專利名稱：：新型可緩慢消化的貯存碳水化合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及可緩慢消化的貯存碳水化合物的制備，更具體地涉及使用糖原分支酶的可緩慢消化的淀粉或糖原的制備。
背景技術：
：淀粉作為葡萄糖的聚合物，是人體內(nèi)能量的主要來源之一。在消化過程中，在小腸內(nèi)淀粉的葡萄糖轉(zhuǎn)移到血液中，導致血液中的葡萄糖水平升高。作為對這種葡萄糖水平升高的反應，身體產(chǎn)生更大量的胰島素來將葡萄糖作為糖原貯存在肝臟和肌肉中。小腸中淀粉的消化特性分為三類可快速消化的淀粉、可緩慢消化的淀粉和不消化的淀粉(抗性淀粉)?？煽焖傧牡矸酆涂删徛牡矸弁ㄟ^所謂血糖反應，即葡萄糖釋放到血液中的速度來區(qū)分。抗性淀粉在小腸中不消化，但在大腸中發(fā)酵。Englyst等給出了淀粉分類的詳細概述(EnglystH.,KingmanS.M.,CummingsJ.H.(1992),"Classificationandmeasurementofnutritionallyimportantstarchfractions",Eur.J.Clin.Nutr.46:33-50)。可快速消化的淀粉將葡萄糖快速釋放到血液中。數(shù)種健康負面因素已歸因于這種快速釋放及隨后的胰島素水平的升高。對一些人群來說，具有快速血糖反應的飲食與II型糖尿病有關(Salmeron等，(1997)JAMA277:472-477)。另外，已將可快速消化的淀粉與肥胖的發(fā)生相關聯(lián)。葡萄糖的快速釋放及所導致的胰島素快速增多使人饑餓并急于攝入更多的食物。結果，F(xiàn)AO/WHO的新報告提倡在高血脂和肥胖患者以及健康人群中選擇緩慢反應的淀粉，盡管胰島素反應也是重要方面。對于烏類，已表明可緩慢消化的淀粉改善了蛋白質(zhì)和氨基酸的消化效率(Poultryworld,2003年10月)。這對哺乳動物特別是人類是重要的，并且認為氨基酸的吸收增加會減輕進食不足的狀況。在運動飲料中，葡萄糖的釋放是重要因素，盡管與健康不直接相關。關于稱作PeptoPro的運動飲料的商業(yè)信息描述了將蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用于葡萄糖聚合物以提高血糖反應。這種提高將增強運動體力之間的恢復。但是，為了準備要求長時間段體力的運動，希望葡萄糖緩慢釋放，以給身體更長的時間來燃燒葡萄糖并防止在肌肉和肝臟內(nèi)不必要的貯存葡萄糖。一些淀粉天然就含有比其他淀粉更高比例的可緩慢消化的淀粉。一種此類淀粉是來自剪股草屬埃塞俄比亞畫眉草(Jg^w&&#y>，一種埃塞俄比亞谷物的淀粉，這種谷物被制成許多埃塞俄比亞人的食物，因此被認為對埃塞俄比亞運動員馬拉松賽跑成績有貢獻(www.s歸teff.nl)。US2003/0005922中說明了隨著淀粉支化度增大，消化性降低，盡管這類產(chǎn)品之前已在EP-A-0418945中說明。因此，在US2005/0159329中為了制備具有所需性能的產(chǎn)品引入了額外的酶促(3-淀粉酶步驟。其它專利文件也說明了將分支酶用于將淀粉轉(zhuǎn)變成具有較低粘度的穩(wěn)定非凝膠產(chǎn)物。在US2004/0014961中，這是通過用來自脂肪嗜熱芽孢桿菌(S.Wearo/Zzermop/HYw)的分支酶或胰淀粉酶處理淀粉并將所得產(chǎn)物分級來實現(xiàn)。在US2002/0065410、JP2001/031574和DE10237442中，將淀粉酶(a-淀粉酶、(3-淀粉酶或兩者)用于獲得高支化淀粉。在WO00/22140中，已說明了提供高支化淀粉的來自奈瑟球菌屬(A^/^eWa)的新的酶。