氮 鍵的酶；作用于碳-磷鍵的酶；和作用于硫-硫鍵的酶。作用于卣素鍵的示 范性水解酶包括，但不限于，烷基鹵化酶，2-鹵酸脫鹵素酶，鹵代乙酸脫鹵 素酶,.甲狀腺素脫碘酶，鹵烷脫鹵素酶，4-氯苯甲酸脫鹵素酶，4-氯苯甲酰 -CoA脫鹵素酶，和莠去凈(atmzine)氯水解酶。作用于環(huán)酰胺中碳-氮鍵 的示范性水解酶包括，但不限于，巴比妥酸酶，二氫嘧啶酶，二氫乳清酸 酶，羧基甲基乙內酰脲酶，尿囊素酶，(3-內酰胺酶，咪唑酮丙酸酶，5-羥脯 氨酸酶(ATP-水解)，肌酸肝酶，L-賴氨酸-內酰胺酶，6-氨基己酸-環(huán)狀-二聚 體水解酶，2,5-二氧代哌嗪水解酶，N-甲基乙內酰脲酶(ATP-水解)，氰尿酸 氨基水解酶，馬來酰亞胺水解酶。"(3-內酰胺酶"用于本文中時包括A型，C 型和D型P-內酰胺酶以及D-ala羧肽酶/轉肽酶，酯酶EstB,青霉素結合 蛋白2X,青霉素結合蛋白5，和D-氨基肽酶。優(yōu)選地，P-內酰胺酶是絲氨 酸卩-內酰胺酶，例如,在與金黃色葡萄球菌(S. aureus) PC1的絲氨酸卩-內酰胺酶的殘基70相對應的位置處具有催化絲氨酸殘基，并且在與金黃
35色葡萄球菌PC1的絲氨酸p-內酰胺酶的殘基166相對應的位置處具有谷
氨酸的那個，其任選地在與金黃色葡萄球菌PC1的絲氨酸p-內酰胺酶的 殘基73相對應的位置處具有賴氨酸殘基，和還任選地在與金黃色葡萄球 菌PC1的絲氨酸p-內酰胺酶的殘基234相對應的位置處具有賴氨酸殘 基。
在一個實施方案中，本發(fā)明的突變水解酶包括在這樣的殘基處的至少 一個氨基酸取代，所述殘基，在野生型水解酶中，與活化水分子有關，例 如，催化三聯體或輔助殘基中的殘基，其中活化的水分子裂解野生型水解 酶中的催化殘基和水解酶底物之間形成的鍵。用于本文中時，"輔助殘基" 是改變另一種殘基活性的殘基，例如，其增強活化水分子的殘基的活性。 本發(fā)明范圍內活化水的殘基包括但不限于與酸-堿催化作用有關的那些，例 如，組氨酸，天冬氨酸和谷氨酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的突變水解 酶包括在這樣的殘基處的至少一個氨基酸取代，所述殘基在野生型水解酶 中，通過底物對水解酶的親核攻擊形成酯中間體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的突變水解酶包括至少2個與跟底物形 成穩(wěn)定鍵有關的氨基酸取代， 一個取代位于在野生型水解酶中與活化水分 子有關的殘基處，或位于在野生型水解酶中通過底物對水解酶的親核攻擊 而形成酯中間體的殘基處，且另一個取代位于在野生型水解酶中位于水解 酶底物結合位點處或其附近的殘基處，例如該殘基的至少一個原子在與野 生型水解酶結合的水解酶底物的3或5 A之內，但不位于在相應野生型水 解酶中與活化水分子有關或與底物形成酯中間體的殘基處。在一個實施方 案中，第二個取代可以位于這樣的殘基處，所述殘基，在野生型水解酶中， 沿著關于底物進入活性位點腔的位點排列，并具有至少一個原子位于與野 生型水解酶結合的水解酶底物的3或5 A之內，諸如在底物通道中的殘基， 其不是相應野生型水解酶中與活化水分子有關或與底物形成酯中間體的 殘基。另外的取代優(yōu)選地增加那些突變體與相應野生型水解酶的底物的形 成穩(wěn)定的共價鍵的速率。
在一個實施方案中，至少一個取代在與來自紫紅紅球菌的DhaA的殘 基272相對應的殘基處。"相對應的殘基"是這樣的殘基，所述殘基在一 種野生型蛋白質中，相對于參考野生型蛋白質，具有相同活性(功能)或任選地，當排列這兩種蛋白質的一級序列時，所述殘基處于相同的相關位 置。例如，在一種酶中形成部分催化三聯體或活化水分子的殘基可以是該
酶中的殘基272，所述殘基272對應于另一種酶中的殘基73，其中殘基73 形成部分催化三聯體并且活化水分子。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明 的突變脫鹵素酶在與來自紫紅紅球菌的DhaA的殘基272相對應的位置處 具有除組氨酸外的殘基，例如苯丙氨酸殘基。在本發(fā)明的另一個實施方案 中，突變水解酶是突變脫鹵素酶，其包括與來自紫紅紅球菌的DhaA的殘 基106相對應的殘基處的至少一個氨基酸取代，例如針對除天冬氨酸外的 殘基的取代。例如，本發(fā)明的突變脫鹵素酶在與來自紫紅紅球菌的DhaA 的殘基106相對應位置處具有半胱氨酸或谷氨酸殘基。在另一個實施方案 中，突變水解酶是包含至少兩個氨基酸取代的突變脫鹵素酶， 一個位于與 來自紫紅紅球菌的DhaA的殘基106相對應的殘基處，和一個位于與來自 紫紅紅球菌的DhaA的殘基272相對應的殘基處。在一個實施方案中，突 變水解酶是包含至少兩個氨基酸取代的突變脫鹵素酶， 一個位于與來自紫 紅紅球菌的DhaA的殘基272相對應的殘基處，和另一個位于與來自紫紅 紅球菌的DhaA的殘基175, 176, 245和/或273相對應的殘基處。在另一個 實施方案中，突變水解酶是突變絲氨酸P-內酰胺酶，其包含位于與金黃色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus) PC1的絲氨酸P-內酰胺酶中的殘基166 或殘基170相對應的殘基處的至少一個氨基酸取代。
在一個實施方案中， 一個取代位于在野生型水解酶中活化水分子的殘 基處，例如組氨酸殘基處，和位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272 相對應的位置處，例如位于與氨基酸殘基272相對應的位置處的取代的氨 基酸是丙氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，苯丙氨酸或甘氨酸。在另一個實施方 案中， 一個取代位于野生型水解酶中與底物形成酯中間體的殘基處，例如， 天冬氨酸殘基處，和在與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106相對應的 殘基處。在一個實施方案中，在與氨基酸106相對應的位置處的取代的氨基 酸是半胱氨酸。在一個實施方案中,第二個取代位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶 的位置175, 176,或273相對應的氨基酸殘基處，例如在與氨基酸殘基175 相對應的位置處的取代的氨基酸是甲硫氨酸、纈氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、 丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸或半胱氨酸，在與氨基酸殘基176相對應的位置處的取代的氨基酸是絲氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、丙 氨酸或精氨酸，在與氨基酸殘基273相對應的位置處的取代的氨基酸是苯 丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。在另一個實施方案中，突變水解 酶還包括第三和任選地第四個取代，其位于在野生型水解酶中在活性位點
腔中和在與野生型水解酶結合的水解酶底物的3或5 A內的氨基酸殘基 處，例如，所述第三個取代位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基273 相對應的位置處，且所述第四個取代位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸 殘基175或176相對應的位置處。
例如，野生型脫鹵素酶DhaA裂解鹵化烴(HaloC3-Halodo)中的碳-鹵 鍵。DhaA的催化中心是經典的催化三聯體，其包括親核體、酸和組氨酸 殘基。三聯體中的氨基酸深入位于DhaA內部(長度約10A和橫截面約20 A2)。 DhaA的卣化底物中的卣素原子，例如，Cl-垸底物的氯原子位于緊密 接近DhaA催化中心處。DhaA結合底物,可能形成ES復合物，且酯中間 體通過由DhaA的Aspl06 (編號基于DhaA的蛋白質序列)親核攻擊底物形 成。然后，Dha的His272活化水，并且活化的水水解該中間體，從催化中 心釋放產物。因此,在本發(fā)明的一個實施方案中，突變水解酶是包括在下列 殘基處的至少一個氨基酸取代的突變脫鹵素酶，所述殘基，在野生型脫鹵 素酶中,與活化水分子有關，例如，催化三聯體中的殘基或輔助殘基，其中 活化的水分子裂解在野生型脫鹵素酶的催化殘基和脫卣素酶底物之間形 成的鍵。
在一個實施方案中，突變水解酶是鹵烷脫鹵素酶，例如，諸如在革蘭 氏-陰性(Keuning等，1985)和革蘭氏-陽性利用鹵垸的細菌(Keiming等， 1985; Yokota等，1987; Scholtz等，1987; Sallis等，1990)中存在的那些。卣烷 脫卣素酶，包括來自自養(yǎng)黃色桿菌UTa"Ao6ac^^wto ro/7/2/c^) GJ10的 DhlA (Janssen等，1988, 1989),來自紫紅紅球菌的DhaA，和來自少動鞘氨 醇單胞菌(S/ /"gowo"ay/ "Mc/woZ)/fc) UT26的LinB (Nagata等，1997), 是催化相對應烴的水解脫鹵素化的酶。進行轉化的鹵化脂族烴包括C2-C10 飽和脂族烴，其具有一個或多個附著的鹵素基團，其中至少2個鹵素在鄰 接的碳原子上。所述脂族烴包括揮發(fā)性氯化脂族(VCA)烴。VCA的烴包 括，例如，脂族烴諸如二氯乙垸，1，2-二氯-丙烷，1,2-二氯丁烷和1,2，3-三氯丙烷。術語"鹵化烴"用于本文中時意指鹵化的脂族烴。當用于本文中時， 術語"鹵素"包括氯、溴、碘、氟，、砹等。優(yōu)選的鹵素是氯。
在一個實施方案中，突變水解酶是熱穩(wěn)定水解酶，諸如熱穩(wěn)定脫鹵素 酶，其包括在與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基117和/或175相對應 的位置處的至少一個取代，所述取代與增強的熱穩(wěn)定性相關。在一個實施
方案中，熱穩(wěn)定水解酶能夠在低溫度下，例如，0。C-約25°C結合水解酶底
物。在一個實施方案中，熱穩(wěn)定水解酶是熱穩(wěn)定突變水解酶，即，除在與紫
紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基117和域175相對應的位置處的取代外， 具有一個或多個取代的那種。在一個實施方案中，熱穩(wěn)定突變脫鹵素酶具 有導致去除帶電殘基，例如，賴氨酸的取代。在一個實施方案中，熱穩(wěn)定突 變脫鹵素酶在與來自紫紅紅球菌的DhaA中殘基H7和域175相對應的位 置處具有絲氨酸或甲硫氨酸。
在一個實施方案中，本發(fā)明的突變水解酶包括至少2個氨基酸取代, 至少其中之一與穩(wěn)定的鍵形成有關，例如，野生型水解酶中活化水分子的 殘基，例如，組氨酸殘基，且位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基 272相對應的位置處，例如，取代的氨基酸是丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或 苯丙氨酸，且至少另一個與提高的功能性表達或結合動力學，或二者有關, 例如，在與SEQ ID NO:l的位置5， 11, 20, 30, 32, 47, 58, 60， 65, 78， 80， 87， 88， 94, 109, 113, 117， 118, 124, 128， 134, 136， 150， 151, 155, 157, 160, 167, 172, 187, 195， 204， 221, 224， 227, 231, 250, 256， 257， 263, 264, 277, 282， 291 或292相對應的位置處。在一個實施方案中，突變水解酶在與位置175, 176， 272,和273相對應的位置處具有取代，以及在與SEQ ID NO:l的位 置5, 11， 20, 30， 32, 47, 58, 60, 65， 78, 80， 87, 88， 94, 109, 113， 117, 118, 124, 128, 134, 136, 150， 151， 155, 157, 160， 167, 172， 187， 195, 204, 221, 224, 227， 231， 250, 256, 257， 263, 264, 277, 282， 291或292相對應的位置處具有至少 另一個取代。在一個實施方案中，突變水解酶在與位置175, 176, 272，和 273相對應的位置處具有取代，以及在與SEQIDNO:l位置5, 7， 11, 12， 20 30, 32， 47, 54， 55， 56， 58， 60， 65, 78， 80, 82, 87， 88， 94， 96， 109， 113, 116， 117， 118, 121， 124， 128， 131, 134, 136， 144, 147, 150， 151, 155, 157， 160， 161, 164， 165, 167, 172, 175， 176, 180, 182, 183， 187, 195, 197, 204， 218， 221, 224, 227,
39231， 233, 250, 256， 257， 263, 264, 273， 277， 280, 282， 288， 291， 292，和/或294 相對應的位置處具有至少另一個取代。
