專利名稱：骨髓細(xì)胞用于長期培養(yǎng)胰腺胰島細(xì)胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來說涉及胰島細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及骨髓細(xì)胞用于在移植前長期培養(yǎng)并可能擴(kuò)增胰島細(xì)胞的用途。本發(fā)明還包括在骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)的胰島細(xì)胞在患者中體內(nèi)替代人胰島功能的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是一個(gè)重大且病例不斷增長的全球性健康問題[1 ]?；跇?biāo)準(zhǔn)胰島素的治療方案盡管管理血糖水平，但不是治愈性的，患者仍遭受該病的許多長期并發(fā)癥[2,3]。胰腺移植可治愈該病，但受限于組織可獲得性和對免疫抑制療法的響應(yīng)[4]。為了保持胰島細(xì)胞的存活力，需要由供體相對快速地收集胰腺。標(biāo)準(zhǔn)移植免疫抑制方案對胰腺移植物并非總是有效。而且，免疫抑制療法可導(dǎo)致對腎臟的進(jìn)一步傷害，這常常使需要胰腺移植的患者的功能受損。或者，胰島(3細(xì)胞移植可能有效，且?guī)缀醪恍枰土业拿庖咭种品桨?；然而，胰島細(xì)胞的可用性不如胰腺[5]。 一次成功的胰島細(xì)胞移植經(jīng)常需要由2個(gè)或3個(gè)供體收集細(xì)胞，這進(jìn)一步限制了可通過該方法治療的個(gè)體的數(shù)目。分離用于移植的胰島(3細(xì)胞也是重要的。
在胰島的分離、儲存和運(yùn)輸過程中經(jīng)歷的事件與導(dǎo)致胰島功能喪
失并限制胰島移植對糖尿病患者的治療潛力的細(xì)胞死亡相關(guān)。采用(3細(xì)胞胰島移植方案的關(guān)鍵問題涉及在體外或體內(nèi)難以保持存活的胰島以及不能通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增胰島組織。研究已表明，在由供體收獲胰腺后盡快進(jìn)行的由胰腺收獲之間沒有培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，胰島細(xì)胞移植是最成功的。不出意料的是，在進(jìn)行大部分移植的中心的移植也是最成功的。由于這種強(qiáng)有力的培養(yǎng)環(huán)境的缺乏，所以用于胰島細(xì)胞移植的供體必須在組織收獲時(shí)鄰近較大的移植中心，受體必須生活在較大的移植中心附近，經(jīng)常長時(shí)間等待一個(gè)以上的供體。
發(fā)明概述
本發(fā)明包括持續(xù)維持培養(yǎng)中的胰島(3細(xì)胞存活力、結(jié)構(gòu)和/或功能的方法。所述方法包括將胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞在降低炎性細(xì)胞因子釋放和凋亡的同時(shí)，促進(jìn)胰島p細(xì)胞的生長和存活力，并改善(3胰島細(xì)胞的功能和形態(tài)。已表明胰島細(xì)胞保持胰島(5細(xì)胞功能，這通過基礎(chǔ)和誘導(dǎo)的胰島素釋放證實(shí)。臍血細(xì)胞和分離的外周CD34+血細(xì)胞不能支持(3胰島細(xì)胞生長或增加存活。
本發(fā)明包括將胰島(3細(xì)胞與多種骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)以擴(kuò)增培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞的方法，其包括降低共培養(yǎng)的凋亡的方法。發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞至少部分通過減少凋亡促進(jìn)胰島(3細(xì)胞生長，也通過增加胰島(3細(xì)胞數(shù)促進(jìn)胰島(3細(xì)胞生長。擴(kuò)增胰島細(xì)胞的能力是降低單個(gè)受體需要多個(gè)供體所必需的，從而潛在地允許廣泛應(yīng)用胰島(3細(xì)胞移植。
本發(fā)明包括將胰島(3細(xì)胞與多種骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)以促進(jìn)培養(yǎng)中的胰島聚集的方法。骨髓細(xì)胞刺激胰島聚集的過程。
本發(fā)明進(jìn)一步包括降低培養(yǎng)胰島(3細(xì)胞的細(xì)胞因子和其它炎性調(diào)節(jié)物的釋放的方法。所述方法包括將胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)。與沒有骨髓細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞相比，胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共
7培養(yǎng)降低炎性細(xì)胞因子如白介素(IL)-1(3的釋放。這可能導(dǎo)致患者響應(yīng)于胰島(3細(xì)胞移植的炎性反應(yīng)下降。
本發(fā)明包括將胰島(3細(xì)胞與多種骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)以增加內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因(包括胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子)的基因表達(dá)的方法。所述因子包括內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因GCG (胰高血糖素，a-細(xì)胞基因)、INS(胰島素，P-細(xì)胞基因)和SST (促生長素抑制素，Y-細(xì)胞基因)；以及(5細(xì)胞胰腺和十二指腸同源框1轉(zhuǎn)錄因子(PDX1或IPF1)、神經(jīng)元素3(NGN3)、成對盒基因6 (PAX6)、胰島-1 (ISL1)、 v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A (MAFa)和Mist 1。所述方法包括將胰島p細(xì)胞與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)。所述方法進(jìn)一步包括增加NGN3的表達(dá)，以增加(3細(xì)胞再生。所述方法進(jìn)一步包括通過增加PDX1 、IPF1 、NGN3、PAX6、ISL1和MAFa中至少一種的表達(dá)促進(jìn)p細(xì)胞的長期存活。所述方法還包括通過增加Mistl的表達(dá)促進(jìn)新胰腺組織組織化的方法。
本發(fā)明包括治療需要胰島細(xì)胞移植的個(gè)體的方法，其包括獲得胰島P細(xì)胞，在骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)胰島細(xì)胞，并將合并的胰島P細(xì)胞和骨髓細(xì)胞植入需要治療的患者中。該方法包括移植骨髓，以通過直接移植在骨髓(優(yōu)選自體骨髓)存在下培養(yǎng)的胰島細(xì)胞，在需要治療的患者體內(nèi)改善和/或替代胰腺細(xì)胞功能，改善被降低的或喪失的胰腺細(xì)
胞功能。需要胰島(3細(xì)胞移植的患者可為罹患I型或II型糖尿病的個(gè)體。糖尿病可為由于疾病或由于至少部分胰腺切除(如胰腺癌)而損害胰腺引起的。本發(fā)明可進(jìn)一步包括選擇或鑒定需要胰島細(xì)胞移植或者需要改善或替代胰島細(xì)胞功能的患者。本發(fā)明還可以包括監(jiān)測患者的改善的胰腺活性。
本發(fā)明進(jìn)一步包括實(shí)施本發(fā)明方法的藥盒。所述藥盒可以包括例如骨髓細(xì)胞或如何獲得骨髓細(xì)胞的說明書，以及如何通過本發(fā)明的方法培養(yǎng)胰腺細(xì)胞的說明書。藥盒可進(jìn)一步包括在骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)胰島細(xì)胞的試劑，或者測定與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)生長的胰島細(xì)胞的存活力、功能和/或特征的試劑。附圖簡述
圖la-ld.有或沒有骨髓細(xì)胞培養(yǎng)6天或156天的胰島細(xì)胞的相差顯微鏡檢查(圖像放大倍數(shù)20x)。圖la顯示了單獨(dú)培養(yǎng)6天的胰島(3細(xì)胞。圖lb顯示了與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)6天的胰島(3細(xì)胞。圖lc顯示了單獨(dú)培養(yǎng)156天的胰島(3細(xì)胞。圖ld顯示了與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)156天的胰島(3細(xì)胞。