但是，這些專利申請中沒有一個說明這些淀粉的支鏈成分和a-極限糊精含量的作用及它們對消化性的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種新的可緩慢消化的貯存碳水化合物，具有至少8.5~9%的支化度，優(yōu)選至少10%,更優(yōu)選至少11%。所述可緩慢消化的貯存碳水化合物優(yōu)選具有約60-約150kD的分子量。此外，優(yōu)選所述貯存碳水化合物能被人類或動物腸道酶水解，相同條件下其水解速度不大于麥芽糖水解速度的0.9#■，優(yōu)選0.1~0.94咅之間，更優(yōu)選0.3~0.74咅之間。本發(fā)明的一部分還提供一種通過用分支酶處理天然來源的貯存碳水化合物制造可緩慢消化的貯存碳水化合物的方法，所述可緩慢消化的貯存石友水化合物具有至少9%、優(yōu)選至少10°/。、更優(yōu)選至少11%和最優(yōu)選至少12%的支化度，即a-l，6糖苷鍵的量。所述酶優(yōu)選為具有E.C.2.4.1.18所述活性并源自微生物的酶，所述微生物優(yōu)選來自紅嗜熱鹽菌屬和/或異常球菌屬或異常球菌-棲熱菌類，更優(yōu)選從由小浜紅嗜熱鹽菌(A/zodor/^rmws0^we似^)、海洋紅嗜熱鹽菌(7/zO(io^2ermws、耐輻射異常球菌(Z)e/"ococcwra(i/0(iwram1)或地熱異常球菌(Z)e/wococcw^^。//7^附(3/^)構成的組中選沖奪的微生物。此外，在所述方法中，所述天然來源是指含有貯存碳水化合物的植物材料，即包含淀粉的植物材科，優(yōu)選根或塊莖，更優(yōu)選馬鈴薯塊莖。優(yōu)選地，所述來自天然來源的淀粉至少包括卯％的支鏈淀粉。本發(fā)明另一個實施方式是用上述方法制備的可緩慢消化的貯存碳水化合物。本發(fā)明又一部分是這種可緩慢消化的貯存碳水化合物作為食品或喂養(yǎng)產(chǎn)品的應用，特別用于糖尿病人食品、嬰兒食品、特殊的膳食配方和/或運動食品和飲料。優(yōu)選地，該可緩慢消化的貯存碳水化合物以至少10wt。/。的量加入所述食品、喂養(yǎng)產(chǎn)品或飲料中。圖1的曲線圖表示了與來自馬鈴薯的支鏈淀粉相比，通過用來自5種不同細菌源的酶處理得到的淀粉的支鏈分布(即支鏈中的葡萄糖殘基數(shù)量)。"R.H9.6"是小浜紅嗜熱鹽菌，"APECAARD"是高支鏈淀粉(不含直鏈淀粉)馬鈴薯淀粉。圖2表示了用于支化淀粉制備的流程圖。具體細節(jié)參見下文。具體實施例方式微生物和動物(包括人類)中含有分支酶，也稱作糖原分支酶(由glgB基因編碼)。它在糖原中產(chǎn)生a-l，6-糖苷鍵，從而由葡萄糖基的正常a-l，4-糖苷鍵結合的品種形成支鏈，這構成了糖原的"骨架"。相似的酶存在于植物中，例如淀粉分支酶，該酶起到相同的作用(在支鏈淀粉(淀粉的兩種葡萄糖聚合物中的一種)中形成a-l,6-糖苷鍵)。但是，已表明糖原分支酶能將淀粉用作它們酶活性的底物。.明中的底物的淀4分包4舌從源自任何天然來源處所用的天然淀粉定義為自然界中發(fā)現(xiàn)的淀粉。其它適宜的淀粉源自于通過雜交育種、易位、倒位、轉(zhuǎn)化或任何其它遺傳或染色體工程的方法以改變天然淀粉的植物。與淀粉相近，糖原也可用作底物，且表明了糖原也可被本發(fā)明的酶轉(zhuǎn)變成可緩慢消化的糖原。在本申請中，淀粉和糖原都將稱作"貯存碳水化合物"。常規(guī)的淀粉來源是谷類、植物的塊莖、根和果實。這些淀粉通常含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。這些來源還可以是更多普通來源的所謂"蠟樣"變體，其中"蠟樣"是指植物產(chǎn)生包含少于10%直鏈淀粉的淀粉；這些淀粉還被指定為"支鏈淀粉"。優(yōu)選蠟樣淀粉，因為他們通常已包含比非蠟樣淀粉更高的支化度(約4%)。但是，具有高含量直鏈淀粉的淀粉也能利用本發(fā)明，因為預期它們用分支酶改性后更穩(wěn)定，且它們的加工將更容易。