專利名稱：：作為治療性干預(yù)靶標(biāo)的miR-21調(diào)節(jié)的基因和途徑的制作方法作為治療性干預(yù)靶標(biāo)的miR-21調(diào)節(jié)的基因和途徑
背景技術(shù)：
：I.:汰術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更加具體而言，本發(fā)明涉及用于治療受miR-21小RNA、小RNA表達(dá)以及受此直接和間接調(diào)節(jié)的基因和細(xì)胞途徑影響的疾病或爿大況的方法。II.
背景技術(shù)：
：在2001年，幾個(gè)小組使用克隆方法從秀麗隱桿線蟲(C.e/eg朋5)、果蠅和人中分離和鑒定了一大群"小RNA"(miRNA)(Lagos-Qmntana等，2001;Lau等'2001;Lee和Ambrmbros，2001)。已經(jīng)在植物和包括人在內(nèi)的動(dòng)物中鑒定出幾百種miRNA，它們似乎不具有內(nèi)源siRNA。因此，雖然miRNA與siRNA類似，<旦是miRNA是不同的。迄今觀察到的miRNA長(zhǎng)度有大約21-22個(gè)核苷酸，并且它們來源于從非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄的更長(zhǎng)的前體。參見綜述Carrington等(2003)。前體形成在自身互補(bǔ)區(qū)折回的結(jié)構(gòu)；然后它們被核酸酶切酶(在動(dòng)物中)或DCL1(在植物中)力口工產(chǎn)生短的雙鏈miRNA。miRNA鏈之一摻入稱作RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的蛋白質(zhì)和miRNA的復(fù)合體中。miRNA指引RISC復(fù)合體靶向至靶mRNA，然后依賴于miRNA與其mRNA的序列互補(bǔ)程度將其斷裂或者發(fā)生翻譯沉默。當(dāng)前，據(jù)信完全或近乎完全的互補(bǔ)性導(dǎo)致mRNA降解，這如在植物中最普遍觀察到的那樣。相反，如主要在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的那樣，不完全的堿基配對(duì)導(dǎo)致翻譯沉默。然而，最近的資料表明了額外復(fù)雜性(Bagga等，2005;Lim等，2005),并且miRNA導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制仍處于緊張研究中。最近研究已經(jīng)表明，眾多miRNA的表達(dá)水平與各種癌癥相關(guān)(在Esquela-Kerscher和Slack,2006;Calin和Croce,2006中綜述)。也已經(jīng)表明miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞與組織分化，這些是癌癥發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞過程。發(fā)明人先前證明，hsa-miR-21參與眾多細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)，這些細(xì)胞活性代表著癌癥治療和其他疾病和紊亂治療的介入點(diǎn)(2005年5月31日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/141,707和2005年11月14日提出的序列號(hào)11/273,640)。Hsa-miR-21在許多腫瘤樣品中(包括肺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、膀胱腫瘤和甲狀腺肺瘤)的表達(dá)高于同一患者正常細(xì)胞中的表達(dá)，并且在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者白血細(xì)胞中的表達(dá)高于正?；颊甙籽?xì)胞中的表達(dá)。Hsa-miR-21激活編碼端粒酶催化結(jié)構(gòu)域的hTert基因。超過90%的人癌癥樣品具有活化的端粒酶(在Dong等，2005中綜述)。發(fā)明人還已經(jīng)觀察到，miR-21表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂有影響，減少細(xì)胞周期中Gl期皮膚細(xì)胞(BJ細(xì)胞)百分?jǐn)?shù)并增加G2/M期BJ細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)顯著增加。有趣的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21降低前列腺癌細(xì)胞(22Rvl)的細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Hsa-miR-21在狼瘡患者細(xì)胞樣品中的表達(dá)水平比正常患者細(xì)胞中的表達(dá)水平高。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE，狼瘡)是慢性炎癥性自身免疫病，最終導(dǎo)致免疫復(fù)合物介導(dǎo)的末端器官衰竭。相反，miR-21在從多發(fā)性硬化(MS)患者分離的腦細(xì)胞中的表達(dá)低于從正?；颊叻蛛x的細(xì)胞中的表達(dá)。其他人隨后報(bào)道了miR-21在人乳腺胂瘤、結(jié)腸腫瘤、肺腫瘤、胰腫瘤、前列腺肺瘤和胃肺瘤(Volima等，2006)、人腦腫瘤(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)(Ciafre等，2005;Chan等，2005)和惡性人膽管細(xì)胞(Meng等，2006)中提高表達(dá)。治療性介入以調(diào)節(jié)hsa-miR-2〗所改變基因和基因途徑的表達(dá)可有效治療hsa-miR-21相關(guān)的癌癥、狼癡、MS和其他疾病。生物信息學(xué)分析表明，任何特定miRNA可結(jié)合并改變多達(dá)幾百個(gè)不同基因的表達(dá)。此外，一個(gè)基因可以一皮幾個(gè)imRNA調(diào)節(jié)。因此，每一miRNA可調(diào)節(jié)基因、基因途徑和基因網(wǎng)絡(luò)間的復(fù)雜相互作用。這種牽涉miRNA的調(diào)節(jié)途徑和網(wǎng)絡(luò)的誤調(diào)節(jié)或改變有可能促成紊亂和疾病，如癌癥的發(fā)展。雖然生物信息學(xué)工具有助于預(yù)測(cè)miRNA結(jié)合把，但它有局限性。因?yàn)閙iRNA與其靶結(jié)合位點(diǎn)的不完全互補(bǔ)性，僅使用生物信息學(xué)工具很難精確預(yù)測(cè)miRNA的mRNA靶。此外，miRNA與靶基因之間的復(fù)雜交互調(diào)節(jié)網(wǎng)路使得很難精確預(yù)測(cè)哪些基因?qū)嶋H上響應(yīng)特定miRNA而被:溪調(diào)節(jié)。通過操縱miRNA表達(dá)或者通過修復(fù)miRNA誤調(diào)節(jié)校正基因表達(dá)錯(cuò)誤代表著不務(wù)復(fù)遺傳病和治療疾病，如癌癥的有前景的方法。如上所述，當(dāng)前該方法的殘缺是任何特定miRNA所影響的調(diào)節(jié)途徑和網(wǎng)絡(luò)的細(xì)節(jié)仍然大部分未知。除了PTEN之夕卜，癌細(xì)胞中被miR-21調(diào)節(jié)的基因、基因途徑和基因網(wǎng)路仍然大部分未知。當(dāng)前，這代表著對(duì)miR-21可能在其中起作用的癌癥治療的重要限制。需要鑒定hsa-miR-21表達(dá)所調(diào)節(jié)的或者調(diào)節(jié)hsa-miR-21表達(dá)的基因、基因途徑和基因網(wǎng)絡(luò)。
發(fā)明內(nèi)容通過鑒定miR-21介導(dǎo)改變另外的基因的表達(dá)之后miR-21調(diào)節(jié)的直接靶標(biāo)基因或者調(diào)節(jié)的間接或下游靶標(biāo)基因，本發(fā)明提供額外的組合物和方法。此外，發(fā)明描述了被miR-21及其家族成員影響的基因、疾病和/或生理途徑和網(wǎng)絡(luò)。在某些方面，本發(fā)明組合物向患有、懷疑患有或者有危險(xiǎn)發(fā)展成代謝性、免疫性、傳染性、心血管、消化性、內(nèi)分泌、眼、泌尿生殖、血液、肌肉骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、先天性、呼吸、皮膚或癌性疾病或狀況的受試者施用。在特定方面，可以基于一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或niRNA表達(dá)和/或異常表達(dá)選擇用于治療的受試者或者患者。在進(jìn)一步的方面中，可以基于一個(gè)或一個(gè)以上生物或生理途徑的異常，包括與途徑相關(guān)的一個(gè)或一個(gè)以上基因的異常表達(dá)、或者與途徑相關(guān)的一個(gè)或一個(gè)以上基因所編碼一個(gè)或一個(gè)以上蛋白質(zhì)的異常表達(dá)選擇用于治療的受試者或者患者。在仍進(jìn)一步的方面中，可以基于mi'RNA表達(dá)或生物或生理途徑異常選擇受試者或者患者。可以基于對(duì)miRNA或mRNA表達(dá)或其缺乏的評(píng)定和/或分析，評(píng)估受試者對(duì)治療或者治療方案的敏感性、抗性和/或有效性?？梢栽谙蚴茉囌呋蛘呋颊呤┯靡环N治療之前、之中或之后評(píng)估受試者對(duì)該治療的可治療性。有代表性地，評(píng)定或評(píng)估可以通過分析miRNA和/或mRNA聯(lián)合其他評(píng)估方法，包括但不限于組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、血液學(xué)工作等開展。在一些實(shí)施方案中，傳染性疾病或狀況包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌感染。這些基因和途徑中多數(shù)與多種癌癥和其他疾病相關(guān)。癌性狀況包括，但不限于其中對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上基因的調(diào)節(jié)足以引起治療反應(yīng)的星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌。有代表性地，癌性狀況是與不受控生長(zhǎng)或不經(jīng)歷細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞凋亡相關(guān)的異常高增生性狀況。本發(fā)明通過鑒定hsa-miR-21調(diào)節(jié)的直接靶標(biāo)基因或者lisa-miR-21介導(dǎo)改變8上游基因表達(dá)之后所調(diào)節(jié)的下游靶標(biāo)基因，克服了本領(lǐng)域的這些問題。此外，本發(fā)明描述了生物學(xué)樣品中受hsa-miR-21表達(dá)影響的基因途徑和網(wǎng)絡(luò)。這些基因和途徑中多數(shù)與多種癌癥和其他疾病相關(guān)。改變細(xì)胞中miR-21的表達(dá)或功能將導(dǎo)致這些關(guān)鍵基因表達(dá)的改變并促成了疾病的發(fā)展。向疾病細(xì)胞或者組織中引入miR-21(用于其中miRNA被下調(diào)的疾病)或miR-21抑制劑(用于其中miRNA被上調(diào)的疾病)將產(chǎn)生治療反應(yīng)。本文提供了對(duì)受miR-21直接或間接調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因和與其相關(guān)的疾病的鑒定。在某些方面，細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞或黏膜細(xì)胞。細(xì)胞可以是，但不限于腦細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血液細(xì)胞、食管細(xì)胞、肺細(xì)胞、心血管細(xì)胞、肝細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、骨細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、腺細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、胰細(xì)胞、胃細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、脾細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌或橫紋肌細(xì)胞。在某些方面，細(xì)胞、組織或耙標(biāo)不應(yīng)是miRNA表達(dá)缺陷性的，然而可以仍然治療性響應(yīng)miRNA表達(dá)或過表達(dá)。miR-21可以用作任何這些疾病的治療靶標(biāo)。在某些實(shí)施方案中，miR-21抑制劑用于降低受試者、器官、組織或細(xì)胞中的miR-21活性。細(xì)胞、組織或者受試者可以是癌癥細(xì)胞、癌性組織、潛伏癌性組織，或者可以是診斷患有或者有危險(xiǎn)發(fā)展成疾病或狀況的受試者或者患者。在某些方面，癌癥細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、膀胱細(xì)月包、血液細(xì)胞、白血病細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、胃細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、宮頸細(xì)胞、食管細(xì)胞、胰細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、腎細(xì)胞或曱狀腺細(xì)胞。在仍進(jìn)一步的方面中，癌癥包括，但不限于星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌。本發(fā)明實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織或受試者中基因表達(dá)或生物或生理途徑的方法，包括向細(xì)胞、組織或者受試者施用一定量分離的核酸或其模擬物，所述一定量分離的核酸或其模擬物包含足以調(diào)節(jié)受miR-21miRNA正向或負(fù)向調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的miR-21或miR-21抑制劑核酸序列。"miR-21核酸序列"或"miR-21抑制劑"包括miR-21全長(zhǎng)前體或其互補(bǔ)物以及相關(guān)序列，包括hsa-miR-21(MIMAT0000076，SEQIDN0:1)、miR-21(MIMAT0002325，SEQIDN0:2)、bta-miR-21(MIMAT0003528，SEQIDN0:3)、bta-miR-21*(MIMAT0003745，SEQIDN0:4)、dre-miR-21(MIMAT0001787,SEQIDNO:5)、fm-miR-21(MIMAT0002999，SEQIDNO:6)、gga-miR-21(MIMAT0003774，SEQIDN0:7)、ggo-miR-21(MIMAT0002322,SEQIDN0:8)、mdo-miR-21(MIMAT0004091，SEQIDNO:9)、mml-miR-21(MIMAT0002320,SEQIDNO:10)、mmu-miR-21(MIMAT0000530，SEQIDNO:11)、mne-miR-21(MIMAT0002324,SEQIDNO:12)、ppa-miR-21(MIMAT0002326,SEQIDNO:13)、ppy-miR-21(MIMAT0002323，SEQIDNO:14)、ptr-miR-2](MIMAT0002321,SEQIDNO:15)、rno-miR-21(MIMAT0000790,SEQIDNO:16)、ssc-miR-21(MIMAT0002165，SEQIDNO:17)、tm-miR-21(MIMAT0003000，SEQ1DN0:18)、hsa-mir-21(MI0000077，SEQIDNO:19)、age-mir-21(MI0002626,SEQIDNO:20)、bta誦mir畫21(MI0004742,SEQIDN0:21)、dre-mir-21-1(MI0001908,SEQIDNO:22)、dre隱mir陽21-2(MI0001909,SEQIDNO:23)、fru-mir-21(MI0003325,SEQIDNO:24)、gga-mir-21(MI0004994,SEQIDNO:25)、ggo-證-21(MT0002623,SEQTDNO:26)、mdo-mir-21(M訓(xùn)05275，SEQIDNO:27)、mml-mir-21(M誦2621，SEQIDNO:28)、mmu-mir-21(MI0000569,SEQIDNO:29)、mne-mir-21(MI0002625,SEQIDNO:30)、ppa-mir-21(MI0002627,SEQIDNO:31)、ppy-mir-21(MI0002624,SEQIDNO:32)、ptr-mir-21(MI0002622，SEQIDNO:33)、rno-mir-21(M10000850,SEQIDNO:34)、ssc-mir-21(MI0002459,SEQIDNO:35)、tni-mir-21(MI0003326,SEQIDNO:36)或其互補(bǔ)物，以及前體miRNA或其加工序列，或其互補(bǔ)物的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或更多個(gè)核苷酸，包括所有范圍和它們之間的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，rm'R-21核酸序列或miR-21抑制劑包含全長(zhǎng)的加工miRNA序列或其互補(bǔ)物，并且被稱作"miR-21全長(zhǎng)加工核酸序列"或"miR-2]全長(zhǎng)加工抑制劑序列"。在仍進(jìn)一步的方面中，miR-21核酸包含與SEQIDNO:l至SEQIDNO:36至少75、80、85、90、95、98、99或100%同源性的miR-21的至少一個(gè)5、6、7、8、9、10、11、]2、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、232、24、25、50核苷酸(包括它們之間的所有范圍和整數(shù))片段或互補(bǔ)片段。在某些方面，會(huì)使用包括一些但并非全部所列miR-21家族成員的miRNA亞組。應(yīng)該考慮到10一個(gè)或一個(gè)以上miR-21家族成員或miR-21miRNA會(huì)明確排除在本發(fā)明某些實(shí)施方案之外。通用術(shù)語miR-21包括miR-21家族所有成員。在特別的實(shí)施方案中，包含miR-21或miR-2J抑制劑的核酸是hsa-miR-21或hsa-miR-21抑制劑或其變體。在進(jìn)一步的方面中，miR-21核酸或miR-21抑制劑可以與l、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)miRNA或miRNA抑制劑一起施用。miRNA或其互補(bǔ)物可以并行施用、順序施用或者以安排的進(jìn)程施用。在某些方面，miR-21或miR-21抑制劑可以與let-7、miR-15a、miR-16、miR-20、miR陽26a、miR-31、miR畫34a、miR-126、miR畫143、miR-145、miR-147、miR畫188、miR-200b、miR-200c、miR-215、miR陽216、miR-292-3p和/或miR-331中一個(gè)或一個(gè)以上聯(lián)合施用。miRNA或其抑制劑的全部或組合可以在單一制劑中施用。施用可以在第二治療法之前、之中或之后。miR-21核酸或其互補(bǔ)物還可以包括多個(gè)異源核酸序列，即不是典型性天然有效連接至miR-21的那些序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。miR-21核酸是重組核酸，并且可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸。重組核酸可包含miR-21或miR-21抑制劑表達(dá)盒，即當(dāng)導(dǎo)入包含核酸合成成分的環(huán)境中時(shí)表達(dá)核酸的核酸片段。在進(jìn)一步的方面中，表達(dá)盒包含在病毒、或質(zhì)粒DNA載體或其他治療性核酸載體或遞送運(yùn)載體，包括脂質(zhì)體等等之中。在某些方面，病毒載體可以以lx102、x103、lx104、lx105、lx106、lx107、lx108、〗x109、x010、lx1011、lx1012、lx1013、lxlO"pfu或病毒顆粒(vp)施用。在特定方面中，miR-21核酸或miR-21抑制劑是合成的核酸。此外，本發(fā)明核酸可以是完全合成或部分合成。在仍進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明核酸或編碼其的DNA可以以0.001、0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、100、200、400、600、800、1000、2000至4000pg或mg施用，包括它們之間的所有數(shù)值和范圍。在仍然進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明核酸，包括合成的核酸，可以以0.001、0.01、0.、1、10、20、30、40、50、100至200(ig或mg每千克(kg)體重施用。其中所述的每一種量可以在一段時(shí)間內(nèi)施用，包括0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘、小時(shí)、天、周、月或年，包括它們之間的所有數(shù)值和范圍。在某些實(shí)施方案中，組合物的施用可以是腸內(nèi)的或腸胃外的。在某些方面，腸內(nèi)施用是口服。在更多方面中，腸胃外施用是病變部?jī)?nèi)、血管內(nèi)、顱內(nèi)、胸膜內(nèi)、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、淋巴內(nèi)、腺內(nèi)、皮下、局部、支氣管內(nèi)、氣管內(nèi)、入病變部?jī)?nèi)。在某些方面，受調(diào)節(jié)的一個(gè)基因或多個(gè)基因包含表1、3、4和/或5中鑒定的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200或更多個(gè)基因或基因組合。在仍進(jìn)一步的方面中，受調(diào)節(jié)的一個(gè)基因或多個(gè)基因可排除表]、3、4和5中鑒定的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、175或更多個(gè)基因或基因組合。調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織或器官中的轉(zhuǎn)錄、mRNA水平、mRNA翻譯和/或蛋白質(zhì)水平。在某些方面，基因表達(dá)或基因產(chǎn)物水平，例如mRNA,被下調(diào)或上調(diào)。在特定方面中，被調(diào)節(jié)的基因包含或選自(并且可能甚至排除)表l、3、4和/或5中鑒定的l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28個(gè)或全部的基因或其任意組合。在某些實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的或者選擇待調(diào)節(jié)的基因來自表l。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的或者選擇待調(diào)節(jié)的基因來自表3。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的或者選擇待調(diào)節(jié)的基因來自表4。在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的或者選擇待調(diào)節(jié)的基因來自表5。本發(fā)明實(shí)施方案還可以包括，在選擇治療模式，例如施用miR-21核酸、miR-21抑制劑或其模擬物之前，得到或評(píng)估靶細(xì)胞的基因表達(dá)譜或miRNA譜。與通過登錄號(hào)或者數(shù)據(jù)庫提交號(hào)所指定核酸和基因有關(guān)的數(shù)據(jù)庫內(nèi)容從本申請(qǐng)的提交日起通過參考并入本文。在本發(fā)明的某些方面，一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或miRNA抑制劑可以調(diào)節(jié)單一基因。在進(jìn)一步的方面中，在一個(gè)或一個(gè)以上遺傳途徑、細(xì)胞途徑或生理途徑中的一個(gè)或一個(gè)以上基因可以被一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或其互補(bǔ)物，包括與其他miRNA組合的miR-21核酸和miR-21抑制劑調(diào)節(jié)。表1.用前體-miRhsa-miR-21轉(zhuǎn)染人癌癥細(xì)胞后增加表達(dá)(正值)或降低表達(dá)(負(fù)值)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞途徑的方法，包括向細(xì)胞施用分離的核酸，所述分離的核酸包含足以調(diào)節(jié)細(xì)胞途徑，特別是表2所述那些途徑或者已知包括表l、3、4和Z或5中一個(gè)或一個(gè)以上基因的途徑的表達(dá)、功能、狀況或狀態(tài)的數(shù)量的miR-21核酸序列或miR-21抑制劑。