圖2a-c.使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記進(jìn)行的胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的免疫熒光和免疫組織化學(xué)分析。圖2a顯示了釆用胰島素原抗體(由箭頭指示)、CD45(骨髓細(xì)胞，由細(xì)箭頭指示)(下圖)的熒光免疫組織化學(xué)染色和采用DAPI的核染色。圖2b顯示了對胰島素原(由粗箭頭指示)和CD45 (由細(xì)箭頭指示)的免疫組織化學(xué)染色。(圖像放大倍數(shù)x40)。圖2c為柱形圖，顯示了與第28天的骨髓-胰島細(xì)胞共培養(yǎng)物相比單獨(dú)的胰島培養(yǎng)物中的胰島素原陽性細(xì)胞數(shù)。(*=p<0.01， n = 6)。
圖3.在培養(yǎng)153天時(shí)使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記進(jìn)行的胰島a和P細(xì)胞的免疫熒光分析。圖像為相差顯微鏡檢查(左圖)和在胰島表面(中圖)和中間(右圖)的共聚焦顯微鏡檢查。a細(xì)胞用胰高血糖素抗體染色(由亮箭頭指示)，P細(xì)胞用胰島素原抗體染色(由暗箭頭指示)。
圖4a-b.有或沒有骨髓細(xì)胞一起生長的胰島P細(xì)胞的功能分析。圖4a為經(jīng)過一系列時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)胰島素分泌圖。圖4b為經(jīng)過一系列時(shí)間點(diǎn)一直到第204天響應(yīng)于高葡萄糖的胰島素釋放圖。(* = 口<0.01,n = 6)。
圖5a-f.培養(yǎng)胰島的生長。圖5a為測定的示意圖。圖5b顯示了在不存在(上圖)或存在(下圖)骨髓細(xì)胞的情況下于格柵上生長的胰島。圖5c為定量培養(yǎng)胰島生長的柱形圖。(* = p<0.05， n = 6)。圖5d顯示了在新生(左圖)或重建(右圖，超過13個(gè)月)過程中與骨髓細(xì)胞一起在柵格上生長的胰島(放大倍數(shù)5x)。圖5e為在圖5d的右圖中顯示的胰島由培養(yǎng)的第322天至第406天的胰島素釋^:圖。圖5f為在第360天、第369天和第399天響應(yīng)于高葡萄糖刺激的胰島素分泌圖。僅胰島的 培養(yǎng)物于相同的時(shí)間點(diǎn)沒有檢測到胰島素分泌。
圖6.使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記于第153天進(jìn)行的有或沒有骨髓 細(xì)胞的胰島(3細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)和免疫熒光分析。左像為有(上圖) 或沒有(下圖)骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞的相差顯微鏡檢查。右圖 圖像為采用Ki67和胰島素原(由箭頭指示)的抗體的熒光免疫組織化 學(xué)。(圖像放大倍數(shù)x20)。
圖7a-e.使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記于第190天進(jìn)行的與骨髓細(xì)胞 一起的胰島(3細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)、免疫熒光和功能性分析。圖7a為由 與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)190天的胰島產(chǎn)生的組織的圖像，條棒代表lcm。所 述組織為約1.8cm長，具有清晰的3維結(jié)構(gòu)。圖7b和c為與圖7a中 所示相仿的冷凍組織的5 nm橫斷切片。圖7b顯示了采用蘇木精和曙 紅的組織化學(xué)染色，以揭示組織結(jié)構(gòu)。箭頭指示在切片中出現(xiàn)的被多 孔支架樣組織環(huán)繞的胰島樣結(jié)構(gòu)。圖7c，采用抗人胰島素原抗體的免 疫熒光染色(由b箭頭指示)、釆用抗人胰高血糖素抗體的細(xì)胞(由箭頭 a指示)和核染色DAPI。圖7d為柱形圖，其顯示了沒有(I)或有(B+I) 骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)胰島(3細(xì)胞于第190天的基線胰島素釋放。圖7e顯示 沒有(I)或有(B+I)骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)胰島I3細(xì)胞于第190天響應(yīng)于葡萄糖 刺激的胰島素釋放的柱形圖。(p<0.05，相對于只有胰島的培養(yǎng)物。 圖像放大倍數(shù)20x)。
圖8.在共培養(yǎng)的前48小時(shí)過程中使用活細(xì)胞膜染料進(jìn)行的胰島 P細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的免疫熒光分析。將用PKI-26GL標(biāo)記的人骨髓細(xì)胞 與用PK-2GL染色的胰島共培養(yǎng)，并用對核染色特異性的抗胰島素原 抗體和DAPI進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以研究培養(yǎng)中骨髓細(xì)胞和胰島P 細(xì)胞之間的相互作用。圖8a顯示了 7小時(shí)后的細(xì)胞。圖8b顯示了 24 小時(shí)后的細(xì)胞。圖8c顯示了 48小時(shí)后的細(xì)胞。圖8d顯示了96小時(shí) 后的細(xì)胞。(圖像放大倍數(shù)x20，箭頭指示骨髓和與(3細(xì)胞一起的骨髓 共定位)。圖9a-j.在將骨髓細(xì)胞和胰島(3細(xì)胞引入共培養(yǎng)后以20分鐘間隔 記錄時(shí)間間隔顯微鏡檢查的圖像。分別用PKH26和PKH 2單獨(dú)地標(biāo) 記骨髓細(xì)胞和胰島細(xì)胞，然后一起培養(yǎng)。圖像a-j為96小時(shí)培養(yǎng)當(dāng)中 的一幕。粗箭頭指示骨髓，細(xì)箭頭指示胰島中的骨髓釋;^欠物質(zhì)。(圖像 放大倍數(shù)x20)。
圖lOa-f.記錄在柵格上彼此遷移(

圖10a-d)并最終融合(圖10e)的 3個(gè)胰島細(xì)胞的時(shí)間間隔顯微鏡檢查的圖像。圖10f得自其中標(biāo)記骨 髓細(xì)胞的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)顯示了骨髓細(xì)胞遷移入一體化的胰島中。
圖11.使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的胰島(3細(xì)胞 與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的IL-lp水平。圖lla圖示了培養(yǎng)物 中的IL-1(3釋放。圖lib圖示了在高葡萄糖(20mM)刺激后在培養(yǎng)物中 的IL-ip釋放。(n = 6, * = p<0.001)。
圖12.使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的與骨髓細(xì) 胞一起的胰島(3細(xì)胞共培養(yǎng)物的凋亡的免疫熒光分析。圖12a顯示了 依據(jù)(TUNEL)測定評價(jià)在沒有(I)或有(B+I)骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)物中的胰 島P細(xì)胞凋亡的免疫熒光分析。用胰島素原抗體于7小時(shí)(7H)、 48小 時(shí)(48H)和3周(3W)培養(yǎng)期進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)染色指示胰島P細(xì) 胞。圖11b為在所示時(shí)間以百分率定量凋亡細(xì)胞對總(3細(xì)胞的圖示。(n =24， * = p<0.01)。
圖13.支持培養(yǎng)中的胰島p細(xì)胞功能的非骨髓細(xì)胞類型的分析。 圖13為單獨(dú)地或與臍血細(xì)胞、外周血細(xì)胞或外周血CD34+細(xì)胞共培 養(yǎng)的胰島P細(xì)胞在31天時(shí)間段內(nèi)的胰島素釋放圖。
圖14.在糖尿病小鼠模型體內(nèi)評價(jià)共培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞和骨髓細(xì) 胞。圖14為在用單獨(dú)培養(yǎng)的胰島I3細(xì)胞或與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島[3 細(xì)胞移植的小鼠的血糖水平圖。
圖15a-f.骨髓促進(jìn)胰島(3細(xì)胞遷移的體外證實(shí)。胰島聚集形成的 時(shí)間間隔顯微鏡檢查圖像。圖15a-e，放大倍數(shù)5x。在圖15f中的胰 島表面上的暗色指示骨髓細(xì)胞遷移入胰島中。(放大倍數(shù)20x)。
ii圖16a-c.圖16a為在沒有或有骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞中 的GCG和INS表達(dá)水平變化倍數(shù)圖。圖16b為在沒有或有骨髓細(xì)胞 一起培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞中的SST和NGN3表達(dá)水平變化倍數(shù)圖。圖16c 在沒有或有骨髓細(xì)胞一起生長的胰島(3細(xì)胞中的IPF1、 ISL1、 PAX6、 MIST1和MAFA表達(dá)水平變化倍數(shù)圖。