糖原的常規(guī)來源是各種動物，包括哺乳動物的肌肉和肝臟(不那么常見的還有腎和脾)，同時諸如細菌、真菌和酵母菌等微生物也能形成糖原的來源。由于支鏈淀粉支化增加，它具有與麥芽糖相當?shù)碾x體消化速度(即麥芽糖消化速度的0.9~1.0倍之間)。這種消化作用根據(jù)所謂Englyst法(Englyst,H.N.等，1992,Eur.J.Clin.Nutr.46:33-50)在試管分析中測定，或在離體腸道模擬系統(tǒng)中測定(TIM-1，Minekus，M.等，1995，Alt.Lab.Animals23:197-209)。發(fā)現(xiàn)的支鏈淀粉的消化速度還通過用源自細菌超嗜熱菌(VanderMaarel等，2003，Biocat.Biot腦form.21:199-207)和脂肪嗜熱芽孢桿菌(TakataH.等,1994，Appl.Environ.Microbiol.60-3096-3104)的分支酶處理天然淀粉得到。從用來自這些細菌的酶處理得到的淀粉分析可知它們具有約5~7%的支化度。此外，在這些分子中制得的支鏈尺寸較大(中值DP—聚合度一每個支鏈約915個葡萄糖基)。目前表明用來自另一種來源的分支酶，可能得到大于8.5%的支化度。這種增加的支化對貯存碳水化合物的消化性具有有利影響，如以下實驗部分所示。進一步表明，聚合度(即支鏈的鏈長)較低的區(qū)域在增加，且淀粉含有至少10%的側(cè)鏈的鏈長為57個葡萄糖基(DP57),優(yōu)選至少15%為DP5-7,更優(yōu)選至少20%為DP5~7,同時鏈長的中值已降至約6~12個葡萄糖基的中值，同時由耐輻射變異球菌的酶制得的淀粉具有約6~7個葡萄糖基的中等鏈長。后一種淀粉的特征為不僅具有非常高的支化度(11~12%),而且還具有非常低的淀粉分子分子量，在約60kDa的數(shù)量級。特別適用于本發(fā)明的酶是來自微生物的酶，其中微生物屬于紅嗜熱鹽菌科和異常球菌科或異常球菌-棲熱菌類，更優(yōu)選選自由小浜紅嗜熱鹽菌、海洋紅嗜熱鹽菌、耐輻射異常球菌或地熱異常球菌構成的組中的微生物。此外，本發(fā)明還涵蓋了仍保留形成a-l，6-糖苷鍵功能的上述那些酶的同源酶。在此意義上，同源是指同源酶具有與上述酶大于70%的序列同源性的氨基酸序列，優(yōu)選大于80%，更優(yōu)選大于90%,最優(yōu)選大于95%的序列同源性。為了計算同一性(或同源性)百分比，可使用采用默認參數(shù)的BLAST運算法則(Altschul等，1997Nucl.AcidsRes,25:3389-3402)，或，選擇采用默認參數(shù)的GAP運算法則(NeedlemanandWunsch，1970J.Mol.Biol.48:443-453),它們兩者都包含在維斯康星遺傳軟件包(GeneticsComputerGroup(GCG)，575Science,麥迪遜，威斯康星州，美國)中。BLAST搜索假定可將蛋白質(zhì)模擬為隨機序列。但是，許多實際的蛋白質(zhì)包括非隨機序列區(qū)域，這些非隨機區(qū)域可能是富含一個或多個氨基酸的均聚物序列、短重復序列或區(qū)域。這種復雜度低的區(qū)域可在無關的蛋白質(zhì)之間比對，即使蛋白質(zhì)的其它區(qū)域完全不同?？墒褂靡恍┑蛷碗s度濾過程序來減少這種低復雜度比對。例如，可單獨使用或組合使用SEG(Wooten和Federhen，1993Comput.Chem.l7:149-163)和XNU(Claverie和States,1993Comput.Chem.17:191-201)低復雜度濾過程序。如此處所用，上下文中兩種蛋白質(zhì)序列(或核苷酸序列)的"序列同一性"或"同一性"或"同源性"是指兩種序列中的殘基，它們在特定對比范圍內(nèi)最大對應來比對時是相同的。