細(xì)胞途徑的調(diào)節(jié)包括，但不限于調(diào)節(jié)一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)?；蛘{(diào)節(jié)可包括抑制內(nèi)源miRNA的功能或者向細(xì)胞、組織或者受試者提供功能性miRNA。調(diào)節(jié)指基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物(例如mRNA)或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或活性，例如mRNA水平可以被調(diào)節(jié)，或者mRNA翻譯可以被調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)可以增加或者上調(diào)基因或基因產(chǎn)物，或者其可以降低或下調(diào)基因或基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)水平或活性)。仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案包括施用miRNA或其模擬物和/或治療患有、懷疑患有或者有危險(xiǎn)發(fā)展成病理狀況的受試者或者患者的方法，包括下列一個(gè)或一個(gè)以上步驟(a)向患者或受試者施用一定量的分離的核酸，所述一定量的分離的核酸包含足以調(diào)節(jié)細(xì)胞途徑表達(dá)的量的miR-21核酸序列或miR-21抑制劑；和(b)施用第二治療法，其中細(xì)胞途徑的調(diào)節(jié)使患者或受試者對(duì)第二治療法敏感或者提高第二治療法的有效性。有效性提高可以包括降低第二治療法的毒性、劑量或持續(xù)時(shí)間，或者有累加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞途徑可包括，但不限于下表2中所述的一個(gè)或一個(gè)以上途徑，或者已知包括表l、3、4和/或5中一個(gè)或一個(gè)以上基因的途徑。第二治療法可以在分離的核酸或miRNA或抑制劑施用之前、之中和/或之后施用。第二治療法可以包括施用第二miRNA或治療性核酸，例如siRNA或反義寡核苷酸，或可以包括多種標(biāo)準(zhǔn)治療法，例如藥物、化學(xué)治療、放射治療、藥物治療、免疫治療等。本發(fā)明實(shí)施方案還可以包括確定或評(píng)估基因表達(dá)或基因表達(dá)譜，用于選^^適當(dāng)治療法。在特定方面中，第二治療法是化學(xué)治療?；瘜W(xué)治療可包括，但不限于紫杉醇、順鉑、碳鉑、阿霉素、草酸鉑、larotaxel、紅豆杉醇、拉帕替尼、多西他塞、甲氨蝶呤、卡培他濱、長(zhǎng)春瑞濱、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、氨柔比星、阿糖胞苷、依托泊苷、喜樹堿、地塞米松、達(dá)沙替尼、替吡法尼、貝伐單抗、西羅莫司、西羅莫司脂化物、依維莫司、洛那法尼、西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、甲磺酸伊馬替尼、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、洛可達(dá)唑、索拉非尼、舒尼替尼、硼替佐米、阿侖單抗、吉妥單抗、托西莫單抗或替伊莫單抗。本發(fā)明實(shí)施方案包括治療患有疾病或狀況的受試者的方法，包括下列一個(gè)或一個(gè)以上步驟(a)確定選自表1、3、4和/或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)譜；(b)基于表達(dá)譜評(píng)估受試者對(duì)治療法的敏感性；(c)基于所評(píng)估的敏感性選擇治療法；和(d)使用所選擇的治療法治療受試者。有代表性地，疾病或狀況將具有作為成分的指示物，或者出現(xiàn)表l、3、4和/或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因的誤調(diào)節(jié)。在某些方面，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)miRNA可以順序使用或者組合使用。例如，可以基于觀察兩個(gè)給定miRNA共享在特定疾病或狀況中被改變的、表l,2,4和/或5所列一組靶基因或途徑，選擇miR-21或miR-21抑制劑與另一miRNA或抑制劑的任意組合。該兩個(gè)miRNA可以導(dǎo)致治療改善(例如毒性降低、效果更大、延長(zhǎng)緩解時(shí)間或者受試者狀況的其他改善)、效果增強(qiáng)、出現(xiàn)提供額外或改善治療反應(yīng)的累加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。不希望被任何特定理論所束縛，兩個(gè)miRNA的協(xié)同作用是更有效地調(diào)節(jié)同一基因或相關(guān)基因(通過共同的途徑或生物學(xué)最終結(jié)果關(guān)聯(lián))的結(jié)果(例如源于同一靶標(biāo)或相關(guān)靶標(biāo)上不同的結(jié)合位點(diǎn))和/或調(diào)節(jié)不同基因的結(jié)果，但是在疾病或狀況中已經(jīng)涉及所有這些。在某些方面，miR-21或miR-21抑制劑和let-7可以向患有急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、黑素瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卯巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌或尿路上皮癌的患者施用。進(jìn)一步的方面包括向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-15。在仍進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-16。本發(fā)明方面包括向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌或頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-20的方法。在仍進(jìn)一步的方面中，向患有急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、白血病、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卯巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌或前列腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-26a。在仍然進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、曱狀腺癌或尿路上皮癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-34a。在某些方面，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卯巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或曱狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-126。在進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-2:l抑制劑和miR-143。在仍進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或曱狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-147。仍然在另一方面，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、白血病、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-188。在更多方面，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌或尿路上皮癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-215。在某些方面，向患有星細(xì)胞瘤、乳腺癌，宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、前列腺癌或頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-216。在進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌或尿路上皮癌的患者施用miR-21或miR-2]抑制劑和miR-292-3p。在仍進(jìn)一步的方面中，向患有星細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、白血病、黑素瘤、粘液纖維肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-331。在仍然進(jìn)一步的方面中，向患有乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、白血病、脂肪瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或甲狀腺癌的患者施用miR-21或miR-21抑制劑和miR-200b/c。應(yīng)該考慮到當(dāng)miR-21或miR-21抑制劑與一種或一種以上其他miRNA分子組合施用時(shí)，兩種不同miRNA或抑制劑可以同時(shí)施用或者相繼施用。在一些實(shí)施方案中，治療以一種miRNA或抑制劑進(jìn)行，并且在治療l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分鐘、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月或者任意此類組合之后緊接著用其他imRNA或抑制劑治療。更多實(shí)施方案包括鑒定和評(píng)估指示細(xì)胞或組織中miR-21狀態(tài)的表達(dá)譜，包括來自表1、3、4和Z或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因或者其任意組合的表達(dá)評(píng)估。術(shù)語"miRNA"依照其普通的和顯然的含義使用并且指在真核生物中存在的、涉及基于RNA的基因調(diào)節(jié)的小RNA分子。見，例如Carrmgtoii等，2003,其通過參考并入本文。術(shù)語可以指從前體加工而來的單鏈RNA分子或者在某些情況下指其前體本身或者其模擬物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)知道細(xì)胞是否內(nèi)源性表達(dá)特定miRNA或者此種表達(dá)是否在特定情況下受影響或者何時(shí)其處于特定疾病狀態(tài)是有用的。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，方法包括測(cè)定細(xì)胞或者包含細(xì)胞的樣品中指示目的基因表達(dá)水平的一個(gè)或一個(gè)以上miRNA標(biāo)志基因或mRNA或其他分析物的存在。因此，在一些實(shí)施方案中，方法包括產(chǎn)生樣品RNA語的步驟。術(shù)語"RNA譜"或"基因表達(dá)譜"指關(guān)于樣品中一個(gè)或一個(gè)以上基因或遺傳標(biāo)記表達(dá)模式的一組數(shù)據(jù)(例如鑒定來自表l、3、4和/或5的一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)記或基因的多個(gè)核酸探針)；應(yīng)該考慮到核酸語可以使用一組RNA、使用例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的核酸擴(kuò)增或雜交技術(shù)得到?；颊邩悠分械谋磉_(dá)譜與參照表達(dá)語，例如來自正?；蛘叻遣±順悠返谋磉_(dá)譜或者數(shù)字化參照之間的差異指示著病理、疾病或癌性狀況。在某些方面，表達(dá)譜是發(fā)展成此種狀況之傾向或可能性的指示物(即，疾病或狀況的危險(xiǎn)因素)。此種危險(xiǎn)性或傾向性指示著進(jìn)行治療、增加監(jiān)控、預(yù)防措施等等。核酸或探針組可以包含或鑒定相應(yīng)mRNA的片段，并且可以包括表l、3、4和/或5所列的或者通過本文所述方法鑒定的基因或遺傳標(biāo)記或核酸、mRNA或其代表性探針的全部或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、100、200、500或更多個(gè)片段，包括可以從它們當(dāng)中導(dǎo)出的任何整數(shù)或范圍的部分。本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及用于評(píng)估、預(yù)測(cè)或治療患者中病理狀況的組合物和方法，包括測(cè)量或確定患者樣品中一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或標(biāo)記的表達(dá)譜，其中患者樣品的表達(dá)謙與正常樣品的表達(dá)譜或參照表達(dá)譜之間的差異指示著病理狀態(tài)和特定癌癥。在本發(fā)明的某些方面，miRNA、細(xì)胞途徑、基因或遺傳標(biāo)記是或代表著表l、2、3、4和/或5中所述一個(gè)或一個(gè)以上途徑或標(biāo)記，包括它們的任意組合。例如，可以使用方法篩選病理狀況；評(píng)估病理狀況的預(yù)后；將病理狀況分級(jí)；評(píng)估病理狀況對(duì)治療的反應(yīng)；或作為第一治療調(diào)節(jié)一個(gè)基因、多個(gè)基因或相關(guān)途徑的表達(dá)或者使受試者對(duì)第二治療法更敏感或更易反應(yīng)。在特定方面，評(píng)估患者的病理狀況可以評(píng)估患者的預(yù)后。預(yù)后可包括，但不限于估算存活時(shí)間或期望存活時(shí)間，評(píng)估對(duì)治療法的反應(yīng)等。在某些方面，一個(gè)或一個(gè)以上基因或標(biāo)記的改變表達(dá)預(yù)示著患者具有病理狀況，其中標(biāo)記是表l、3、4和/或5中的一個(gè)或一個(gè)以上，包括其任意組合。表2.在人癌細(xì)胞中過表達(dá)hsa-miR-21之后顯著改變的功能性細(xì)胞途徑基因數(shù)量途徑功能13基因表達(dá)，癌癥，細(xì)月包死亡11細(xì)胞裝配和組織，癌癥，免疫性疾病1細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，血液系統(tǒng)發(fā)育和功能11細(xì)胞周期，細(xì)胞發(fā)育，骨格和肌肉系統(tǒng)發(fā)育和功能免疫應(yīng)答，細(xì)胞與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相互作用，血液系統(tǒng)發(fā)育和功能1免疫應(yīng)答，細(xì)胞裝配和組織，基因表達(dá)1心血管疾病，細(xì)胞裝配和組織，結(jié)締組織發(fā)育和功能1心血管系統(tǒng)發(fā)育和功能，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞發(fā)育1癌癥，毛發(fā)和皮膚發(fā)育和功能，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能1氨基酸代謝，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞裝配和組織]細(xì)胞死亡，細(xì)胞與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相互作用，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖1細(xì)胞裝配和組織，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，分子轉(zhuǎn)運(yùn)1細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相互作用，細(xì)胞裝配和組織1分子轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)運(yùn)輸，細(xì)胞與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相互作用1細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分子轉(zhuǎn)運(yùn)，神經(jīng)疾病表3.針對(duì)RefSeqID參考序列■Pmitt等，2005預(yù)測(cè)的hsa隱miR-21靶基因基因符號(hào)RefS叫轉(zhuǎn)錄物ID描述A2BP1畫—145891共濟(jì)失調(diào)蛋白2-結(jié)合蛋白1同種型1AADATNM—016228a-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶ABCA1麗—005502ATP-結(jié)合盒，亞家族A成員1ABCD2畫—005164ATP-結(jié)合盒，亞家族D,成員2ABCD3麗—002858ATP-結(jié)合盒，亞家族D,成員3ABHD4麗一022060含自水解酶結(jié)構(gòu)域4ACATI雨—000019乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1前體ACBD5麗一145698含酰基輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域522<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>預(yù)測(cè)的其mRNA表達(dá)水平受hsa-miR-21影響的hsa-miR-21的基因靶，代表著用于通過控制它們的表達(dá)水平進(jìn)行癌癥治療和其他疾病治療的特別有用的候選物。本發(fā)明某些實(shí)施方案包括通過擴(kuò)增分析、雜交分析或蛋白質(zhì)分析確定一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)記、基因或代表一個(gè)或一個(gè)以上基因的核酸片段的表達(dá)，上述種種方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知。在某些方面，擴(kuò)增分析可以是定量擴(kuò)增分析，例如定量RT-PCR等。在仍進(jìn)一步的方面中，雜交分析可以包括陣列雜交分析或溶液雜交分析。來自樣品的核酸可以從樣品中標(biāo)記和/或?qū)?biāo)記核酸與一個(gè)或一個(gè)以上核酸探針雜交。核酸、mRNA和/或核酸探針可以偶聯(lián)至支持物。此類支持物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的并且包括，但不限于玻璃、塑料、金屬或乳膠。在本發(fā)明的特定方面，支持物可以是平面的或者是珠的形式或者本領(lǐng)域已知的其他幾何形狀或構(gòu)型。蛋白質(zhì)有代表性地通過免疫印跡、層析或質(zhì)譜分析法或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他方法分析。本發(fā)明還應(yīng)該考慮到包含本發(fā)明組合物或者借以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的組合物的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以用于評(píng)估一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)記分子和/或表達(dá)一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或miRNA抑制劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包舍、至少包含或至多包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、U、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、100、150、200或更多個(gè)與待評(píng)估標(biāo)記相關(guān)的探針、重組核酸或合成核酸分子或者待表達(dá)或調(diào)節(jié)的miRNA或miRNA抑制劑，并且可以包括從它們導(dǎo)出的任何范圍或組合。試劑盒可以包含可以單獨(dú)包裝的或者置于一個(gè)容器，例如管、瓶、小瓶、注射器或其他適宜容器裝置內(nèi)的成分。單獨(dú)成分還可以濃縮量形式在試劑盒中提供；在一些實(shí)施方案中，成分以與它在含其他成分的溶液中的濃度相同的濃度單獨(dú)提供。成分的濃度可以以lx、2x、5x、10x、20x或更高倍數(shù)提供?？梢宰鳛楸景l(fā)明的部分包含用于使用本發(fā)明探針、合成核酸、重組核酸或非合成核酸開展治療應(yīng)用、預(yù)后應(yīng)用或診斷應(yīng)用的試劑盒。特別考慮的是對(duì)應(yīng)于據(jù)報(bào)導(dǎo)影響本文所述一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)志基因或基因途徑的生物學(xué)活性或表達(dá)的任何miRNA的任何此類分子。在某些方面，陰性和/或陽性對(duì)照包括在一些試劑盒實(shí)施方案中。對(duì)照分子可以用于證實(shí)轉(zhuǎn)染效率和/或控制轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的細(xì)胞變化。某些實(shí)施方案涉及用于通過樣品核酸譜分析評(píng)估患者病理狀況或者發(fā)展成病理狀況危險(xiǎn)的試劑盒，包含在適宜容器裝置中的兩種或者兩種以上核酸雜交或擴(kuò)增試劑。試劑盒可以包含用于標(biāo)記樣品中核酸的試劑和/或核酸雜交試劑。雜交試劑有代表性地包含雜交探針。擴(kuò)增試劑包括，但不限于擴(kuò)增引物、試劑和酵。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，表達(dá)譜通過包括下列的步驟產(chǎn)生(a)標(biāo)記樣品中的核酸；(b)將核酸與諸多探針雜交或擴(kuò)增諸多核酸，和(c)確定和/或定量與探針雜交的核酸或者探測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物，其中表達(dá)譜產(chǎn)生。見美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/575,743和美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/649,584和美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/141,707和美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/273,640,所有這些專利申請(qǐng)通過參考并入本文。本發(fā)明方法包括基于miRNA和/或標(biāo)記核酸表達(dá)譜診斷和/或評(píng)估患者預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞中特定基因或遺傳途徑或核酸組表達(dá)水平較之正常或非病理細(xì)胞或組織樣品中它們的表達(dá)水平提高或降低與疾病狀態(tài)或病理狀況關(guān)聯(lián)。在測(cè)量^C評(píng)估生物學(xué)樣品中一個(gè)或一個(gè)以上核酸表達(dá)水平并與正?；蛘叻遣±砑?xì)胞或組織樣品中的表達(dá)水平相比較時(shí)，該關(guān)聯(lián)使得可以開展診斷和/或預(yù)后方法。特別考慮的是，患者特別是懷疑患有或傾向具有特定疾病或狀況例如癌癥的那些患者的表達(dá)譜可以通過評(píng)估本申請(qǐng)所述任何的或多組的miRNA和/或核酸產(chǎn)生。從患者產(chǎn)生的表達(dá)譜將是提供關(guān)于特定疾病或狀況信息的表達(dá)譜。在許多實(shí)施方案中，使用核酸雜交或擴(kuò)增(例如陣列雜交或RT-PCR)產(chǎn)生表達(dá)譜。在某些方面，表達(dá)譜可以與其他診斷和/或預(yù)后試驗(yàn)，例如組織學(xué)、血清中蛋白質(zhì)譜和/或細(xì)胞遺傳評(píng)估聯(lián)合使用。方法可以進(jìn)一步地包括一個(gè)或一個(gè)以上步驟，包括:(a)從患者得到樣品，(b)從才羊品分離核酸，(c)標(biāo)記從樣品分離的核酸，和(d)將標(biāo)記的核酸與一個(gè)或一個(gè)以上探針雜交。