在一個實施方案中，突變水解酶在與位置106， 175,和176相對應的 位置處具有取代，以及在與SEQ ID NO:l的位置5， 11， 20， 30, 32, 47， 58, 60， 65, 78, 80, 87， 88, 94, 109, 113, 117, 118, 124, 128, 134, 136, 150, 151, 155， 157, 160, 167， 172， 187, 195， 204, 221, 224, 227， 231, 250， 256, 257， 263, 264, 277， 282, 291或292相對應的位置處具有至少另一個取代。在一個實 施方案中，突變水解酶在與位置106， 175, 176, 272,和273相對應的位置 處具有取代，以及在與SEQ ID NO:l的位置5, 11, 20， 30, 32,47, 58， 60， 65， 78, 80， 87, 88, 94, 109, 113， 117, 118, 124, 128， 134， 136, 150， 151， 155, 157， 160， 167， 172, 187, 195, 204, 221， 224, 227, 231， 250， 256, 257， 263, 264， 277, 282,291或292相對應的位置處具有至少另一個取代。在一個實施方案中， 突變水解酶在與位置106, 175, 176, 272，和273相對應的位置處具有取代, 以及在與位置5， 7， 11, 12, 20, 30， 32， 47, 54， 55， 56, 58， 60， 65, 78， 80, 82, 87， 88， 94， 96， 109, 113， 116， 117, 118， 121, 124， 128， 131， 134, 136， 144， 147, 150, 151, 155， 157, 160, 161, 164, 165， 167, 172, 175, 176， 180, 182， 183, 187， 195, 197, 204, 218, 221， 224, 227， 231, 233, 250, 256， 257， 263， 264, 273， 277, 280， 282, 288， 291, 292，和/或294相對應的位置處具有至少另一個取代。
突變水解酶可以包括其他取代，例如，引入促進相應基因或其一部分 的克隆的那些，和域位于N-和/或C-端處或附近的額外的殘基，例如引入 促進相應的基因或其一部分的克隆，但是其不必須具有活性，例如不能分 別檢測的那些。
融合配偶體
本發(fā)明編碼突變水解酶的多核苷酸可以與其他核酸序列一起使用，例 如,.天然序列諸如cDNA或已經進行體外操作的核酸序列，例如用于制備 N-端、C-端或N-和C-端融合蛋白。許多合適是融合配偶體的實例在本領 域中已知，且可以用在本發(fā)明的實施中。
例如，本發(fā)明還提供融合蛋白，其包括突變水解酶和關于目的蛋白質 或肽的氨基酸序列，例如，關于下列各項的序列標記蛋白，例如可選擇的標記蛋白，親合標記物的序列,例如多組氨酸序列，目的酶，例如螢光素
酶，RNA酶抑制劑，RNA酶，和/或GFP，核酸結合蛋白,胞外基質蛋白，分 泌蛋白，抗體或其一部分諸如Fc，生物發(fā)光蛋白，受體配體，調節(jié)蛋白， 血清蛋白，免疫原性蛋白，熒光蛋白，具有反應性半胱氨酸的蛋白，受體 蛋白，例如NMDA受體，通道蛋白，例如離子通道蛋白諸如鈉-、鉀-或鈣-敏感的通道蛋白包括HERG通道蛋白，膜蛋白，胞質蛋白，核內蛋白，結 構蛋白，磷蛋白，激酶，信號傳導蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體相關 蛋白，熒光蛋白，酶底物，例如蛋白酶底物，轉錄因子，蛋白質去穩(wěn)定序列, 或轉運蛋白，例如，EAAT1-4谷氨酸轉運蛋白，以及指導突變水解酶到達 特定位置的靶向信號，例如，質體靶向信號，諸如線粒體定位序列，細胞 核定位信號或myristilation序列。
在一個實施方案中，融合蛋白可以在突變水解酶N-端包括目的蛋白， 任選地，在C-端包括不同的目的蛋白。
在一個實施方案中，融合蛋白包括突變水解酶和與膜締合的蛋白質或 其一部分，例如，靶向蛋白諸如用于內質網靶向的那些，細胞膜結合蛋白 質，例如，整聯蛋白或其結構域諸如整聯蛋白的細胞質、跨膜和/或胞外柄 結構域，和/或將突變水解酶連接于細胞表面的蛋白，例如，糖基磷酸肌醇 信號序列。
融合配偶體可以包括具有酶活性的那些。例如，功能性蛋白質序列可 以編碼激酶催化結構域(Hanks和Hunter, 1995),從而生成可以向特定氨 基酸酶促添加磷酸酯部分的融合蛋白，或可以編碼Src同源2 (SH2)結構 域(Sadowski等，1986; Mayer和Baltimore, 1993),從而生成特異性結合磷 酸化酪氨酸的融合蛋白。
所述融合還可以包括親合結構域，其包括能夠與結合配偶體相互作用 的肽序列，例如，諸如固定在固體支持物中，有效用于鑒定或純化的肽序 列。編碼多個連續(xù)單氨基酸，諸如組氨酸的DNA序列，在融合于表達的 蛋白質時,可以用于通過與樹脂柱，諸如鎳瓊脂糖高親合性結合一步純化 重組蛋白質。示范性親合結構域包括His5 (HHHHH) (SEQ ID NO:3), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:4)， C,c (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:5)， Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:6), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ IDNO:7),血凝素，例如，HA標簽(YPYDVPDYA)(SEQIDNO:8), GST，硫氧 還蛋白，纖維素結合結構域，RYIRS (SEQ ID NO:9)， Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:IO)，殼多糖結合結構域，S-肽,T7肽，SH2結構域，C-末端RNA標簽, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:ll)，金屬結合結構域，例如，鋅 結合結構域或鈣結合結構域諸如來自鈣-結合蛋白質的那些，例如，鈣調蛋 白，肌鈣蛋白C，鈣依賴磷酸酶B,肌球蛋白輕鏈，恢復蛋白，S-調制蛋白, 視錐蛋白，VILIP，神經鈣蛋白，海馬鈣蛋白，frequenin,鈣牽蛋白，需鈣蛋
白大亞基，S100蛋白質，小清蛋白，鈣結合蛋白D9K，鈣結合蛋白D28K,和
鈣網膜蛋白，內含肽，生物素，鏈霉抗生物素，MyoD, Id，亮氨酸拉鏈序列， 和麥芽糖結合蛋白質。
示范性的異源序列包括但不限于序列諸如FRB和FKBP中的那些，蛋 白質激酶的調節(jié)亞基(PKa-R)和蛋白質激酶的催化亞基(PKa-C), src同源區(qū) (SH2)和能夠被磷酸化的序列，例如，包含酪氨酸的序列，14-3-3的同種型， 例如，14-3-3t(見Mils等，2000),和能夠被磷酸化的序列，具有WW區(qū)的蛋 白質(結合富含脯氨酸的分子的蛋白質中的序列(見Ilsley等，2002;和 Einbond等，1996))和能夠被磷酸化的異源序列，例如，包含絲氨酸和/或蘇 氨酸的序列，以及二氫葉酸還原酶(DHFR)和促旋酶B(GyrB沖的序列。
最優(yōu)化的水解酶序列，和編碼該水解酶的載體和宿主細胞
還提供包括編碼水解酶或其融合體的核酸序列的分離的核酸分子(多 核苷酸)。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包括最優(yōu)化為在至少一 種選擇的宿主中表達的核酸序列。最優(yōu)化的序列包括作為最優(yōu)化的密碼子 的序列，即，相對于另一種生物體，例如，關系遠的生物體，在一種生物體 中更頻繁使用的密碼子，以及包括用于添加或修飾Kozak序列和/或內含 子，和/或去除不需要的序列例如潛在轉錄因子結合位點的修飾。在一個實 施方案中，多核苷酸包括編碼突變脫鹵素酶的核酸序列，該核酸序列最優(yōu) 化在選擇的宿主細胞中表達。在一個實施方案中，最優(yōu)化的多核苷酸不再 與相應的非最適合序列雜交，例如，在中度或高度嚴格條件下不與非最適 合的序列雜交。在另一個實施方案中，多核苷酸與相應的非最適合序列具有 少于90%，例如，少于80%，的核酸序列同一性，并任選地編碼與由所述非最適合序列編碼的多肽具有至少80%，例如，至少85%, 90%或更多，氨 基酸序列同一性的多肽。還提供包括所述分離的核酸分子的構建體，例如， 表達盒，和載體，以及包括所述分離核酸分子、構建體或載體的試劑盒。
包括編碼與水解酶的融合體的核酸序列的核酸分子任選地最優(yōu)化為 在特定宿主細胞中表達，并且還任選地與轉錄調節(jié)序列，例如， 一個或多 個增強子、啟動子、轉錄終止序列或其組合操作性地相連接，從而形成表 達盒。
在一個實施方案中，通過用在特定(選擇的)細胞中優(yōu)選使用的密碼 子替換野生型或突變水解酶序列中的密碼子而最優(yōu)化編碼水解酶或其融 合體的核酸序列。優(yōu)選的密碼子在選擇的細胞中具有相對高的密碼子使用 頻率，且優(yōu)選地，它們的引入導致為所選擇的宿主細胞中存在的轉錄因子 引入相對少的轉錄因子結合位點，和相對少的其他不需要的結構屬性。因 此，最優(yōu)化的核酸產物由于提高的密碼子使用頻率而具有提高的表達水 平，并且由于減少不需要的轉錄調節(jié)序列的數量而具有降低的不適當轉錄 行為風險。
本發(fā)明分離的和最優(yōu)化的核酸分子可以具有這樣的密碼子組成，所述 密碼子組成與相應野生型核酸序列的密碼子組成在多于30%, 35%, 40%或 多于45%,例如，50%，55%，60%或更多密碼子處不同。用于本發(fā)明的優(yōu)選 密碼子是在特定生物體中比至少一種關于同一氨基酸的其他密碼子更頻 繁使用的那些，并且更優(yōu)選地，也不是在該生物體中低使用的密碼子且不 是在用于克隆或篩選該核酸分子表達的生物體中低使用的密碼子。而且, 對于某些氨基酸(即，具有3個或更多個密碼子的那些氨基酸)優(yōu)選的密 碼子,可以包括2個或更多個比其他(非-優(yōu)選的)密碼子更頻繁使用的密碼 子。在一種生物體中比在另一種生物體中更頻繁使用的密碼子在核酸分子 中的存在導致核酸分子，在被引入到更頻繁使用那些密碼子的生物體的細 胞中時，在那些細胞中，以比野生型或親本核酸序列在那些細胞中的表達 更高的水平表達。
在本發(fā)明的一個實施方案中，不同的密碼子是在哺乳動物中更頻繁使 用的那些，而在另一個實施方案中，不同的密碼子是在植物中更頻繁使用 的那些。不同生物體的優(yōu)選密碼子在本領域中已知，例如，見www.kazusa.or.b./codon/0 一種特殊類型的哺乳動物，例如，人，可以具 有與另一種類型的哺乳動物不同的優(yōu)選密碼子組。同樣地，特殊類型的植 物可以具有與另一種類型的植物不同的優(yōu)選密碼子組。在本發(fā)明的一個實 施方案中，大部分不同的密碼子是在理想的宿主細胞中優(yōu)選的密碼子。生 物體，包括哺乳動物(例如，人)和植物的優(yōu)選密碼子在本領域中已知(例 如，Wada等，1990; Ausubel等，1997)。例如，優(yōu)選的人密碼子包括，但不限 于，CGC (Arg), CUG (Leu)， UCU (Ser), AGC (Ser), ACC (Thr), CCA (Pro)， CCT (Pro), GCC (Ala), GGC (Gly)， GUG (Val)， AUC (lie), AUU (lie), AAG (Lys)， AAC (Asn)， CAG (Gin), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp)， UAC (Tyr)， UGC (Cys)和TTC (Phe) (Wada等，1990)。因此，在一個實施方案中， 本發(fā)明的合成的核酸分子，具有這樣的密碼子組成，該密碼子組成通過具 有增多數量的優(yōu)選的人密碼子而與野生型核酸序列相區(qū)別，所述優(yōu)選的人 密碼子例如，CGC, CUG， UCU, AGC, ACC, CCA， CCU, GCC, GGC, GUG， AUC， AUU， AAG， AAC， CAG, CAC， GAG， GAC, UAC， UGC， UUC,或其任 意組合。例如，相對于野生型核酸序列，本發(fā)明的核酸分子可以具有增多 數量的CUG或UUG亮氨酸-編碼密碼子,GUG或GUC纈氨酸-編碼密碼 子，GGC或GGU甘氨酸-編碼密碼子,AUC或AUU異亮氨酸-編碼密碼子, CCA或CCU脯氨酸-編碼密碼子，CGC或CGU精氨酸-編碼密碼子,AGC 或TCU絲氨酸-編碼密碼子，ACC或ACU蘇氨酸-編碼密碼子，GCC或 GCU丙氨酸-編碼密碼子，或其任意組合。在另一個實施方案中，優(yōu)選的秀 麗隱桿線蟲(C. degans)密碼子包括，但不限于，UUC (Phe), UUU (Phe)， CUU (Leu)， UUG (Leu)， AUU (lie), GUU (Val), GUG (Val)， UCA (Ser)， UCU (Ser), CCA (Pro), ACA (Thr)， ACU (Thr), GCU (Ala), GCA (Ala)， UAU (Tyr), CAU (His), CAA (Gin), AAU (Asn), AAA (Lys), GAU (Asp), GAA (Glu), UGU (Cys)， AGA (Arg), CGA (Arg), CGU (Arg), GGA (Gly)，或其任意組 合。在另一個實施方案中，優(yōu)選的果蠅(Drosophilia)密碼子包括，但不限 于，UUC (Phe), CUG (Leu)， CUC (Leu), AUC (He), AUU (lie), GUG (Val)， GUC (Val)， AGC (Ser), UCC (Ser)， CCC (Pro), CCG (Pro), ACC (Thr)， ACG (Thr)， GCC (Ala)， GCU (Ala), UAC (Tyr)， CAC (His), CAG (Gin), AAC (Asn)， AAG (Lys)， GAU (Asp), GAG (Glu)， UGC (Cys)， CGC (Arg)， GGC(Gly), GGA (gly),或其任意組合。優(yōu)選的酵母密碼子包括但不限于UUU (Phe), UUG (Leu)， UUA (Leu)， CCU (Leu)， AUU (Ile)， GUU (Val)， UCU (Ser): UCA (Ser), CCA (Pro), CCU (Pro), ACU (Thr)， ACA (Thr), GCU (Ala), GCA (Ala)， UAU (Tyr)， UAC (Tyr)， CAU (His), CAA (Gln)， AAU (Asn), AAC (Asn)， AAA (Lys)， AAG (Lys)， GAU (Asp)， GAA (Glu)， GAG (Glu), UGU (Cys), CGU (Trp)， AGA (Arg)， CGU (Arg)， GGU (Gly)， GGA (Gly)，或其任 意組合。類似地，具有增多數量的在植物中更頻繁使用的密碼子的核酸分 子，具有這樣的密碼子組成，所述密碼子組成通過具有增多數量的植物密 碼子與野生型或親本核酸序列相區(qū)別，所述植物密碼子包括，但不限于, CGC (Arg)， CUU (Leu), UCU (Ser), UCC (Ser)， ACC (Thr)， CCA (Pro), CCU (Pro), GCU (Ser)， GGA (Gly)， GUG (Val)， AUC (He), AUU (lie), AAG (Lys)， AAC (Asn), CAA (Gin), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp)， UAC (Tyr), UGC (Cys), UUC (Phe),或其任意組合(Murray等，1989)。優(yōu)選的密碼子對 不同類型的植物可以不同(Wada等，1990)。