定義
"持續(xù)期"或"持續(xù)時(shí)間段"被理解為這樣的時(shí)間段其足以保 存胰島f3細(xì)胞，使得胰島P細(xì)胞的胰島素釋;^文功能保留，優(yōu)選伴有胰島 組織生長。在某些實(shí)施方案中，所述持續(xù)期為至少約30天，優(yōu)選至 少約60天，更優(yōu)選至少約90天，再更優(yōu)選至少約120天。
"胰島P細(xì)胞功能"可通過眾多測定中的任一種定義，所述測定 包括但不限于形態(tài)測定、免疫組織化學(xué)測定和功能測定。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，胰島(3細(xì)胞功能通過靜息細(xì)胞中或響應(yīng)于葡萄糖的胰島素 釋放測定的活性定義。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島(3細(xì)胞被定義為 具有在約20-100個(gè)胰島中在30分鐘內(nèi)(響應(yīng)于采用20 fiM葡萄糖的處 理)釋放至少約150單位的胰島素(IEQ)的功能。確切測定胰島細(xì)胞功 能的方法不是本發(fā)明的限制因素。
"增加的胰島(3細(xì)胞存活力"-波理解為在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)或隨時(shí)間變 化觀察到的較低的細(xì)胞死亡率，優(yōu)選與其中胰島(3細(xì)胞在沒有骨髓細(xì) 胞的情況下培養(yǎng)的對照培養(yǎng)物相比。依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 (例如錐蟲藍(lán)染色排除)測定活細(xì)胞數(shù)，以鑒定活細(xì)胞，并使用血細(xì)胞 計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定在特定面積或容量中的活細(xì)胞數(shù)。也可 以使用眾多市售可得的凋亡測定或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 測定細(xì)胞存活力。與對照樣品相比樣品中的凋亡細(xì)胞百分率較低表明 胰島P細(xì)胞存活力增加。凋亡測定可與免疫組織化學(xué)染色組合，以證 實(shí)胰島(3細(xì)胞的一致性。測定胰島(3細(xì)胞存活力的具體方法不是本發(fā)明 的限制因素。本文所理解的"胰島"為在胰腺中存在的細(xì)胞聚簇，其分泌胰島 素和其它激素，并形成器官的內(nèi)分泌部分，有時(shí)被稱為郎格罕氏島。
胰島占胰腺質(zhì)量的約1-2%。在健康成人胰腺中有約100萬個(gè)胰島，其 在整個(gè)器官中均勻分布，它們的合并重量為1-1.5克。每個(gè)胰島均含 有約1000個(gè)細(xì)胞，直徑為50-500 pm。產(chǎn)胰島素的(3細(xì)胞占胰島細(xì)胞 的約65-80%，釋放胰高血糖素的a細(xì)胞占胰島細(xì)胞的約15-20%。胰島 細(xì)胞還包括產(chǎn)促生長素抑制素的S細(xì)胞(約3-10%)和含胰腺多肽的PP 細(xì)胞(1%)。
"獲得細(xì)胞"在本文被理解為制備、購買或以其它方式獲得細(xì)胞。 在"胰島(3細(xì)胞擴(kuò)增"中的術(shù)語"擴(kuò)增"被理解為隨著時(shí)間推移 增加培養(yǎng)物的存活的和/或功能性的胰島(3細(xì)胞的數(shù)量。擴(kuò)增可通過促
進(jìn)既有的胰島(3細(xì)胞中的細(xì)胞分裂或骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u細(xì)胞或這二 者而發(fā)生。
術(shù)語"(在)培養(yǎng)物中"或"培養(yǎng)"或"(在)培養(yǎng)中"可被理解為 包括在適宜的溫度、C02和營養(yǎng)物條件下細(xì)胞在例如有蓋培養(yǎng)皿中的 生長。細(xì)胞例如可在諸如來自動物、植物或海藻的天然或人工蛋白基 質(zhì)存在下培養(yǎng)。在適宜的上下文中，培養(yǎng)例如可被理解為細(xì)胞在非天 然條件下的生長。例如，細(xì)胞可在植入諸如小鼠的動物中的培養(yǎng)生長， 包括在動物的特定器官中的培養(yǎng)生長，或在轉(zhuǎn)移入動物之前在離體器 官培養(yǎng)中培養(yǎng)生長。
在"保留/保持胰島|3細(xì)胞功能"中的術(shù)語"保留，，或"保持"被 理解為包括與沒有骨髓細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞相比胰島(3細(xì)胞存活 力增加，和/或胰島(3細(xì)胞功能改善，和/或胰島P細(xì)胞形態(tài)改善。
術(shù)語"患者"是指活體生物。在某些實(shí)施方案中，活體生物為動 物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者為哺乳動物。在某些實(shí)施方案中， 患者為馴養(yǎng)的哺乳動物。在某些實(shí)施方案中，患者為人。患者包括人、 猴、狗、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、山羊和綿羊。所述患者可^f皮診斷 為患有糖尿病。在其它實(shí)施方案中，所述患者已被診斷為具有一些其它胰腺疾病。
術(shù)語"選擇患者"或"鑒定患者"被理解為基于具體特征選擇混 合的個(gè)體群體中的一個(gè)或多個(gè)成員，所述具體特征包括但不限于體 癥、依據(jù)診斷方法確定的臨床特征。
術(shù)語"監(jiān)測患者"被理解為在植入胰島細(xì)胞之后，優(yōu)選在植入胰 島細(xì)胞之前和之后觀察患者的改變的胰島細(xì)胞功能，優(yōu)選改善的胰島 細(xì)胞功能。
本文提供的范圍被理解為所述范圍內(nèi)所有值的簡略表達(dá)。例如，
1-50秒的時(shí)間被理解為包括1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49或50秒。
除非另有說明或由上下文顯而易見，否則本文使用的術(shù)語"或" 被理解為是包括端點(diǎn)的。
除非另有說明或由上下文顯而易見，否則本文使用的術(shù)語"一 個(gè)"、"一種"、"所述，，和"該"被理解為是單數(shù)或復(fù)數(shù)。
發(fā)明詳述和優(yōu)選的實(shí)施方案
在本研究中，研究同種異體骨髓在體外支持供體人胰島的內(nèi)分泌 功能的能力。已表明人胰島(3細(xì)胞和同種異體骨髓的共培養(yǎng)增加胰島 存活和功能，最后形成的新胰腺內(nèi)分泌組織能夠維持微環(huán)境，以保持 胰島結(jié)構(gòu)和P細(xì)胞功能。
已表明骨髓細(xì)胞能夠在降低胰島細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子如IL-ip釋 放的同時(shí)刺激胰腺內(nèi)分泌組織生長。與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)還減少胰島細(xì) 胞凋亡。最終表明骨髓細(xì)胞在長期培養(yǎng)(超過13個(gè)月)下將人胰島細(xì)胞 重建成功能性胰腺內(nèi)分泌胰島組織。這些作用^皮發(fā)現(xiàn)是骨髓特異性 的。臍血細(xì)胞和/或分離的外周血CD34+細(xì)胞對于在體外維持胰島功能 或存活無益。這表明，骨髓在支持人內(nèi)分泌胰腺組織方面提供了獨(dú)特
14的優(yōu)勢，該優(yōu)勢可顯著改善實(shí)現(xiàn)胰島素非依賴性的成功率。
本發(fā)明包括胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)物。然而，在優(yōu)選的
實(shí)施方案中，比率為約25-100個(gè)胰島對約l-5xl(^個(gè)骨髓細(xì)胞。要理 解的是，胰島對骨髓細(xì)胞的其它比率是可能的，培養(yǎng)物可以包括其它 的細(xì)胞類型，例如骨髓基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和胰腺a細(xì)胞。
盡管不希望受到作用機(jī)制的束綽，但數(shù)據(jù)提示，骨髓細(xì)胞通過降 低胰島細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放(包括IL-1 (3)增加胰島細(xì)胞的形態(tài)、存活力 和/或功能。這已被提出導(dǎo)致炎性因子釋放下降和凋亡或細(xì)胞死亡下 降。還表明共培養(yǎng)增加胰腺特異性基因和與再生相關(guān)的生長因子的表 達(dá)。本文公開的數(shù)據(jù)提示，盡管某些骨髓細(xì)胞呈現(xiàn)(3細(xì)胞的表型，但 可能是已證實(shí)的存活和生長作用的較小組分。更有可能的是本發(fā)明的 共培養(yǎng)方法的已證實(shí)的抗凋亡作用基于旁分泌作用，其中一種旁分泌 作用可為抑制炎性細(xì)胞因子白介素-1(3 [25,28-30]。由骨髓旁分泌生長 因子刺激的胰島細(xì)胞增殖和生長有可能是促成重構(gòu)胰島組織的主要 因素[20,31-33]。