本發(fā)明核酸包括一個(gè)或一個(gè)以上核酸，所述核酸包含至少一個(gè)具有表l、3、4和/或5中一個(gè)或一個(gè)以上基因或標(biāo)記所代表核酸序列或互補(bǔ)序列的片段。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>NF1NF墨1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)G,AC，NF，PCC,ML(Golay等，1996)PBX1PBX-1轉(zhuǎn)錄AIX(Rubin和Gutmann，2005)PDGFRLPDGFR樣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)CRC,NSCLC,HCC,PC(Aspland等，2001)PDPK1PDK-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)BC(Fujiwara等，1995:Komiya等，1997)SMAD3SMAD-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)GC,CRC,HCC，BC,MX(Zeng等，2002;Tseng等，2006;Xie等，2006)SRI抗藥蛋白多藥抗性O(shè)C,BC,AML(Zhu等，1998;Han等，2004;Liu和Matsuura，2005;Yamagata等,2005;Yang等,2006)VAV3Vav3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PC(Parekh等，2002;Tan等，2003)WNT7BWnt--7b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)BC,BldC(Dong等，2006)縮寫:AC,星細(xì)胞瘤；ALL,急性淋巴細(xì)胞白血病；AML，急性髓性白血病BC,乳腺癌；BL,伯基特淋巴瘤；BldC，膀胱癌；CRC，結(jié)腸直腸癌；EC,子宮內(nèi)膜癌；G，神經(jīng)牧質(zhì)瘤；GB,成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；GC,胃癌HCC,肝細(xì)胞癌；M,黑素瘤MCL，套細(xì)胞淋巴瘤ML,髓性白血??；NB,神經(jīng)母細(xì)胞瘤；NF,神經(jīng)纖維瘤NSCLC,非小細(xì)胞肺癌；OC,卵巢癌OepC,食管癌PaC,胰腺癌；PC，前列腺癌；PCC，嗜鉻細(xì)胞瘤；RCC,腎細(xì)胞癌；RMS,橫紋肌肉瘤；SCC麗，頭頸部鱗護(hù)C細(xì)"包癌。方法或組合物實(shí)現(xiàn)，并且不同的實(shí)施方案可以組合。應(yīng)該特別考慮到是，本文所迷的對(duì)于miRNA分子、miRNA、基因和代表基因的核酸的任何方法和組合物可以使用合成核酸實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，合成核酸處于適當(dāng)條件下，以便使其變成加工的或者成熟的核酸，例如生理?xiàng)l件下的miRNA。最初4是交的權(quán)利要求考慮涵蓋多次從屬于任何所提交權(quán)利要求或所提交權(quán)利要求組合的權(quán)利要求。同樣，涉及特異基因(包括其代表性片段)、mRNA或名稱叫作miRNA的本發(fā)明的任何實(shí)施方案還考慮涵蓋涉及其序列與特定miRNA的成熟序列具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、9、92、93、94、95、96、97、98、99%同一性的廳RNA的實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，除非另外指出，采用縮寫符號(hào)時(shí)，對(duì)基因或其標(biāo)記或miRNA的一般描述指任何其基因家族成員(通過數(shù)字區(qū)分)或其代表性片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，"基因家族"指具有相同編碼序列或mi:RNA編碼序列的一組基因。有代表性地，miRNA基因家族的成員通過最初指定名后跟數(shù)字鑒別。例如，miR-16-l和miR-16-2是miR-16基因家族成員，"mir-7"指miR-7-l、nriR-7-2和miR-7-3。此外，除非另外指出，縮寫符號(hào)指相關(guān)miRNA(通過字母區(qū)分)。該縮寫符號(hào)的例外將另外鑒別。在本申請(qǐng)的各處討論本發(fā)明的另外實(shí)施方案。對(duì)于本發(fā)明的一個(gè)方面所討-淪的^壬何實(shí)施方案也適用于本發(fā)明的其他方面并且反之亦然。實(shí)施例和具體實(shí)施方式部分中的實(shí)施方案理解為可適用于本發(fā)明所有方面的本發(fā)明實(shí)施方案。術(shù)語"抑制"、"降低"或"預(yù)防"或者這些術(shù)語的任何變化形式，當(dāng)用于權(quán)利要求書和/或說明書中時(shí)包括達(dá)到期望結(jié)果的任何可測(cè)量的降低或完全抑制。當(dāng)詞"一"或"一"在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語"包含"聯(lián)合使用時(shí)，可能意思是"一個(gè)"，但其還有"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)"和"一個(gè)或一個(gè)以上"的意在該申請(qǐng)的通篇中，術(shù)語"大約"用于指數(shù)值包括對(duì)于用來確定數(shù)值的設(shè)備或方法的誤差一示準(zhǔn)差。雖然此公開支持術(shù)語"或者"指僅備選物和"和/或"，但是在權(quán)利要求書中術(shù)語"或者"用于指"和/或"，除非明確指出是指僅備選物或者備選物相互排斥。如在該說明書和權(quán)利要求書中所使用，詞"包含"(和包含的任何形式，例如"包含"和"包含")、"具有，，(和具有的任何形式，例如"具有"和"具有")、"包括"(和包括的任何形式，例如"包括"和"包括")或者"含有"(和含有的任何形式，例如"含有"和"含有")是包含性的或者開放性的，并且不排除額外的、非描述的元件或方法步驟。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)在詳細(xì)描述之后會(huì)變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳細(xì)描述和特定實(shí)施例僅以例證的方式給出以顯示本發(fā)明特定實(shí)施方案，因?yàn)閺脑撛敿?xì)描述可以看出，處于本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及組合物和方法，所述組合物和方法與如通過所鑒定基因的表達(dá)所代表的鑒定和表征基因和與這些基因相關(guān)的生物學(xué)途徑相關(guān)，并且涉及與此相關(guān)的miRNA用于治療、預(yù)后和診斷應(yīng)用的用途，特別是與評(píng)估和/或鑒定miR-21表達(dá)或其異常表達(dá)直接或間接相關(guān)的病理狀況相關(guān)的那些方法和組合物。在某些方面，本發(fā)明涉及用于對(duì)細(xì)胞或受試者評(píng)估、分析和/或治療的方法，在所述的細(xì)胞或受試者中，因?yàn)槿魏我粋€(gè)或者組合的miR-21家族成員或其抑制劑表達(dá)增加或降低，使得某些基因表達(dá)降低或增加(相對(duì)于正常)。在某些情況下，針對(duì)miR-20表達(dá)或抑制的表達(dá)譜和/或反應(yīng)可以指示疾病或病理狀況，例如癌癥。表征任何一個(gè)或組合的所列miRNA或所列標(biāo)記(包括其代表性核酸)的預(yù)后分析可以用于患者評(píng)估中，以確定如果有治療方案的話，什么治療方案是對(duì)的。與上述的診斷分析一樣，限定低表達(dá)的絕對(duì)值會(huì)依賴于用于測(cè)量miRNA的平臺(tái)。對(duì)于診斷分析所描述的方法同樣可用于預(yù)后分析。I.治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明實(shí)施方案涉及當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)后執(zhí)行內(nèi)源miRNA活性或者抑制內(nèi)源miRNA的核酸。在某些方面，核酸是合成的或非合成的miRNA。序列特異性的miRNA抑制劑可以用于連續(xù)性或組合抑制細(xì)胞內(nèi)一個(gè)或一個(gè)以上內(nèi)源miRNA活性，以及受內(nèi)源miRNA調(diào)節(jié)的那些基因和相關(guān)途徑的活性。本發(fā)明在一些實(shí)施方案中涉及在細(xì)胞中作為miRNA或者miRNA抑制劑起作用的短核酸分子。術(shù)語"短"指15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、100、150個(gè)核智酸或更少的單一多核苷酸長(zhǎng)度，包括可從它們當(dāng)中導(dǎo)出的所有整數(shù)或范圍。核酸分子有代表性地是合成的。術(shù)語"合成的"指非細(xì)胞內(nèi)天然產(chǎn)生的核酸分子。在某些方面，化學(xué)結(jié)構(gòu)偏離天然存在的核酸分子，例如內(nèi)源前體、miRNA或miRNA分子或其互補(bǔ)物。然而在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明部或部分的天然存在序列或其互補(bǔ)物。然而，應(yīng)該考慮到施用至細(xì)胞的合成的龍A^rr，、,rT'右tVtt^irfi;b乂,久/4;A::r々niT，、/工計(jì)iC4"A:Tilt;db入AA^^'工々去、你a又*v>ia/口仁-w/vcjr、j,r》廠i'-入i入又，"jxj"^v-5、"j-Ai,j/j—vi「口"uj、z、""存在的核酸，例如成熟miRNA序列相同。例如，合成的核酸可以具有與前體miRNA序列不同的序列，但是該序列一旦進(jìn)入細(xì)胞可以^皮改變成與內(nèi)源性的、加工了的miRNA或其抑制劑相同的序列。術(shù)語"分離的"意思是指，本發(fā)明核酸分子最初從不同的(依據(jù)序列或結(jié)構(gòu))和不需要的核酸分子分離而來，以致于所分離核酸的群體就其他多核芬酸分子而言是至少大約卯％同源的，并且可以是至少大約95、96、97、98、99或100%同源的。在"i牛多本發(fā)明實(shí)施方案中，核酸是分離的，因?yàn)樗呀?jīng)被體外合成，與細(xì)胞內(nèi)源核酸分離開來。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，分離的核酸可以隨后混合或集合在一起。在某些方面，本發(fā)明的合成miRNA是RNA或RNA類似物。miRNA抑制劑可以是DNA或RNA或其類似物。本發(fā)明的miRNA和miRNA抑制劑總稱為"合成核酸"。在一些實(shí)施方案中，存在具有17和130個(gè)殘基之間長(zhǎng)度的miRNA或合成的miRNA。本發(fā)明涉及長(zhǎng)度是、是至少或者是至多5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43,44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、川、〗12、113、U4、115、116、U7、118119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、140、145150、160、170、180、190、200或更多個(gè)殘基的miRNA或合成miRNA分子，包括它們之間的任何整數(shù)或范圍。在某些實(shí)施方案中，合成miRNA具有(a)"miRNA區(qū)域"，其序列或結(jié)合區(qū)從5'至3，與全部或部分成熟imRNA序列相同或互補(bǔ)，和(b)"互補(bǔ)區(qū)域"，其序列從5，至3，與(a)中miRNA序列具有60%和100%之間的互補(bǔ)性。在某些實(shí)施方案中，這些合成miRNA也是分離的，如上面所定義。術(shù)語"miRNA區(qū)域"指合成miRNA上與成熟的天然存在miRNA序列的全部序列或其互補(bǔ)物具有至少75、80、85、90、95或100°/0同源性的區(qū)域，包括它們之間的全部整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，miRNA區(qū)域與天然存在miRNA的序列或其互補(bǔ)物具有或具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%同源性。術(shù)語"互補(bǔ)區(qū)域"或"互補(bǔ)物"指與成熟的天然存在miRNA序列具有或具有至少60%互補(bǔ)性的核酸或模擬物的區(qū)域?；パa(bǔ)區(qū)域具有或具有至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%互補(bǔ)性或者從其中可導(dǎo)出的任何范圍。在單個(gè)多核苷酸序列內(nèi)，可以具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，這是miRNA區(qū)域和互補(bǔ)區(qū)域之間化學(xué)鍵合的結(jié)果。在其他實(shí)施方案中，互補(bǔ)區(qū)域在與miRNA區(qū)域不同的核酸分子上，在該情況下，互補(bǔ)區(qū)域在互補(bǔ)鏈上而miRNA區(qū)域在活性鏈上。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，存在為miRNA抑制劑的合成核酸。miRNA抑制劑長(zhǎng)度在大約17至25個(gè)核苷酸之間，并且包含與成熟imRNA的5，至3，序列具有至少90%互補(bǔ)性的5'至3'序列。在某些實(shí)施方案中，miRNA抑制劑分子長(zhǎng)度是17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸或者可從它們導(dǎo)出的任何范圍。然而，miRNA抑制劑可以具有與成熟miRNA、特別是成熟的天然存在miRNA的5，至3'序列具有或具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%或可從其導(dǎo)出的任何范圍的互補(bǔ)性的序列(從5'至3，)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用與成熟miRNA序列互補(bǔ)的部分miRNA序列作為miRNA抑制劑序列。然而，該部分核酸序列可以被改變，以致于其與成熟miRNA序列仍然具有適當(dāng)百分?jǐn)?shù)的互補(bǔ)性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，合成的miRNA或抑制劑包含一個(gè)或一個(gè)以上設(shè)計(jì)元件。這些設(shè)計(jì)元件包括，但不限于:(i)對(duì)于互補(bǔ)區(qū)域5'末端核苷酸的磷酸或羥基的取代基；(ii)互補(bǔ)區(qū)域開始或最后1-6個(gè)殘基中一個(gè)或一個(gè)以上糖修飾；或(iii)互補(bǔ)區(qū)域3，端最后1-5個(gè)殘基內(nèi)的一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸與miRNA區(qū)域相應(yīng)核苷酸的非互補(bǔ)性。多種設(shè)計(jì)修飾是本領(lǐng)域眾所周知的，見下文。在某些實(shí)施方案中，合成的miRNA在其互補(bǔ)區(qū)域5'端具有其磷酸和/或羥基已經(jīng)被另一化學(xué)基取代的核芬酸(被稱為"取代設(shè)計(jì)")。在一些情況下，磷酸基被取代，而在另外一些情況下，羥基已經(jīng)被取代。雖然其他取代基為本領(lǐng)域技術(shù).人員眾所周知并且同樣可以-使用，《旦是在特定實(shí)施方案中，耳又代基.是生物素、胺基、低碳烷基胺胺基、乙?；?'0-Me(T氧-甲基)、DMTO(帶氧的4,4'-二甲氧基三苯甲基)、熒光素、巰基或吖啶。該設(shè)計(jì)元件還可以在miRNA抑制劑中使用。另外的實(shí)施方案涉及在互補(bǔ)區(qū)域開始或最后卜6個(gè)殘基中具有一個(gè)或一個(gè)以上糖修飾的合成miRNA(被稱為"糖取代設(shè)計(jì)")。在某些情況下，在互補(bǔ)區(qū)域的開始l、2、3、4、5、6或更多個(gè)殘基或可從其中導(dǎo)出的任何范圍的殘基中存在一個(gè)或一個(gè)以上糖修飾。在另外的情況下，在互補(bǔ)區(qū)域的最后]、2、3、4、5、6或更多個(gè)殘基或可從其中導(dǎo)出的任何范圍殘基內(nèi)存在一個(gè)或一個(gè)以上糖修飾d應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語"開始"和"最后"是對(duì)于區(qū)域的從5，端至3'端的殘基次序而言的。在特定實(shí)施方案中，糖修飾是2，0-Me修飾。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在互補(bǔ)區(qū)域的開始或最后2-4個(gè)殘基內(nèi)或者互補(bǔ)區(qū)域的開始或最后4-6個(gè)殘基內(nèi)存在一個(gè)或一個(gè)以上糖修飾。該設(shè)計(jì)元件還可以在miRNA抑制劑中使用。因此，如上所述，miRNA抑制劑可以在5，末端核苷酸上具有該設(shè)計(jì)元件和/或取代基。本發(fā)明另外的實(shí)施方案，存在其中互補(bǔ)區(qū)域3'端最后1-5個(gè)殘基中一個(gè)或一個(gè)以上核苦酸與miRNA區(qū)域相應(yīng)核普酸不互補(bǔ)的合成miRNA或抑制劑("非互補(bǔ)性")(被稱為"非互補(bǔ)性設(shè)計(jì)，，)。非互補(bǔ)性可以存在于互補(bǔ)miRNA的最后1、2、3、4和/或5個(gè)殘基中。在某些實(shí)施方案中，在互補(bǔ)區(qū)域的至少2個(gè)核苷酸內(nèi)存在非互補(bǔ)性。應(yīng)該考慮到本發(fā)明的合成miRNA具有一個(gè)或一個(gè)以上取代、糖修飾或非互補(bǔ)性設(shè)計(jì)。在某些情況下，合成RNA分子具有它們當(dāng)中的兩種，而在另外一些情況下，這些分子在適當(dāng)位置具有全部三種設(shè)計(jì)。miRNA區(qū)域和互補(bǔ)區(qū)域可以在同一或者分開的多核苷酸上。在miRNA區(qū)域和互補(bǔ)區(qū)域包含在同一多核苷酸之上或之內(nèi)的情況下，miRNA分子將考慮為單一多核苷酸。在不同的區(qū)域位于分開的多核苷酸之上的實(shí)施方案中，合成miRNA將考慮包含在兩個(gè)多核苷酸內(nèi)。當(dāng)RNA分子為單一多核普酸時(shí)，在mi:RNA區(qū)域和互補(bǔ)區(qū)域之間可存在接頭區(qū)。在一些實(shí)施方案中，單一多核苷酸是能夠形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，這是miRNA區(qū)域和互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的結(jié)果。接頭構(gòu)成了發(fā)夾環(huán)。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)該考慮到接頭區(qū)長(zhǎng)度為、為至少或?yàn)橹炼?、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個(gè)殘基或者可從其中導(dǎo)出的任何范圍。在某些實(shí)施方案中，接頭長(zhǎng)度為3和30個(gè)殘基(包含在內(nèi))之間。除了具有miRNA區(qū)或抑制劑區(qū)和互補(bǔ)區(qū)域之外，還可以在區(qū)域的5，端或3，端具有側(cè)翼序列。在一些實(shí)施方案中，在這些區(qū)域的一側(cè)或兩側(cè)存在或存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)核苷酸或更多個(gè)核普酸，或者可從其中導(dǎo)出的任何范圍。本發(fā)明方法包"^降低或消除細(xì)^^內(nèi)一個(gè)或一個(gè)以上miRNA活性，包括向細(xì)胞內(nèi)引入miRNA抑制劑(其在本文一般描述為miRNA,以致于描述miRNA在適當(dāng)?shù)牡胤揭矔?huì)指miRNA抑制劑)；或者提供或增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)一個(gè)或一個(gè)以上miRNA活性。本發(fā)明還涉及通過向細(xì)胞特定核酸，例如特異性合成miRNA分子或合成miRNA抑制劑分子誘導(dǎo)某些細(xì)胞特性。然而，在本發(fā)明方法中，miRNA分子或miRNA抑制劑不必須是合成的。它們可以具有與天然存在imRNA具有同源性的序列或者它們可以不具有任何設(shè)計(jì)修飾。在某些實(shí)施方案中，miRNA分子和Z或miRNA抑制劑是合成的，如上所述。向細(xì)胞提供的特定核酸分子理解為對(duì)應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)的特定miRNA，因此細(xì)胞內(nèi)的miRNA被稱為"對(duì)應(yīng)miRNA"。在指定m!RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)的情況下，對(duì)應(yīng)miRNA將^皮理解為被誘導(dǎo)或抑制的miRNA或者被誘導(dǎo)或抑制的miRNA功能。然而，應(yīng)該考慮到被引入細(xì)胞內(nèi)的miRNA分子不是成熟miRNA,而是能夠在適當(dāng)生理?xiàng)l件下變成成熟miRNA或者充當(dāng)成熟miRNA。在特定的對(duì)應(yīng)miRNA^支miRNA抑制劑抑制的情況下，特定miRNA將被稱為"靶向的miRNA"。應(yīng)該考慮到可以涉及多個(gè)對(duì)應(yīng)miRNA。在特定實(shí)施方案中，一種以上miRNA分子被引入細(xì)胞內(nèi)。然而，在其他實(shí)施方案中，--種以上miRNA抑制劑被引入細(xì)胞內(nèi)。此夕卜，miRNA分子和miRNA抑制劑的組合可以被Sj入細(xì)胞內(nèi)。發(fā)明人應(yīng)該考慮到，miRNA組合可以在異常表型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞途徑中一個(gè)或一個(gè)以上點(diǎn)處起作用，并且此種組合對(duì)把細(xì)胞的有效性增加，而與此同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞沒有不利影響。因此，miRNA組合可以對(duì)受試者或者患者具有最低限度的不利影響，而同時(shí)提供充足的治療作用，例如狀況改善、細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、所靶向細(xì)胞的死亡、細(xì)胞表型或生理學(xué)改變、細(xì)胞生長(zhǎng)放緩、對(duì)第二治療法的敏化、對(duì)特定治療法的敏化等等。方法包括鑒定需要諒、導(dǎo)這些細(xì)胞特性的細(xì)胞或患者。同樣，應(yīng)當(dāng)理解的是，向細(xì)胞或有機(jī)體提供的一定量合成核酸是"冇效量"，其指達(dá)到期望的目標(biāo)，諸如誘導(dǎo)特定細(xì)胞特性所需要的量(或足夠量)。方法的某些實(shí)施方案包括向細(xì)胞提供或引入有效達(dá)到期望的生理學(xué)結(jié)果數(shù)量的對(duì)應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)miRNA的核酸分子。此外，方法可以包括提供合成或非合成miRNA分子。在這些實(shí)施方案中應(yīng)該考慮到，方法可限于或可不限于提供僅僅一個(gè)或一個(gè)以上合成mtRNA分子或者僅僅一個(gè)或一個(gè)以上非合成miRNA分子。因此，在某些實(shí)施方案中，方法可以涉及提供合成miRNA分子和非合成miRNA分子。在該情況下，最有可能向一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞沖是供對(duì)應(yīng)于特定miRNA的合成miRNA分子和對(duì)應(yīng)于不同miRNA的非合成miRNA分子。此外，使用一列miRNA用馬庫什組語言限定的任何方法可以不用馬庫什組語言而用分離性的詞(即，或者)限定，反之亦然。有代表性地，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因、miRNA或mRNA被調(diào)節(jié)。在特定實(shí)施方案中，核酸序列包含至少一個(gè)在核酸序列上與一個(gè)或一個(gè)以上miRNA或基因序列具有至少70、75、80、85、90、95或10()%同源性的片段。表達(dá)的調(diào)節(jié)或者內(nèi)源基因、rm'RNA或mRN八的表達(dá)或加工的調(diào)節(jié)可以貫穿于inRNA加工的調(diào)節(jié)中，此類加工包括細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或翻譯。調(diào)節(jié)還可以通過細(xì)胞、組織或器官內(nèi)miRNA.活性的抑制或增強(qiáng)而實(shí)現(xiàn)。