在一個實施方案中，編碼水解酶或其融合體的最優(yōu)化核酸序列相對于 編碼相應水解酶或其融合體的非最適合核酸序列具有少于100%，例如， 少于90%或少于80%，的核酸序列同一性。例如，編碼DhaA的最優(yōu)化核 酸序列相對于編碼相應DhaA的非最適合(野生型)核酸序列具有少于約 80%的核酸序列同一性，且由最優(yōu)化核酸序列編碼的DhaA任選地與相應 的野生型DhaA具有至少85%的氨基酸序列同一性。在一個實施方案中， 由最優(yōu)化核酸序列編碼的DhaA的活性是由非最適合序列編碼的DhaA的 活性的至少10%,例如，50%或更高，例如，由最優(yōu)化核酸序列編碼的突變 DhaA以與由非最適合核酸序列編碼的突變DhaA結合相同底物基本相同 的效率，即，至少50%，80%，100%或更高，結合底物。
突變DhaA的示范性最優(yōu)化￡>/2o4基因具有下列密碼子最優(yōu)化序列 (對于大腸桿菌和多種哺乳動物物種消除罕用密碼子)并編碼D78G, K175M， C176G,H272N，和Y273F取代
:atggcagaaatcggtactggctttccattcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgcatgcactacgtcg atgttggtccgcgcgatggcacccctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcctcctacctgtggcgcaacatc atcccgcatgttgcaccgagccatcgctgcattgctccagacctgatcggtatgggcaaatccgacaaaccagacc tgggttaUtcttcgacgaccacgtccgctacctggatgccttcatcgaagccctgggtctggaagaggtcgtcctggtcattcacgactggggctccgctctgggtttccactgggccaagcgcaatccagagcgcgtcaaaggtattgcatgt
atggagUcatccgccctatcccgacctgggacgaatggccagaatttgcccgcgagaccttccaggccttccgca
ccgccgacgtcggccgcgagctgatcatcgatcagaacgcmtatcgagggtgcgctgccgatgggtgtcgtcc
gcccgctgactgaagtcgagatggaccattaccgcgagccgttcctgaagcctgttgaccgcgagccactgtggc
gcttcccaaacgagctgccaatcgccggtgagccagcgaacatcgtcgcgctggtcgaagcatacatgaactggc
tgcaccagtcccctgtcccgaagctgctgttctggggcaccccaggcgttctgatcccaccggccgaagccgctc
gcctggccgaaagcctgcctaactgcaagactgtggacatcggcccgggtctgaattttctgcaagaagacaacc
cggac"gatcggcagcgagatcgcgcgctggctgccggcgctg (SEQ ID NO:30)
其編碼
maeigtgfjjfdphyvevlgermhyvdvgprdgtpvlflhgnptssylwmiiphvapshrciapdligmgks dkpdlgyffddhvryldafiealgleevvlvihdwgsalgfhwakmpervkgiacmefirpiptwdewpefa retfqafrtadvgreliidqnafiegalpmgvvrpltevemdhyrepflkpvdreplwrfijnepiag印aniva iveaymnwihqspvpkUfWgtpgvUppaeaariaeslpncktvdigpglnflqednpdligseiarwlpal (SEQ ID NO:73)。
可以將核酸分子或表達盒引入載體中，例如，質粒或病毒載體中，其 任選地包括可選擇的標記基因，且可以將所述載體引入到目的細胞中，例
如，原核細胞諸如大腸桿菌，鏈霉菌屬(^印tom少cay spp.),桿菌屬 (Sfl"7/w spp.),葡萄球菌屬(5to/ /^/ococcw spp.)等等，以及真核細胞，包 括植物(雙子葉植物或單子葉植物)，真菌，酵母，例如，畢赤酵母菌屬 (戶/cWa),酵母屬(Sacc/zaramjcM)或裂殖酵母屬(Sc/^oracc/wrawyces), 或哺乳動物細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞包括牛、山羊、綿羊、犬科、貓科、 非-人靈長類動物例如猿、和人細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞系包括，但不限 于，CHO, COS, 293, Hela, CV-1, SH-SY5Y (人成神經細胞瘤細胞),HEK293: 和NIH3T3細胞。
編碼的突變水解酶的表達可以受控于能夠在原核細胞或真核細胞中 表達的任何啟動子。優(yōu)選的原核啟動子包括，但不限于，SP6, T7, T5， toc， 6"/rP,ga/,/ac或麥芽糖啟動子。優(yōu)選的真核啟動子包括，但不限于，組成 型啟動子，例如，病毒啟動子諸如CMV、SV40和RSV啟動子，以及可調 節(jié)的啟動子，例如,可誘導的或可抑制的啟動子諸如tet啟動子，hsp70啟動 子和受CRE調節(jié)的合成啟動子。在一個實施方案中，用于克隆或表達的載 體包括Flexi 載體，諸如美國公開的申請?zhí)?0050074785和 20050074883中公開的那些，將其內容引人本文作為參考，Gateway 載
46體,或任何其他合適的克隆或表達載體。用于細菌表達的載體包括
pGEX-5X-3,且用于真核表達的載體包括但不限于pCIneo-CMV。
可以通過任何方法，包括，但不限于，鈣-介導的轉化、電穿孔、顯微 注射、脂轉染、粒子轟擊等等，將本發(fā)明的核酸分子、表達盒和/或載體引 入細胞。
官能團
本發(fā)明的底物和方法中有效使用的官能團是可檢測或能夠檢測的分 子。本發(fā)明范圍內的官能團能夠共價連接雙功能性連接體或水解酶的底物 的一個反應性取代基，并且，作為本發(fā)明的底物的一部分,與不與天然存在 的底物相連接并能夠與突變水解酶形成穩(wěn)定復合物的官能團具有基本相 同的活性。官能團因此具有一種或多種促進檢測，和任選地分離，具有該 官能團的底物和突變水解酶之間的穩(wěn)定復合物的性質。例如，官能團包括 具有特有的電磁光譜性質諸如發(fā)射或吸收，磁性，電子自旋共振，電容， 介電常數或電導率的那些，以及鐵磁性，順磁性，反磁性，發(fā)光，電化學發(fā) 光，熒光性，磷光性，彩色，抗原性，或具體不同質量的官能團。官能團包括， 但不限于,核酸分子，即，DNA或RNA，例如，寡核苷酸或核苷酸，諸如具 有核苷酸類似物的那種，能夠結合蛋白質的DNA,相應于目的基因的單鏈 DNA,相應于目的基因的RNA，缺乏終止密碼子的mRNA,氨基乙?；?始子tRNA,氨基乙?；暌种苹騮RNA，或用于RNAi的雙鏈RNA， 蛋白質，例如，發(fā)光蛋白，肽，肽核酸，由配體識別的表位，例如，生物素 或鏈霉抗生物素，半抗原，氨基酸，脂質，脂質雙分子層，固體支持物，熒 光團，生色團，報道分子，放射性核素，諸如用在例如放射活性測量中的 放射性同位素或用在方法諸如同位素編碼的親合標記物(ICAT)中的穩(wěn)定 同位素，電子不穿透分子,X-射線造影試劑,MRI造影劑，例如，錳，釓(ni) 或氧化鐵粒子，等等。在一個實施方案中，所述官能團是氨基酸，蛋白質， 糖蛋白，多糖，三重致敏物，例如，CALI,核酸分子，藥物，毒素，脂質，生 物素,或固體支持物，諸如自我-裝配的單分子層(見，例如，Kwon等,2004), 結合C^+,結合K+,結合Na+，是pH靈敏的，是電子不穿透的，是生色團， 是MRI造影劑，存在NO下發(fā)熒光或對下列各項靈敏活性氧，納米顆粒,酶，酶的底物，酶的抑制劑，例如，自殺底物(見，例如，Kwon等，2004)， 輔因子，例如，NADP,輔酶，琥珀酰亞胺基酯或醛，熒光素，谷胱甘肽, NTA，生物素，cAMP,磷脂酰肌醇，cAMP的配體，金屬，用作自旋阱(spin trap)的硝基氧或硝酮(通過電子自旋共振(ESR)檢測的)，金屬螯合劑，例 如，用于在時間分辨的熒光性中或為了捕獲金屬用作造影劑，光籠蔽
(photocaged)化合物，例如，當輻射釋放籠蔽化合物諸如熒光團時，嵌入 劑，例如，諸如補骨脂素或有效用于結合DNA或用作光活化分子的另一 種嵌入劑，即三磷酸酯或亞磷酰胺，例如，用于容許將底物結合到DNA或 RNA中，抗體，或異雙功能性交叉-連接體諸如有效綴合蛋白質或其他分 子的那種，交叉-連接體包括但不限于酰肼，芳基疊氮化物，馬來酰亞胺, 碘乙酰胺/溴乙酰胺，N-羥基琥珀酰亞胺基酯，混合的二硫化物諸如吡啶基 二硫化物，乙二醛/苯甲酰甲醛，乙烯基砜/乙烯基磺酰胺，丙烯酰胺，硼酯
(boronic ester)，異羥肟酸，imidate酉旨，異氰酸酯/異硫氰酸酯，或氯三嗪/ 二氯三嗪。
例如，官能團包括但不限于一種或多種氨基酸，例如，天然存在的氨 基酸或非-天然的氨基酸，肽或多肽(蛋白質)，包括抗體或其片段，His-標 記物，FLAG標記物，Streptag，酶，輔因子，輔酶，酶的肽或蛋白質底物，例 如，分支的肽底物(例如，Z-氨基苯甲?；?Abz)-Gly-Pro-Ala-Leu-Ala-4-硝基芐酰胺(NBA),自殺底物，或受體， 一種或多種核苷酸(例如，ATP， ADP，AMP,GTP或GDP)，包括其類似物，例如，寡核苷酸，對應于基因或 其一部分的雙鏈或單鏈DNA，例如，能夠結合蛋白質諸如轉錄因子的 DNA，對應于基因的RNA，例如，缺乏終止密碼子的mRNA，或其一部分， 用于RNAi的雙鏈RNA或其載體，糖蛋白，多糖，肽-核酸(PNA)，脂質， 包括脂質雙分子層；或是固體支持物，例如，沉積粒子諸如磁性粒子，瓊脂 糖或纖維素珠，膜，玻璃，例如，載玻片，纖維素，藻酸鹽，塑料或其他合 成制備的聚合物，例如，eppendorf管或多-孔板的孔，自我裝配的單分子層, 表面等離振子共振芯片，或具有電子傳導表面的固體支持物，且包括藥物， 例如，化學治療劑諸如多柔比星，5-氟尿嘧啶，或鹽酸伊立替康和山梨醇注射 劑(CPT-11;伊立替康)，氨基乙酰化tRNA諸如氨基乙?；鹗甲觮RNA 或氨基乙酰化琥珀抑制基因tRNA，結合(^2+的分子，結K+的分子，結合Na+的分子，pH靈敏的分子，放射性核素，電子不穿透的分子,造影劑，例 如，鋇，碘或其他MRI或X-射線造影劑，存在NO下發(fā)熒光或對下列各項 靈敏的分子活性氧，納米顆粒，例如，免疫金顆粒，順磁性納米顆粒，增頻 (upconventing)納米顆粒，或量子點，酶的非蛋白質底物，酶的抑制劑， 可逆或不可逆的抑制劑，螯合劑，交聯基團，例如，琥珀酰亞胺基酯或醛, 谷胱甘肽，生物素或其他抗生物素蛋白結合分子，抗生物素蛋白，鏈霉抗 生物素，cAMP，磷脂酰肌醇，血紅素，cAMP的配體，金屬，NTA，并且，在 一個實施方案中，包括一種或多種染料，例如，B占噸染料，鈣靈敏染料，例 如，l-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-咕噸基)-苯氧基]-2-(2'-氨基-5'-甲 基苯氧基)乙垸-N，N，N'，N'-四乙酸(Fluo-3)，鈉靈敏染料，例如，1，3-苯二羧 酸，4,4'-[1，4，10，13-四氧雜-7，16-二氮雜環(huán)十八垸-7，16-二基二(5-甲氧基-6，2-苯并呋喃二基)]二 (PBFI)， NO靈敏染料，例如，4-氨基-5-甲基氨基-2'，7'-二 熒光素,或其他熒光團。在一個實施方案中，所述官能團是半抗原或免疫原 性分子，即，被特異于該分子的抗體結合的那種。在一個實施方案中，所述 官能團不是放射性核素。在另一個實施方案中，所述官能團是放射性核素， 例如，3H， 14C， 35S， 125I， mI，包括有效用于診斷方法中的分子。
用于檢測特殊官能團方法在本領域中已知。例如，核酸分子可以通過雜 交、擴增、與特異于該核酸分子的核酸結合蛋白的結合、酶測定(例如，如 果該核酸分子是核糖核酸酶)檢測，或，如果該核酸分子本身包括可檢測或 能夠檢測的分子，例如，放射性標簽或生物素，則其可以通過適用于該分 子的測定法檢測。
示范性官能團包括半抗原，例如，有效用于增強免疫原性的分子，諸如 匙孔血藍蛋白(KLH)，可裂解的標簽，例如，光致斷裂的生物素，和熒光 標記，例如，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)修飾的香豆素和琥珀酰亞胺或 sulfonosuccinimide修飾的BODIPY (其可以通過UV和/或可見光激發(fā)的熒 光性檢測來檢測)，羅丹明，例如，RllO，對甲氨基酚，CRG6,德克薩斯甲 基紅(羧基四甲基羅丹明)，5-羧基-X-羅丹明，或fluoroscein,香豆素衍生 物，例如，7氨基香豆素，和7-羥基香豆素，2-氨基-4-甲氧基萘，l-羥基芘, 試卣靈，phenalenones或benzphenalenones (美國專禾ll號4，812，409)，卩丫錠酮 (acridinones)(美國專利號4，810,636)，蒽，和ot-和P-萘酚的衍生物，氟化口占噸衍生物，包括氟化的熒光素和對甲氨基酚(例如，美國專利號