當使用關于蛋白質(zhì)的序列同一性百分比時，認為不相同的殘基位置通常因保守氨基酸取代基而不同，其中氨基酸被取代為其他具有相似化學性能(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基，因而不改變分子的功能性性質(zhì)。如果序列在保守取代基上不同，可上調(diào)序列同一性百分比以校正取代基的保守性質(zhì)。在這種保留取代基上不同的序列稱為具有"序列相似姓"或"相似性"。進行這些調(diào)整的手段是本領域技術人員公知的。通常，這包括將保守取代基作為部分錯配而不是全部錯配來評分，從而提高序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸給出l分，而非保守耳又^基i"會出0分，保守耳又代基給出0~1之間的分。例如才艮據(jù)Meyers和Miller(ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17，1988)算法計算保留取代基的分值。特別優(yōu)選的是如上定義的同源酶，它們具有增強的熱穩(wěn)定性，即對高溫的耐受性增強和/或最適溫度增高。屬于糖苷水解酶族13的分支酶(參見http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/GHl3.html)具有四個保守區(qū)域,一些分析必需的保守殘基位于其中(參見vanderMaarel等，2002,J.Biotechnology94:137-155)。族GH13與糖苷水解酶族70和77—起形成所謂的a-淀粉酶族，其中所有酶都共用這些保守結構域。由幾個最近的出版物已知這些保守區(qū)域和它們直接相鄰區(qū)域中的變9異對酶活性、特異性和形成在由這些酶制得產(chǎn)品中的糖苷鍵有顯著影響。Leemhuis等(Biochemistry,2004，43:13204-13213)表明在游動放線菌SE50/110的acerviosyl轉(zhuǎn)移酶中，當將存在于保守區(qū)域1中的G104轉(zhuǎn)變成H時，該酶變成葡聚糖轉(zhuǎn)移酶類似酶。這種突變還引入了環(huán)糊精形成活性。另一個實例為在路氏乳桿菌121的reuteransucrase中與催化的Asp緊鄰的區(qū)域4中引入的突變將這種酶轉(zhuǎn)變成葡聚糖蔗糖酶(通過該突變制得產(chǎn)品中的1，6-糖苷鍵的量為85°/。，而野生型酶制得含有約50%1，6-糖苷鍵的產(chǎn)品)(Kralj等，Biochemistry2005，44，9206-9216)。使用分支酶的酶解處理用技術人員公知的技術進行。酶的用量取決于酶來源、淀粉來源以及諸如pH和溫度等工藝參數(shù)的活性。通常使用50~400U/g的干重量。一個單位(U)定義為使直鏈淀粉-碘化物復合物在660nm處每分鐘的吸收值減少1%的酶用量。關于pH和溫度，用于現(xiàn)有
技術領域：
和本發(fā)明中的酶具有各種優(yōu)化的值。對于淀粉酶解處理的工業(yè)應用，優(yōu)選使用在6(TC以上或更高溫度下具有活性，或者至少能在較高溫度下存活的酶或其突變體。通常，導致溫度穩(wěn)定性提高的突變是那些使鄰近氨基酸殘基之間的相互作用量增大的突變(氫鍵、范德華相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用)或者是包含形成硫橋的硫側(cè)基的一個或兩個氨基酸(諸如半胱氨酸)的具體引入(參見ao.J.Fitter,2005.Structuralanddynamicalfeaturescontributingtothermostabilityinalpha-amylases，CellMolLifeSci，62:1925-1937;KimYW等,2003，DirectedevolutionofThermusmaltogenicamylasetowardenhancedthermalresistance.AppLEnviron.Microbiol.69:4866-4874)。