此類加工可影響所編碼產(chǎn)物的表達(dá)或者mRNA的穩(wěn)定性。仍然在其他實(shí)施方案中，核酸序列可包含修飾核酸序列。在某些方面，一個(gè)或一個(gè)以上miRNA序列可包括或包含〗務(wù)飾核石咸基或核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明方法中，可通過向細(xì)胞或有機(jī)體施用其一旦進(jìn)入細(xì)胞即充當(dāng)對(duì)應(yīng)miRNA的核酸分子，向細(xì)胞或其他生物物質(zhì)例如有機(jī)體(包括患者)提供對(duì)應(yīng)于特定miRNA的miRNA或miRNA分子。向細(xì)胞提供的分子的形式可以不是一旦進(jìn)入細(xì)胞即充當(dāng)rm'RNA的形式。因此，在一些實(shí)施方案中應(yīng)該考慮到提供合成miRNA或非合成miRNA，以致于其一旦進(jìn)入細(xì)胞的miRNA加工機(jī)構(gòu)即被加工成成熟的和活化的miRNA。在某些實(shí)施方案中，特別考慮的是，提供的miRNA分子不是成熟miRNA分子，而是其一旦進(jìn)入miRNA加工機(jī)構(gòu)即被加工成成熟mi:RNA的核酸分子。miRNA背景下的術(shù)語"非合成"意思是指miRNA不是"合成的"，如本文所定義。此外，應(yīng)該考慮到在涉及使用合成miRNA的本發(fā)明實(shí)施方案中，在本發(fā)明的一個(gè)方面也考慮使用相應(yīng)的非合成，反之亦然。應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語"提供"試劑用于包括向患者"施用"試劑。在某些實(shí)施方案中，方法還包括靶向miR.NA以在細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)。術(shù)語"靶向miRNA以調(diào)節(jié)"意思是指將采用本發(fā)明核酸以調(diào)節(jié)所選擇的miRNA。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)用對(duì)應(yīng)于所靶向miRNA的合成或非合成miRNA實(shí)現(xiàn)，其有效地向細(xì)胞或有機(jī)體提供所靶向的miRNA(正向調(diào)節(jié))。在其他實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)用miRNA抑制劑實(shí)現(xiàn)，其有效地抑制細(xì)胞或有機(jī)體中的所靶向的miRNA(負(fù)向調(diào)節(jié))。在一些實(shí)施方案中，,皮靶向調(diào)節(jié)的miRNA是影響疾病、狀況或途徑的miRNA。在某些實(shí)施方案中，miRNA被靶向，因?yàn)橹委熆梢酝ㄟ^負(fù)向調(diào)節(jié)所靶向miRNA而提供。在其他實(shí)施方案中，miRNA被靶向，因?yàn)橹委熆梢酝ㄟ^正向調(diào)節(jié)所靶向miRNA或其靶標(biāo)而提供。在本發(fā)明的某些方法中，存在向需要與靶向皿RNA調(diào)節(jié)相關(guān)的治療的或需要本文所述生理學(xué)或生物學(xué)結(jié)果(例如對(duì)于特定細(xì)胞途徑或結(jié)果，如細(xì)胞活力下降)的細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體(總稱為"生物物質(zhì)")施用所選擇的miRNA調(diào)節(jié)劑的更多步驟。因此，在本發(fā)明的一些方法中，存在鑒定需要通過提供miRNA調(diào)節(jié)劑治療的患者的步驟。應(yīng)該考慮到，在一些實(shí)施方案中施用有效量的miRNA調(diào)節(jié)劑。在特定實(shí)施方案中，賦予生物物質(zhì)治療益處，其中"治療益處"指一種或一種以上狀況或與疾病或狀況相關(guān)癥狀的改善，或者就疾病而言預(yù)后、持續(xù)時(shí)間或狀況的改善。應(yīng)該考慮到治療益處包括，但不限于疼痛降低、發(fā)病率降低和/或癥狀減少。例如，就癌癥而言，應(yīng)該考慮到治療益處可以是腫瘤生長(zhǎng)的抑制、轉(zhuǎn)移的阻止、轉(zhuǎn)移灶數(shù)量的減少、癌細(xì)胞增殖的抑制、癌細(xì)胞中細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)、癌細(xì)胞附近血管發(fā)生的抑制、癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、疼痛的減輕、復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的降低、癌細(xì)胞中化學(xué)敏感性或輻射敏感性的誘導(dǎo)、生命的延長(zhǎng)和/或癌癥直接或間接相關(guān)的死亡的延遲。此外，應(yīng)該考慮到，miRNA組合物可以作為治療的一部分與傳統(tǒng)治療法或預(yù)防試劑聯(lián)合向患者提供。此外，應(yīng)該考慮到在治療背景下討論的任何方法，可以預(yù)防性地特別應(yīng)用于經(jīng)鑒定潛在需要治療或者處于需要治療的狀況或疾病風(fēng)險(xiǎn)之中的患者。jt匕夕卜，本發(fā)明方法涉及1吏用一種或一種以上對(duì)應(yīng)于miRNA的核酸和治療藥物。核酸可以增強(qiáng)藥物的作用或有效性、降低任何副作用或毒性、改變其生物利用率和/或降低所需要的劑量或頻率。在某些實(shí)施方案中，治療藥物是癌癥治療劑。因此，在一些實(shí)施方案中，存在治療患者中癌癥的方法，包括向患者施用癌癥治療劑和有效量的至少一種改善癌癥治療劑有效性或保護(hù)非癌細(xì)胞的miRNA分子。癌癥治療法還包括與基于化學(xué)和輻射的治療的多種聯(lián)合治療。聯(lián)合治療包括但不限于，例如，5-氟尿嘧啶、阿侖單抗、氨柔比星、貝伐單抗、博來霉素、硼替佐米、白消安、喜樹堿、卡培他濱、碳鉑、西妥昔單抗、笨丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、COX-2抑制劑(例如塞來昔布)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、更生霉素、達(dá)沙替尼、柔紅霉素、地塞米松、多西他塞、阿霉素(亞德里亞霉素)、EGFR抑制劑(吉非替尼和西妥昔單抗)、埃羅替尼、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、依維莫司、法呢基-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗、替伊莫單抗、異環(huán)磷酰胺、甲磺酸伊馬替尼、la.rotaxel、拉帕替尼、洛那法尼、氮芥、美法侖、甲氨蝶呤、絲裂霉素、諾維本、亞硝基脲、洛可達(dá)唑、草酸鉑、紫杉醇、plicoraycm、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔單抗、西羅莫司、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、紅豆杉醇、多西他賽、西羅莫司脂化物、替口比法尼、4乇西莫單抗、traiisplatinum、曲妥珠單-抗、長(zhǎng)春石咸、長(zhǎng)春新石咸、或長(zhǎng)春瑞濱或者上述藥物的任何類似物或衍生變休。通常，可給與miRNA抑制劑以降低內(nèi)源miRNA的活性。例如，增加細(xì)胞增殖的miRNA分子的抑制劑可以向細(xì)胞提供以降低細(xì)胞增殖。本發(fā)明應(yīng)該考慮到針對(duì)本文所公開的不同miRNA分子和mi:RNA抑制劑觀察到不同生理效應(yīng)的這些實(shí)施方案。這包括，但不限于下列生理效應(yīng)增加和降低細(xì)胞增殖、增加或降低細(xì)胞凋亡、增加轉(zhuǎn)化、增加或降低細(xì)胞活力、激活或抑制激酶(例如Erk)、激活/誘導(dǎo)或抑制hl，ert、抑制促進(jìn)生長(zhǎng)途徑(例如Stat3信號(hào)途徑)的興奮、減少或增加活細(xì)胞數(shù)、和增加或降低細(xì)胞周期中特定期細(xì)胞數(shù)。本發(fā)明方法一般考慮包括提供或引入對(duì)應(yīng)于一種或一種以上不同miRNA分子的一種或一種以上不同核酸分子。應(yīng)該考慮到下列數(shù)量、至少下列數(shù)量或至多下列數(shù)量的不同核酸或rm'RNA分子可以被提供或引入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、U、1213、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、3]、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或從其中導(dǎo)出的任何范圍。這也適用于可以提供或引入細(xì)胞內(nèi)的不.3同miRNA分子的數(shù)量。II.藥物制劑和遞送本發(fā)明方法包括遞送冇效量的miRNA或編碼其的表達(dá)構(gòu)建體。"有效量"藥物組合物通常定義為足以可檢測(cè)地和可重復(fù)地達(dá)到所述期望的結(jié)果，例如改善、降低、最小化或限制疾病或其癥狀程度的數(shù)量?？刹捎闷渌鼑?yán)格的定義，包括消除、消滅或治愈疾病。A.施用在某些實(shí)施方案中，期望殺死細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制轉(zhuǎn)移、降低腫瘤或組織大小和/或逆轉(zhuǎn)或降低細(xì)胞的惡性或疾病表型。施用途徑自然地隨著待靶向的病變或部位的位置和性質(zhì)而變化，并且包括例如真皮內(nèi)、皮下、區(qū)域、腸胃外、靜^^內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、全身和口月良施用和制劑。直接注射、瘤內(nèi)注射或腫瘤脈管系統(tǒng)內(nèi)注射特別考慮用于分散的、實(shí)體的、可接近的腫瘤或其他可接近的乾區(qū)域。局部、區(qū)域或全身施用也是適當(dāng)?shù)?。?duì)于，,4cm的腫瘤，待施用的體積將會(huì)是大約4-10nil(優(yōu)選10ml)，而對(duì)于<4cm的腫瘤，將使用大約1-3ml的體積(優(yōu)選3ml:)。作為單次劑量遞送的多次注射包含大約O.i至大約0.5ml的體積。本發(fā)明組合物可以在多次注射中施用至腫瘤所所耙向部位。在某些方面，注射可以以大約1cm的間隔間隔開。在手術(shù)介入的情況下，本發(fā)明可在手術(shù)前使用，以使得不宜手術(shù)的腫瘤受試者能夠行切除術(shù)。備選地，本發(fā)明可以在手術(shù)的同時(shí)使用，和/或手術(shù)之后使用以治療殘留的或轉(zhuǎn)移的疾病。例如，可向?qū)⑶谐牧龃沧⑸浠蛘吖嘧琺iRNA或其組合的制劑。在切除術(shù)后可連續(xù)施用，例如通過在手術(shù)部位植入導(dǎo)管。還構(gòu)想了定期術(shù)后治療。還考慮連續(xù)灌注表達(dá)構(gòu)建體或病毒構(gòu)建體。適當(dāng)時(shí)也可以采用連續(xù)施用，例如，當(dāng)腫瘤或其他不希望的患病區(qū)域被切除和瘤床或耙向部位被處理以消除殘留的微小疾病(microsc叩icdisease)時(shí)?？紤]通過注射器或?qū)Ч苓f送。此類連續(xù)灌注可在最初治療之后持續(xù)從大約1-2小時(shí)至大約2-6小時(shí)、至大約6-12小時(shí)、至大約12-24小時(shí)、至大約1-2天、至大約l-2周或者更長(zhǎng)時(shí)間。通常，通過連續(xù)灌注的治療組合物的劑量等同于隨著灌注持續(xù)階段調(diào)整的單次或多次注射的劑量。治療方案同樣也可變化，并且常常依賴于腫瘤類型、腫瘤部位、免疫狀況、靶位點(diǎn)、疾病進(jìn)程和患者的健康和年齡。某些腫瘤類型將需要更積極治療。臨床醫(yī)生將最適合基于治療制劑的已知有效性和毒性(如果存在的話)做出此類決定。在某些實(shí)施方案中，被治療的腫瘤或患病區(qū)域可能是，至少最初是不可切除的。用本發(fā)明組合物治療可以因?yàn)檫吔缡湛s或者消除了某些特別的侵襲部分而增加腫瘤的可切除性。在治療后，行切除術(shù)是可能的。在切除術(shù)后的額外的治療可用作消除肺瘤或靶向部位的微小殘留疾病。治療可以包括多種"單位劑量"。單位劑量定義為包含預(yù)定量的治療組合物。待施用的量和特定途徑和制劑處于臨床領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。單位劑量不需要以單次注射施用，但是可以包含在設(shè)定的時(shí)間階段內(nèi)連續(xù)灌注。對(duì)于本發(fā)明的病毒成分，單位劑量可以方便地以|Lig或mgmiRNA或miRNA才莫擬物的方式描述。備選地，指定量可以是作為每日平均劑量、每周平均劑量或每月平均劑量施用的量。miRNA可以以大:約或jL少大約0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、7、18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)小時(shí)和/或1、2、3、4、5、6、7天或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)連續(xù)地全身施用。此外，可通過由制劑和/或施用模式實(shí)現(xiàn)的定時(shí)釋放或持續(xù)釋放機(jī)制施用。C.組合治療在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物和方法涉及miRNA或編碼其的表達(dá)構(gòu)建體。這些miRNA組合物可以與第二治療法組合使用以增強(qiáng)miRNA治療的效果或者提高所采用的另一治療法的治療效果。這些組合物將以有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期效果，例如殺死癌細(xì)胞和Z或抑制細(xì)胞過度增殖的組合量4是供。該過程可涉及細(xì)胞與miRNA或第二治療法同時(shí)或不同時(shí)間^接觸。這可以如下實(shí)現(xiàn)通過細(xì)胞與一種或一種以上組合物或包含一種或一種以上試劑的藥物制劑接觸，或者通過細(xì)胞與兩種或兩種以上不同組合物或制劑接觸，其中一種組合物提供(l)raiRNA;和/或(2)第二治療劑?？梢允┯冒ɑ瘜W(xué)治療、放射治療、手術(shù)治療、免疫治療或基因治療的第二組合物或方法。應(yīng)該考慮到可以在大約12-24小時(shí)內(nèi)、并且優(yōu)選地在大約6-12小時(shí)內(nèi)向患者提供miRNA治療和第二治療法。然而，在一些情況下，希望明顯延長(zhǎng)治療時(shí)間期限，時(shí)間期限為從幾天(2、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)的分別施用間隔。在某些實(shí)施方案中，療程將持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22'23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更長(zhǎng)。應(yīng)該考慮到，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、io、n、12、]3-14、15、6、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、3〗、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天或其任意組合.,給于第-一試劑，并且在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、3]、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天或其任-意組合,給于另一-試劑。在一天內(nèi)(24小時(shí)的時(shí)間內(nèi))，可以向患者一次施用或者多次施用試劑。此外，應(yīng)該考慮到在一個(gè)療程之后有一個(gè)不進(jìn)行治療的時(shí)間段。該時(shí)間段可持續(xù)l、2、3、4、5、6、7天和/或l、2、3、4、5周和/或l、2、3、4、5、6、7、8、9>0、11、12月或更長(zhǎng)，取決于患者狀況，例如其預(yù)后、強(qiáng)度、健康等?？刹捎枚喾N組合，例如miRNA治療法是"A"并且第二治療法是"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A任何本發(fā)明化合物或治療基向患者的施用將遵循施用此類化合物的一般方案，如果存在的話，要考慮載體或任何蛋白質(zhì)或其他試劑的毒性。因此，在一些實(shí)施方案中，存在檢測(cè)歸因于組合治療的毒性的步驟。預(yù)計(jì)在需要時(shí)將重復(fù)治療周期。也應(yīng)該考慮到，多種標(biāo)準(zhǔn)治療法以及手術(shù)介入可應(yīng)用于與所述治療法相組合。在特定方面，應(yīng)該考慮到第二治療法，例如化學(xué)治療、放射治療、免疫治療、手術(shù)治療或其他基因治療被用來與如本文所述的niiRNA治療相組合。1.化學(xué)治療根據(jù)本發(fā)明可使用廣泛多種的化學(xué)治療劑。術(shù)語"化學(xué)治療"指使用藥物治療癌癥。"化學(xué)治療劑"用于指在治療癌癥中施用的化合物或組合物。這些試劑或藥物通過它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活性模式分類，例如它們是否或者在什么階段影響細(xì)胞周期。備選地，試劑可基于其直接交聯(lián)DNA、嵌入DNA或者通過影響核酸合成引起染色體和有絲分裂異常的能力來表征。大部分化學(xué)治療劑歸于下列幾類烷化劑、抗代謝藥、抗胂瘤抗生素、有絲分裂抑制劑和亞硝基脲。a.》克<匕劑烷化劑是直接與基因組DNA相互作用以防止癌細(xì)胞增殖的藥物。該類化學(xué)治療藥物代表著影響細(xì)胞周期所有階段的試劑，即它們不是階段特異性的?？蓱?yīng)用烷化劑治療慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多發(fā)性骨髓瘤、和乳腺、肺和卵巢的特定癌癥。它們包括白消安、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺(環(huán)磷氮芥)、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、氮芥(氮芥)和美法侖。曲格列酮可以用于與4壬何一個(gè)或一個(gè)以上的這些烷化劑相組合治療癌癥。b.抗代謝藥抗代謝藥破壞DNA和RNA合成。與烷化劑不同，它們特異性地影響細(xì)胞周期的S期。它們除了用于治療乳腺、卵巢和胃腸道腫瘤之外，還已經(jīng)用于治療慢性白血病?？勾x藥包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟達(dá)拉濱、吉西他濱和甲氨蝶呤。5-氟尿嘧啶(5-FU)具有化學(xué)名5-氟-2,4(lH,3H)-嘧啶二酮。其作用機(jī)制被認(rèn)為是通過阻斷脫氧尿苷酸至胸苷酸的曱基化反應(yīng)。因此，5-FU千擾脫氧核糖核酸(DNA)的合成并且較'、！、程度地抑制核糖核S臾(RNA)的形成。由于DNA和RNA是細(xì)胞分裂和增殖所必需的，據(jù)認(rèn)為5-FU的效應(yīng)是產(chǎn)生胸苷缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，5-FU的效應(yīng)存在于快速分裂的細(xì)胞內(nèi)，快速分裂是轉(zhuǎn)移癌的特征。c.抗腫瘤抗生素抗胂瘤抗生素具有抗微生物活性和細(xì)胞毒性活性。這些藥物也通過化學(xué)性抑制酶和有絲分裂或者改變細(xì)胞膜而千擾DNA。這些試劑不是階段特異性的，以致于它們?cè)诩?xì)胞周期的所有階段起作用。因此，它們廣泛用于多種癌癥?？鼓[瘤抗生素實(shí)例包括博來霉素、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素(亞德里亞霉素)和伊達(dá)比星，其中一些在下文更詳細(xì)描述。廣泛用于腫瘤臨床治療環(huán)境的這些化合物以從25-75mg/n的劑量21天的間隔靜脈大丸劑注射阿霉素至35-100mg/m2靜脈或口服依托泊苷施用。d.有絲分裂抑制劑有絲分裂抑制劑包括可以抑制細(xì)胞分裂或有絲分裂所需蛋白質(zhì)合成的植物生物堿和其他天然試劑。它們?cè)诩?xì)胞周期的特定階段起作用。有絲分裂抑制劑包括多西他塞、依托泊苷(VP16)、紫杉醇、紅豆杉醇、多西他賽、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新-成和長(zhǎng)春瑞濱。e.亞硝基脲像烷化劑一樣，亞硝基脲抑制DNA修復(fù)蛋白。它們除了用于治療腦腫瘤外，還用于治療非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、惡性黑素瘤。實(shí)例包括卡氮芥和洛莫司汀。2.放射治療放射治療也稱作輻射治療，是用電離輻射治療癌癥和其他疾病。電離輻射儲(chǔ)存能量，通過損傷遺傳物質(zhì)使得這些細(xì)胞不能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，以損傷或破壞所治療區(qū)域的細(xì)胞。雖然輻射損傷癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，但是正常細(xì)胞能夠自我修復(fù)并正確地起作用。放射治療可用于治療局限性實(shí)體腫瘤，例如皮膚、舌、喉、腦、乳腺或?qū)m頸癌癥。其還可用于治療白血病和淋巴瘤(分別是血液形成細(xì)胞和-淋巴系纟充癌癥)。根據(jù)本發(fā)明使用的放射治療可包括，但不限于，使用y-射線、X-射線和/或向胂瘤細(xì)胞直接遞送放射性同位素。也考慮其他形式的DNA損傷因素，例如微波、質(zhì)子束照射(美國(guó)專利5,760,395和4，870,287)和UV-照射。最有可能所有這些因素對(duì)DNA、DNA前體、DNA復(fù)制和修復(fù)以及染色體的組裝和維持造成廣泛損傷。對(duì)于X-射線的劑量范圍從長(zhǎng)時(shí)間段的每日50至200倫琴的劑量(3至4周)，至2000至6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的劑量范圍變化極大，并且依賴于同位素的半衰期、所釋放放射線的強(qiáng)度和類型以及被腫瘤細(xì)胞的攝取。放射治療可包括使用放射標(biāo)記的抗體以直接向癌癥部位遞送劑量輻射(放射免疫治療)。一旦抗體被注射入體內(nèi)，其積極地搜尋出癌細(xì)胞，通過輻射的細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性)作用摧毀癌細(xì)胞。該方法可使輻射損傷健康細(xì)胞的危險(xiǎn)降到最低。對(duì)于腦和其他腫瘤的立體定位放射手術(shù)(Y刀)不使用刀，而是來自y放射治療的數(shù)百個(gè)不同角的極精確靶向束。僅需要一期放射治療，大約4至5小時(shí)。為了該種治療，將特制金屬框附在頭上。然后，開展幾次x-射線掃描以找到需要治療的精確區(qū)域。在腦胂瘤的放射治療期間，患者躺臥，其頭位于巨大頭盔中，頭盔具有數(shù)百個(gè)孔允許放射治療束穿過。相關(guān)方法允許定位身體其他區(qū)域的腫瘤以1更治療。3.免疫治療在癌癥治療的情況下，免疫治療通常依賴于使用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子以靶向和摧毀癌細(xì)胞。曲妥珠單抗(赫賽汀TM)即為此類實(shí)例。免疫效應(yīng)器可以是例如對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的一些標(biāo)記特異的抗體?？贵w可以單獨(dú)充當(dāng)治療的效應(yīng)器或者其可以招募其他細(xì)胞實(shí)際行使細(xì)胞殺傷?？贵w也可以綴合至藥物或毒素(化學(xué)治療劑、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)并且僅充當(dāng)靶向劑。備選地，效應(yīng)器可以是攜帶有直接或間接與腫瘤細(xì)胞靶相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。多種效應(yīng)器細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。治療方式的組合，即直接的細(xì)胞毒性活性和抑制或降低ErbB2將會(huì)在ErbB2過表達(dá)的癌癥治療中4是供治療益處。在免疫治療的一個(gè)方面，腫瘤或疾病細(xì)胞必須帶有適宜靶向，即在大多數(shù)細(xì)胞上不存在的一些標(biāo)記。存在許多腫瘤標(biāo)記并且任何這些腫瘤標(biāo)記在本發(fā)明中適宜靶向。共有的腫瘤標(biāo)記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿腫瘤相關(guān)的抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、即68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erbB和pl55。免疫治療的一個(gè)備選方面是組合抗癌效果與免疫刺激效果。