本發(fā)明不限于胰島(3細(xì)胞與完整骨髓的共培養(yǎng)。通過梯度、細(xì)胞
知的。預(yù)期一個(gè)或多個(gè)亞群骨髓細(xì)胞可在一定持續(xù)培養(yǎng)期內(nèi)有效提升 培養(yǎng)胰島(3細(xì)胞存活力、形態(tài)和功能。所述方法同樣不受細(xì)胞源限制。 要理解的是，同種異體胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)方法可用于任 何哺乳動物胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)。術(shù)語"哺乳動物"在本文 用于指溫血動物，例如嚙齒動物、兔或靈長類動物患者，尤其是人類 患者。特定的目標(biāo)嚙齒動物和靈長類動物包括代表公認(rèn)的人類疾病才莫 型的那些動物，包括豬、黑猩猩、綿羊、山羊、馬、小鼠、大鼠、兔 和猴。特定的目標(biāo)人患者包括患有、懷疑患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有胰腺細(xì)胞 功能下降或喪失的那些患者。而且，包括在得自棵小鼠或沒有免疫系 統(tǒng)的其它哺乳動物的骨髓中培養(yǎng)人胰島細(xì)胞的方法在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。
15本文公開的數(shù)據(jù)表明，同種異體人骨髓與(3-細(xì)胞胰島的共培養(yǎng)允 許隨著胰島組織生長在體外保持胰島數(shù)和胰島素釋放功能達(dá)某一持 續(xù)期(包括13個(gè)月以上)。在先前的研究中，培養(yǎng)的人胰島一般在3-4 周后失去功能和存活力[27。在這些研究中，胰島中的細(xì)胞包括a和P 細(xì)胞，其保持了基線胰島素生產(chǎn)和對葡萄糖挑戰(zhàn)的響應(yīng)。這些觀察結(jié) 果提示使用與同種異體骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)物進(jìn)行胰島細(xì)胞移植的直 接策略。然而，本發(fā)明的方法不限于在胰島細(xì)胞培養(yǎng)生長后使用所述 胰島細(xì)胞。
本發(fā)明由以下的實(shí)施例進(jìn)一步闡述。提供這些實(shí)施例是為了幫助 理解本發(fā)明，不能^皮視為限制本發(fā)明。在整個(gè)申請中提及的所有參考 文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請的內(nèi)容以及圖都整體在此引入作為參考。
實(shí)施例
實(shí)施例1-細(xì)胞染色方法
使用熒光和化學(xué)染料進(jìn)行細(xì)胞染色和免疫熒光的方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員眾所周知的。眾多的實(shí)例包括這樣的染色方法。提供示例性 的細(xì)胞染色方法。用3%多聚甲醛固定在腔室載玻片上生長的細(xì)胞， 接著使細(xì)胞接觸10%正常山羊血清。在不洗滌的情況下印跡載玻片， 施加原初抗體混合物，然后在濕潤的腔室中于4°C溫育載玻片過夜。 洗滌載玻片3次，之后于室溫接觸第二抗體45分鐘。在洗滌后，施 加稀釋的第二抗體，溫育載玻片15分鐘。隨后用PBS徹底洗滌載玻 片，以上過程任選地用第二種熒光顏色(例如DAPI)和/或第三抗原檢 測抗體重復(fù)。在結(jié)束該過程時(shí)，用熒光封片介質(zhì)和蓋玻片覆蓋載玻片。 然后使用共聚焦熒光顯微鏡觀測樣品并拍照[22]。
實(shí)施例2-人骨髓和人胰島P細(xì)胞的共培養(yǎng)
來自正常供體的人胰島組織得自賓夕法尼亞大學(xué)人類胰島實(shí)驗(yàn)室ICR基礎(chǔ)科學(xué)胰島分配計(jì)劃(ICR Basic Science Islet Distribution Program, Human Islet Laboratory, University of Pennsylvania (Philadelphia, PA))的胰島資源中心(Islet Resource Centers (ICR))、 Joslin 糖尿病中心(Joslin Diabetes Center (Boston, MA))和希望之城國家醫(yī)療 中心(City of Hope National Medical Center (Duarte, CA))。這些細(xì)胞的 使用得到Roger Williams醫(yī)院(Roger Williams Hospital)的IRB和ICR 委員會的批準(zhǔn)。來自正常供體的人骨髓在簽署已被Roger Williams醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查 委員會(Roger Williams Hospital Institutional Review Committee (IRB)) 批準(zhǔn)的適宜知情同意書后獲得。按照生產(chǎn)商的指引通過Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences; Amersham, UK)分離骨髓單核細(xì)胞。然后 用5% FCS/PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸浮在培養(yǎng)基(參見下文)中。使用 錐蟲藍(lán)染色評價(jià)細(xì)胞存活力。在志愿供體死亡后48小時(shí)內(nèi)由胰島細(xì)胞資源中心(ICR)得到人胰 島(純度〉90%，存活力〉95%)。于濕潤的37。C溫育箱、5%(302中在 補(bǔ)加10。/。熱失活胎牛血清(HiFBS)、 5.5 mM葡萄糖、10 mM HEPES 和1% P/S的RPMI 1640 (生產(chǎn)商)中培養(yǎng)50胰島當(dāng)量(IEQ)/ml和1 x 106個(gè)/1111同種異體全BM細(xì)胞。圖la-d顯示了在沒有(a和c)或有(b和d)骨髓細(xì)胞的情況下培養(yǎng)6 天(a和b)或156天(c和d)的胰島(3細(xì)胞。在僅6天后就看到形態(tài)差異。 在沒有骨髓細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞開始形成單層(圖la)，而在骨髓 細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞沒有顯示出相似的形態(tài)損失。骨髓細(xì)胞 環(huán)繞在胰島細(xì)胞周圍，以保護(hù)胰島細(xì)胞膜，并防止胰島細(xì)胞擴(kuò)散(圖 lb)。形態(tài)差異在第156天甚至更顯著。在沒有骨髓細(xì)胞的情況下培養(yǎng) 的細(xì)胞形成單層(圖lc),而在存在骨髓細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞形成 圓形胰島(圖ld)。圖2a-b顯示了在沒有(左圖)或有(右圖)骨髓細(xì)胞的情況下培養(yǎng)至 第28天的胰島p細(xì)胞。用0.05。/。胰蛋白酶(Promega, Madison, WI)消化胰島5分鐘。在用PBS洗滌1次后，制作細(xì)胞的cytospin切片。在圖 2a的上圖中的細(xì)胞用DAPI染色，以顯現(xiàn)核。在下圖中的細(xì)胞用靶向 胰島素原和骨髓細(xì)胞標(biāo)記CD45的抗體染色，并用在成像時(shí)表現(xiàn)為不 同顏色的第二抗體顯現(xiàn)。與骨髓共培養(yǎng)物(右圖)相比，在單獨(dú)的胰島細(xì)胞培養(yǎng)物(左圖)中 的細(xì)胞數(shù)顯著較少。而且，在僅胰島細(xì)胞的培養(yǎng)物中，沒有顯示出許 多細(xì)胞表達(dá)胰島素原(即，被DAPI染色，但沒有被抗CD45抗體染色)。在右圖中，由向下粗箭頭指示的相對大的細(xì)胞聚簇對胰島素原染 色，并帶有某些混雜的CD45染色，提示在聚簇中存在一些骨髓細(xì)胞。 向上細(xì)箭頭指示用CD45抗體染色的細(xì)胞。在針對CD45染色的共培 養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞不對胰島素原染色，表明它們是骨髓細(xì)胞。為證實(shí)免疫熒光分析的觀察結(jié)果，使用免疫組織化學(xué)方法染色細(xì) 胞。用不同的發(fā)色團(tuán)染色表達(dá)胰島素原的細(xì)胞和表達(dá)CD45的細(xì)胞。 此外，在單獨(dú)的骨髓培養(yǎng)物中的大量胰島細(xì)胞不表達(dá)胰島素原，而在 共培養(yǎng)物中的非骨髓細(xì)胞幾乎全部都表達(dá)胰島素。胰島素原染色在左圖中由箭頭指示，右圖中更向右的箭頭指示。CD45染色在左圖中由 圖中更向左的箭頭指示。此外，在共培養(yǎng)物中觀察到細(xì)胞更有活力和 胰島素原染色更強(qiáng)。胰島素原陽性胰島的百分率的定量分析示于圖1 c。發(fā)現(xiàn)相比于單 獨(dú)的胰島細(xì)胞培養(yǎng)物，共培養(yǎng)物中顯著更大量(2.7倍高)的胰島細(xì)胞表 達(dá)胰島素原(p〈0.01， n = 6)。圖3顯示了培養(yǎng)153天形成的胰島。左圖是胰島的相差圖像。中 圖和左圖分別是胰島頂部和中心的共聚焦圖像。a細(xì)胞用胰高血糖素 的抗體染色，并由向著細(xì)胞質(zhì)中心的箭頭指示，P細(xì)胞用靶向胰島素 原的抗體染色，并由向著細(xì)胞質(zhì)外周的箭頭指示。a細(xì)胞響應(yīng)于低血 糖釋放胰高血糖素。由共聚焦圖像清楚可見，(3細(xì)胞圍繞著a細(xì)胞。該 分析證實(shí)，P細(xì)胞占細(xì)胞群的大部分，a細(xì)胞定位在胰島的中心部分， 提示在這些培養(yǎng)物中發(fā)生重建[23,24]。18這些結(jié)果清楚地證實(shí)，骨髓細(xì)胞可用于在一定持續(xù)時(shí)間體外維持 胰島的形態(tài)和維持胰島細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)。