6,162,931),生物發(fā)光分子，例如，熒光素，腔腸素(coelenterazine),螢光 素酶，化學發(fā)光分子，例如，穩(wěn)定化的二氧雜環(huán)丁烷，和電化學發(fā)光分子。 由于與相應的野生型水解酶的底物相連接而與突變水解酶相連接的熒光 (或發(fā)光)官能團，可以用于在系統中實時感應改變，如磷酸化。而且，熒 光分子，諸如金屬離子的化學感應劑，例如,C^+的9-羰基蒽修飾的甘氨酰 基-組氨酰基-賴氨酸(GHK),在本發(fā)明的底物中，可以用于標記與該底物 結合的蛋白質。發(fā)光或熒光官能團諸如BODIPY，羅丹明綠,GFP,或紅外 染料，也存在作為官能團的用途并可以，例如，用在相互作用的研究中，例 如，使用BRET， FRET， LRET或電泳。
另一種類型的官能團是與包含接納體基團的分子("親合"分子)選 擇性相互作用的分子。因此，包括親合分子的水解酶底物，由于該親合分 子與另一種分子，例如可以是生物或非-生物來源的接納體分子的選擇性相 互作用，可以促進具有所述底物和突變水解酶的復合物的分離。例如，親 合分子與之相互作用的特異性分子(稱為接納體分子)可以是小的有機分 子、化學基團諸如巰基基團(-SH)或大生物分子諸如關于親合分子的抗 體或其他天然存在的配體。所述結合通常在自然界中是化學性的，且可以 涉及共價或非-共價鍵或相互作用諸如離子或氫鍵的形成。所述接納體分子 可以是在溶液中游離的或自身與固體或半-固體表面、聚合物基質或固體或 半-固體基底表面上的殘基結合。所述相互作用也可以由外部試劑諸如光、 溫度、壓力或添加起催化劑作用的化學或生物學分子觸發(fā)。發(fā)生從反應混 合物中檢測和/或分離復合物，這是因為親合分子和接納體分子之間的相互 作用，通常為一種類型的結合。
親合分子的實例包括分子，諸如免疫原性分子，例如，蛋白質、肽、 碳水化合物或脂質的表位，即有效用于制備特異于該分子的抗體的任何分 子；生物素，抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素，及其衍生物；金屬結合分子; 和這些分子的片段和組合。示范性親合分子包括His5 (HHHHH) (SEQ ID NO:3), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:4), C考c (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:5), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:6), SteptTag(WSHPQFEK) (SEQ IDNO:7),HA標記物(YPYDVPDYA)(SEQIDNO:8),硫氧還蛋白，纖維素結合結構域，殼多糖結合結構域，S-肽，T7肽，鈣調蛋白結合肽，C-末端
RNA標記物，金屬結合結構域，金屬結合反應基，氨基酸反應基，內含肽， 生物素，鏈霉抗生物素，和麥芽糖結合蛋白質。例如，包括生物素的水解 酶底物與突變水解酶接觸。生物素在突變水解酶和底物之間的復合物中的 存在允許復合物與抗生物素蛋白分子，例如包被在表面例如，珠、微孔、 硝化纖維等上的鏈霉抗生物素分子的選擇性結合。合適的表面包括用于層 析分離的樹脂、塑料諸如組織培養(yǎng)表面或結合板、微量滴定皿和珠、陶瓷 和玻璃、粒子包含磁性粒子、聚合物和其他基質。例如，用磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌處理的表面，從而去除缺乏生物素，并分離包含-生物素的復 合物。在一些情形中，這些物質可以是生物分子傳感裝置，諸如光纖、 chemfets、胞質基因檢測器的一部分。
親合分子的另一個實例是丹磺酰賴氨酸。與丹磺酰環(huán)相互作用的抗體 可商購獲得(西格瑪化學(Sigma Chemical) St. Louis, MO)或可以使用己 知方案諸如在抗體實驗室手冊(Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow 和Lane, 1988))中記述的方案而制備。例如，將抗-丹磺酰抗體固定在層 析柱的包裝基質上。該方法，即親合柱層析，通過使得本發(fā)明的突變水解 酶和底物之間的復合物由于其與固定的抗體的相互作用保留在柱中，而其 他分子流過柱而實現分離。然后，通過破壞抗體-抗原相互作用釋放所述復 合物。特異性層析柱材料諸如離子-交換或親合瓊脂糖，聚丙烯酰胺葡聚糖， 交聯葡聚糖和其他層析樹脂可商購獲得(西格瑪化學(Sigma Chemical) StLouis，MO;法瑪西亞生物技術(Pharmacia Biotech) ; Piscataway, N丄)。 丹磺酰賴氨酸可以由于其熒光性質便利地檢測。
當使用抗體作為接納體分子時，分離也可以通過其他的生物化學分離 方法，諸如將抗體免疫沉淀和固定到過濾器或其他表面諸如珠、板或樹脂 上進行。例如，本發(fā)明的突變水解酶和底物的復合物可以通過用親合分子 -特異性或水解酶-特異性抗體包被磁珠而分離。珠時常利用磁場從混合物 中分離出來。
另一種類型的功能性分子包括可利用電磁輻射檢測的分子，且包括但 不限于咕噸熒光團，丹磺酰熒光團，香豆素和香豆素衍生物，熒光 acridinium部分,基于苯并芘的熒光團，以及7-硝基苯-2-氧雜-l，3-二唑,和
513-N-(7-硝基苯-2-氧雜—l,3-二唑-4-基)-2,3-二氨基-丙酸。優(yōu)選地，所述熒光 分子在與天然氨基酸不同的波長處具有熒光性的高量子產率，和更優(yōu)選 地，具有在光譜的可見光或在UV和可見光二者部分激發(fā)的熒光性的高量 子產率。當在預選的波長處激發(fā)時，可以視覺上或使用常規(guī)熒光性檢測方 法檢測低濃度的分子。電化學發(fā)光分子諸如釕螯合物及其衍生物或硝基氧 氨基酸及其衍生物可以在毫微微摩爾范圍及以下檢測。
在一個實施方案中，任選可檢測的官能團包括下列之一除熒光分子外，多種具有基于分子對電磁場和輻射的相互作用和響應 的物理性質的分子可以用于檢測本發(fā)明的突變水解酶和底物之間的復合 物。這些性質包括電磁譜UV、可見光和紅外區(qū)的吸收、具有拉曼活性的 生色團的存在，并可以進一步通過共振拉曼光譜學、電子自旋共振活性和 核磁共振和分子質量，例如通過質譜儀進一步增強。
用于檢測和分離具有親合分子的復合物的方法包括色譜技術，其包括 凝膠過濾、快-壓或高-壓液體色譜、反相色譜、親合色譜和離子交換色譜 法。蛋白質分離的其他方法也有效用于檢測及隨后分離本發(fā)明的突變水解 酶和底物之間的復合物，例如電泳、等電聚焦和質譜法。
連接體
術語"連接體"，其也通過符號"L"識別，指將一個或多個官能團共 價附著到包含反應基的底物上或反應基上的一個基團或數個基團。連接 體，用于本文中時，不是單共價鍵。連接體的結構不關鍵，條件是它產生 能夠被其靶酶結合的底物。在一個實施方案中，連接體可以是二價基團，
其將官能團(R)和反應基分開約5埃-約1000埃的長度，包含端點。其 他合適的連接體包括將R和反應基分開約5埃-約100埃的連接體，以及 將R和底物分開約5埃-約50埃、約5-埃-約25癌、約5埃-約500埃、或 約30埃-約100埃的連接體。
在一個實施方案中，所述連接體是氨基酸。
在另一個實施方案中，所述連接體是肽。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1， 2, 3,或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2， 3,或4個)羥基或氧 代(=0)基團取代，其中該鏈中的一個或多個(例如，1, 2, 3，或4個)碳原 子任選地被非-過氧化物-O-,-S-或-NH-替換，且其中該鏈中的一個或多個 (例如，1, 2, 3,或4份額)碳原被芳基或雜芳基環(huán)替換。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1, 2, 3，或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2, 3,或4個)羥基或氧代(=0)基團取代，其中該鏈中的一個或多個(例如，1,2, 3,或4個)碳原子 任選地被非-過氧化物-O-， -S-或-NH-替換，且其中該鏈中的一個或多個 (例如，1, 2, 3,或4個)碳原被一個或多個(例如，1， 2, 3，或4個)芳基或雜芳基 環(huán)替換。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1, 2, 3,或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2, 3,或4個)羥基或氧 代(=0)基團取代，其中該鏈中的一個或多個(例如，1， 2, 3,或4個)碳原 子任選地被非-過氧化物-O-,-S-或-NH-替換，且其中該鏈中的一個或多個 (例如，1,2，3,或4個)碳原被一個或多個(例如，1，2,3,或4個)雜芳基環(huán)替換。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1， 2， 3，或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2， 3，或4個)羥基或氧 代(=0)基團取代，其中該鏈中的一個或多個(例如，1, 2， 3，或4個)碳原 子任選地被非-過氧化物-O-，-S-或-NH-替換。
在另一個實施方案中，所述連接體是式-W-F-W-的二價基團，其中F
是(C,-C3o)烷基，(C2-C3Q)鏈烯基，(C2-C3Q)炔基，(C3-Cs)環(huán)垸基，或(CVdo),
其 中 W
是-N(Q)C(=0)-， -C(=0)N(Q)-， -0C(=0)-， -C(-O)O畫，畫O隱，-S-， -S(O)匿 ,-S(0)2-，-N(Q)-，-C(K))-，或直接的鍵；其中每個Q是獨立的.H或(d-C6)
烷基o
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1， 2, 3,或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2, 3,或4個)羥基或氧 代(=0)基團取代。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1, 2, 3,或4個) 雙鍵或三鍵。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約30個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈。在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約20個碳原子的二價
分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1, 2, 3,或4個) 雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個(例如，2, 3，或4個)羥基或氧 代(=0)基團取代。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約20個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個(例如，1, 2， 3，或4個) 雙鍵或三鍵。
在另一個實施方案中，所述連接體是包括約2-約20個碳原子的二價 分支或不分支的碳鏈。
在另一個實施方案中，所述連接體是"(CH2CH20)-wo。
在另一個實施方案中，所述連接體 是-C(=0)NH(CH2)3-; -C(=0)NH(CH2)5C(=0)NH(CH2)-; -CH2OC(=0)NH(C H2)20(CH2)20(CH2)-; -C(=0)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)r; -CH2OC(=0)NH(C H2)20(CH2)20(CH2)3-; -(CH2)4C(=0)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-; -C(=0)N H(CH2)5C(=0)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-。
在另一個實施方案中，所述連接體包括一個或多個二價雜芳基基團。
具體地，(d-C3。)烷基可以是甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異-丁
基，仲-丁基，戊基3-戊基，己基，庚基，辛基，壬基或癸基；(C3-Cs)環(huán)垸 基可以是環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，或環(huán)己基；(CrC3o)鏈烯基可以是乙烯 基，烯丙基，l-丙烯基，2-丙烯基，l-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，l,-戊烯基, 2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，l-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，庚烯基，辛烯基，壬烯基，或癸烯基；(C2-C^)炔基可以是乙炔基, l-丙炔基，2-丙炔基，l-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，l-戊炔基，2-戊炔基，3-戊炔基,4-戊炔基，l-己炔基,2-己炔基，3-己炔基,4-己炔基,5-己炔基，庚炔 基，辛炔基，壬炔基，或癸炔基；(C6-Cu))芳基可以是苯基，茚基，或萘基; 和雜芳基可以是呋喃基，咪唑基，三唑基，三嗪基，噁唑基，異噁唑基，噻 唑基，異噻唑基，吡唑基，吡咯基，吡嗪基，四唑基，吡啶基，(或其N-氧 化物)，噻吩基，嘧啶基(或其N-氧化物)，吲哚基，異喹啉基(或其N-氧化 物)或喹啉基(或其N-氧化物)。