也存在免疫刺激分子，包括細(xì)胞因子例如[L-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、")MFN、趨化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生長(zhǎng)因子例如FLT3配體。免疫刺激分子，或者作為蛋白質(zhì)或者用于基因遞送，與腫瘤抑制物例如MDA-7的組合已經(jīng)顯示出增強(qiáng)抗腫瘤效果(Ju等，2000)。此外，抗任何這些化合物的抗體可用于本文所述抗癌試劑的靶向。當(dāng)前研究中的或者使用中的免疫治療劑實(shí)例為免疫佐劑，例如牛分枝桿菌(A/少C(9/wC/"ehMOT/)(9V/,S;)、惡'〖生疾原蟲(/3/必'附0^//"附./^/"^3^/附)、二石肖基ll笨禾o芳香族化合物(美國(guó)專利5,801,005和5,739:169;Hui和Hashimoto,1998;Christodoulides等，1998)、細(xì)胞因子治療劑例如干擾素a、千擾素卩和千擾素y、IL-1、GM-CSF和TNF(Bi!kowski等，1998;Davidson等，1998;Hellstrand等,1998)基因治療劑例如TNF、IL-l、IL-2、p53(Qm等，1998;Austin-Ward和Villaseca，1998;美國(guó)專利5，830,880和5,846,945)以及單克隆抗體，例如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2抗體、抗HER-2抗體、抗pl85抗體；Pietras等，1998;Hanibuchi等，1998;美國(guó)專利5,824,311)。赫賽汀(曲妥珠單抗)是阻斷HER2-neu受體的嵌合(小鼠-人)單克隆抗體。其擁有抗腫瘤活性并且批準(zhǔn)用于惡性腫瘤的治療(Dillman,1999)。非限定性的幾種已知抗癌免疫治療劑及其靶名單包括(以通用名稱(靶標(biāo))形式列出)西妥昔單抗(EGFR)、帕尼單抗(EGFR)、曲妥珠單抗(erbB2受體)、貝伐單抗(VEGF)、阿侖單抗(CD52)、吉妥單抗奧唑米星(CD33)、利妥昔單抗(CD20)、托西莫單抗(CD20)、馬妥珠單抗(EGFR)、替伊莫單抗(CD20)、托西莫單抗(CD20)、HuPAM4(MUCl)、MORAb-009(間皮素)、G250(碳酸酐酶IX)、mAb8H9(8H9抗原)、M195(CD33)、Ipilimumab(CTLA4)、HuLuc63(CSl)、阿侖單抗(CD53)、依帕珠單抗(CD22)、BC8(CD45)、HuJ59l(前列腺特異性膜抗原)、hA20(CD20)、來沙木單抗(TRAJL受體-2)、帕妥珠單抗(HER-2受體)、Mik-(3-l(IL-2R)、RAV12(RAAG12)、SGN-30(CD30)、AME-133v(CD20)、HeFi-l(CD30)、BMS-663513(CD137)、Volociximab(抗a5pl整聯(lián)蛋白)、GC1008(TGF(3)、HCD122(CD40)、希普利珠單抗(CD2)、MORAb-003(葉酸受體a)、CNT0328(IL-6)、MDX-060(CD30)、Ofatumumab(CD20)和/或SGN-33(CD33)。應(yīng)該考慮到一個(gè)或一個(gè)以上這些治療劑可以與本文所述miRNA治療劑一起使用。存在諸多用于癌癥被動(dòng)免疫治療的不同方法。它們大概分成如下幾類抗體單獨(dú)注射；偶聯(lián)至毒素或化學(xué)治療劑的抗體的注射；偶聯(lián)至放射性同位素的抗體的注射；抗獨(dú)特型抗體的注射；和骨髓中腫瘤細(xì)胞的清除。4.基因治療仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合治療包括基因治療，其中治療性多核苷酸在一個(gè)或一個(gè)以上治療miRNA施用之前、之后或同時(shí)施用。治療性多肽或者編碼核酸與miRNA組合遞送可對(duì)靶組織具有組合的治療效果。本發(fā)明包含多種蛋白質(zhì)，其中一些在下文描述?？梢耘c本發(fā)明組合用于多種形式基因治療靶向的多種基因包括，但不限于細(xì)胞增殖誘導(dǎo)物、細(xì)胞增殖抑制劑、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物、細(xì)胞因子和其他治療核酸或者編碼治療蛋白質(zhì)的核酸。腫瘤抑制物癌基因的作用是抑制細(xì)胞過度增殖。這些基因的失活破壞了其抑制活性，導(dǎo)致增殖不受調(diào)節(jié)。腫瘤抑制物(例如治療多肽)p53、FHIT、p16和C-CAM可以采用。除了p53之外，另一個(gè)細(xì)胞增殖抑制劑是p16。真核細(xì)胞周期的多數(shù)轉(zhuǎn)換由細(xì)胞周期蛋白-依賴性激酶或CDK激發(fā)。細(xì)胞周期蛋白-依賴性激酶4(CDK4)是一種CDK，其調(diào)節(jié)通過GI。該酶的活性可以在晚G1期磷酸化Rb。CDK4的活性通過激活亞基D型細(xì)胞周期蛋白和通過抑制亞基pl6INK4控制，pl6MK4已經(jīng)被表征為特異性結(jié)合并抑制CDK4并且因此可以調(diào)節(jié)Rb磷酸化的蛋白質(zhì)(Serrano等，1993;Serrano等，1995)。由于pl6INK4蛋白質(zhì)是CDK4抑制劑(Serrano,1993)，該基因的缺失可以增加CDK4的活性，導(dǎo)致Rb蛋白質(zhì)的過度磷酸化。還已知p16調(diào)節(jié)CDK6的功能。p16INK4屬于新近描述的一類CDK-抑制蛋白，該類蛋白還包括p16B、p19、p21WAFl和p27KIPl。pl6INK4基因位于9p21，該區(qū)是許多腫瘤類型中頻繁缺失的染色體區(qū)域。pl6INK4基因的純合缺失和突變?cè)谌四[瘤細(xì)胞系中常見。該證據(jù)表明pl6INK4基因是腫瘤抑制基因。然而，該解釋受到如下觀察結(jié)果的挑戰(zhàn)，即在原代未培養(yǎng)的腫瘤中pl6INK4基因改變的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)的細(xì)胞系中(Caldas等，1994;Cheng等,994;Hussussmn等，1994;Kamb等,1994;Mon等，]994;Okaraoto等，1994;Nobori等，1995;Orlow等，1994;Arap等，1995)。通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)野生型pI6INK4功能的恢復(fù)降低了一些人癌癥細(xì)胞系的集落形成(Okamoto，1994;Arap，1995)。根據(jù)本發(fā)明可以使用的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-[I、zacl、p73、VHL、MMAC/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合基因、p21/p27融合基因、抗血栓基因(例如COX-l、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管發(fā)生中涉及的基因(例如VEGF、FGF、血小板反應(yīng)蛋白、BAI-1、GDAIF或它們的受體)和MCC。5.外科手術(shù)大約60%的癌癥患者將經(jīng)歷一些類型的外科手術(shù)，其包括預(yù)防性手術(shù)、診斷性或分期手術(shù)、治療性手術(shù)和姑息性手術(shù)。治療性手術(shù)是可以與其他治療法，如本發(fā)明治療法、化學(xué)治療法、放射治療法、激素治療法、基因治療法、免疫治療法和/或備選治療法聯(lián)合的癌癥治療。治療性手術(shù)包括切除術(shù)，其中物理性去除、切除和/或^:壞全部或部分癌組織。肺瘤切除術(shù)指物理性去除至少部分腫瘤。除了腫瘤切除術(shù)之外，外科手術(shù)治療還包括激光外科手術(shù)、冷凍外科手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微控制手術(shù)(Mohs外科手術(shù))。還進(jìn)一步應(yīng)該考慮到，本發(fā)明可用于與淺表癌、前期癌或附帶量的正常組織去除聯(lián)合。在切除部分或全部癌細(xì)胞、組織或腫瘤時(shí)，會(huì)在身體內(nèi)形成空洞。可通過灌注、直接注射或區(qū)域局部應(yīng)用另外的抗癌治療實(shí)現(xiàn)治療。此類治療可以重復(fù)，例如-爭(zhēng)l、2、3、4、5、6或7天、或每L2、3、4和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月。這些治療同樣可以改變劑量。6.其他試劑應(yīng)該考慮到其他試劑可用于與本發(fā)明相組合以改善治療的治療性效果。這些額外的試劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、上調(diào)細(xì)胞表面受體和縫隙連接的試劑、細(xì)胞抑制劑和分化試劑、細(xì)胞黏著抑制劑、提高高增生性細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感性的試劑或其他生物學(xué)試劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；千擾素a,(3和7;IL-2和其他細(xì)胞因子；F42K和其他細(xì)胞因子類似物；或者M(jìn)IP-1，MIP-1卩，MCP-1，RANTES，和其他趨化因子。還應(yīng)該考慮到，細(xì)胞表面受4^或其配體，如Fas/Fas配體、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配體)的上調(diào)通過確立對(duì)高增生性細(xì)胞的自分泌或旁分泌效應(yīng)將使本發(fā)明具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。通過提高縫隙連接數(shù)增加細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)將增加對(duì)臨近高增生性細(xì)胞群體的抗高增生性作用。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞抑制劑或分化試劑可用于與本發(fā)明相組合以改善治療的抗高增生效果?？紤]的了細(xì)胞黏著抑制劑以改善本發(fā)明的有效性。細(xì)胞黏著抑制劑實(shí)例是黏著斑激酶(FAK)抑制劑和洛伐他汀。還應(yīng)該考慮到，增加高增生性細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感性的其他試劑，例如抗體c225,可用于與本發(fā)明相組合以改善治療有效性。Apo2配體(Apo2L，也稱作T:RAIL)是肺瘤壞死因子(TNF)細(xì)胞因子家族成員。T.RA止在許多類型癌細(xì)胞中激活快速的細(xì)胞凋亡，然而對(duì)正常細(xì)胞不具有毒性。TRAILmRNA廣泛存在于多種組織中。大多數(shù)正常細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)TRAIL的細(xì)胞毒性作用具有抵抗，表明存在保護(hù)細(xì)胞不被TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。描述的TRAIL的第一個(gè)受體稱作死亡受體4(DR4),包含胞質(zhì)"死亡結(jié)構(gòu)域";DR4傳遞由TRAIL攜帶的細(xì)胞凋亡信號(hào)。已經(jīng)鑒定出結(jié)合TRAIL的額外的受體。一個(gè)受體稱作DR5，包含胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域并且與DR4非常相似傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)。DR4和DR5mRNA在多種正常組織和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)。最近，已經(jīng)鑒定出誘殺受體例如DcRl和DcR2，其阻止TRAIL通過DR4和DR5i秀導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，這些誘殺受體代表著直接在細(xì)胞表面調(diào)節(jié)對(duì)促細(xì)胞凋亡細(xì)胞因子敏感性的新機(jī)制。這些抑制性受體在正常組織內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)表明，TRAIL可以用作誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的同時(shí)保護(hù)正常細(xì)胞的抗癌劑(Marsters等，1999)。在《I入細(xì)胞毒性化學(xué)治療藥物之后開展癌癥治療中存在許多進(jìn)步。然而，化學(xué)治療的后果之一是藥物抗性表型的產(chǎn)生/獲得和多藥耐藥的產(chǎn)生。藥物抗性的產(chǎn)生仍然是此類腫瘤治療的主要障礙，并且因此明顯需要替代方法，例如基因治療。用于與化學(xué)治療、放射治療或生物治療聯(lián)合的另一種形式的治療包括過熱治療，其為將患者組織暴露于高溫(一直到J06。F)下的方法。外部或內(nèi)部加熱裝置可用于局部、區(qū)域或全身過熱治療應(yīng)用中。局部過熱治療包括向小的區(qū)域例如腫瘤應(yīng)用熱治療。加熱可以用來自體外i殳備的靶向腫瘤的高頻波在外部產(chǎn)生。內(nèi)部加熱可涉及無菌探針，包括細(xì)的經(jīng)加熱的導(dǎo)線或者充滿熱水的中空管、植入的微波天線或射頻電極。對(duì)于區(qū)域治療，將患者器官或者肢體加熱，這使用產(chǎn)生高能量的裝置如磁體實(shí)現(xiàn)。備選地，患者的一些血液被取出，并且在灌注入將被內(nèi)部加熱的區(qū)域之前加熱。在癌癥擴(kuò)散至全身的情況下，也可以進(jìn)行全身加熱。熱水毯、熱蠟、感應(yīng)線圈和熱室可用于此目的。激素治療也可以用于與本發(fā)明聯(lián)合，或者與先前所述的其他癌癥治療相組合。激素可用于治療某些癌癥，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌，以降低某些激素的水平或者阻斷某些激素的效應(yīng)，例如睪酮或雌激素。該種治療常常用于與至少一種其他癌癥治療向組合作為一種治療選擇或者降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。于2006年2月8日提出的、要求2005年2月8日所提出美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/650,807的優(yōu)先權(quán)的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)！1/349,727在此通過參考全部并入本申請(qǐng)。III.miRNA分子關(guān)于小RNA分子("miRNA")雖然已經(jīng)有19個(gè)核苦酸和一直到23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的報(bào)道，但是其長(zhǎng)度通當(dāng)為21至22個(gè)核苷酸。miRNA各自從更長(zhǎng)的前體RNA分子("前體miRNA")加工而來。前體miRNA從非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄而來。前體miRNA具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，使得其能夠形成莖-環(huán)樣結(jié)構(gòu)或者折回樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在動(dòng)物中由稱作切酶的核糖核酸酶l[I樣核酸酶切開。所加工的miRNA有代表性地是部分莖。所加工miRNA(也被稱為"成熟miRNA")變成大復(fù)合體的一部分以下調(diào)特定靶基因或其基因產(chǎn)物。動(dòng)物miRNA實(shí)例包括與靶不完全堿基配對(duì)的那些，其使翻譯停止(01sen等，1999;Seggerson等，2002)。siRNA分子也是由切酶加工，但是是從長(zhǎng)的雙鏈RNA分子加工而來。siRNA非天然存在于動(dòng)物細(xì)胞中，但是它可以通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)指導(dǎo)mRNA靶的序列特異性切割(Denli等，2003)。A.陣列制備本發(fā)明某些實(shí)施方案涉及mRNA或核酸陣列、miRNA或核酸陣列和/或miRNA或核酸探針陣列的制備和用途，其是核酸分子(探針)的巨陣列或微陣列，所述核酸分子(探針)與衍生自由miR-20miRNA所調(diào)節(jié)多種基因和基因途徑的多個(gè)核酸、mRNA或miRNA分子、前體miRNA分子或核酸具有完全或幾乎完全的互補(bǔ)性(在探針的整個(gè)長(zhǎng)度上)或同源性(在探針的整個(gè)長(zhǎng)度上)，并且以空間分開的組織結(jié)構(gòu)置于支持物或支持材料上。巨陣列有代表性地是其上已經(jīng)點(diǎn)有探針的硝酸纖維素或尼龍板。微陣列更緊密地放置核酸探針，以致于在典型的l-4平方厘米的區(qū)域內(nèi)可以固定至多10,000種核酸分子。微陣列可以通過將核酸分子例如基因、寡核香酸等點(diǎn)在基質(zhì)上或者通過在基質(zhì)上原位構(gòu)建寡核苷酸序列來制造。所點(diǎn)的或者所構(gòu)建的核酸分子可以以每平方厘米至多大約30種非相同核酸分子的高密度基質(zhì)模式或者更高密度的基質(zhì)模式，例如每平方厘米至多大約100或者甚至1000種的基質(zhì)模式應(yīng)用。與濾膜陣列的基于硝酸纖維素的材料或miRNA-互補(bǔ)核酸樣品的有序陣列，每一樣品的位置可以被追蹤并且可以與原始樣品聯(lián)系起來。在其中多個(gè)不同核酸探釷穩(wěn)定結(jié)合在固體支持物表面多種不同的陣列裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對(duì)于陣列有用的基質(zhì)包括尼龍、玻璃、金屬、塑料、乳膠和硅。此類陣列可以多種不同方式變化，包括平均探針長(zhǎng)度、探針序列或類型、探針和陣列表面結(jié)合的性質(zhì)，例如共價(jià)或非共價(jià)等。在對(duì)于除了探針之外的任何參數(shù)的有效性上，本發(fā)明的標(biāo)記和篩選方法和陣列不限于檢測(cè)miRNA或基因或者代表基因的核酸；因此，方法和組合物可以用于多種不同類型的核酸陣列。用于制備微陣列的代表性方法和儀器已經(jīng)描述于例如美國(guó)專利5,143,854、5,202,231、5,242,974、5,288,644、5,324,633、5,384,261、5,405,783、5,412,087、5,424,186、5，429,807、5,432,049、5,436,327、5,445,934、5,468,613、5,470,710、5,472,672、5,492,806、5,525,464、5,503,980、5,510,270、5,525,464、5，527,681、5,529,756、5,532,128、5,545,531、5,547,839、5,554,501、5,556,752、5,561,071、5,571,639、5,580，726、5,580,732、5,593,839、5,599,695、5,599,672、5,610;287、5,624,711、5,631,134、5，639，603、5,654,413、5,658,734、5,661,028、5,665,547、5,667,972、5,695,940、5,700，637、5,744,305、5,800,992、5,807,522、5,830,645、5,837,196、5,871,928、5,847,219、5,876,932、5,919,626、6,004,755、6,087,102、6,368,799、6,383,749、6,617，112、6,638,717、6,720，38，以及WO93/17126、WO95/11995、WO95/21265、WO95/21944、WO95/35505、WO96/31622、WO97/10365、WO97/27317、WO99/35505、WO09923256、WO09936760、WO0138580、WO0168255、WO03020898、WO03040410、WO03053586、WO03087297、WO03091426、WO03100012、WO04020085、WO04027093、EP373203、EP785280、EP799897和UK8803000中;其公開全部通過參考并入本文。應(yīng)該考慮到陣列可以是高密度陣列，抑制它們包含2、20、25、50、80、100或更多種不同探針。應(yīng)該考慮到它們可以包含1000、16,000、65,000、250,000或1,000,000或更多種不同探針。探針可以指向一個(gè)或一個(gè)以上不同生物體或者細(xì)胞類型中的mRNA和/或miRNA靶。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸探針長(zhǎng)度范圍/人5至50、5至45、10至40、9至34或10至40個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸探針長(zhǎng)度為5、10、15、20至20、25、30、35、40個(gè)核苷酸，包括它們之間的所有整數(shù)和范圍。通常已知陣列中每一不同探針序列的位置和序列。然而，大數(shù)量的不同探針可以占用相對(duì)小的面積，提供了高密度陣列，其具有通常大于每平方厘米60、100、600、1000、5,000、10,000、40，000、100,000或400,000種不同寡核苷酸探針的探針密度。陣列的表面積可以是大約或者小于大約1、1.6、2、3、4、5、6、7、8、9或10cni2。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地分析使用陣列產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。此類方法描述于上文并且包括在WO9743450、WO03023058、WO03022421、WO03029485、WO03067217、WO03066906、WO03076928、WO03093810、WO03100448A1中找到的信息，所有這些明確地通過參考并入本文。B.樣品制備應(yīng)該考慮到廣泛多種樣品的RNA和/或miRNA可以使用本發(fā)明的陣列、探針?biāo)饕?indexofprobe)或陣列技術(shù)分析。雖然應(yīng)該考慮到內(nèi)源miRNA與本發(fā)明組合物和方法，重組一起使用，但是miRNA，包括與內(nèi)源miRNA或前體miRNA互補(bǔ)或相同的核酸也可以如本文所述處理和分析。樣品可以是生物學(xué)樣品，在此情況下，它們可以來^自活組織檢查、細(xì)針抽取物、表皮脫落物、血液、組織、器官、精液、唾液、眼淚、其他體液、毛囊、皮膚或包含生物細(xì)胞，特別是癌細(xì)胞或高增生性細(xì)胞或由其組成的任何樣品。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是，但不限于，活組織檢查或從活組織檢查或其他體液或組織純化或富集一定程度的細(xì)胞。備選地，樣品可以不是生物學(xué)樣品，而是化學(xué)混合物，例如無細(xì)胞的反應(yīng)混合物(其可以包含一種或一種以上的生物酶)。c.雜交當(dāng)制備陣列或一組探針和/或標(biāo)記樣品中的核酸或探針之后，靶核酸群體在雜交條件下與陣列或探針接觸，其中此種條件可以按所期望那樣調(diào)整，以釷對(duì)待開展的特定分析提供最佳特異性水平。適宜雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的綜述于Sambrook等(2001)和WO95/21944中。在許多實(shí)施方案中特別感興趣的是在雜交過程中使用嚴(yán)格條件。嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。特別考慮的是單個(gè)陣列或探針組可以與多個(gè)樣品接觸。樣品可以用不同的標(biāo)記物標(biāo)記以區(qū)別樣品。例如，單個(gè)陣列可以與用Cy3標(biāo)記的胂瘤組織樣品和用Cy5標(biāo)記的正常組織樣品接觸。對(duì)于樣品中對(duì)應(yīng)于陣列上探針的特定miRNA之間的差異可以容易地確定和定量。小的陣列表面積使得雜交條件一致，例如溫度調(diào)節(jié)和鹽含量。此外，由于高密度陣列占用的面積小，雜交可以在非常小的流體體積(例如大約250〖U或更少，包括大約或少于大約5、10、25、50、60、70、80、90、l(XUil的體積或從其中導(dǎo)出的任何范圍)中開展。在小的體積中，雜交可以非?？焖俚剡M(jìn)行。D.差異表達(dá)分析本發(fā)明的陣列可以用于檢測(cè)兩個(gè)樣品之間的差異。特別考慮的應(yīng)用包括鑒定和/或定量正常樣品與非正常樣品之間、疾病或狀況與未表現(xiàn)出此種疾病或狀況的細(xì)胞之間、或者兩個(gè)不同處理樣品之間的miRNA或基因表達(dá)差異。同樣，可以比較據(jù)信易患特定疾病或狀況的樣品與據(jù)信不易患或者抵抗該疾病或狀況的樣品之間的miRNA或基因表達(dá)。非正常的樣品是表現(xiàn)出疾病或狀況表型或遺傳型性狀的樣品或者據(jù)信就該疾病或狀況而言為非正常的樣品。其可以與就該疾病或狀況而言為正常的細(xì)胞比較。表型性狀包括疾病或狀況的癥狀或易感性，其中一項(xiàng)是、或者可以是、或者可以不是遺傳的或者由一個(gè)或多個(gè)高增生性或腫瘤細(xì)胞引起。