實(shí)施例3-在胰島素釋放測定中評價(jià)胰島功能
通過在有或沒有葡萄糖挑戰(zhàn)的情況下檢測胰島素釋放從而評價(jià) 胰島細(xì)胞功能。每周收集2次培養(yǎng)基，并儲存于-80。C,直至通過ELISA 測定基礎(chǔ)胰島素釋放。
如下每周1次進(jìn)行高葡萄糖挑戰(zhàn)測定收集培養(yǎng)基，用RPMI培 養(yǎng)基洗滌1次培養(yǎng)的細(xì)胞。然后用高葡萄糖(20 mM) RPMI 1640置換 培養(yǎng)基達(dá)15和30分鐘。最后收集培養(yǎng)基，并儲存于-80。C，直至通過 ELISA進(jìn)行胰島素測定。
使用人胰島素ELISA試劑盒(Linco Research, St. Charles, MO)按 照生產(chǎn)商的說明檢測標(biāo)本(細(xì)胞培養(yǎng)基或組織提取物)中的胰島素濃 度。簡而言之，將胰島素標(biāo)準(zhǔn)品和適宜稀釋(1:50-1:500)的樣品加至包 被胰島素抗體的96孔微量滴定板，并于4。C溫育2小時(shí)。在洗滌后， 將抗人胰島素酶綴合物加至每個(gè)孔，于室溫溫育30分鐘。在洗滌后， 加入酶底物溶液，然后于室溫在黑暗中溫育45分鐘。通過加入1 N 硫酸終止反應(yīng)。用iuQuantTM微量讀板器(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski， VT)讀取450 nm的吸光度，并通過KC Junior⑧微量讀板器 軟件(Bio-Tek Instruments, Inc.)計(jì)算濃度[20]。
使用基礎(chǔ)胰島素釋放測定和響應(yīng)于高葡萄糖挑戰(zhàn)的胰島素分泌 測定來測定細(xì)胞的功能完整性。這些測定證實(shí)，與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的 胰島在培養(yǎng)中以穩(wěn)定方式釋放胰島素達(dá)204天(圖4a)。胰島素釋放水 平由開始時(shí)的約8000 |aU/ml至培養(yǎng)195天時(shí)的約10,000 pU幾乎是穩(wěn) 定的。隨時(shí)間推移而增加的人胰島素釋放提示，胰島細(xì)胞隨著時(shí)間推 移而再生和/或擴(kuò)增。
單獨(dú)培養(yǎng)的胰島顯示出不穩(wěn)定的胰島素釋;^(圖4a)，開始時(shí)為平 均約9,500 |LiU/ml,由高約17,500 |nU/ml顯著變化，至培養(yǎng)28天時(shí)快第5周喪失功能。結(jié)合形態(tài)學(xué)研究，峰值 處于第15和28天的這些發(fā)現(xiàn)可能歸因于單獨(dú)培養(yǎng)的胰島中的垂死P 細(xì)胞泄漏胰島素。以類似的方式，在共培養(yǎng)的前21天^L察到的相對 低的基礎(chǔ)胰島素釋放可能歸因于在達(dá)到功能穩(wěn)定之前垂死的(3細(xì)胞極 少。
對葡萄糖挑戰(zhàn)(20 mM)下的胰島素分泌進(jìn)行評價(jià)揭示，與骨髓細(xì) 胞一起培養(yǎng)的胰島細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中響應(yīng)于葡萄糖達(dá)204天，相比之 下，單獨(dú)的胰島細(xì)胞培養(yǎng)物至第42天基本上喪失其響應(yīng)于高葡萄糖 挑戰(zhàn)的能力，至第70天完全喪失(圖4b)。就胰島素釋放和響應(yīng)于葡萄 糖挑戰(zhàn)的胰島素而言，僅胰島的培養(yǎng)物和胰島加BM之間的差異是統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著的(p〈0.01， n = 6)。
實(shí)施例4-胰島P細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞生長和胰島團(tuán)形成
通過在沒有或有骨髓細(xì)胞的情況下在柵格上培養(yǎng)胰島P細(xì)胞監(jiān)測 細(xì)胞生長和胰島細(xì)胞形成。在柵格上的胰島細(xì)胞示意圖如在圖5a中所 示。使用柵格可監(jiān)測單個(gè)胰島隨著時(shí)間推移的生長。跟蹤胰島細(xì)胞， 并以顯微照片記錄形態(tài)變化。使用NIH圖像分析軟件定量胰島表面積 (像素值)。3個(gè)胰島表面值的平均值被視為1個(gè)樣品，每組收集6個(gè)樣
O
口口o
在培養(yǎng)的前3周，盡管存在顯著的功能差異，但在有和沒有骨髓 細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰島之間幾乎沒有觀察到形態(tài)差異(未顯示)。然而， 在3周后，在骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)的胰島繼續(xù)擴(kuò)增，而在沒有骨髓細(xì) 胞的情況下培養(yǎng)的胰島收縮，并且它們最終消失(圖5c)。使用圖像分 析軟件定量胰島和細(xì)胞大小的變化。結(jié)果證實(shí)，與胰島一起的骨髓共 培養(yǎng)導(dǎo)致在17天的時(shí)間段內(nèi)(由第54天至第71天)它們的表面擴(kuò)增達(dá) 1.8倍。這與其中細(xì)胞顯示出尺寸基本沒有增加和沒有胰島形成的僅 胰島的培養(yǎng)物相比是顯著差異(圖5c， p<0.05, n = 6)。
圖5d顯示了在柵格載玻片上在新生早期(左圖)和共培養(yǎng)13個(gè)月
20(右圖)中的胰島細(xì)胞生長。在柵格載玻片上容易觀察到隨著時(shí)間推移 共培養(yǎng)物中的胰島大小顯著增加。胰島大小增加可為以骨髓細(xì)胞刺激
胰島增殖的結(jié)果，所述骨髓細(xì)胞通過其顯著的Ki67表達(dá)來鑒定(圖6)。 圖5e和f證實(shí)，胰島細(xì)胞在培養(yǎng)13個(gè)月后保持功能性。如上進(jìn) 行功能測定。觀測胰島素釋放的觀察期為406天(圖5e)。在如所示的 第360天、第369天和第399天觀測響應(yīng)于高葡萄糖的胰島素分泌(圖 5f)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在骨髓存在下生長的胰島P細(xì)胞的功能維持達(dá)至 少13個(gè)月。
實(shí)施例5-胰島P細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)促進(jìn)增殖
圖6顯示了在培養(yǎng)153天后有(上圖)或沒有(下圖)骨髓細(xì)胞一起 培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞培養(yǎng)物。左圖為相差圖像。在右圖中，細(xì)胞用胰島 素原和細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67染色。核用DAPI顯色。上圖表明，依據(jù)大 的胰島素原染色細(xì)胞聚簇，細(xì)胞已發(fā)展出胰島形態(tài)，并通過顯著的胰 島素原染色證實(shí)正在增殖。還觀察到許多的Ki67染色斑點(diǎn)，包括由 箭頭指示的細(xì)胞。下圖顯示出相對均一的單層，幾乎沒有胰島素原或 Ki67染色。在胰島培養(yǎng)物中，基本上僅通過DAPI染色顯現(xiàn)出細(xì)胞。 這些圖像證實(shí)，在骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞在培養(yǎng)中表達(dá)胰 島素原、形成胰島并增殖持續(xù)一定時(shí)間。相反，在單獨(dú)的胰島(3細(xì)胞 培養(yǎng)物中沒有觀察到特定的胰島形態(tài)。同樣，在單獨(dú)的胰島(3細(xì)胞培 養(yǎng)物中幾乎沒有觀察到胰島素原或Ki67染色。
實(shí)施例6-胰島P細(xì)胞與骨髄細(xì)胞的共培養(yǎng)促進(jìn)宏觀胰島形成
在長期培養(yǎng)胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞后，形成宏觀組織。圖7a顯示 了由與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)190天的胰島細(xì)胞產(chǎn)生的組織。條棒代表1 cm。 該組織為約1.8cm長，具有清晰的3維結(jié)構(gòu)。由相仿的組織樣品制備 5 nm的冷凍切片，并用蘇木精和曙紅染色，以揭示組織的形態(tài)(圖7b)。 組織染色表明，組織具有在切片中出現(xiàn)的、由多孔支架樣組織圍繞的