術語芳香族包括芳基和雜芳基基團。芳基表示苯基自由基或具有約9-10個環(huán)原子的單邊稠合的雙環(huán)碳環(huán) 自由基，其中至少一個環(huán)是芳香族的。
雜芳基包括通過包含5或6個環(huán)原子的單環(huán)芳香族環(huán)的環(huán)碳附著的自 由基，所述環(huán)由碳和l-4個雜原子組成，其每個選自由非-過氧化物氧、硫、 和N(X)組成的組，其中X不存在或是H, 0, (d-C4)烷基，苯基或節(jié)基， 以及包括源自其的約8-10個環(huán)原子單邊稠合的雙環(huán)雜環(huán)的自由基，具體地 是苯-衍生物或通過向其融合丙烯、亞丙基、或四亞甲基二自由基來源的那 種。
術語"氨基酸，"當關于連接體使用時，包括處于D或L形式的天然氨 基酸(例如，Ala, Arg, Asn， Asp, Cys, Glu， Gln， Gly, His， Hyl， Hyp， Ile， Leu, Lys， Met， Phe, Pro, Ser, Thr， Tip, Tyr,和Val)，以及非天然氨基酸(例如，磷 酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸，磷酸酪氨酸，羥基脯氨酸，Y-羧基谷氨酸；馬尿酸， 八氫吲哚-2-羧酸，statine, 1，2，3，4,-四氫異喹啉-3-羧酸，青霉胺，鳥氨酸，瓜 氨酸，a-甲基-丙氨酸，對-苯甲酰苯丙氨酸，苯基甘氨酸，炔丙基甘氨酸， 肌氨酸，和叔-丁基甘氨酸)的殘基。該術語還包括帶有常規(guī)氨基保護基團 (例如，乙酰基或芐氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基端(例 如，如(d-C6)烷基，苯基或芐基酯或酰胺)受保護的天然和非天然氨基酸。 其他合適的氨基和羧基保護基團是本領域中那些技術人員已知的(見例如， Greene，有機合成中的疾滬基激(Tra/ec/一 gra，/" iS，/ze^);
Wiley:紐約，1981,和其中引用的參考文獻)。氨基酸可以通過羧基端、氨 基端、或通過任何其他方便的附著點，諸如，例如，通過半胱氨酸的硫與 另一種分子相連接。
術語"肽"在關于連接體使用時，描述2-25個氨基酸(例如如上文中 定義的)或肽基殘基的序列。所述序列可以是線性或環(huán)形的。例如，可以 制備或可以由在序列中2個半胱氨酸殘基之間二硫鍵的形成產生環(huán)肽。肽 可以通過羧基端、氨基端、或通過任何其他方便的附著點，諸如，例如， 通過半胱氨酸的硫與另一種分子相連接。優(yōu)選地，肽包括3-15，或5-21 個氨基酸?？梢匀缑绹鴮＠?，612，302; 4,853,371;和4,684,620中公開的， 制備肽衍生物。本文中具體敘述的肽序列按氨基端在左和羧基端在右書 寫。示范性底物
在一個實施方案中，水解酶底物具有式(I)的化合物R-連接體-A-X， 其中R是一個或多個官能團，其中所述連接體是多原子直鏈或分支鏈，包 括C, N, S,或0,或包括一個或多個環(huán)，例如，飽和或不飽和環(huán)，諸如一個 或多個芳基環(huán)，雜芳基環(huán)，或其任意組合的基團，其中A-X是脫卣素酶如 鹵烷脫鹵素酶或裂解脂肪族或芳香族鹵化底物中的碳-卣鍵的脫卣素酶的 底物，諸如關于紅球菌屬(i /20tfo"CC船)、鞘氨醇單胞菌屬 (5)^/n,"go附o"as )、 葡萄球菌屬 (S啤/yz/ococ，)、 假單胞菌屬 (/^ew(iowowas)、伯克氏菌屬(Bw^/zo/cfen'a)、 土壤桿菌屬(/4graZ a"en'wm) 或黃色桿菌屬(X""AW""w)脫鹵素酶的底物，且其中X是鹵素。在一 個實施方案中,鹵代垸共價附著于連接體L,其是共價附著一個或多個官能 團從而形成脫鹵素酶底物的一個基團或多個基團。
在一個實施方案中,具有連接體的關于脫鹵素酶的本發(fā)明底物具有式
(I):
R—連接體-A-X (I)
其中R是一個或多個官能團(諸如熒光團，生物素，發(fā)光團，或熒光 或發(fā)光分子，或是固體支持物，包括微球體，膜，聚合板，玻璃珠，載玻片， 等等)，其中所述連接體是多原子直鏈或分支鏈，包括C, N， S，或O，其中 A-X是脫鹵素酶的底物，且其中X是鹵素。在一個實施方案中,A-X是脫 鹵素酶的鹵代脂族或鹵代芳香族底物。在一個實施方案中，所述連接體是 包括約12-約30個碳原子的二價分支的或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包 括一個多個(例如，1, 2, 3,或4個)雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多 個(例如，2， 3,或4個)羥基或氧代(=0)基團取代，其中所述鏈中的一個 或多個(例如，1, 2, 3,或4個)碳原子任選地被非-過氧化物-O-, -S-或-NH-替 換。在一個實施方案中，連接體包括3-30個原子，例如，11-30個原子。在 一個實施方案中,連接體包括(CH2CH20)y且y = 2- 8 。在一個實施方案中，A 是(CH^且n = 2 -10,例如，4-10。在一個實施方案中，A是CH2CH2或 CH2CH2CH2。在另一個實施方案中，A包括芳基或雜芳基基團。在一個實 施方案中，關于脫鹵素酶諸如紅球菌屬脫鹵素酶的底物中的連接體是多原子直鏈或分支鏈，包括C，N,S,或O，且優(yōu)選地當官能團R包括芳香族環(huán)
系統或是固體支持物時，為11-30個原子。
在另一個實施方案中，具有連接體的關于脫鹵素酶的本發(fā)明底物具有
式(II):
R—連接體-CH2-CHrCH2-X (II)
其中X是鹵素，優(yōu)選地氯化物。在一個實施方案中，R是一個或多個 官能團，諸如熒光團，生物素，發(fā)光團，或熒光或發(fā)光分子，或是固體支持 物，包括微球體，膜，玻璃珠，等等。當R是放射性標記，或小的可檢測原 子諸如光譜活性的同位素時，所述連接體可以是0-30個原子。
示范性脫鹵素酶底物記述在美國公開的申請?zhí)?006/0024808和 2005/0272114中，將其引入本文作為參考。
示范性方法
技術領域：
本發(fā)明提供用于監(jiān)測細胞中分子表達、位置和/或運輸，以及用于監(jiān)測 細胞中微環(huán)境變化，例如，以用于成像，鑒定，定位，展示或檢測樣品中， 例如，細胞中可能存在的一種或多種分子，或用于捕獲，純化或分離分子， 諸如細胞中的那些的方法，所述方法使用本發(fā)明的水解酶底物和突變水解 酶。本發(fā)明方法中使用的水解酶底物優(yōu)選地可溶于水性或主要為水性的溶 液，包括水和具有大于或等于約6的pH的水溶液。然而，底物的儲液，可 以在稀釋到水溶液或緩沖液中之前溶解在有機溶劑中。優(yōu)選的有機溶劑是 非質子極性溶劑諸如DMSO，DMF,N-甲基吡咯烷酮，丙酮，乙腈，二噁垸, 四氫呋喃和其他非羥基、完全水-混合溶劑。待使用的水解酶底物和突變水 解酶濃度依賴于實驗條件和所需要的結果，例如，為了在合理時間內，以 最小背景或不需要的標記獲得結果。水解酶底物的濃度典型地在納摩爾-微摩爾的范圍內。對相應的突變水解酶所需的水解酶底物的濃度通過底物 中系統變化直至實現滿意的標記來確定。起始范圍容易由本領域中已知的 方法確定。
在一個實施方案中，包括具有光學性質的官能團的底物用于檢測細胞分子和具有突變水解酶的融合體的融合配偶體之間的相互作用。所述底物 與包括融合片段的目的樣品結合一段時間，所述時間足以使融合配偶體結 合細胞分子和突變水解酶結合底物，其后，在選擇用于激發(fā)該官能團光學 響應的波長處照射該樣品。任選地，洗滌所述樣品，從而去除殘余的、過 量或未結合的底物。在一個實施方案中，所述標記用于通過進一步比較所 述光學響應和標準或預期響應而確定樣品的特定特征。例如，與底物結合 的突變水解酶用于針對它們在樣品中的空間和時間分布，監(jiān)測所述樣品的 特異性成分。備選地，與底物結合的突變水解酶用于確定或檢測某種分子 的存在或數量。
與固有性熒光蛋白，例如GFP相反，與熒光底物結合的突變水解酶不 需要天然蛋白質結合來保持熒光性。在熒光底物結合后，可以在例如，變
性電泳凝膠，例如SDS-PAGE中，或在用有機溶劑，例如低聚甲醛固體的 細胞中檢測突變水解酶。
可檢測的光學響應意指在測試系統中通過直接觀察或通過儀器能夠 察覺到的參數改變或出現。所述可檢測的響應包括顏色、熒光性、反射率、 化學發(fā)光、光極化、光散射、或X-射線散射的改變或出現。典型地，可檢 測的響應是在熒光性的改變，諸如熒光的強度、激發(fā)或發(fā)射波長分布，熒 光性壽命，熒光極化，或其組合中的改變?？蓹z測的光學響應可以遍及樣 品或在具有結合突變水解酶的底物的樣品的局部部分發(fā)生。光學響應與標 準或預期響應的程度比較可以用于確定樣品是否和以何種程度具有給定 的特征。
包括突變水解酶的樣品典型地通過被動方式，即通過與底物溫育進行 標記。然而，任何將底物引入樣品的方法，諸如將底物顯微注射到細胞或 細胞器中，可以用于將底物引入樣品。本發(fā)明的底物，在使用濃度下，通 常對活細胞和其他生物學成分是無毒的。
包括突變水解酶的樣品可以在與本發(fā)明的底物接觸后立即觀察。包括 突變水解酶或其融合體的樣品任選地在標記過程中與其他溶液結合，包括 洗滌溶液、透化和/或固定溶液、和包含另外的檢測試劑的其他溶液。與底 物接觸后的洗滌可以提高光學響應的檢測，這歸因于洗滌后非特異性背景 的減少。通過使用較低的標記濃度，可以在不洗滌的條件下獲得滿意的顯現。許多固定劑和固定條件在本領域中已知，包括甲醛、低聚甲醛、福爾 馬林、戊二醛、冷甲醇和3:1甲醇乙酸。固定典型地用于保持細胞形態(tài) 學和在研究致病樣品時降低生物危害。選擇的底物實施方案在細胞中充分 保持。按照本領域中通常已知的方法，任選地，在固定后進行或伴隨著固
定進行透化，諸如用丙酮、乙醇、DMSO或不同去污劑，從而容許本發(fā)明
的大底物穿過細胞膜。任選地，底物的使用可以與產生可檢測響應的另外 的檢測試劑的使用相結合，這是因為包括突變水解酶或其融合體的樣品中 存在特異性細胞成分、胞內物質、或細胞條件。當另外的檢測試劑具有與 底物的那些不同的光譜性質時，多-色應用是可能的。
在與具有帶光學性質的官能團的底物結合后或該過程中的任何時刻， 用導致可檢測光學響應的光波長照射包括突變水解酶或其融合體的樣品， 并用用于檢測光學響應的方法進行觀察。盡管一些底物可使用環(huán)境光通過 比色法檢測，但是其他底物通過親本熒光團的熒光性性質檢測。當諸如通 過紫外或可見波長發(fā)射燈，弧光燈、激光或甚至日光或普通的室內光照射 時，底物，包括與互補特異性結合對成員結合的底物，展示出強烈的可見 的吸光度以及熒光發(fā)射。選擇的有效用于照射本發(fā)明底物的設備包括，但 不限于，手持紫外燈、水銀弧光燈、氤氣燈、氬激光器、激光二極管、和
YAG激光器。這些照射源任選地整合到激光掃描儀、熒光微量板讀數器、 標準或小熒光計、或色譜檢測器中。該比色吸光度或熒光發(fā)射任選地通過
視覺檢查，或通過使用任何下列裝置檢測CCD照相機、攝像機、照相膠
片、激光掃描裝置、熒光計、光二極管、量子計數器、落射熒光顯微鏡、 掃描顯微鏡、流式細胞儀、熒光微量板讀數器，或通過用于擴增信號的設 備諸如光電倍增管檢測。當利用流式細胞儀、熒光顯微鏡或熒光計檢查包 括突變水解酶或其融合體的樣品時，該儀器任選地用于區(qū)分和辨別包括作 為熒光團的官能團的底物和具有可檢測的不同光學性質的第二熒光團，典 型地通過區(qū)分底物的熒光響應和第二熒光團的熒光響應。當利用流式細胞 儀檢查樣品時，樣品的檢查任選地包括通過使用分類裝置基于底物的熒光 響應分離樣品中的粒子。
示范性突變水解酶和使用那些水解酶的方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供第一突變脫鹵素酶，其相對于第二突 變脫鹵素酶包括至少一個氨基酸取代。所述第一和第二突變脫鹵素酶與包 括一個或多個官能團的脫鹵素酶底物形成鍵，所述鍵比在相應的野生型脫 鹵素酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。在所述第一突變脫鹵素酶中而不在 所述第二突變脫鹵素酶中的至少一個氨基酸取代，是提高功能性表達或結 合動力學的取代。所述第一和第二突變脫鹵素酶在這樣的殘基處或在這樣 的氨基酸殘基處具有至少一個氨基酸取代，所述殘基在相應的野生型脫鹵 素酶中與活化水分子有關，所述活化水分子裂解相應的野生型脫鹵素酶和 該底物之間形成的鍵，所述氨基酸殘基在野生型脫鹵素酶中與底物形成酯
中間體。至少一個提高功能性表達或結合動力學的取代位于與SEQ ID NO:l中位置5, 11, 20, 30， 32, 47, 58， 60， 65, 78, 80， 87， 88, 94， 109， 113， 117， 118， 124, 128, 134, 136, 150， 151, 155, 157， 160, 167, 172， 187, 195,204, 221， 224， 227， 231， 250， 256, 257， 263, 264, 277, 282, 291或292相對應的位置 處。在一個實施方案中，所述第一突變脫鹵素酶具有至少2個位于與SEQ IDNO:l中位置5, 11,20,30， 32,58,60， 65,78， 80 87, 94, 109, 113, 117, 118， 124， 134， 136, 150, 151， 155， 157, 172， 187， 204， 221, 224， 227, 231, 250, 256, 263,277,282,291和292相對應的位置處的取代。在一個實施方案中，所 述第一突變脫鹵素酶具有位于與SEQ ID NO:l中位置58， 78， 87， 155, 172, 224， 227， 291,或292相對應的位置或其多處位置的取代，和位于與SEQ ID NO:l中位置175, 176,272或273相對應的位置或其多處位置的取代。在 一個實施方案中，所述第一突變脫鹵素酶具有位于與SEQ IDNO:l中58， 78， 155, 172， 224， 291,或292相對應的位置或其多處位置的取代，和位于與 SEQ ID NO:l中位置175, 176, 272或273相對應的位置或其多處位置的取 代。例如，所述第一突變脫鹵素酶中處于與位置291相對應的位置處的取 代的氨基酸是G、 S或Q，或與位置80相對應的位置處的取代氨基酸是 Q,N，K或T。在一個實施方案中，所述第二突變脫鹵素酶具有位于與位置 272相對應的殘基處的取代，并且還包括位于與SEQIDNO:l中位置175， 176或273相對應的位置處的一個或多個取代，例如具有SEQIDNO:18。 在一個實施方案中，所述第一或第二突變脫鹵素酶的至少一個取代位于野 生型脫鹵素酶中處在活性位點腔中的氨基酸殘基處，并且該殘基的一個原子在與野生型脫鹵素酶結合的脫鹵素酶底物的5 A內。在一個實施方案中， 所述第一和第二突變脫鹵素酶的至少一個取代位于與紫紅紅球菌脫鹵素