陣列包含帶有連接至支持物上的核酸探針的固體支持物。陣列有代表性地包含多種不同的核酸探針，其以不同的、已知的位置偶聯(lián)至基質(zhì)表面。這些陣列，也描述為"微陣列"或通俗語"芯片"，也已經(jīng)在本領(lǐng)域中廣泛描述，例如美國(guó)專利5,143,854、5,445,934,5,744,305、5,677,195'6,040,193、5,424,186和Fodor等(1991)，為了所有目的其中每一篇文獻(xiàn)的全文通過參考并入本丈。使用機(jī)械合成方法合成這些陣列的技術(shù)描迷于，例如美國(guó)專利5,384,261,為了所有目的其全文通過參考并入本文。雖然在某些方面使用平面陣列表面，陣列可以在實(shí)際上任何形狀的表面或者甚至復(fù)雜表面上制造。陣列可以是珠、凝膠、多聚體表面、纖維如光纖、玻璃或任何其他適宜基質(zhì)上的核酸，見美國(guó)專利5,770，358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5，800，992，為了所有目的其全文通過參考并入本文。陣列可如此方式包裝，以便于診斷和所有內(nèi)含裝置的其他操作，見例如美國(guó)專利5,856,174和5,922,591，為了所有目的其全文通過參考并入本文。對(duì)于陣列、其制造和其特性有關(guān)的額外信息，還可見于20()0年4月7日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/545,207,為了所有目的其全文通過參考并入本文。特別地，陣列可以用于評(píng)估樣品的病理狀況，例如癌癥和相關(guān)狀況。特別考慮的是，本發(fā)明可以用于評(píng)估疾病各期或亞分類之間的差異，例如良性、癌性和轉(zhuǎn)移組織或肺瘤之間。待評(píng)估的表型性狀包括特征，例如壽命、發(fā)病率，期望存活率、對(duì)特定藥物或治療性治療的易感性或感受性(藥物有效性)和藥物毒性危險(xiǎn)。其表型性狀不同的樣品也可以使用所述的組合物和方法評(píng)估。在某些實(shí)施方案中，可產(chǎn)生miRNA和/或表達(dá)譜，以評(píng)估并將這些表達(dá)譜與藥代動(dòng)力學(xué)或治療關(guān)聯(lián)。例如，可以產(chǎn)生并誶估患者被治療前的或者治療過程當(dāng)中的患者腫瘤和血液樣品的這些表達(dá)譜，以確定是否存在其表達(dá)與患者治療結(jié)果關(guān)聯(lián)的miRNA或基因。差異miRNA或基因的鑒定可用于診斷分析，以評(píng)定腫瘤和/或血液樣品以確定將向患者提供什么樣的藥物方案。此外，其可以用于鑒定或者選擇適宜特定臨床試驗(yàn)的患者。如果經(jīng)確定表達(dá)譜與藥物有效性或藥物毒性相關(guān)，則該表達(dá)語與患者是否是接受藥物、接受藥物組合或者藥物特定劑量的適宜患者相關(guān)。除了上述預(yù)后分析之外，來自患有多種疾病的患者的樣品可評(píng)估以確定不同的疾病是否可以基于miRNA和/或相關(guān)基因表達(dá)水平鑒定?？梢曰谧V進(jìn)行-珍斷分析，醫(yī)生可以使用該諳鑒定患有疾病的個(gè)體或者鑒定誰處于發(fā)展成疾病的危險(xiǎn)之中。備選地，可以基于miRNA譜分析設(shè)計(jì)治療方案。此類方法和組合物的實(shí)例描述于2005年5月23日提出的、題目為"包括miRNA和nuRNA抑制劑分子的方法和組合物"的美囯臨時(shí)專利申請(qǐng)中，其全文通過參考并入本文。E.其他分析法除了使用陣列和微陣列之外，應(yīng)該考慮到許多不同的分析法可用于分析miRNA或相關(guān)基因、它們的活性和它們的作用。此類分析法包括，但不限于，核酸擴(kuò)增、聚合酶鏈反應(yīng)、定量PCR、RT-PCR、原位雜交、Northern雜交、雜交保護(hù)分析法(HPA)(GenProbe)、分支DNA(bDNA)分析法(Chiron)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、單分子雜交檢測(cè)(USGenomics)、侵染檢測(cè)(ThirdWaveTechnologies)和/或BridgeLitigation分析法(Geuaco)。IV.核酸本發(fā)明涉及可標(biāo)記、用于陣列分析或者用于診斷、治療或預(yù)后應(yīng)用中的核酸、修飾或模擬核酸、miRNA、mRNA、基因和其代表性片段，特別是與病理狀況如癌癥相關(guān)的那些。分子可以是細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的或者是化學(xué)或重組合成的或產(chǎn)生的。它們可以是分離的和/或純化的。每一miRNA在本文描述并且包^"這些miRNA序列相應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)號(hào)SEQIDNO和登錄號(hào)。rmRNA名稱常以無"hsa-"前綴的形式縮寫或提到，并且將依賴于上下文語境作如此理解。除非另外指出，在本申請(qǐng)中miRNA指鑒定為miR-X或let-X的人序列，其中X是數(shù)字和/或字母。在某些方面，可以使用通過后綴"5P"或"3P"指定的miRNA探針。如在萬維網(wǎng)sanger.ac.uk上描述的那樣:，"5P"指成熟miRNA衍生自前體的5，端，并且對(duì)應(yīng)的"3P"指其衍生自前體的3，端,如在萬維網(wǎng)sanger.ac.uk所述。此外，在一些實(shí)施方案中，使用了與已知人miRNA不對(duì)應(yīng)的miRNA探針。應(yīng)該考慮到這些非人miRNA探針可以用于本發(fā)明實(shí)施方案中或者存在與非人miRNA同源的人rm'RNA。在其他實(shí)施方案中，可以采用任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞、生物學(xué)樣品或其制備物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，包《、miRNA的方法和組合物可以涉及miRNA、標(biāo)記物(mRNA)和/或其他核酸。核酸長(zhǎng)度可以是、是至少或是至多3、4、5、6、7、8、9、10、n、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65.66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、10、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、30、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、8!0、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或JOOO個(gè)核苷酸或從其中導(dǎo)出的任何范圍。此長(zhǎng)度涵蓋了加工miRNA、miRNA探針、前體miRNA、包含miRNA的載體、mRNA、niRNA探針、對(duì)照核酸和其他探針和引物的長(zhǎng)度。在許多實(shí)施方案中，miRNA長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸，而miRNA探針長(zhǎng)度為19-35個(gè)核芬酸，這取決于加工miRNA和所加入的任何側(cè)翼區(qū)域的長(zhǎng)度。在人中，nuRNA前體通常在62和110個(gè)核芬酸之間。本發(fā)明核酸可以具有與另一核酸相同或互補(bǔ)的區(qū)域。應(yīng)該考慮到互補(bǔ)性或同源性同源性區(qū)域可以是至少5個(gè)連續(xù)殘基，可是特別考慮的是該區(qū)域是、是至少或是至多6、7、S;、9、10、11、12、13,14、15、i6、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77,78、79、80、8i、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92,.93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、5〗0、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000個(gè)連續(xù)核苷酸。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，前體imRNA或其他核酸內(nèi)的互補(bǔ)性長(zhǎng)度或者miRNA探針與miRNA或miRNA基因之間的互補(bǔ)性長(zhǎng)度是如此長(zhǎng)度。而且，互補(bǔ)性可以表示為百分?jǐn)?shù)，意思是在整個(gè)探針長(zhǎng)度上探針與其靶之間的互補(bǔ)性是90%或者更高。在一些實(shí)施方案中，互補(bǔ)性是或者是至少90%、95%或100%。具體而言，如此長(zhǎng)度可以適用于包含本文所述任何序列標(biāo)識(shí)號(hào)、登錄號(hào)或本文所公開的任何其他序列所確定核酸序列的核酸。有代表性地，提供imRNA的通用名稱(在前綴中帶有其鑒定來源，例如，對(duì)于人序列為"hsa")和加工miRNA序列。除非另外指出，不帶前綴的miRNA將理解為指人miRNA。此外，niiRNA名稱中的小寫字母可以小寫也可以不小寫；例如，hsa-mir-130b也可以被稱為miR-130B。術(shù)語"miRNA探針"指可鑒定特定miRNA或結(jié)構(gòu)相關(guān)miRNA的核酸纟笨4f。應(yīng)當(dāng)理解，一些核酸衍生自基因組序列或基因。在該方面，對(duì)于特定miRNA或基因，術(shù)語"基因"為簡(jiǎn)單起見用于指編碼前體核酸或miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明實(shí)施方案可以包含-在其表達(dá)中涉及的miRNA基因組序列，例如啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"重組體"可以使用，并且該術(shù)語通常指已被體外操作的分子或者此種分子的復(fù)制或表達(dá)產(chǎn)物。術(shù)語"核酸"是本領(lǐng)域眾所周知的。如本文所使用，"核酸"通常指DNA、RNA分子(一個(gè)或一個(gè)以上的鏈)或包含核堿基的其衍生物或類似物。核堿基包括，例如在DNA(例如腺嘌呤"A"、鳥噤呤"G"、胸腺嘧啶"T"或胞嘧啶"C")或RNA(例如A、G、尿嘧啶"U"或C)中天然存在的噪呤或嘧啶堿基。術(shù)語"核酸"包含術(shù)語"寡核苷酸"和"多核苷酸"，術(shù)語"寡核香酸"和"多核苷si"每一個(gè)都是術(shù)語"核酸"的亞屬。術(shù)語"miRNA"通常指單鏈分子，但是在特別的實(shí)施方案中，在本發(fā)明中應(yīng)用的分子還將包含一個(gè)與同一單鏈分子的另一個(gè)區(qū)域或者另一個(gè)核酸部分互補(bǔ)(在整個(gè)鏈長(zhǎng)度上具有10和50%之間的互補(bǔ)性)、基本互補(bǔ)(在整個(gè)鏈長(zhǎng)度上具有大于50%但小于100%的互補(bǔ)性)或完全互補(bǔ)的區(qū)域或額外鏈。因此，miRNA可包含含有特定序列的一個(gè)或一個(gè)以上互補(bǔ)鏈.或自身互補(bǔ)鏈或"互補(bǔ)物"的分子。例如，前體miRNA可具有自身互補(bǔ)區(qū)域，其一直到100%的補(bǔ)體性。本發(fā)明的miRNA探針或核酸與其耙的互補(bǔ)性可以包括、可以是、可以是至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%互補(bǔ)性。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的"合成核酸"意思是指核酸不具有天然存在核酸的全部或部分化學(xué)結(jié)構(gòu)或序列。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語"合成miRNA"指在細(xì)胞中或者在生理?xiàng)l件下作為天然存在miRNA起作用的"合成核酸"。雖然本發(fā)明實(shí)施方案可包括合成miRNA或合成核酸，但是在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，核酸分子無需是"合成"的。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法和組合物中采用的非合成核酸或miRNA可以具有天然存在mRNA或ituRNA前體或成熟mRNA或miRNA的全部序列和結(jié)構(gòu)。例如，在本發(fā)明方法和組合物中使用的非合成miRNA可以不具有一個(gè)或一個(gè)以上修飾核苷酸或核苷酸類似物。在這些實(shí)施方案中，非合成！niRNA可以是或可以不是重組產(chǎn)生的。在特定實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法和/或組合物中的核酸特別是合成miRNA,而不是非合成miRNA(即不是"合成"的miRNA);可以在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明特別包含非合成miRNA,而不包含合成miRNA。就合成miRNA的使用而言討論的任何實(shí)施方案可以適用于非合成miRNA，反之亦然。應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語"天然存在"指在沒有任何人介入的有機(jī)體中存在的事物；它可以指天然存在的野生型或突變體分子。在一些實(shí)施方案中，合成miRNA分子不具有天然存在niiRNA分子的序列。在其他實(shí)施方案中，合成niiRNA分子可以具有天然存在miRNA分子的序列，但是分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是與精確序列特別不相關(guān)的部分中的化學(xué)結(jié)構(gòu)(非序列化學(xué)結(jié)構(gòu))不同于具有該序列的天然存在nuRNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在一些情況下，合成miRNA具有序列化學(xué)結(jié)構(gòu)和天然存在miRNA中不存在的非序列化學(xué)結(jié)構(gòu)。然而，合成分子的序列能鑒別哪一個(gè)miRNA將被有效提供或被抑制；內(nèi)源rmRNA被稱為"對(duì)應(yīng)imRNA"。可以在本發(fā)明情況下使用的相應(yīng)miRNA序列包括，但不限于，全部或部分的本文所提供序列標(biāo)識(shí)號(hào)中那些序列以及任何其他miRNA序列、miRNA前體序列或其任何互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方案中，序列是、或衍生自、或包含本文所鑒定靶向特定miRNA(或一組miRNA)的序列的全部或部分，所述特定miRNA(或一組miRNA)可以與序列一起使用?？梢赃x捧任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、]10、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260種或它們之間任意數(shù)量或范圍的序列，而排除所有非選捐:序列。如本文所使用，"雜交作用"、"雜交"或"能夠雜交"理解為意思是指形成雙鏈或三鏈分子或者具有部分雙鏈或三鏈性質(zhì)的分子。如本文所使用的術(shù)語"退火"是"雜交"的同義詞。術(shù)語"雜交作用"、"雜交"或"能夠雜交"包括術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格性"和術(shù)語"低嚴(yán)格性"或"低嚴(yán)格條件"。如本文所使用的"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格性"是允許包含互補(bǔ)序列的一個(gè)或一個(gè)以上核酸鏈之間或之內(nèi)雜交但排除隨機(jī)序列雜交的那些條件。嚴(yán)格條件允許核酸與靶鏈之間有少量錯(cuò)配，如果存在的話。此類條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，并且對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用是優(yōu)選的。非限定性的應(yīng)用包括分離核酸，例如基因或其核酸片段或者檢測(cè)至少一個(gè)特異性mRNA轉(zhuǎn)錄物或其核酸片段，等等。嚴(yán)格條件可以包括低鹽和/或高溫度條件，例如在大約42。C至大約70。C溫度下大約0.02M至大約0.5MNaCl所提供的條件。應(yīng)當(dāng)理解，預(yù)期嚴(yán)格性的溫度和離子強(qiáng)度部分地通過特定核酸的長(zhǎng)度、靶序列的長(zhǎng)度和核堿基內(nèi)容、核酸的電荷組成以及雜交混合物中甲酰胺、四曱基氯化銨或其他溶劑的存在或濃度決定。還應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于雜交的這些范圍、組成和條件僅僅是以非限定性實(shí)例的方式描述，并且對(duì)于特定雜交反應(yīng)的預(yù)期嚴(yán)格性常常通過比較一個(gè)或一個(gè)以上陽性或陰性對(duì)照經(jīng)驗(yàn)性確定。取決于所擬想的應(yīng)用，優(yōu)選采用變化的雜交條件以實(shí)現(xiàn)核酸對(duì)靶序列的不同程度的選擇性。在非限定性實(shí)例中，對(duì)在嚴(yán)格條件下不與核酸雜交的相關(guān)靶核酸的鑒定可以通過在低溫度和/或高離子強(qiáng)度下雜交完成。此類條件稱作"低嚴(yán)格性"或"低嚴(yán)格條件"，并且低嚴(yán)格性的非限定性實(shí)例包4套在大約20。C至大約50。C的溫度范圍內(nèi)在大約0.15M至大約0.9MNaCl情況下進(jìn)行雜交。當(dāng)然，進(jìn)--步修改低或高嚴(yán)格條件以適合特定應(yīng)用處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。A.核堿基、核苷、核苷酸和修飾核普酸如本文所使用的"核堿基"指雜環(huán)堿基，例如諸如在至少一種天然存在核酸(即DNA和RNA)中存在的天然存在核堿基(即A,T、G、C或U)，和此類核堿基的天然或非天然存在衍生物和類似物。核堿基通?？梢耘c至少一個(gè)天然存在核》成基以這樣一種方式形成一個(gè)或一個(gè)以上氬鍵("退火"或"雜交")，即其可以代替天然存在的核石咸基配對(duì)(例如A.和T、G和C以及A和U之間的氫鍵)。"噤呤"和/或"嘧咬"核堿基包含天然存在噤呤和/或嘧啶核堿基以及其衍生物和類似物，包括但不限于，嗜呤或嘧咬被一個(gè)或一個(gè)以上烷基、羧烷基、氨基、羥基、鹵素(即氟、氯、溴或碘)、巰基或烷硫基部分取代的那些。優(yōu)選的烷基(例如烷基、羧烷基等)部分包含大約1、大約2、大約3、大約4、大約5、至大約6個(gè)碳原子。噤呤或嘧啶的其他非限定性實(shí)例包括脫氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-氯鳥嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鳥嘌呤、8-羥基鳥。票呤、8-甲基鳥。票呤、8-硫鳥嘌呤、氮鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲基硫腺嘌呤、N,N-二甲腺嘌呤、氮雜腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。其他實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。如本文所使用，"核苷"指包含共價(jià)連接至核堿基接頭部分的核堿基的單個(gè)化學(xué)單位。"核堿基接頭部分"的非限定性實(shí)例是包含5-碳原子的糖(即"5-碳糖")，包括但不限于脫氧核糖、核糖、阿拉伯糖或5-碳糖的衍生物或類似物。5-碳糖衍生物或類似物的非限定性實(shí)例包括2'-氟-2'-脫氧核糖或者其中糖環(huán)中的氧原子被碳取代的碳環(huán)糖。核堿基與核堿基接頭部分的不同類型共價(jià)連接是本領(lǐng)域已知的(Kornberg和Baker，]992)。如本文所使用，"核芬酸"指還包含"骨架部分"的核苷。骨架部分通常共價(jià)連接核苷酸至包含核苷酸的另一分子或者共價(jià)連接至另一核苷酸以形成核酸。天然存在核苷酸中的"骨架部分"有代表性地包含共價(jià)連接至5-碳糖的磷部分。骨架部分的連接有代表性地發(fā)生在5-碳糖的3'-位或者5'-位。然而，其他類型的連接是本領(lǐng)域已知的，特別是當(dāng)核苷酸包含天然存在5-碳糖或磷部分的衍生物或類似物時(shí)。核酸可以包含天然存在核酸中存在的核堿基、核堿基接頭部分和/或骨架部分的衍生物或類似物，或完全由其組成。帶有核酸類似物的RNA也可以根據(jù)本發(fā)明方法標(biāo)記。如本文所使用的"衍生物"指化學(xué)修飾或改變形式的天然存在分子，而術(shù)語"模擬物"或"類似物"指結(jié)構(gòu)上類似或者不類似于天然存在分子或部分，但具有相似功能的分子。如本文所使用，"部分"通常指較大化學(xué)或分子結(jié)構(gòu)的較小化學(xué)或分子成分。核堿基、核苷和核苷酸類似物或衍生物是本領(lǐng)域眾所周知的，并且已經(jīng)描述(見例如，Scheit,1980,通過參考并入本文)。核苷、核苷酸或核酸的另外非限定性實(shí)例包括美國(guó)專利5,681,947、5,652,099和5,763,167、5,614,617、5,670,663、5,872,232、5,859,221、5,446,137、5,886,165、5,714,606、5,672,697、5,466,786、5,792,847、5,223,618、5,470,967、5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289、5,602,240、5,858,988、5,214,136、5,700,922、5,708,154、5,728,525、5，637，683、6，251,666、5,480，980和5，728,525中的那些,每一篇的全文通過參考并入本文。本發(fā)明的標(biāo)記方法和實(shí)際盒特別應(yīng)該考慮到核苷酸的使用，核苷酸被修飾以連接標(biāo)記并且可以摻入到miRNA分子中,.此類核苷酸包括可以用染料，包括熒光染料或者用分子，例如生物素標(biāo)記的那些核普酸?？扇菀椎氐玫綐?biāo)記的核苷酸；它們可以商業(yè)性獲得或者它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的反應(yīng)合成。用于本發(fā)明的修飾核苷酸不是天然存在核苷酸，而是在其上具有反應(yīng)部分的制備的核苷酸。感興趣的特異性反應(yīng)官能團(tuán)包括氨基、巰基、烷基磺酰氧基(sulfoxyl)、氨基巰基、疊氮基、環(huán)氧化物、異硫氰酸酯、異氰酸酯、酐、一氯三口秦、二氯三漆、一卣或二卣取代吡啶、一取代或二取代二。秦、馬來酰亞胺、環(huán)氧化物、氮丙啶、磺酰鹵、鹵酸、烷基卣、芳基鹵、烷基礒酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺酯、亞氨酸酯、肼、疊氮基硝基苯基、疊氮化物、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛、醛、碘乙酰、氰曱基酯、p-硝基笨基酯、o-硝基苯基酯、羥基吡啶酯、羰基咪唑和其他此類化學(xué)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)官能團(tuán)可以與核苷酸直接鍵合或其可以通過連接基團(tuán)與核苷酸連接。功能性部分和任何接頭基本上不損傷核芬酸被添加至miRNA或者被標(biāo)記的能力。代表性的連接基團(tuán)包括含碳連接基團(tuán)，有代表性地從大約2至18、通常從大約2至8個(gè)碳原子，其中含碳連接基團(tuán)可以包括或者可以不包括--個(gè)或一個(gè)以上雜原子，如S、O、N等，并且可以包括或者可以不包括一個(gè)或一個(gè)以上不飽和位點(diǎn)。在許多實(shí)施方案中特別感興趣的是烷基連接基團(tuán)，有代表性的是1至16個(gè)、通常1至4個(gè)碳原子的低碳烷基胺連接基團(tuán)，其中連接基團(tuán)可以包括一個(gè)或一個(gè)以上不飽和位點(diǎn)。在上述官能化靶產(chǎn)生的方法中使用的官能化核苷酸(或引物)可以使用已知方'法命j造或者乂人供貨商，例i口Sigma、Roche、Ambion、BiosearchTechnologies和NEN購(gòu)買。官能團(tuán)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式制備，包括美國(guó)專利4,404,289;4,405,711;4，337，063和5,268,486以及英國(guó)專利1,529,202中的代表性信息，每一專利通過參考并入本文。在本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案中使用胺修飾的核苷酸。胺修飾的核苷酸是帶有用于連接標(biāo)記的活性胺基的核苷酸。應(yīng)該考慮到任何核糖核苷酸(G、A、U或C)或脫氧核糖核苷酸(G、A、T或C)可以被修飾以便標(biāo)記。