在以下表l中，列出了所得淀粉的支化百分比、分子量和幾種分支酶的最適宜溫度，而表6和圖1示出了用所述分支酶處理的淀粉的支鏈聚合度的分布曲線。凝來進行。使用膠凝的方法對本領域技術人員是公知的，例如在"J丄.Doublier.Rheologicalstudiesonstarch.Flowbehaviourofwheatstarchpastes.Starch/StSrke,33(1981)415-420;P.DeMeuter,J.Amelrijckx,H.Rahier，B.VanMele"中所述。濃縮的無定形淀粉體系的等溫結晶作用通過調(diào)制式差示掃描量熱法測定(J.Polym.Sci.:PartB:Polym.Phys.,37(1999)2881-2891)。表1.與蠟樣和正常馬鈴薯淀粉相比的不同支化產(chǎn)物的支化度。支化度通過用異淀粉酶或通過用異淀粉酶和支鏈淀粉酶的組合用于水解1,6-糖苷鍵來測定。應注意當使用異淀粉酶/支鏈淀粉酶組合時，耐輻射異常球菌支化產(chǎn)物的支化度增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*在55。C時有活性nc^未才全測糊化使淀粉溶解，從而使它更容易接近酶。或者，淀粉可如"C.Mercier,P.Feillet.Medificationofcarbohydratecomponentsbyextrusion-cookingofcerealproducts.CerealChem.,52(1975)283-297"中所述，在擠出機工藝中用酶力口工；如"R.J.Nicholls,I.A.M.Appelqvist，A.P.Davies,S.J.Ingman,P.J.Lillford.Glasstransitionandfracturebehaviourofglutenandstarcheswithintheglassystate.J.CerealSci.，21(1995)25-36"中所述在加熱的低濕粉末中用酶加工；中或通過轉(zhuǎn)鼓式干燥來加工(P.Colonna，J丄.Doublier，J.P.Melcion,F.deMonredon,C.Mercier.Extrusioncookinganddrumdryingofwheatstarch.I.Physicalandmacromolecularmodifications.CerealChem.,61(1984)538-543)。優(yōu)選地，酶促轉(zhuǎn)化在可能達到最大干燥固體竟爭的條件下進行。這種轉(zhuǎn)化的常規(guī)溫度為10-9(TC之間，特別是在50~80。C之間。通常，調(diào)節(jié)反應進行的pH為3.0~6.0之間。這些轉(zhuǎn)化符合漸近時間曲線，且在所有淀粉基本轉(zhuǎn)化之前，反應可具有長持續(xù)時間。但是，為了有效轉(zhuǎn)化，約1~36小時，更優(yōu)選2~24小時的反應時間就足夠了?？蛇x擇地，在完成轉(zhuǎn)化之后，可用本領域公知技術滅活用于轉(zhuǎn)化的酶，諸如將pH降至低于pH3.0或通過例如噴射蒸煮升高溫度。在酶轉(zhuǎn)化和可選擇地滅活后，通過擠出或噴霧干燥、急驟干燥、空氣干燥、冷凍干燥、真空干燥、傳送帶干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥或本領域中用于干燥淀粉的任何其他公知的方法來分離淀粉。優(yōu)選地，通過噴霧干燥來分離淀;盼。轉(zhuǎn)化程度通常由右旋糖當量(DE)來計量，其大致為淀粉中已斷裂的糖苷鍵的部分。