酶的氨基酸殘基272相對應的位置處，例如，位于與氨基酸殘基272相 對應的位置的取代的氨基酸是天冬酰胺，谷氨酰胺，苯丙氨酸，甘氨酸或 丙氨酸，和任選地位于位置273處的另一個取代。
在一個實施方案中，所述第一突變脫鹵素酶還包括目的蛋白，由此產 生融合蛋白，例如,可選擇的標記蛋白，膜蛋白，胞質蛋白，核內蛋白，結 構蛋白，酶，酶底物，受體蛋白，轉運蛋白，轉錄因子，通道蛋白，磷蛋白, 激酶，信號傳導蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體相關蛋白，核酸結合蛋 白，胞外基質蛋白，分泌蛋白，受體配體，血清蛋白，免疫原性蛋白質，熒 光蛋白，或具有反應性半胱氨酸的蛋白質。
還提供編碼所述第一突變脫鹵素酶的分離的多核苷酸。在一個實施方 案中，所述分離的多核苷酸編碼融合多肽，所述融合多肽包括所述第一突 變脫鹵素酶和非脫鹵素酶多肽。在一個實施方案中，所述第一突變脫鹵素 酶在非脫鹵素酶多肽的C-端。在一個實施方案中，所述融合體在所述第一 突變脫鹵素酶和非脫鹵素酶多肽之間包括具有蛋白酶識別序列的連接體 序列，例如，所述連接體序列包括EPTTEDLYFQS/C (SEQ ID NO:31)或 EPTTEDLYFQS/CDN (SEQ ID NO:38)。
本發(fā)明的突變水解酶有效用于多種方法中。在一個實施方案中，本發(fā) 明提供用于檢測或確定突變水解酶的存在或量的方法。所述方法包括使具 有突變水解酶樣品與包括一個或多個官能團的水解酶底物相接觸，其中 突變水解酶相對于相應野生型水解酶包括至少2個氨基酸取代，其中一個 氨基酸取代導致所述突變水解酶與底物形成比相應的野生型水解酶和該 底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且位于在相應的野生型水解酶中與活化水 分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解相應的野生型水解酶和底 物之間形成的鍵，或位于在相應的野生型水解酶中與底物形成酯中間體的 氨基酸殘基處。在一個實施方案中，第二個取代位于與SEQIDNO:l中位 置5， 11, 20， 30， 32， 47， 58， 60， 65， 78， 80， 87， 88， 94， 109， 113， 117， 118， 124， 128， 134, 136， 150， 151, 155, 157, 160, 167, 172, 187, 195, 204， 221， 224, 227, 231, 250, 256, 257, 263， 264, 277， 282, 291或292相對應的位置處。在一個實施方案中，突變水解酶具有位于與SEQIDNO:l中位置5, 11， 20, 30， 32, 58, 60, 65， 78, 80， 87, 94, 109， 113， 117, 118, 124, 134， 136, 150, 151, 155， 157， 172， 187, 204， 221, 224， 227， 231, 250， 256, 263, 277, 282， 291,或292 相對應的位置處的多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶具有至少一 個與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272相對應的位置處的取代，例如, 其中位于與氨基酸殘基272相對應的位置處的取代的氨基酸是天冬酰胺、 谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一個實施方案中，突變水解酶 還包括位于與SEQ ID NO:l中位置175， 176或273相對應的位置處的一 個或多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶與相應的野生型水解酶具 有至少80%,例如，至少85%的氨基酸序列同一性。檢測或確定所述官能 團的存在或量，由此檢測或確定所述突變水解酶的存在或量。在一個實施 方案中，突變水解酶融合于目的分子，例如，目的蛋白。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于標記細胞的方法。所述方法包括 使具有包括突變水解酶的細胞的樣品與包括一個或多個官能團的水解酶 底物相接觸，其中所述突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至少2 個氧基酸取代。 一個氨基酸取代導致突變水解酶與底物形成比相應的野生 型水解酶和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且所述取代位于在相應的野 生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解相 應的野生型水解酶和底物之間形成的鍵，或位于在相應的野生型水解酶中 與底物形成酯中間體的氨基酸殘基處。第二個取代位于與SEQIDNO:l中 位置5, 11, 20, 30, 32， 47, 58， 60, 65, 78, 80, 87， 88, 94, 109， 113, 117, 118, 124, 128, 134， 136， 150， 151， 155, 157， 160， 167, 172， 187, 195, 204， 221， 224, 227, 231, 250, 256， 257， 263， 264, 277, 282， 291或292相對應的位置處。在 一個實施方案中，突變水解酶具有位于與SEQ ID NO:l中位置5, 11， 20, 30: 32， 58, 60, 65, 78, 80, 87, 94, 109, 113, 117， 118， 124， 134, 136, 150, 151, 155, 15, 172， 187, 204， 221, 224， 227， 231， 250, 256， 263, 277, 282， 291,或292相 對應的位置處的多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶具有至少一個 位于與紫紅紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272相對應的位置處的取代，例 如，其中位于與氨基酸殘基272相對應的位置處的取代的氨基酸是天冬 酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一個實施方案中，突變水解酶還包括位于與SEQ ID NO:l中位置175， 176或273相對應的位置 處的一個或多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶與相應的野生型水 解酶具有至少80%,例如，至少85%的氨基酸序列同一性。然后檢測或確 定樣品中所述官能團的存在或量。在一個實施方案中，所述細胞是細菌細 胞。在另一個實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中， 突變水解酶融合于目的分子，例如，目的蛋白。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于分離目的蛋白的方法。所述方法 包括提供包括一種或多種融合蛋白的樣品，至少其中一種融合蛋白包括突 變水解酶和目的蛋白，并且提供包括一種或多種水解酶底物的固體支持 物。所述突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至少2個氨基酸取代, 其中一個氨基酸取代導致突變水解酶與底物形成比相應的野生型水解酶 和該底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且所述取代位于在相應的野生型水解 酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解相應的野生 型水解酶和底物之間形成的鍵，或位于在相應的野生型水解酶中與底物形 成酯中間體的氨基酸殘基處。第二個取代位于與SEQ ID NO:l中位置5, 11, 20, 30, 32， 47， 58， 60, 65, 78, 80, 87， 88， 94, 109, 113, 117, 118, 124, 128， 134, 136, 150， 151, 155， 157, 160, 167, 172, 187, 195， 204, 221, 224, 227, 231, 250， 256， 257， 263, 264, 277, 282， 291或292相對應的位置處。在一個實施 方案中，突變水解酶具有位于與SEQ ID NO:l中位置5， 11, 20， 30, 32， 58, 60， 65, 78, 80, 87， 94， 109， 113， 117， 118， 124， 134， 136， 150, 151， 155， 157， 172, 187, 204, 221, 224, 227， 231, 250， 256， 263, 277, 282, 291，或292相對應 的位置處的多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶具有位于與紫紅紅 球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272相對應的位置處的至少一個取代，例如， 其中位于與氨基酸殘基272相對應的位置處的取代的氨基酸是天冬酰胺、 谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一個實施方案中，突變水解酶 還包括位于與SEQ ID NO:l中位置175， 176或273相對應的位置處的一 個或多個取代。在一個實施方案中，突變水解酶與相應的野生型水解酶具 有至少80%,例如，至少85%的氨基酸序列同一性。所述樣品和所述固體 支持物相接觸，從而分離目的蛋白。在一個實施方案中，目的蛋白與目的 分子結合。在一個實施方案中，分離與目的蛋白結合的目的分子。本發(fā)明的方法使用包括水解酶底物的化合物。在一個實施方案中，所 述突變水解酶是突變脫鹵素酶，且所述底物是式(I)的化合物R-連接體
-A-X,其中R是一個或多個官能團；連接體分開R和A的基團;A-X是脫 鹵素酶的底物；和X是鹵素，例如，Cl或Br。在一個實施方案中，連接體 是多原子直鏈或分支鏈，其包括C，N，S，或O。在一個實施方案中，連接體 是包括約2-約30個碳原子的二價分支的或不分支的碳鏈，所述鏈任選地 包括一個或多個雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個羥基或氧代 (K))基團取代，其中所述鏈中的一個或多個碳原子任選地被非-過氧化物 -O-， -S-或-NH-替換。在一個實施方案中，連接體在所述鏈中通過至少12 個原子分開R和A。在一個實施方案中，所述鏈中的一個或多個碳原子被 芳基或雜芳基環(huán)替換。在一個實施方案中，A是(CH2)n且n = 2-10或n = 4-10。在一個實施方案中,R包括生物素或其他抗生物素蛋白結合分子，固 體支持物，例如，磁性粒子，瓊脂糖珠，纖維素珠，載玻片，或多孔板的孔， 或熒光團，諸如咕噸，香豆素，色烯，B引哚，異吲哚，唑,BODIPY， BODIPY 衍生物，咪唑，嘧啶，噻吩，芘，苯并芘，苯并呋喃，熒光素，羅丹明，對甲 氨基酚,phenalenone, acridinone,試卣靈,萘,蒽，acridinium， a-萘鼢,卩-萘 酚，丹磺酰，花青，嗪，硝基苯并噁唑(NBD), dapoxyl，萘二酰亞胺，苯乙
烯基5等o
本發(fā)明將進一步通過下列非限制性實施例進行描述。 實施例l
在缺乏融合配偶體的條件下，HT2在大腸桿菌或無細胞系統中的表達 是充沛的。然而，當與另一種基因融合時，可溶性和功能性HT2的產量較 低，這可能歸因于該融合體的兩種成分之間的結構不相容性。 一般地，當 HT2是融合體的C-端成分時，該問題更明顯。為了改善突變水解酶諸如在 與SEQ ID NO: 1中位置272相對應的位置處具有取代的突變脫卣素酶與融 合配偶體之間的結構相容性，并且為了改善除具有TMR官能團的那些以 外的水解酶底物的相對標記動力學，使用演變的過程。FAM配體用于篩選 進一步最優(yōu)化的突變DhaA，其目的是一些鑒定的突變提供提高的FAM配 體動力學。然后，用TMR配體檢查候選者，從而確保所述突變基本不改
65變與該配體的動力學。
形成針對DhaA,H272F H11YL (圖4; "HT2， SEQ ID NO:20)的DNA的 下列位點-定向的改變，并發(fā)現其相對于DhaA.H272FHllYL，提高了在大 腸桿菌D78G，F80S，P291A,和P291G中的功能性表達。
DhaA.H272F H11YL中的密碼子80， 272，和273處的位點-飽和誘變 用于構建包含處于這些位置中每一個的所有可能的氨基酸的文庫。該文庫 在大腸桿菌中過表達，并利用包含脫鹵素酶底物(C31H31C1N08)的羧基二 氫熒光素(FAM)和熒光極化(FP)篩選功能性表達/提高的動力學。篩選的 性質容許鑒定具有提供的表達以及提供的動力學的蛋白。具體地，該篩選 排除具有較低固有動力學的突變體。具有理想性質的取代包括下列F80Q, F80N， F80K， F80H, F80T， H272N, H272Y, Y273F， Y273M，禾B Y273L。其中， Y273F顯示提供的固有動力學。