21胰島樣結(jié)構(gòu)(箭頭指示)。發(fā)現(xiàn)所述組織的胰島素含量為56307 pU/mg 蛋白(ELISA測定)。通過熒光免疫組織化學(xué)表明，該胰島樣組織主要 含(3細(xì)胞和少量a細(xì)胞(圖7c)。胰島p細(xì)胞用胰島素原抗體染色(由箭頭 a指示)，ot細(xì)胞用胰高血糖素抗體染色(由箭頭b指示)，核用DAPI染 色。
使用上述方法分析所述組織的基礎(chǔ)胰島素釋放和誘導(dǎo)的響應(yīng)于 高葡萄糖的胰島素分泌。正如所料，在胰島(3細(xì)胞-骨髓共培養(yǎng)物中形 成的組織表現(xiàn)出基礎(chǔ)胰島素釋放(圖7 d)和誘導(dǎo)的響應(yīng)于高葡萄糖的胰 島素分泌(圖7e)。由相同年齡的僅胰島p細(xì)胞的培養(yǎng)物中的細(xì)胞基本上 未觀察到胰島素分泌。這些數(shù)據(jù)表明，胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培 養(yǎng)允許形成更高級的三維結(jié)構(gòu)，其具有胰島樣結(jié)構(gòu)和功能。
實(shí)施例7-骨髓細(xì)胞與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)物的相互作用
使用組織化學(xué)和免疫熒光分析進(jìn)一步證實(shí)骨髓細(xì)胞保存培養(yǎng)中 的胰島(3細(xì)胞的能力。PKH細(xì)胞標(biāo)記試劑盒(Sigma, St. Louis. MO)用于 標(biāo)記骨髓和胰島(3細(xì)胞，以監(jiān)測細(xì)胞類型之間的相互作用。PKH染料 可用于活細(xì)胞標(biāo)記，而不影響細(xì)胞的形態(tài)或功能。染料為連接至長親 脂性尾的熒光標(biāo)記，該長親脂性尾整合入膜中，留下發(fā)熒光的部分暴 露在細(xì)胞表面附近。所述染料允許跟蹤群體中的兩類活細(xì)胞。按照生 產(chǎn)商的說明，將4 |LiM PKH 26 (PKH26GL)和PKH 2 (PKH2GL)分別與 lxl()S個(gè)骨髓細(xì)胞和50個(gè)胰島溫育3分鐘。用PBS單獨(dú)洗滌細(xì)胞。通 過加入1 ml冷的1% BSA的PBS溶液終止染色。溫和沉淀細(xì)胞，并 在PBS中重懸浮5次。以除去任何未結(jié)合的染料。在完成標(biāo)記后，在 上述條件下共培養(yǎng)骨髓細(xì)胞和胰島。
在培養(yǎng)7、 24、 48和96小時(shí)后收集細(xì)胞。用靶向胰島素原的抗 體染色細(xì)胞。觀察到在7小時(shí)時(shí)(圖8a)骨髓細(xì)胞(粗箭頭)緊密靠近胰 島，并在24小時(shí)時(shí)主動遷移入胰島中(圖8b)。在48小時(shí)后，骨髓細(xì) 胞出現(xiàn)粘附至胰島中的(3細(xì)胞(圖8c,插圖高放大倍數(shù))。高放大倍數(shù)的
22圖像表明骨髓細(xì)胞與胰島(3細(xì)胞相互作用。而且，如在左上角高放大
倍數(shù)圖像中所示，在培養(yǎng)96小時(shí)時(shí)，骨髓細(xì)胞出現(xiàn)將P細(xì)胞培育匯合 在一起，形成如在顯微照片中所見的完整胰島(圖8d,插圖高放大倍 數(shù))。人們可在任一側(cè)觀察到與胰島P細(xì)胞締合的骨髓。
還利用實(shí)時(shí)時(shí)間間隔顯微鏡檢查和活體染料分析骨髓細(xì)胞與胰 島(3細(xì)胞的相互作用，以監(jiān)測64小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)物中的骨髓細(xì)胞和人胰島， 圖像每20分鐘記錄1次(圖9)。骨髓細(xì)胞(粗箭頭)逐漸靠近胰島移動， 如在圖9a、 b和c中所見。這之后為骨髓細(xì)胞進(jìn)入胰島聚簇中，如在 d、 e和f中所見。骨髓細(xì)胞逐漸由胰島向外移動，如在g、 h、 i和j 中所見(細(xì)箭頭)。所述圖像清楚表明，BM細(xì)胞與胰島細(xì)胞接觸，并 將物質(zhì)釋放到胰島細(xì)胞附近。
還觀察到與胰島(3細(xì)胞共培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞在更長時(shí)間段內(nèi)遷移， 讓人們了解到骨髓是如何參與胰島再生的。在圖10中，在3小時(shí)的 共培養(yǎng)物(圖10a)中與人胰島(大聚簇)分離的、用活體染料PKH-26標(biāo) 記的人骨髓細(xì)胞(用箭頭指示)在30天培養(yǎng)后遷移入胰島中(圖10b)， 并在60天培養(yǎng)物中形成圍繞著胰島的嚢樣組織(圖10c)。僅胰島的培 養(yǎng)物在3小時(shí)時(shí)沒有顯示出任何紅色(圖10d)，在30天時(shí)培養(yǎng)物中的 胰島變成單層(圖10e)，并在60天時(shí)保持如此(圖10f)。(放大倍數(shù)x20)。
實(shí)施例9-胰島p細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)抑制細(xì)胞因子辨，放
已知由人胰島產(chǎn)生并釋放的IL-ip在胰島存活和功能中起關(guān)鍵作 用[25,26]。為評價(jià)IL-ip在胰島培養(yǎng)物存活中的作用，在有和沒有骨 髓細(xì)胞的情況下檢測胰島P細(xì)胞培養(yǎng)物中的IL-1P水平。使用對人IL-1(3 特異性的ELISA試劑盒，在單獨(dú)培養(yǎng)胰島時(shí)，證實(shí)胰島的IL-1(3釋放 逐漸增加。細(xì)胞因子生產(chǎn)水平由在接種培養(yǎng)物時(shí)的檢測不到的水平增 加至培養(yǎng)63天后的25倍增加。這與其中IL-1(3水平非常低的、和骨 髓細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰島相反(圖lla)。進(jìn)一步評價(jià)在高葡萄糖挑戰(zhàn)存在 時(shí)的IL-ip釋放表明，IL-1(3釋放水平在單獨(dú)培養(yǎng)的胰島中增加1500倍，而在胰島與骨髓一起培養(yǎng)時(shí)，IL-ip水平保持得非常低(圖llb)。
實(shí)施例io-胰島p細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞存活
胰島(3細(xì)胞凋亡被視為在體內(nèi)和體外的(3細(xì)胞損失的主要原因，分 析人胰島存活和功能的骨髓調(diào)節(jié)是否與培養(yǎng)的胰島的凋亡過程相關(guān)。 使用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)介導(dǎo)的dUTP-地高辛缺口末端 標(biāo)記(TUNEL)法(Clone ApoAlertTM DNA片段化測定試劑盒BD Clontech)按照生產(chǎn)商的說明檢測凋亡的細(xì)胞核。簡而言之，以3%多 聚曱醛固定人胰島制備物，并在0.3%&02的曱醇溶液中溫育5分鐘， 以封閉內(nèi)源過氧化物酶。將載玻片與TdT溫育緩沖液于37°C溫育2 小時(shí)，并用2xSSC終止。還用抗人胰島素原抗體染色細(xì)胞。在沒有 先前治療方案的信息的情況下，通過計(jì)算凋亡細(xì)胞總數(shù)除以胰島素陽 性細(xì)胞總數(shù)來分析凋亡細(xì)胞。結(jié)果由自每個(gè)載玻片隨機(jī)揀選的10個(gè) 以上胰島的檢測計(jì)算，每個(gè)樣品檢測總共4個(gè)載玻片[21]。
檢驗(yàn)凋亡由培養(yǎng)開始起隨時(shí)間的變化揭示，早在7小時(shí)時(shí)，骨髓 細(xì)胞就保護(hù)胰島免于凋亡，并且該作用在與沒有骨髓的情況下培養(yǎng)的 胰島相比時(shí)是顯著的(圖12a和b)。圖12a顯示了在僅胰島(I)的培養(yǎng)物 中于7小時(shí)時(shí)開始的顯著TUNEL染色(上行)。骨髓細(xì)胞保護(hù)胰島細(xì)胞 免于凋亡隨著培養(yǎng)時(shí)程增加變得更明顯，例如與48小時(shí)和3周時(shí)的 細(xì)胞相比。盡管可在8小時(shí)時(shí)觀察到一些非凋亡細(xì)胞，但在3周時(shí)于 僅胰島的培養(yǎng)物圖像中幾乎沒有鑒定出 一個(gè)非凋亡細(xì)胞。這與其中細(xì) 胞在所有觀測時(shí)間點(diǎn)都似乎是基本上非凋亡的胰島+骨髓(I+B)培養(yǎng)物 明顯不同(下行)。定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)物中的凋亡細(xì)胞百分率示于圖 12b,反映出圖像中所顯示的證實(shí)骨髓對胰島細(xì)胞幾乎即時(shí)的保護(hù)作 用。
實(shí)施例11-在臍血細(xì)胞或CD34+外周血細(xì)胞存在下共培養(yǎng)胰島p細(xì)胞