實(shí)例包括，但不限于，下列修飾核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸5-(3-氨基歸丙基)-UTP;8-[(4-氨基)丁基]-氨基-ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP;N6-(4-氨基)丁基-ATP、N6-(6-氨基)丁基-ATP、N4-[2,2-氧-雙-(乙基胺)]-CTP;N6-(6-氨基)己基-ATP;8-[(6-氨基)己基]-氨基-ATP;5-炔丙基氨基-CTP、5..炔丙基氨基-UTP;5-(3-氨基烯丙基)-dl丌P;8-[(4-氨基)丁基]-氨基-dATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-dATP;N6-(4-氨基)丁基-dATP、N6-(6-氨基)丁基-dATP、N4-[2,2-氧-雙-(乙基胺)]-dCTP;N6-(6-氨基)己基-dATP;8-[(6-氨基)己基]-氨基-dATP;5-炔丙基氨基-dCTP和5-炔丙基氨基-dUTP。此類核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。然而，本烯丙基)-CTP、5-(:3-氨基烯丙基)-GTP、5-(3-氨基烯丙基)-ATP、5-(3-氨基烯丙基)-dCTP、5-(3-氨基烯丙基)-dGTP、5-(3-氨基烯丙基)-dTTP或代替5-(3-氨基烯丙基)-UTP的5-(3-氨基烯丙基)-dUTP。B.核酸制備核酸可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備，例如化學(xué)合成、酶^f足生產(chǎn)或生物學(xué)生產(chǎn)。特別考慮的是，化學(xué)合成本發(fā)明的iniRNA探針。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，miRNA從生物學(xué)樣品中回收或分離。miRNA可以是重組體或者其可以細(xì)胞天然的或內(nèi)源的(:從細(xì)胞基因組產(chǎn)生)。應(yīng)該考慮到，生物學(xué)樣品可以以增強(qiáng)小的RNA分子例如miRNA回收的方式處理。美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/667,126描述了此類方法并且該文獻(xiàn)明確地通過參考并入本文。通常，方法包括以舍有胍和去污劑的溶液裂解細(xì)胞。備選地，核酸合成根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法開展。見例如，Itakura和Riggs(1980)以及美國(guó)專利4,704,362、5,221,619和5,583,013，每一文獻(xiàn)通過參考并入本文。合成核酸(例如合成寡核苷酸)的非限定性實(shí)例包括使用例如描迷于EP266,032(通過參考并入本文)中的磷酸三酯、亞磷酸鹽或亞磷酰胺化學(xué)和固相技術(shù)，或者如Froehler等，1986和美國(guó)專利5,705,629(每一文獻(xiàn)通過參考并入本文)中所述經(jīng)由脫氧核苷H-膦酸酯中間體通過體外化學(xué)合成制造的核酸。寡核苷酸合成的多種不同機(jī)制已經(jīng)描述于例如美國(guó)專利4,659,774、4,816,571、5:141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574，〗46、5,602,244中，每一專利通過參考并入本文。酶促生產(chǎn)核酸的非限定性實(shí)例包括在擴(kuò)增反應(yīng)如PCR中通過酶產(chǎn)生的核酸(見例如美國(guó)專利4,683,202和4,682,195，每一專利通過參考并入本文)或者描述于美國(guó)專利5,645,897(通過參考并入本文)中的寡核苷酸的合成。還可見Sambrook等，2001，其通過參考并入本文。寡核苷酸合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。寡核芬酸合成的多種不同機(jī)制已經(jīng)描述于例如美國(guó)專利4,659,774、4,816,571、5，141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中，每一專利通過參考并入本文。用于在細(xì)胞中產(chǎn)生核酸的重組方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些方法包括使用載體(病毒和非病毒載體)、質(zhì)粒、粘粒和其他載體遞送核酸至細(xì)胞，細(xì)胞可以是靶細(xì)胞(例如癌纟田胞)或者只是宿主細(xì)胞(以生產(chǎn)大量的目的RNA分子)。備選地，此類載體可以用于無細(xì)胞系統(tǒng)情況下，只要存在用于產(chǎn)生RNA分子的試劑即可。此類方法包括描述于Sambrook，2003，Sambrook，2001和Sambrook,1989中的那些，每一文獻(xiàn)通過參考并入本文。C.核酸分離核酸可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)分離，但是在特定實(shí)施方案中，可以采用用于分離小的核酸分子和/或分離RNA分子的方法。層析是常常使用從蛋白質(zhì)或從其他核酸中分開或分離核酸的方法。此類方法可以包括膠基質(zhì)電泳、過濾柱、醇沉淀和/或其他層析。如果打算使用或評(píng)怙來自細(xì)胞的miRNA，方法通常包括在開展分離特定群體RNA的方法之前，用離液劑(例如異硫氰酸胍)和/或去污劑(例如N-月桂?；“彼猁})裂解細(xì)胞。在用于從其他核酸中分離miRNA的特定方法中，雖然也可以使用瓊脂糖制備凝膠基質(zhì)，但是凝膠基質(zhì)用聚丙烯酰胺制備。凝膠可以是濃度梯度的或者是濃度均勻的。板或管可用于容納用于電泳的凝膠基質(zhì)。對(duì)于核酸分離通常采用一維電泳。板用于制備平板凝膠，而管(代表性的是玻璃或橡膠管)可以用于制備管凝膠。短語"管電泳"指使用管而不是平板形成凝膠。開展管電泳的材料可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備或者從例如C.B.S.ScientificCo.,Inc.或Scie-Plas購(gòu)買。方法可以包括使用有機(jī)溶劑和/或醇以分離核酸，特別是本發(fā)明方法和組合物中使用的miRNA。一些實(shí)施方案描述于美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/667,126中，其通過參考并入本文。通常，該公開提供了從細(xì)胞中有效分離小RNA分子的方法，包括向細(xì)胞裂解物中加入醇溶液和將醇/裂解物混合物應(yīng)用在固體支持物上，然后從固體支持物上洗脫RNA分子。在一些實(shí)施方案中，加至細(xì)胞裂解物的醇的量達(dá)到了大約55%至60%的醇濃度。雖然可以使用不同的醇類，但是乙醇效果良好。固體支持物可以是任何結(jié)構(gòu)，并且它包括珠、濾紙和柱，其可以包括帶有負(fù)電基團(tuán)的礦物支持物或多聚體支持物。玻璃纖維濾紙或柱對(duì)于此種分離過程效果特別好。在特別的實(shí)施方案中，皿RNA分離方法包括a)用含胍的裂解溶液裂解細(xì)胞樣品，其中產(chǎn)生胍濃度至少大約iM的裂解物；b)用含苯酚的提取溶液從裂解物中提取miRNA分子；c)向裂解物加入醇溶液，形成裂解物/醇混合物，其中混合物中醇濃度在大約35%至大約70%之.間；d)將裂解物/醇混合物應(yīng)用至固體支持物；e)用離子溶液從固體支持物洗脫niiRNA分子；和f)收集imRNA分子。有代表性地，樣品被干燥并且重懸于適宜后續(xù)操作的液體和體積中。V.才示i己牙口才示"i己才支才在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及標(biāo)記的rmRNA。應(yīng)該考慮到miRNA可以在標(biāo)記之前首先^皮分離和/或純化。這可以完成更有效標(biāo)記miRNA的反應(yīng)，這與樣品中的其他RNA的標(biāo)記相反，其中在標(biāo)記之前miRNA未分離或純化。在許多本發(fā)明實(shí)施方案中，標(biāo)記是非放射性的。通常，通過加入標(biāo)記核苷酸(一步法)或者加入核苷酸并標(biāo)記所加入核苷酸(兩-歩法)可以標(biāo)記核酸。A.標(biāo)記技術(shù)在一些實(shí)施方案中，通過向核酸催化性添加已經(jīng)標(biāo)記的一種或多種核苷酸，將核酸標(biāo)記。一種或一種以上標(biāo)記核芬酸可以添加至miRNA分子。見美國(guó)專利6,723,509，其通過參考并入本文。在其他實(shí)施方案中，未標(biāo)記的一種或多種核苷酸催化性添加至miRNA，并且未標(biāo)記核苷酸用化學(xué)部分修飾，化學(xué)部分能夠使它在以后被標(biāo)記。在本發(fā)明實(shí)施方案中，化學(xué)部分是活性胺，從而核苷酸是胺修飾核苷酸。胺修飾核苷酸的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，許多可以商業(yè)獲得，例如從Ambion、Sigma、JenaBioscience和TriLink獲得。與在cDNA合成過程中標(biāo)記cDNA不同，標(biāo)記miRNA的問題是如何標(biāo)記已經(jīng)存在的分子。本發(fā)明涉及能夠使用二-或三-磷酸核糖核苷酸或脫氧核糖核香酸作為底物的酶用于將底物添加至miRNA的用途。此外，在特別的實(shí)施方案中，它包括使用修飾的二.-或三-磷酸核糖核苷酸，其被添加至miRNA的3，端。能夠添加此類核普酸的酶包括，但不限于，poly(A)聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶和多核苷酸磷酸化酶。在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中，連接酶不是作為用于添加標(biāo)記的酶考慮的，并且改為采用非連接酶的酶。末端轉(zhuǎn)移酶催化核苷酸添加至核酸3'末端。多核苷酸磷酸化酶可將核苷酸二磷酸聚合，而無需引物。B.一示i己9miRNA或imRNA探針上的標(biāo)記可以是比色的(包括可見光謹(jǐn)和紫外光譜，包括熒光)、發(fā)光的、酶的或發(fā)射正電子(包括放射性的)的標(biāo)記。標(biāo)記可以直接或間接檢測(cè)。放射性標(biāo)記包括1251、32P、"P和"S。酶標(biāo)記實(shí)例包括堿性磷酸酶、螢光素酶、辣根過氧化物酶和卩半乳糖苷酶。標(biāo)記也可以是具有發(fā)光特性的蛋白質(zhì)，例如綠色熒光蛋白和藻紅蛋白。考慮用作綴合物的比色和熒光標(biāo)記包括，但不限于，AiexaFluor染料，BODIPY染料，例如BODIPYFL;CascadeBue;CascadeYe!low;香豆素及其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素和羥基香豆素；花青染料，例如Cy3和Cy5;曙紅和赤蘚紅；熒光素及其^"生物，例如熒光素異^L氰酸酯；鑭系離子大環(huán)螯合物，例如QuantumDyeTM:MarinaBlue;俄勒岡綠；羅丹明染料，例如羅丹明紅，四甲基羅丹明紅和羅丹明6G;德克薩斯紅；熒光能量轉(zhuǎn)移染料，例如噻唑橙-乙錠異二聚體；和TOTAB。染料的特定實(shí)例包括，但不限于，上面鑒定的那些和下列的那些AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFl匿430、AlexaFl麗488、AlexaFluor500.AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、A〗exaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、A〗exaF〗uor633、AiexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、和AlexaFluor750;活性胺BODIPY染料、例如BODIPY493/503、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/655、BODIPYFL、BODIPYR6G、BODIPYTMR,和BODIPY-TR;Cy3、Cy5、6-FAM、熒光素異硫氰酸酯、HEX、6-JOE、俄勒岡綠488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(lán)、REG、羅丹明綠、羅丹明紅、Renographm、ROX、SYPRO、TAMRA、2',4',5',7'-(Tetrabromosulfonefluorescem)四溴砜熒光素和TET。熒光標(biāo)記的核糖核香酸的特定實(shí)例可以從MolecularProbes獲得，并且它們包括AlexaFluor488-5-UTP.熒光素-12-UTP、BODIPYFL誦14-UTP、BODIPYTMR-14-UTP、四甲基羅丹明紅-6-UTP、AlexaFluor546-14-UTP、德克薩斯紅-5-UTP、和BODIPYTR-14-UTP。其他熒光核糖核苷酸可從AmershamBiosciences獲得，例如Cy3-UTP和Cy5-UTP。熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸實(shí)例包括二硝基苯基(DNP)-1l-dUTP、CascadeBlue-7-dUTP、AlexaFluor488--5-dUTP、熒光素-12-dUTP、俄勒閃綠488-5-dUTP、BODIPYFL-14-dUTP、羅丹明綠-5-dUTP、AlexaFluor532-5-dUTP、BODIPYTMR-14-dUTP、四曱基羅丹明紅-6-dUTP、AlexaFluor546-14-dUTP、AlexaFluor568-5-dUTP、德克薩斯紅-12-dUTP、德克薩斯紅-5-dUTP、BODIPYTR-M-dUTP、AlexaFluor594-5-dUTP、BODIPY630/650-14-dUTP、BODIPY650/665-14-dUTP;AlexaFluor488-7-OBEA-dCTP、AlexaFluor546-16-OBEA-dCTP、AlexaFluor594-7-OBEA-dCTP、AlexaFluor647-12畫OBEA-dCTP。應(yīng)該考慮到核酸可以用兩種不同標(biāo)記標(biāo)記。此外，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)可以在本發(fā)明方法中采用(例如Klost隱eier等，2002;Emptage，2001;[)idenko，2001，每一文獻(xiàn)通過參考并入本文)。備選地，標(biāo)記可以不是本身可檢測(cè)性的，而是可間接檢測(cè)性的或者允許靶向核酸的分離或分選。例如，標(biāo)記可以是生物素、地高辛、多價(jià)陽離子、螯合基和其他配體，包括抗體的配體。C.可視化技術(shù)容易得到用于可視化或者檢測(cè)所標(biāo)記核酸的諸多技術(shù)。此類技術(shù)包括，但不限于，顯微術(shù)、陣列，熒光分析法、Lightcyclers或其他實(shí)時(shí)PCR儀器、FACS分析、閃爍計(jì)數(shù)器、磷像儀、蓋革計(jì)數(shù)器、MRI、CAT、基于抗體的檢測(cè)方法(Western、免疫萸光、免疫組織化學(xué))、組織化學(xué)技術(shù)、HPLC(Griffey等,1997)、光譜學(xué)、毛細(xì)管凝膠電泳(Ciunmins等，1996)、光語學(xué)、質(zhì)譜、放射性技術(shù)和質(zhì)量平衡技術(shù)。當(dāng)采用兩個(gè)或更多個(gè)不同顏色的標(biāo)記時(shí)，可采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)以表征一個(gè)或---個(gè)以上核酸的結(jié)合。此外，本領(lǐng)域普通扭^術(shù)人員完全知道可視化、鑒定和表征所標(biāo)記核酸的方法，因此此類方法可以用作本發(fā)明的部分。還可以使用的工具的實(shí)例包括熒光顯微術(shù)、BioAnalyzer、板閱讀器、Stomi(MolecularDynamics),陣列掃描儀、FACS(熒光激活細(xì)胞分選)或具有激發(fā)和檢測(cè)熒光分子能力的任何儀器。VI.試劑盒本文所述的任何組合物可以包含在試劑盒中。在非限定性實(shí)例中，用于分離miRNA、標(biāo)記miRNA和/或4吏用陣列、核酸擴(kuò)增和/或雜交評(píng)估m(xù)iRNA群體的試劑以及用于從血液樣品中制備樣品的試劑可以包括在試劑盒內(nèi)。試劑盒可以進(jìn)一步包括用于產(chǎn)生或合成miRNA探針的試劑。因此，試劑盒將在適宜容器裝置中包含用于通過摻入標(biāo)記核苷酸或未標(biāo)記核芬酸(隨后標(biāo)記)標(biāo)記miRNA的酶。在某些方面，試劑盒可包括擴(kuò)增試劑。在更多方面，試劑盒可包括不同的支持物，例如玻璃、尼龍、多聚體珠等等，和/或用于偶聯(lián)任何探針和/或靶核酸的試劑。其還可以包括一種或一種以上的緩沖液，例如反應(yīng)緩沖液、標(biāo)記緩沖液、洗滌緩沖液或雜交緩沖液，用于制備miRNA探針的化合物，和用于分離miRNA的成分。本發(fā)明的其他試劑盒可包括制造包含imRNA的核酸陣列的成分，并且因此可以包括例如固體支持物。特別應(yīng)該考慮到用于開展本文所述本發(fā)明方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，為用于制備制備多重標(biāo)記raiRNA的試劑盒和用于制備miRNA探針和/或miRNA陣列的試劑盒。在這些實(shí)施方案中，試劑盒在適宜容器裝置包含下列1、2、3、4、5、6、7、8、9、〗0、1〗、12或更多種(l)poly(A)聚合酶；(2)未修飾核普酸(G、A、T、C、和/或U);(3)修飾核苷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記)；(4)poly(A)聚合酶緩沖液；和，(5)至少一個(gè)微孔濾器；(6)可連接至核苷酸的標(biāo)記；(7)至少一種miRNA探針；(8)反應(yīng)緩沖液；(9)miRNA陣列或用于制造此陣列的成分；(10)乙酸；(ll)醇；(:12)用于制備、分離、富集和純化imRNA或miRNA探針或陣列的溶液。其他試劑包括通常用于處理RNA的那些試劑，例如甲酰胺、上樣染料、核糖核酸酶抑制劑和DNA酶。在特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括包含miRNA探針的陣列，如本申請(qǐng)中所描述。陣列可以具有探針，所述探針對(duì)應(yīng)于特定條件下有機(jī)體或特定組織或器官的所有已知miRNA或者對(duì)應(yīng)于此類探針的亞組。本發(fā)明陣列上的探針亞組可以是或包括經(jīng)鑒定與特定診斷、治療或預(yù)后應(yīng)用關(guān)聯(lián)的那些。例如，陣列可包含一種或一種以上探針，所述探針指示或暗示(〗)疾病或狀況(急性髓性白血病)，(2)對(duì)特定藥物或治療的易感性或抗性；(3)對(duì)藥物或物質(zhì)毒性的易感性；(4)疾病或狀況進(jìn)展或嚴(yán)重性的分級(jí)(預(yù)后)；和(5)對(duì)疾病或狀況的遺傳易感性。對(duì)于包括陣列的任何試劑盒實(shí)施方案，可以存在包含或可用于擴(kuò)增下述序列的核酸分子，所述序列是本文所述任意序列標(biāo)識(shí)號(hào)的全部或部分序列的變體、或與之相同或互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒或陣列可包含用于本文所述序列標(biāo)識(shí)號(hào)所確定miRNA的一種或一種以上探針。上述的任何核酸可作為試劑盒的部分應(yīng)用。試劑盒的成分可以在水介質(zhì)中包裝或者以凍千形式包裝。試劑盒的容器裝置通常包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置，成分可以包裝在這些容器中并且優(yōu)選地適當(dāng)?shù)确职b在這些容器中。在試劑盒中包含一種以上成分的情況下(標(biāo)記試劑和標(biāo)記可以包裝在一起)，試劑盒還通常包含第二、第三或者其他額外容器，額外的成分可以分開置于這些容器中。然而，可以在小瓶中包含成分的多種組合。本發(fā)明試劑盒還代表性地包括包含核酸的裝置和商業(yè)銷售的任何其他密閉的試劑容器。此類容器可包括注塑或吹塑容器，在所述容器中放置期望的小瓶。當(dāng)試劑盒的成分以一種和/或更多種液體溶液提供時(shí)，液體溶液是水溶液，特別優(yōu)選無菌水溶液。然而，試劑和成分可以作為千粉提供。當(dāng)試劑和/或成分作為千粉提供時(shí)，可以通過加入適宜溶劑將粉末重構(gòu)。應(yīng)該考慮到，溶劑還可在另一容器裝置中提供。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記染料作為干的粉末提供。應(yīng)該考慮到在本發(fā)明試劑盒中4是供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、IOOO昭或者至少或至多這些量的干的染料。然后，染料可以重懸于任何適宜溶劑中，例如DMSO。此類試劑盒還可以包括幫助分離標(biāo)記皿RNA的成分。其還可以包括保存或維持miRNA或保護(hù)免受降解的成分。此類成分可以是無RNA酶的或者免受RNA酶污染。此類試劑盒通常會(huì)在適宜裝置中包含不同的容器，用于每一個(gè)別試劑或溶液。試劑盒還可以包括說明書，說明試劑盒成分的使用以及試劑盒中未包括的任何其他試劑的使用。說明書可包括可以實(shí)現(xiàn)的變動(dòng)。本發(fā)明的試劑盒還可以包括下列的一種或一種以上:對(duì)照RNA;無核酸酶水；無RNA酶容器，例如1.5ml管；無RNA酶洗脫管；PEG或葡聚糖；乙醇；乙酸；乙酸鈉；乙酸胺；胍；去污劑；核酸分子量標(biāo)記物；無RNA酶管尖；和RNA酶或DNA酶抑制劑。應(yīng)該考慮到此類試劑是本發(fā)明試劑盒的實(shí)施方案。然而，此類試劑盒不限于上面確定的特定事項(xiàng)，并且可以包括用于操作或表征miRNA的任何試劑。VII.實(shí)施例所附的下列實(shí)施例旨在證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以下發(fā)明人所發(fā)明的代表性技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)良好地實(shí)施本發(fā)明，并且因此可以考慮構(gòu)成其優(yōu)選的實(shí)施模式。然而，依據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，對(duì)已經(jīng)公開的特定的實(shí)施方案中可以做諸多改變，并且仍然得到同樣的或相似的結(jié)果，并未脫離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1:HSA-德R-21轉(zhuǎn)染后的基因表達(dá)分析據(jù)信皿RNA通過結(jié)合至耙mRNA轉(zhuǎn)錄物并且(l)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄物降解或者(2)改變蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)錄物的翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)。導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的翻譯調(diào)節(jié)可產(chǎn)生下游基因產(chǎn)物和基因活性和表達(dá)的改變，翻譯調(diào)節(jié)反過來被這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)。這些眾多的調(diào)節(jié)效應(yīng)顯示為整體mRNA表達(dá)譜的變化。開展微陣列基因表達(dá)分析以鑒定由hsa-miR-21表.達(dá)誤調(diào)節(jié)的基因。合成前體-miR-21(Ambion)或兩種陰性對(duì)照皿RNA(前體-miR-NC，Ambion目錄號(hào)AM17110和前體-miR-NC2,Ambion，目錄號(hào)AM1711l)反向感染進(jìn)入一式四4分的A549細(xì)胞樣品中，每一份為三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。使用siPO:RTNeoFX(Ambion)#4居廠商的推薦以下列參數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在六孔板中每孔200,000個(gè)細(xì)胞，5.0plNeoFX，2.5ml中的30nM終濃度的m涯A。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)收獲。使用RNAqueous-4PCR(Ambion)根據(jù)廠商推薦的方法提取總RNA。mRNA陣列分析由AsuragenServices(Austin,TX)根據(jù)公司標(biāo)準(zhǔn)操作方法開展。使用MessageAmp11-96aRNA擴(kuò)增試劑盒(Ambion:目錄號(hào)1819)2貼總RNA用作輩巴制備和生物素標(biāo)記。使用AgilentBK)ana!yzer2100毛細(xì)管電泳法定量cRNA產(chǎn)量。使用廠商的推薦和下列參數(shù)將標(biāo)記的靶與Affymetr!xmRNA陣歹'J(人HG-U133A2.0陣列)雜交。雜交在AffyraetnxModel640雜交箱于45°C開展16小時(shí)。