HT2中272處的Phe缺乏與Glu-130形成氫鍵的能力。認為His-272 和Glu-130之間的相互作用起結構作用，并且因此該鍵的缺乏可以使HT2 去穩(wěn)定化。而且，Phe與位置273處的Tyr》Leu變化的接近可以提供來自 這些相鄰殘基的側鏈之間的潛在協助性相互作用。在位置273處為Leu或 Phe的情形中，確定Asn為位置272處的較好殘基。當建模包括Asn-272 的HT2結構時，證明1) Asn填充與His相比相似的幾何學的空間，和2) Asn可以與Glu-130形成氫鍵。發(fā)現在位置272處具有Asn取代的HT2在 大腸桿菌、無細胞系統、和哺乳動物細胞中產生較高水平的功能性蛋白， 這可能是提高所述蛋白總穩(wěn)定性的結果。
兩輪誘變PCR用于以1-2氨基酸取代/序列的頻率向HT2的整個編碼 序列中引入突變。該方法容許耙向整個序列，并不依賴于任何HT2結構/ 功能的現有技術。在第一輪誘變中，在N-端HT2融合的情形中，將Asn-272、 Phe-273、和Gly-78固定于作為模板的人源化/^m7/a螢光素酶。確定6種 有益于改善針對FAM配體的FP信號的突變(S58T, A155T, A172T, A224E, P291S， A292T; V2)，并確定除A172T以外的每種取代在大腸桿菌中提供增 加的蛋白質產量。然而，A172T變化提供提高的固有動力學。然后組合這 6種取代(包括"11+/-273)，從而提供組合序列(V3/V2)，該序列在與多個 配偶體融合且以兩種方向融合時，提供顯著提高的蛋白質生產和固有標記動力學。
在第二輪誘變中，使用6種不同的模板V3或V2在C-端與人源化
Renilla螢光素酶(RL)、螢火蟲螢光素酶、或Id融合。如上進行誘變PCR， 將確定為有益于3種配偶體中的至少2種的突變組合，從而提供V6 (Leu-273)。在第二輪誘變PCR中，在選擇賦予熱穩(wěn)定性的序列的嘗試中， 利用升高的溫度(30。C)誘導蛋白表達。突變DhaA融合體增高的固有結構 穩(wěn)定性可以導致蛋白質更有效的生成。
與理想性質有關的隨機突變包括下列G5C, G5R， D11N, E20K, R30S, G32S， L47V, S58T， R60H, D65Y， Y87F， L88M, A94V， S109A, F113L, K117M: R118H， K124I, C128F, P134H, P136T， Q150H, A151T, A155T, V157I, E160K: A167V, A172T, D187Q K195N, R204S, L221M, A224E, N227E, N227S， N227D, Q231H， A250V, A256D, E257K, K263T, T264A, D277N， 1282F， P291S，P291Q，A292T,和A292E。
除以上取代外，確定了在突變DhaA和下游C-端配偶體/^w7/fl熒光 素酶之間的連接體序列中的取代。親本連接體序列(殘基294-320)是 QYSGGGGSGGGGSGGGGENLYFQAIEL (SEQ ID N0:19)。在連接體中確 定的與提高的FP信號有關的取代是Y295N, G298C, G302D， G304D， G308D, G310D, L313P, L313Q，和A317E。特別地，9種中的5種帶負電 荷。
除A172T和Y273F (在H272N情形中)夕卜，所有以上取代作為N-端融合，在大腸桿菌中提供提高的功能性表達。然而，A172T和Y273F 提高標記的固有動力學。
突變DhaA中具有一般提高的性質的示范性組合的取代是 DhaA 2.3 (V3): S58T， D78G， A155T, A172T, A224E， F272N, P291S,和 A292T。
DhaA 2.4 (V4): S58T， D78G， Y87F， A155T， A172T， A224E， N227D,
F272N, Y273F, P291Q，禾卩A292E。 DhaA 2.5 (V5): G32S， S58T， D78G， Y87F， A155T， A172T, A224E,
N227D， F272N， P291Q,和A292E。 DhaA2.6 (V6): L47V, S58T， D78G, Y87F， L88M, C128F， A155T， E160K,A167V, A172T， K195N, A224E， N227D, E257K， T264A， F272N，P291S,和A292T。 DhaA2.6中存在的取代中，除改善固有動力學的A167V以外，全部改 善在大腸桿菌中的功能性表達。
圖5提供在大腸桿菌中提高的功能性表達的另外的取代。
實施例2
使用V6序列作為C-端處誘變的模板。在Id-V6融合體(V6是C-端 配偶體)的情形中，制備包含隨機、二-殘基延長(尾部)的突變體文庫， 并用FAM配體篩選。鑒定具有提高的蛋白質生產和較少非-特異性裂解(如 通過TMR配體標記和凝膠分析確定地)的突變體。DhaA2.6 ("V6")中的 兩個C-端殘基被Glu-Ile-Ser-Gly替換，從而產生V7(圖8)。作為對Id的 N-和C-端兩端的融合，將V7的表達與V6進行比較。融合體在大腸桿菌 中過表達，并用10 TMR配體標記完全，然后由SDS-PAGE +熒光成 像解析(圖6)。數據顯示由V7序列形成更多功能性的融合蛋白。另外， 關于V7， FAM配體隨時間的標記動力學與關于V6的相似(圖6)，盡管 在測試純化的非融合蛋白時，V7具有比V6更快的動力學。
V7還表達在兔網織紅細胞TNT不含細胞的表達系統中(圖7)。用 10 nM TMR配體標記裂解物至完全，并通過SDS-PAGE +熒光成像分析功 能性表達。如在大腸桿菌中的表達，在兔裂解物中，更多功能性蛋白由 V7序列的表達產生。V7的表達比SEQ ID NO:20 ("HT2")提高約140-— 250-倍。相對于麥芽轉錄/翻譯系統中的HT2， V7的表達也提高了(圖9)。
為了測試體內標記，用關于HT2， V3, V7和V7F (V7F相對于V7具有 單氨基酸差別；V7F在位置273處具有Phe而非Leu)的載體轉染HeLa細 胞后24小時，用0.2 TMR配體體內標記細胞5分鐘，15分鐘，30分鐘 或2小時。通過SDS-PAGE /熒光成像分析并通過ImageQuant定量樣品。 V7禾Q V7F導致比HT2和V2更好的功能性表達，且V7、 V7F和V3相對 于HT2在哺乳動物細胞中具有提高的體內動力學(圖IO)。
而且，V7作為N-或C-端融合體具有提高的功能性表達(圖ll)，且 在破壞(pulldown)測定中比其他突變DhaA更有效。結果顯示關于能夠
68的突變DhaA-Id融合體破壞的MyoD的量， V7>V6>V3。 V7和V7F具有提高的標記動力學(圖13)。具體地，V7F 具有比V7快約1.5—約3.0-倍的標記。圖14顯示關于不同突變DhaA蛋白的熱穩(wěn)定性數據。該數據是利用 純化的蛋白產生的，并且顯示關于熱穩(wěn)定性，V7>V6>V7F>V3>HT2。例 如，在一些條件下(暴露于48°C 30分鐘)，純化的V7F失去其活性的50%， 而V7仍保持80%活性。當V7和V7F在大腸桿菌中表達并作為裂解物分 析時，這二者中間的熱穩(wěn)定性差異更顯著。圖15顯示暴露于尿素和鹽酸胍后的穩(wěn)定性。圖16-17顯示使用兩種不同配體對不同DhaA突變體的標記動力學。 圖18比較關于兩種DhaA突變體對比鏈霉抗生物素-生物素的標記速率。圖19提供關于包括那些有效用作N-或C-端融合體的不同DhaA突變 體的核苷酸和氨基酸序列。注意到這些突變體末端可以接納包括尾部和連 接體序列以及取代的不同序列。例如，突變DhaA的N-端可以是 M/GA/SETG(SEQIDNO:39)，且C-端可以包括取代和添加("尾部")， 例如，P/S/QA/T/ELQ/EY/I (SEQ ID NO:40)，和任選地SG。例如，該C-端可以是EISG(SEQIDNO:41)，EI， QY或Q。關于N-載體，N-端可以是 MAE，且在C-載體中，N-端序列或突變DhaA可以是GSE或MAE。尾部 包括但不限于QY和EISG。兩種蛋白質之間的序列(連接體序列)可以包括由蛋白酶識別的序列。 在一個實施方案中，連接體序列可以包括TEV蛋白酶位點(Doherty等， 1989)、約4個氨基酸的上游區(qū)域(P10-P7)、和約2或3個氨基酸的下游 區(qū)域(P'2-P'4)。包含TEV位點可以降低重組表達在大腸桿菌中的溶解性 (Kurz等，2006)，并可以減少哺乳動物表達(數據未顯示)。為了解決該問 題，最優(yōu)化TEB位點，從而在不降低TEV蛋白酶裂解序列能力的條件下， 維持在哺乳動物細胞、無細胞表達系統或大腸桿菌中的表達水平。為了增 強哺乳動物的表達，在TEV蛋白酶位點中進行下列改變在P5， N變?yōu)?D，且在上游區(qū)序列中，在P10處，I變?yōu)镋， P'2 D， P'3 N和任選地P'4D。 這些改變提高TEB裂解，減少在大腸桿菌中的非特異性平截，并提高在 哺乳動物細胞和無細胞表達系統中的表達。為了與DhaA突變體一起使用，N-端序列包括EPTT-EDLYFQ(S/C)-DN (SEQ ID NO:38)，且C-端序列包括 EPTT-EDLYFQS-DND (SEQ ID NO:50)。這些序列不減少在哺乳動物細胞、 無細胞系統、或大腸桿菌細胞中DhaA突變融合蛋白表達的表達或溶解性。 這些序列可以與任何融合體一起使用。按照生產商的建議，利用LT1 (Mirus)，將攜帶p65-HT2， p65-HTv3, p65-HTv6, p65-HTv7和p65-HTv7飾載體引入到涂布在24孔板(每個時間點 或配體濃度2個孔)中的HeLa細胞中。轉染后24小時，用圖20中指出的不 同濃度TMR配體(5 nM ， 15分鐘)標記細胞一段不同的時間段。洗去未結 合的配體，并用SDS-PAGE樣品緩沖液收集細胞。將熒光標記的蛋白質在 SDS-PAGE上解析，并在熒光成像(Typhoon-9410，安瑪西亞(Amersham)) 上分析。用p65-HT2,p65-V3,p65-V7,或p65-V7F瞬時轉染、裂解并用p65 AB 和IkB AB探測的HeLa細胞的蛋白質印跡分析顯示在圖21中。為了進一步在不同條件下探索突變DhaA的標記動力學，在增高的鹽 濃度、裂解緩沖液中存在的非去污劑試劑、不同的緩沖劑和不同的去污劑 的存在下進行反應(圖22-29)。公開的突變DhaA提供提高的功能性融合蛋白生產，這容許利用與基 底或載玻片連接的合適的配體破壞蛋白質-蛋白質相互作用。預期的取代包括圖5中公開的位置處的那些，以及位置147，例如, E147K,位置282，例如，L282M，或位置164,例如，D164E。參考文獻Ausubel等，現代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)，巻III,A.l(3-4),增刊38 (1997).Chalfie，M.和Kain,S.R.,編，GFP:綠色熒光蛋白策略和應用(GFP: Green Fluorescent Protein Strategies and Applications ) (Wiley,紐約，1998).Cubitt等，生物化學科學趨勢(Trends Biochem. Sci.)， 20:448 (1995).Doherty等，病毒學(Virol.) ，171:356(1989).Einbond等，FEBS通信(FEBSLett.) ，384:1 (1996).Farinas等，生物化學雜志(J.Biol. Chem.) ,274:7603 (1999).Griffin等，科學(Science) ,281:269(1998).Hanks和Hunter, FASEB雜志(FASEB J) , 9:576-595 (1995)，Harlow和Lane，在抗體實驗室手冊(Antibodies: A Laboratory Manual),冷泉港實驗室出版社，第726頁(198S)Ilsley等，細胞信號傳導(Cell Signaling) ,14:183 (2002).Hermanson，生物綴合技術(BioconjugateTechniques),學院出版社 (Academic Press)，圣地亞哥，CA (1996).Janssen等，細菌學雜志(J. Bacteriol.) ，171:6791 (1989).Keuning等,細菌學雜志(J. Bacteriol.) ,163:635 (1985).Kneen等，生物物理雜志(Biophys.J.) ,74:1591 (1998).Kulakova等，微生物學(Microbiology) ,143:109(1997).Kurz等，蛋白質表達禾口純化(Protein Expression and Purification)， 50:68 (2006).Llopis等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95:6803 (1998).Mayer和Baltimore,細胞生物學趨勢(Trends Cell. Biol), 3:8 (1993).Miesenb3ck等,自然(Nature) ,394:192(1998).Mils等，癌基因(Oncogene)， 19:1257(2000).Miyawaki等，自然(Nature) ,388:882 (1967).Nagata等，環(huán)境微生物學應用(Appl. Environ. Microbiol.) ， 63:3707(1997).Orm6等，科學(Science) ，273:1392 (1996). Rosomer等，生物化學雜志(J. Biol. Chem.) ，272:13270(1997). Sadowski，等，分子細胞生物學(Mol. Cell. Bio.) ,6:4396(1986). Sallis等，遺傳學和微生物學雜志(J. Gen. Microbiol.) ， 136:115(1990).Scholtz等,細菌學雜志(J. Bacteriol.) ,169:5016(1987). Stroffekova等，歐洲生理學雜志(Eur. J. Physiol.) ,442:859(2001). Tsien，生物化學年度綜述(Ann. Rev. Biochem.) ,67:509 (1998). Wada等，核酸研究(Nucleic Acids Res.) ， 18增刊:2367 (1990).Yokota等，細菌學雜志(J.Bacteriol.) ,169:4049(1987).所有公開、專利和專利申請引入本文作為參考。盡管在前述說明書 中，是以及關于其某些優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，且為了舉例說明的目 的，已經闡述了許多詳細信息，但是本領域中的那些技術人員應該清楚的 是，本發(fā)明可受另外的實施方案的影響，并且本文中的某些詳細信息可以 在不偏離本發(fā)明的基本原則的條件下顯著變化。