為評價(jià)除BM之外的細(xì)胞對胰島功能的作用，將全臍帶血細(xì)胞、流動的外周血細(xì)胞和流動的外周CD 34+細(xì)胞與胰島在和上述BM培養(yǎng)相同的條件下培養(yǎng)，以確定它們是否可支持胰島(3細(xì)胞生長并促進(jìn)胰島形成。在所示培養(yǎng)天數(shù)后，分析胰島素釋放(圖13)。胰島胰島素釋放檢測的數(shù)據(jù)表明這些細(xì)胞和僅胰島的培養(yǎng)物之間沒有顯著差異，這表明BM細(xì)胞可在胰島細(xì)胞存活方面提供獨(dú)特的優(yōu)勢。
實(shí)施例12-使用與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞在糖尿病小鼠模型中重建胰腺功能
為評價(jià)與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞可在糖尿病小鼠模型中用于胰島細(xì)胞移植方法，使用在單獨(dú)地或者與骨髓共培養(yǎng)3周的培養(yǎng)物中保持的胰島細(xì)胞進(jìn)行胰島細(xì)胞移植。以STZ 200 mg/kg體重(腹膜內(nèi))注射小鼠(8周齡，雄性Balb/cSCID小鼠)，以誘發(fā)糖尿病，所述糖尿病定義為所具有的血糖水平在3天內(nèi)始終超過400 mg/dL。將沒有(I3W=1500個(gè)胰島(正(^))或有骨髓(13\￥= 1500個(gè)胰島(正Q)和lxl()6個(gè)骨髓細(xì)胞)培養(yǎng)的人胰島細(xì)胞植入左腎包膜下。監(jiān)測血糖水平(圖14)。
在4個(gè)月后，移植骨髓共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞的動物具有正常的血糖水平，血液具有可檢測的人胰島素水平(157^iU/ml)。移植在單獨(dú)的培養(yǎng)物中生長的胰島細(xì)胞的動物保持低血糖。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示，胰島素響應(yīng)被在骨髓共培養(yǎng)物中生長的移植胰島替代，但沒有被在僅胰島的培養(yǎng)物中生長的胰島替代。
為確保血糖控制被移植的細(xì)胞誘導(dǎo)，取出含有移植的細(xì)胞的腎臟。作為響應(yīng)，動物變成高血糖的。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞用于胰島細(xì)胞移植以及治療和/或改善糖尿病的用途。
實(shí)施例13-胰島|3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)有利于胰島聚集
骨髓有利于胰島聚集。先前的數(shù)據(jù)已表明，在共培養(yǎng)物中形成顯著的胰腺組織，該組織可由胰島聚集物的骨髓刺激產(chǎn)生。得自時(shí)間間隔顯微鏡檢查圖像(圖15)的數(shù)據(jù)表明，骨髓刺激胰島聚集的過程和一體化胰腺組織的形成。在培養(yǎng)物下使用柵格能夠以每周l次獲取的活 體顯微鏡圖像鑒定和監(jiān)測單個(gè)胰島遷移。
在圖15a中，3個(gè)胰島在柵格的中心區(qū)域是可見的。在圖15b、 c 和d中，3個(gè)較大胰島中的2個(gè)彼此相對遷移，并在圖15e中最終合 成一體，形成更大的胰島(放大倍數(shù)-x5)。在用活體染料PKH-26 (在 單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中)標(biāo)記骨髓后，發(fā)現(xiàn)骨髓遷移入一體化的胰島中，并形成 嚢化的重建胰島(圖1Sf)(放大倍數(shù)-x20)。
實(shí)施例14-在沒有和有骨髓的情況下培養(yǎng)的胰島細(xì)胞中的基因表達(dá)的 分析
分析在單獨(dú)的胰島(胰島)或者胰島和骨髓共培養(yǎng)(胰島+B)中培養(yǎng) 的人胰島P細(xì)胞中的基因表達(dá)。使用釆用基因特異性引物的RT-PCR 分析內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因表達(dá)和再生轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平。培 養(yǎng)細(xì)胞209天，分離總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，使用常規(guī)方法通過PCR對產(chǎn) 生的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。
內(nèi)分泌特異性基因GCG、 INS和SST的表達(dá)顯著增加，共培養(yǎng) 物的細(xì)胞中的再生相關(guān)基因NGN3的表達(dá)也顯著增加，但在僅胰島的 培養(yǎng)物中沒有增加(圖16a和b)。這些結(jié)果提示，骨髓細(xì)胞在體外刺激 人胰島細(xì)胞再生。同樣，在共培養(yǎng)物中還觀察到胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子 PDX1或IPF1、 PAX6、 ISL1和MAFa的表達(dá)增加，但在單獨(dú)的胰島 培養(yǎng)物中沒有觀察到(圖16c)。這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的遷移、分 化和增殖，這可導(dǎo)致在共培養(yǎng)物中觀察到的長期存活和功能增強(qiáng)。
Mistl是在內(nèi)分泌細(xì)胞中特異性表達(dá)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因 子，是胰腺腺泡細(xì)胞的組織化和功能所必需的。研究提示，Mist-l表 達(dá)提供了支持胰島發(fā)育和功能的微環(huán)境。Mistl的表達(dá)可允許胰島細(xì) 胞組織化為更高級的結(jié)構(gòu)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)所有的數(shù)據(jù)都以平均值士SEM表示，并通過方差分析(ANOVA) 繼之以student-t檢驗(yàn)來分析，除非另有說明。Sigma Plot (SPSS Inc. Chicago, IL)用于畫圖。所有的數(shù)據(jù)都代表3個(gè)的結(jié)果。
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引入作為參考
本文列出的或在它處提到的所有參考文獻(xiàn)、專利、專利申請、肽 和核酸登錄號都引入到本說明書中作為參考。
31等價(jià)方案
僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就會認(rèn)識到或能夠確定本文 描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這樣的等價(jià)方案包括 在下列權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)胰島β細(xì)胞的方法，所述方法包括在體外將胰島β細(xì)胞和骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中持續(xù)培養(yǎng)所述胰島P細(xì)胞一定時(shí)間。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述持續(xù)期為至少約30天。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述持續(xù)期為至少約60天。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述持續(xù)期為至少約90天。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述持續(xù)期為至少約120天。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中與沒有骨髓細(xì)胞的情況下 培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞相比，將胰島(3細(xì)胞與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)提高胰島|3 細(xì)胞存活力，改善胰島P細(xì)胞功能，和/或改善胰島|3細(xì)胞形態(tài)。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞功能通過基礎(chǔ)胰島素分泌測 定來測定。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞功能通過葡萄糖誘導(dǎo)的胰島 素分泌測定來測定。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)增加胰島P細(xì)胞存 活力、改善胰島(3細(xì)胞功能和/或改善胰島(3細(xì)胞形態(tài)。
11. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中與沒有骨髓細(xì)胞的情況 下培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞相比，所述方法減少與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島p細(xì) 胞的凋亡。
12. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中與沒有骨髓細(xì)胞的情況 下培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞相比，所述方法降低與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島P細(xì) 胞的細(xì)胞因子釋》文。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞因子為IL-lp。
14. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法增加至少一種 內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因選自GCG(胰高血糖素，a-細(xì)胞基因)、INS (胰島素，(3-細(xì)胞基因)和SST (促生長素抑制素，Y-細(xì)胞基因)；(3細(xì)胞胰腺和十二指腸同源框1的轉(zhuǎn)錄 因子(PDX1或IPF1)、神經(jīng)元素3(NGN3)、成對盒基因6 (PAX6)、胰 島-1 (ISL1)、 v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(MAFa)和Mist 1。
16. —種體外擴(kuò)增胰島(3細(xì)胞的方法，所述方法包括將胰島P細(xì)胞 和骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)。
17. —種提高胰島(3細(xì)胞存活力、改善胰島(3細(xì)胞功能和/或改善(3 細(xì)胞形態(tài)的方法，所述方法包括在體外將胰島(5細(xì)胞和骨髓細(xì)胞一起 培養(yǎng)。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞功能通過基礎(chǔ)胰島素分泌 測定來測定。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞功能通過葡萄糖誘導(dǎo)的胰 島素分泌測定來測定。
20. 權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，其中與沒有骨髓細(xì)胞的情 況下培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞相比，所述方法降低與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰 島(3細(xì)胞的凋亡。
21. 權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的方法，其中與沒有骨髓細(xì)胞的情 況下培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞相比，所述方法降低與骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)的胰 島(3細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)胞因子為IL-1(3。
23. 權(quán)利要求17-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法增加至少一 種內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述內(nèi)分泌細(xì)胞特異性基因選自 GCG(胰高血糖素，a-細(xì)胞基因)、INS (胰島素，(3-細(xì)胞基因)和SST (促 生長素抑制素，y-細(xì)胞基因)；p細(xì)胞胰腺和十二指腸同源框1的轉(zhuǎn)錄 因子(PDX1或IPF1)、神經(jīng)元素3(NGN3)、成對盒基因6 (PAX6)、胰 島-1 (ISL1)、 v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(MAFa)和Mist1。
25. —種治療需要移植胰島p細(xì)胞的患者的方法，所述方法包括 在體外將胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)；和 將所述胰島細(xì)胞和骨髓細(xì)胞植入需要移植胰島P細(xì)胞的個(gè)體中。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述患者罹患I型或II型糖尿病。
27. 權(quán)利要求l、 16、 17或24中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步 包括獲得胰島(3細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。
28. 權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述骨髓細(xì)胞為同種 異體的骨髓細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括鑒定 需要移植胰島P細(xì)胞的患者。
30. 權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括在胰 島細(xì)胞移植后監(jiān)測所述患者。
31. —種在其需要的患者中治療糖尿病的方法，所述方法包括 在體外將胰島P細(xì)胞和骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)；和 將培養(yǎng)的胰島P細(xì)胞植入患者中；由此治療所述患者的糖尿病。
32. 權(quán)利要求22的方法，其中所述患者罹患I型或II型糖尿病。
33. 權(quán)利要求22或23的方法，所述方法進(jìn)一步包括獲得胰島(3 細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。
34. 權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述骨髓細(xì)胞為同種 異體的骨髓細(xì)胞。
35. 權(quán)利要求31-34中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括鑒定 患有糖尿病的患者。
36. 權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括在胰 島細(xì)胞移植后監(jiān)測所述患者。
37. —種將胰島p細(xì)胞植入患者的方法，所述方法包括 在體外將胰島(3細(xì)胞和骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)；和將培養(yǎng)的胰島(3細(xì)胞植入患者中。
38. 權(quán)利要求31或37的方法，所述方法進(jìn)一步包括獲得胰島P 細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。
39. 權(quán)利要求37或38的方法，其中所述骨髓細(xì)胞為同種異體的 骨髓細(xì)胞。
40. 權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括鑒定 需要移植胰島(3細(xì)胞的患者。
41. 權(quán)利要求37-40中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括在移 植胰島細(xì)胞后監(jiān)測所述患者。
42. —種藥盒，其包括骨髓細(xì)胞和按照權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的 方法使用的說明書。
全文摘要
業(yè)已表明，骨髓細(xì)胞可用于在一定時(shí)間內(nèi)持久維持共培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞的存活力、結(jié)構(gòu)和/或功能。還發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞在降低炎性細(xì)胞因子釋放和減少凋亡的同時(shí)促進(jìn)β細(xì)胞生長。而且，已表明與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞保持胰島素響應(yīng)功能，并在糖尿病小鼠模型的胰島細(xì)胞移植中起作用，以恢復(fù)正常的胰島素分泌。臍血細(xì)胞和分離的外周CD34+血細(xì)胞不能支持β胰島細(xì)胞生長或提高存活。
文檔編號C12N5/02GK101652470SQ200780049872
公開日2010年2月17日 申請日期2007年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日
發(fā)明者羅履廣 申請人:羅杰·威廉斯醫(yī)院