在AffymetrixFS450Fluidics站上洗滌陣列并著色，運(yùn)行洗滌腳本Midi—euk2v3—450。陣列在AffymetrixGeneChip掃描儀3000上掃描。圖像信號(hào)資料的概括信息、組平均值、帶有顯著性標(biāo)志的p值..log比值和陣列上每一基因的基因注釋使用Affymetrix統(tǒng)計(jì)學(xué)算法MAS5.0(GCOSvl.3)產(chǎn)生。數(shù)據(jù)報(bào)道于包含Affymetrix數(shù)據(jù)和結(jié)果的文件(cab川d)和包含陣列最初圖像和處理后單元強(qiáng)度的文件(.cel)中。數(shù)據(jù)針對(duì)兩種陰性對(duì)照小RNA序列的平均觀察效果標(biāo)準(zhǔn)化，然后一起平均后給出結(jié)果。其表達(dá)水平比平均陰性對(duì)照變化至少0.71og2的一列基因組合在一起。微陣列基因表達(dá)分析結(jié)果示于表1。實(shí)施例2:HSA-miR-21影響的細(xì)胞途徑hsa-mi:R-21對(duì)基因表達(dá)的誤調(diào)節(jié)(表l)影響許多細(xì)胞途徑，這些細(xì)胞途徑代表著控制癌癥和其他疾病和紊亂的潛在治療靶。發(fā)明人確定了纟皮hsa-miR-21表達(dá)誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性級(jí)聯(lián)所影響的細(xì)胞遺傳途徑的身份和性質(zhì)。細(xì)胞途徑分析使用IngenuityPathwaysAnalysis(Version4.G,Ingenuity)Systems,RedwoodCity，CA)開展。特定途徑的改變通過Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher,922)確定。在A549細(xì)胞中受hsa-miR-21過表達(dá)影響最顯著的途徑示于表2。這些數(shù)據(jù)證明，hsa-miR-21直接或間接影響眾多癌癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，并且因此主要影響與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞增殖相關(guān)的功能途徑。這些細(xì)胞過程在多種癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中全部具有整合作用。對(duì)表2所示細(xì)胞途徑中的基因表達(dá)水平的操縱代表著對(duì)癌癥和其他疾病(其中hsa-miR-21的表達(dá)增加或降低在疾病中發(fā)揮作用)的潛在有用的治療法。實(shí)施例3:預(yù)測(cè)的HSA-MIR-21基因靶標(biāo)結(jié)合hsa-miR-2！并被hsa-miR-21調(diào)節(jié)的基因靶使用專有算法miRNATarget預(yù)(Asiiragen)預(yù)測(cè)，該算法是Krek等(2005)所建議的方法的實(shí)現(xiàn)。預(yù)測(cè)的靶基因示于表3。表現(xiàn)出在轉(zhuǎn)染前體-miRhsa-miR-21后的人癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平改變的預(yù)測(cè)的基因靶示于表4。實(shí)施例4:HSA-M[R-21改變的癌癥相關(guān)基因表達(dá)細(xì)胞增殖和存活途徑通常在腫瘤^改變(Hanahan和Weinberg,2000)。發(fā)明人已經(jīng)顯示，hsa-miR-21直接或間接調(diào)節(jié)在這些途徑的調(diào)節(jié)中至關(guān)重要的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物。這些靶中多數(shù)具有先天的致癌活性或胂瘤抑制活性。具有預(yù)后和/或治療價(jià)值的用于治療不同惡性腫瘤的Hsa-miR-21靶示于表5。Hsa-miR-21調(diào)節(jié)編碼與控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程以及蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性有關(guān)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物。例如，hsa-imR-21負(fù)向調(diào)節(jié)腫瘤抑制物神經(jīng)纖維瘤蛋白(:NF1),當(dāng)神經(jīng)纖維瘤蛋白缺失或突變時(shí)則引起神經(jīng)纖維瘤病，這是最常見的遺傳性腫瘤易感性綜合征之一(Rub!n和Gutmann,2005)。NF1功能的缺失也存在于其他惡性肺瘤中，例如星細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和白血病。NF1作為針對(duì)固有的致癌性RAS蛋白質(zhì)的GTP酶激活蛋白(GAP)起作用，通過催化RAS相關(guān)GTP變成GDP而使RAS失活。因此，相應(yīng)于hsa-miR-21水平的提高NF1表達(dá)降低，這可以增強(qiáng)RAS功能，誘導(dǎo)促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶(MAPK)以及磷酸肌醇3-激酶(PBK)途徑，并且因此誘導(dǎo)增殖。傳遞促分裂原信號(hào)的其他hsa-miR-21靶是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(FGF-BP)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體樣蛋白質(zhì)(PDGFR-L)。PDGFR-L也稱作PDGF-受體(3樣鐘瘤抑制物(PRLTS),是跨膜受體和腫瘤抑制物候選物。在廣泛多種的癌癥中顯示，PDGFR-L因雜合性缺失(LOH)或錯(cuò)義和移碼突變而喪失功能(Fujiwara等，1995;Komiya等，1997)。FGF-BP是以無活性形式在細(xì)胞外基質(zhì)硫酸肝素蛋白聚糖上儲(chǔ)存的分泌蜜白(Tass!等，2001;Abiiharbeid等，2006)。其對(duì)FGF-1和FGF-2具有高親和性，并且充當(dāng)?shù)鞍装閭H以動(dòng)員局部?jī)?chǔ)存的FGF。因此，F(xiàn)GF-BP是FGF的正向調(diào)節(jié)物，增強(qiáng)RIF信號(hào)和血管發(fā)生(Tassi等，2001)。FGF-BP表達(dá)是高度組織特異性的并且在多數(shù)正常成人組織中缺乏。然而，F(xiàn)GF-BP在多種類型癌癥中過表達(dá)，包括乳腺、結(jié)腸和前列腺癌癥(Abuharbeid等，2006)。高FGF-BP表達(dá)與腫瘤發(fā)展的早期階段相關(guān)，促成腫瘤血管發(fā)生。我們的數(shù)據(jù)表明，hsa-皿R-21上調(diào)FGF-BPmRNA水平并且因此可能刺激FGF信號(hào)。CTGF(也被稱為胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白8;IGFBP8)最初作為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的促分裂原描述(Bradham等，1991)。與FGF-BP類似，其作為生長(zhǎng)因子活性調(diào)節(jié)劑起作用并且在多種胂瘤中過表達(dá)(Hishikawa等，1999;Shimo等，2001;Un等，2005;Yang等，2005)。CTGF由缺氧誘導(dǎo)并且增強(qiáng)血管發(fā)生以及腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)(Shimo等，2001;Yang等，2005)。然而，CTGF在癌癥中的協(xié)調(diào)作用仍然難以捉摸.并且會(huì)依賴于細(xì)胞的背景(Hishikawa等，1999;Lin等，2005)。受hsa-miR-21調(diào)節(jié)的靶包括內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)-l(EPAS-l)和組蛋白脫乙?；竘(HDAC-l),該兩者均為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。HDAC-1作為一般的轉(zhuǎn)錄抑制劑起作用，并且與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白(Rb)協(xié)作降低細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(Wade,2001)。hsa-imR-21瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致HDAC-1mRNA水平降低，并且因此可能刺激這些細(xì)胞的總體細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，EPAS-1mRNA水平被hsa-miR-21上調(diào)。EPAS-i屬于bHLH(堿性區(qū)域，螺旋-環(huán)-螺旋)類轉(zhuǎn)錄因子，其包含Per-ARNT-Sim(PAS)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Tian等，1997)。其還稱作缺氧可誘導(dǎo)因子2a(HIF-2oc)并且與良好表征的親緣分子HTF-la共享48%序列同源性。與HIF-1a相類似，HIF-2a主要在高度血管化的組織中表達(dá)，其通過缺氧誘導(dǎo)并且驅(qū)動(dòng)從缺氧應(yīng)答啟動(dòng)子元件進(jìn)行基因表達(dá)(Tian等，1997)。例如，HIF-2oc誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)轉(zhuǎn)錄，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是腫瘤血管發(fā)生的主要貢獻(xiàn)者并且是制藥工業(yè)的優(yōu)選藥物靶(Xm等，2001;Ferrara等，2004)。H:IF-2a表達(dá)在多種癌癥中是高的并且與這些胂瘤的血管發(fā)生和侵襲性相關(guān)(Xm等，2002;Baiigo腦等，2004;Yosiiimura等，2004;Holmquist-Mengelbiei.等，2006)。hsa-imR-21除了控制轉(zhuǎn)錄之外，還通過調(diào)節(jié)滯蛋白-5的表達(dá)控制蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，滯蛋白-5是E3遍在蛋白連接酶復(fù)合體中的支架蛋白(Deshaies，1999)。滯蛋白-5輔助靶向蛋白質(zhì)底物，以便由26S蛋白酶體降解。相應(yīng)基因a〃j位于往往與乳癌中LOH相關(guān)的基因組區(qū)域。與之相一致，滯蛋白-5在80%的乳腺癌腫是缺乏的或者表現(xiàn)出表達(dá)降低，并且在該類型癌癥中作為腫瘤抑制物起作用(Fay等，2003)?；谶@些靶的功能以及它們?nèi)绾伪籬sa-nuR-21調(diào)節(jié)，hsa-miR-21表現(xiàn)出具有致癌潛能。具體而言，F(xiàn)GF-BP、CTGF和EPAS-1的hsa-miR-21依賴性調(diào)節(jié)表明了hsa-miR-21在腫瘤血管發(fā)生中的作用。該見解受到我們的觀察結(jié)果支持，即大多數(shù)人癌癥組織表現(xiàn)出hsa-miR-21水平提高。然而，hsa-miR-21還勉強(qiáng)調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因，表明該miRNA可能能夠在適當(dāng)時(shí)候阻斷腫瘤發(fā)展。這些靶當(dāng)中的一個(gè)靶是雄激素受體(AR)，其為信號(hào)傳導(dǎo)分子，在雄激素依賴性前列腺癌癥中高并且是惡性表型所必需的(Feldman和Feldman,2001)。由于hsa-miR-21降低AR的表達(dá)，遞送hsa-imR-21可以為患該類型癌癥的患者提供治療益處。Hsa-miR-21還控制Smad3和細(xì)胞周期蛋白Dl的表.達(dá).，該兩者均是細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)物。細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的輔因子，并且在細(xì)胞周期進(jìn)程中起作用。細(xì)胞周期蛋白Dl.是從G1期過渡到S期所必需的并且在眾多癌癥類型中過表達(dá)(Donnellan和Chetty，1998)。Hsa-miR-21負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)并且因此可以干擾依賴于高水平細(xì)胞周期蛋白Dl的異常細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，Smad3是細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)節(jié)物,并且被hsa-miR-21上調(diào)(Liu和Matsuura，2005)。其他感興趣的hsa-miR-2i耙包括在眾多癌癥類形中過表達(dá)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2),和熱休克蛋白70-1(Hsp-70-l;也被稱為Hsp-70或Hsp-72)(Chandler等，1999)。Hsp-70-l是ATP依賴性蛋白伴侶，其輔助新合成多肽的正確折疊、多蛋白復(fù)合體的裝配和蛋白質(zhì)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Rohde等，2005)。其在多種起源的癌癥中大量表達(dá)并且是先天致癌性的(Jaattela,1995;Volloch和Sherman，1999)。Hsp-70-l的腫瘤中表達(dá)與常規(guī)治療方案的藥物抗性和差的效果相關(guān)(Ciocca等，1993;Vargas-Roig等，1998)?？傊琱sa-miR-21控制著本身為細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物的蛋白質(zhì)的活性。這些靶常常在人癌癥中去調(diào)節(jié)?；谑躮iR-21調(diào)節(jié)的基因和相關(guān)途徑的這種評(píng)論，向多種癌癥細(xì)胞類型中引入hsa-miR-21或抑制性抗-hsa-miR-21將會(huì)產(chǎn)生治療反應(yīng)。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)，以它們向本文所述的那些補(bǔ)充提供可示范程序或其他細(xì)節(jié)的程度明確地通過參考并入本文。美國(guó)專利4,337,063美國(guó)專利4,404,289美國(guó)專利4,405,711美國(guó)專利4,659,774美國(guó)專利4,682,195美國(guó)專利4,683,202美國(guó)專利4,704,362美國(guó)專利4,816,571美國(guó)專利4,870,287美國(guó)專利4,959,463美國(guó)專利5，141，8〗3美國(guó)專利5,143,854美國(guó)專利5，202，231美國(guó)專利5.214,136美國(guó)專利5,221,619美國(guó)專利5,223,618美國(guó)專利5,242,974美國(guó)專利5,264,566美國(guó)專利5，268,486美國(guó)專利5,288,644美國(guó)專利5,324,633美國(guó)專利5,378,825美國(guó)專利5,384,261美國(guó)專利5,399,363美國(guó)專利5，405,783美國(guó)專利5,412,087美國(guó)專利5,424,186美國(guó)專利5,428,148美國(guó)專利5，429,8()7美國(guó)專利5,432,049美國(guó)專利5,436，327美國(guó)專利5,445,934美國(guó)專利5,446，B7美國(guó)專利5,466,468美國(guó)專利5,466，786美國(guó)專利5,468，6〗3美.國(guó)專利5,470,710美國(guó)專利5,470,967美國(guó)專利5,472,672美國(guó)專利5,480,980美國(guó)專利5;492,806美國(guó)專利5,503,980美國(guó)專利5,510,270美國(guó)專利5,525,464美囯專利5,527,681美國(guó)專利5,52.9,756美國(guó)專利5,532,128美國(guó)專利5,543,158美國(guó)專利5,545,531美國(guó)專利5,547,839美國(guó)專利5,554,50〗美國(guó)專利5,554,744美國(guó)專利5，556,752美國(guó)專利5,561,071美國(guó)專利5,571,639美國(guó)專利5,574,〗46美國(guó)專利5,580,726美國(guó)專利5,580,732美國(guó)專利5，583,013美國(guó)專利5,593,839美國(guó)專利5,599,672美國(guó)專利5，599,695美國(guó)專利5,602,240美國(guó)專利5,602,244美國(guó)專利5,610,289美國(guó)專利5,610,287美國(guó)專利5，614，617美國(guó)專利5,623,070美國(guó)專利5,624,711美國(guó)專利5,631,134美國(guó)專利5,637,683美國(guó)專利5,639,603美國(guó)專利5,641,515美國(guó)專利5.645,897美國(guó)專利5,652,099美國(guó)專利5,654,413美國(guó)專利5,658,734美國(guó)專利5,661，028美國(guó)專利5,665,547美國(guó)專利5，667,972美國(guó)專利5,670,663美國(guó)專利5,672,697美國(guó)專利5,677,195美國(guó)專利5,681,947美國(guó)專利5,695,940美國(guó)專利5,700,637美國(guó)專利5,700,922美國(guó)專利5,705,629美國(guó)專利5,708，153美國(guó)專利5,708,154美國(guó)專利5,714，606美國(guó)專利5,728,525美國(guó)專利5,739,169美國(guó)專利5,744,305美國(guó)專利5,760,395美國(guó)專利5，763，167美國(guó)專利5，770,358美國(guó)專利5，777，092美國(guó)專利5,789,162美國(guó)專利5，792,847美國(guó)專利5,800,992美國(guó)專利5,801,005美國(guó)專利5,807,522美國(guó)專利5，824，3li美國(guó)專利5,830,645美國(guó)專利5,830,880美國(guó)專利5,837,96美國(guó)專利5，846，225美國(guó)專利5,846,945美國(guó)專利5，847,219美國(guó)專利5,856,174美國(guó)專利5,858,988美國(guó)專利5;859,22J美國(guó)專利5，871,928美囯專利5,872,232美國(guó)專利5，876,932美國(guó)專利5,886,165美國(guó)專利5,919,626美國(guó)專利5,922,591美國(guó)專利6,004,755美國(guó)專利6,040,193美國(guó)專利6,087,102美國(guó)專利6,251,666美國(guó)專利6,368,799美國(guó)專利6,383,749美國(guó)專利6,617,112美國(guó)專利6,638,7〗7美國(guó)專利6,720,138美國(guó)專利6,723,509美國(guó)專利序列號(hào)09/545,207美國(guó)專利序列號(hào)10/667,126矢閨下7f'j/^夕'j"TlJ/141,707美國(guó)專利序列號(hào)！1/273,640美國(guó)專利序列號(hào)11/349,727美國(guó)專利序列號(hào)60/575,743美國(guó)專利序列號(hào)60/649,584美國(guó)專利序列號(hào)60/650,807Abuharbeid等，IntJBiochemCellBiol,38(9):1463-1468,2006.Akiba等，IntJOncol,18(2):257-264,2001.Aspland等，Oncogene,20(40):5708-5717,2001.Bagga等，Cdl,122(4):553-563,2005.Bandres等，Moi.Cancer5:29-,2006.Bangoura等，WorldJGastroenterol,10(4):525-530,2004.Bradl麗等，JCellBiol,114(6):1285-1294,1991.Bui等，Br.TCancer,77(2):319-324,1998.Calin和Croce，NatRevCancer,6(11):857-866,2006.Carrington和Ambios,301(5631):336-338,2003.Chan等，CancerRes,65(14):6029-6033,2005.Chandler等，IntJCancer,81(3):451-458,1999.Cheng等，Nucl.Ac!d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án)利要求31的方法，其中細(xì)胞活性被降低，細(xì)胞增殖被降低，細(xì)胞轉(zhuǎn)移被降低或者細(xì)胞對(duì)治療的敏感性增加。33.權(quán)利要求31的方法，其中癌癥細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肺細(xì)』包、肝細(xì)胞、腦細(xì)月包、乳腺細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、血液細(xì)胞、白血病細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、胃細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、宮頸細(xì)胞、食管細(xì)胞、胰細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、腎細(xì)胞或甲狀腺細(xì)胞。34.4又利要求24的方法，其中miR-21抑制劑是重組核酸。35.權(quán)利要求34的方法，其中重組核酸是DNA。36.權(quán)利要求35的方法，其中重組核酸是病毒載體或質(zhì)粒DNA載體。37.治療診斷患有或者懷疑患有或者懷疑發(fā)展成與miRNA所調(diào)節(jié)基因相關(guān)病理狀況或疾病的患者的方法，包4舌步驟(a)向患者施用一定量分離的核酸，所述一定量分離的核酸包含足以調(diào)節(jié)細(xì)胞途徑或者生理途徑的量的miR-2]抑制劑；和(b)施用第二治療法，其中細(xì)胞途徑或者生理途徑的調(diào)節(jié)使患者對(duì)第二治療法敏感。38.權(quán)利要求37的方法，其中一個(gè)或一個(gè)以上細(xì)胞途徑或者生理途徑包含表l、3、4或5中鑒定的一個(gè)或一個(gè)以上基因。39.選擇待向患有、懷疑患有或者傾向發(fā)展成病理狀況或者疾病的受試者施用的miRNA的方法，包括(a)確定選自表1、3、4或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)譜；(b)基于表達(dá)i普評(píng)估受試者對(duì)miRNA治療的lt感性；和(c)基于所評(píng)估的壽i感性選4奪一個(gè)或一個(gè)以上miRNA。40.4又利要求39的方法，還包括用I、2、4、5、6、7、8、9、IO或更多個(gè)miRNA治療受試者。41.權(quán)利要求40的方法，其中每一miRNA單獨(dú)施用或者一種或一種以上組合施用。42.權(quán)利要求41的方法，其中i川'RNA在單一組合物中。43.評(píng)估細(xì)胞、組織或者受試者的方法，包括在至少一個(gè)樣品中評(píng)估m(xù)iR-21的表達(dá)與評(píng)估來自表l、3、4或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)相聯(lián)合。44.評(píng)估樣品中miR-21狀態(tài)的方法，包括步驟(a)評(píng)估樣品中來自表1、3、4或5的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)；和(b)基于樣品中mi.R-21表達(dá)水平確定miR-21狀態(tài)。全文摘要本發(fā)明涉及用于鑒定被miR-21調(diào)節(jié)的基因或者基因途徑，使用miR-21調(diào)節(jié)基因或者基因途徑，使用該譜評(píng)估患者狀況和/或用適當(dāng)miRNA治療患者的方法和組合物。文檔編號(hào)C12N15/11GK101622349SQ200780049435公開日2010年1月6日申請(qǐng)日期2007年12月10日優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日發(fā)明者大衛(wèi)·布朗,安德里斯·G·巴德,查爾斯·D·約翰遜,麥克·拜羅姆申請(qǐng)人:奧斯瑞根公司