權利要求
1.第一突變脫鹵素酶，其相對于第二突變脫鹵素酶包括至少一個氨基酸取代，其中所述第一和第二突變脫鹵素酶與包括一個或多個官能團的脫鹵素酶底物形成鍵，所述鍵比在相應的野生型脫鹵素酶和所述底物之間形成的鍵更穩(wěn)定，其中在所述第一突變脫鹵素酶中而不在所述第二突變脫鹵素酶中的至少一個氨基酸取代是提高功能性表達或結合動力學的取代，其中所述第一和第二突變脫鹵素酶具有在這樣的殘基處或在這樣的氨基酸殘基處的至少一個氨基酸取代，所述殘基在所述相應的野生型脫鹵素酶中與活化水分子有關，所述活化水分子裂解所述相應的野生型脫鹵素酶和所述底物之間形成的鍵，所述氨基酸殘基在所述野生型脫鹵素酶中與底物形成酯中間體，并且其中提高功能性表達或結合動力學的所述至少一個取代位于與SEQ ID NO1中位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，277，282，291或292相對應的位置處。
2. 權利要求1的第一突變脫鹵素酶，其具有位于與SEQIDNO:l中位 置5, 11， 20, 30， 32， 58, 60, 65, 78, 80 87， 94, 109, 113, 117， 118, 124, 134, 136， 150， 151， 155， 157, 172, 187, 204, 221, 224， 227, 231, 250, 256, 263， 277， 282, 291和292相對應的位置處的至少2個取代。
3. 權利要求1或2的第一突變脫鹵素酶，其具有位于與SEQIDNO:l 中位置58, 78， 87, 155， 172， 224, 227, 291, 292相對應的位置處或其多處的 取代，和位于與SEQ ID NO:l中位置175， 176, 272或273相對應的位置處 或其多處的取代。
4. 權利要求1或2的第一突變脫鹵素酶，其具有位于與SEQIDNO:l 中位置58, 78, 155, 172， 224， 291，或292相對應的位置處或其多處的取代， 和位于與SEQ ID NO: 1中位置175， 176, 272或273相對應的位置處或其多 處的取代。
5. 權利要求1-4中任一項的第一突變脫鹵素酶，其中位于與位置291相對應的位置處的取代的氨基酸是G、 S或Q。
6. 權利要求l-5中任一項的第一突變脫鹵素酶，其具有位于與位置272 相對應的殘基處的取代，并還包括位于與SEQIDNO:l中位置175， 176或 273相對應的位置處的一個或多個取代。
7. 權利要求1-6中任一項的第一突變脫鹵素酶，其還包括目的蛋白， 由此產生融合蛋白。
8. 權利要求7的第一突變脫鹵素酶，其中所述目的蛋白是選擇標記蛋 白、膜蛋白、胞質蛋白、核內蛋白、結構蛋白、酶、酶底物、受體蛋白、 轉運蛋白、轉錄因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信號傳導蛋白、代謝蛋 白、線粒體蛋白、受體相關蛋白、核酸結合蛋白、胞外基質蛋白、分泌蛋 白、受體配體、血清蛋白、免疫原性蛋白、熒光蛋白、或具有反應性半胱 氨酸的蛋白。
9. 權利要求1-8中任一項的第一突變脫鹵素酶，其中所述第一和第二 突變脫鹵素酶中的所述至少一個取代位于與紫紅紅球菌(/ /20^^0CCW Wzodoc/^ow)脫鹵素酶的氨基酸殘基272相對應的位置處。
10.權利要求9的第一突變脫鹵素酶，其中位于與氨基酸殘基272相 對應的位置處的取代的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸 或丙氨酸。
11. 權利要求1-10中任一項的第一突變脫鹵素酶，其中位于與位置80 相對應的位置處的取代的氨基酸是Q、 N、 K或T。
12. 權利要求l-ll中任一項的第一突變脫鹵素酶，其中所述第一和第 二突變脫鹵素酶還包括位于位置273處的取代。
13. 用于檢測或確定突變水解酶的存在或量的方法，其包括 a)使具有突變水解酶的樣品與包括一個或多個官能團的水解酶底物相接觸，其中所述突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至少2個氨基 酸取代，其中一個氨基酸取代導致所述突變水解酶與所述底物形成比在所 述相應的野生型水解酶和所述底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且位于在所 述相應的野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水 分子裂解在所述相應的野生型水解酶和所述底物之間形成的鍵，或位于在 所述相應的野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基處，且其中第二個取代位于與SEQ ID NO:l中位置5, 11， 20， 30， 32， 47， 58, 60， 65, 78， 80， 87， 88， 94， 109， 113， 117， 118， 124， 128, 134， 136， 150， 151， 155， 157， 160, 167, 172， 187， 195, 204, 221, 224, 227， 231, 250, 256， 257， 263, 264, 277, 282, 291或292相對應的位置處；和b)檢測或確定所述官能團的存在或量，由此檢測或確定所述突變水解 酶的存在或量。
14. 用于標記細胞的方法，其包括a) 使具有包括突變水解酶的細胞的樣品與包括一個或多個官能團的水 解酶底物相接觸，其中所述突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至 少2個氨基酸取代，其中一個氨基酸取代導致所述突變水解酶與所述底物 形成比在所述相應的野生型水解酶和所述底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵， 且所述取代位于在所述相應的野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基 酸殘基處，所述活化水分子裂解在所述相應的野生型水解酶和所述底物之 間形成的鍵，或位于在所述相應的野生型水解酶中與所述底物形成酯中間 體的氨基酸殘基處，且其中第二個取代位于與SEQ ID NO:l中位置5， 11， 20, 30， 32, 47, 58, 60， 65, 78, 80, 87, 88， 94, 109, 113, 117, 118， 124, 128, 134， 136, 150, 151， 155， 157, 160, 167， 172， 187, 195， 204, 221， 224， 227， 231， 250, 256, 257, 263， 264, 277, 282， 291或292相對應的位置處；和b) 檢測或確定所述樣品中所述官能團的存在或量。
15. 權利要求14的方法，其中所述細胞是細菌細胞。
16. 權利要求14的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
17. 權利要求13或14的方法，其中所述突變水解酶與目的蛋白融合。
18. 權利要求13或14的方法，其中所述突變水解酶與目的分子融合。
19. 分離目的蛋白的方法，其包括a)提供包括一種或多種融合蛋白的樣品，其中至少一種融合蛋白包括 突變水解酶和目的蛋白，并且提供包括一種或多種水解酶底物的固體支持 物，其中所述突變水解酶相對于相應的野生型水解酶包括至少2個氨基酸 取代，其中一個氨基酸取代導致所述突變水解酶與所述底物形成比所述相 應的野生型水解酶和所述底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵，且所述取代位于 在所述相應的野生型水解酶中與活化水分子有關的氨基酸殘基處，所述活化水分子裂解所述相應的野生型水解酶和所述底物之間形成的鍵，或位于 在所述相應的野生型水解酶中與所述底物形成酯中間體的氨基酸殘基處，且其中第二個取代位于與SEQ ID NO:l中位置5, 11, 20， 30, 32， 47， 58， 60， 65, 78， 80, 87, 88， 94, 109, 113, 117, 118， 124, 128， 134, 136, 150， 151， 155, 157， 160, 167， 172, 187, 195， 204, 221， 224, 227， 231, 250, 256, 257， 263， 264, 277， 282， 291或292相對應的位置處；和b)使所述樣品與所述固體支持物相接觸，從而分離所述目的蛋白。
20. 權利要求19的方法，其中所述目的蛋白與目的分子結合。
21. 權利要求20的方法，其中所述目的分子是分離的。
22. 權利要求13-18中任一項的方法，其中所述突變水解酶是突變脫 鹵素酶，且其中所述底物是式(I)的化合物R-連接體-A-X，其中所述連 接體是包括2-30個碳原子的分支的或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一 個或多個雙鍵或三鍵，且所述鏈任選地被一個或多個羥基或氧代(=0)基 團取代，其中所述鏈中的一個或多個碳原子任選地被非-過氧化物-O-， -S-或-NH-替換，其中所述連接體-A通過所述碳鏈中的至少11個原子分開R 和X,其中A-X是脫鹵素酶的底物，其中A是(CH2)n且n^2-10,其中X 是鹵氣R-連接體-A-X，且其中R是一個或多個官能團。
23. 權利要求22的方法，其中R包括光學檢測分子。
24. 權利要求23的方法，取自R包括熒光團或生物素。
25. 權利要求19-21中任一項的方法，其中所述底物是式(I)的化合 物固體支持物-連接體-A-X，其中所述連接體是包括2-30個碳原子的分 支的或不分支的碳鏈，所述鏈任選地包括一個或多個雙鍵或三鍵，且所述 鏈任選地被一個或多個羥基或氧代(=0)基團取代，其中所述鏈中的一個或 多個碳原子任選地被非-過氧化物-O-, -S-或-NH-替換，其中所述連接體 -A通過所述碳鏈中的至少11個原子分開R和X,其中A-X是脫鹵素酶的 底物，其中A是(CH2)n且n:2-10,其中X是鹵素，R-連接體-A-X。
26. 權利要求25的方法，其中所述固體支持物是磁性粒子、瓊脂糖珠、 纖維素珠、載玻片、或多孔板的孔。
27. 權利要求22-26中任一項的方法，其中所述鏈中一個或多個碳原 子被芳基或雜芳基環(huán)替換。
28. 權利要求22-27中任一項的方法，其中X是氯或溴。
29. 權利要求13-28中任一項的方法，其中所述突變水解酶具有位于 與SEQIDNO:l中位置5, 11， 20， 30， 32, 58, 60, 65,78, 80, 87,94, 109, 113， 117， 118, 124, 134, 136， 150, 151, 155, 157, 172, 187， 204, 221, 224， 227, 231， 250， 256， 263， 277, 282， 291，或292相對應的位置處的多個取代。
30. 權利要求29的方法，其中所述突變水解酶還包括位于與SEQ ID NO:l中位置175, 176或273相對應的位置處的一個或多個取代。
31.權利要求13-30中任一項的方法，其中所述突變水解酶與所述相 應的野生型水解酶具有至少80%的氨基酸序列同一性。
32. 權利要求13-31中任一項的方法，其中所述突變水解酶具有位于 與紫紅紅球菌脫卣素酶的氨基酸殘基272相對應的位置處的至少一個取 代。
33. 權利要求32的方法，其中位于與氨基酸殘基272相對應的位置處 的取代的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。
34. 權利要求13-33中任一項的方法，其中所述突變水解酶還包括位 于位置273處的取代。
35. 編碼權利要求1-12中任一項的第一突變脫鹵素酶的多核苷酸。
36. 編碼包括權利要求1-12中任一項的第一突變脫鹵素酶和非脫鹵素 酶多肽的融合多肽的多核苷酸。
37. 權利要求36的多核苷酸，其中所述融合體在所述第一突變脫鹵素 酶和非脫鹵素酶多肽之間包括具有蛋白酶識別序列的連接體序列。
38.權利要求37的多核苷酸，其中所述第一突變脫卣素酶在所述非脫 鹵素酶多肽的C-端。
39.權利要求37的多核苷酸，其中所述連接體序列包括
40. 具有權利要求35-39中任一項的多核苷酸的宿主細胞。
41. 包括編碼EPTTEDLYFQS/C (SEQ ID NO:31)的核苷酸序列的多核 苷酸。
42. 權利要求41的多核苷酸，其中所述核苷酸序列還編碼與 EPTTEDLYFQS/C (SEQ ID NO:31)融合的多肽。
43.權利要求41的多核苷酸，其中所述核苷酸序列還編碼與EPTTEDLYFQSDN (SEQ ID NO:51)融合的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供具有增強的動力學和功能性表達的突變水解酶蛋白，以及編碼該突變蛋白的多核苷酸，和使用所述多核苷酸和不同蛋白質的方法。
文檔編號C12Q1/34GK101595215SQ200780048962
公開日2009年12月2日 申請日期2007年10月30日 優(yōu)先權日2006年10月30日
發(fā)明者保羅·奧托, 克里斯·齊默曼, 蘭斯·P·昂塞爾, 凱特·欽·趙, 基思·V·伍德, 格季米納斯·維杜基里斯, 莫妮卡·G·伍德, 邁克爾·R·斯蘭特爾, 阿爾迪斯·達爾津斯, 雷切爾·弗西德曼·瓦納 申請人:普羅梅加公司