用這種方法制得的食品包括*麥芽糖糊精，輕度水解(DE10-20)的淀4分產(chǎn)品，用作溫和t朱道填料和增稠劑；多種玉米糖漿(DE30-70),用作多種加工食品中的增甜劑和增稠劑的粘溶液；右旋糖(DE100),商用葡萄糖，由淀粉完全水解制得；@高果糖糖漿，通過用葡萄糖異構酶處理右^走糖溶液，直至葡萄糖基本被轉(zhuǎn)化成果糖制得。在美國，高果糖玉米糖漿是甜飲料中所用的主要增甜劑，因為果糖味道比葡萄糖更甜，所以可以使用較少的增甜劑。所得淀粉特征為DE小于3。圖2為淀粉酶解處理的常規(guī)處理原理的流程圖。開始通過約20。/。干重淀粉的淤漿(優(yōu)選從噴射式蒸煮鍋(140。C5秒)穿過的去硬化水中的馬鈴薯淀粉)形成。然后，加入酶并在適宜條件(pH、溫度)下進行反應達充足的時間。優(yōu)選高溫(例如50。C7(TC之間)，因為這抑制微生物污染物開始生長。反應后，將改性淀粉溶液通過噴射式蒸煮鍋(130°C5秒)以使酶滅活，在緩沖罐中收集材料。最后，將改性淀粉噴霧干燥。制得的改性淀粉可理想地用作食品和喂養(yǎng)應用中的可緩慢消化的淀粉?，F(xiàn)今，淀粉用于許多食品和喂養(yǎng)應用中，例如作為主食復合物，作為用于面包店產(chǎn)品(面包、蛋糕、餅干、點心、糖塊等)制造及用于乳制品(乳酪、布丁等)、湯和沙司的制造的粘結劑、填料、增粘劑或膠凝劑。含有較短支鏈的高支化貯存碳水化合物的另一個優(yōu)點是降低的粘度以及凝膠形成性能。在制備上述食品和喂養(yǎng)產(chǎn)品的工藝中，以及也使用淀粉的非食品工藝中，諸如紡織工業(yè)(用于紡紗過程中使紗增強)、造紙工業(yè)，以及用于紙涂層，在這些工藝中經(jīng)常使用中間產(chǎn)物的加熱和冷卻，包括涂布的淀粉，已知的是現(xiàn)有技術的淀粉酶分子和淀粉的支鏈淀粉的長側(cè)鏈相互作用，從而形成不可逆凝膠?，F(xiàn)有技術的淀粉的性能導致在這種工藝中的適用性降低。本發(fā)明的高支化貯存碳水化合物未表現(xiàn)出這些相互作用，或只最低限度地表現(xiàn)這些相互作用，從而將導致不可逆凝膠形成更少，由此導致這些淀粉在上述工藝中的適用性增大。實施例本專利申請中所述酶的基因序列及其相應的氨基酸序列可在美國國立生物信息中心(NCBI)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezZquerv.fcsiCMD=search&DB=protein)。氨基酸序列具有以下入藏登記號小浜紅嗜熱鹽菌NCBI入藏登記號Q93HU3地熱異常球菌NCBI入藏登記號ABF45281(Q1IZQ3)耐輻射異常球菌NCBI入藏登記號AE000513(Q9RTB7)脂肪嗜熱芽桿菌NCBI入藏登記號AAA22482(P30538)。基于以上給出的序列信息，本領域技術人員能得到編碼這些酶的DNA并將該DNA用于異源表達系統(tǒng)中。還可能將酶從上述微生物的培養(yǎng)菌中分離。超嗜熱菌基因的克隆已在vanderMaarel等的"萬/ocato(yw;y腸if謂咖m加'ow,遷3,2/..，-，"中說明。實施例1改性淀粉的生產(chǎn)由常規(guī)食品級馬鈴薯淀粉和蠟樣馬鈴薯淀粉，通過在68。C下每克淀粉與400U的分支酶活性共孵育20小時來制得最大支化產(chǎn)物。淀粉漿通過將淀粉懸浮于每升包含0.2883gCaCl2.21120的軟化水中并在IO(TC的水浴中邊攪拌邊加熱20分鐘制得；隨后將所得淀粉溶液在121。C壓煮20分鐘。將底物冷卻到所需孵育溫度后加入分支酶。20小時后，通過將培養(yǎng)混合物加熱至10(TC停止反應。隨后，支化葡聚糖用乙醇沉淀然后干燥得到。加入乙醇至90%的最終濃度，然后緩和混合乙醇/淀粉懸浮液50分鐘。然后將改性淀粉在濾紙上過濾。保留在濾紙上的材料用100%乙醇洗滌并接著懸浮在100%的乙醇中。然后再將所得淀粉過濾并在37。C干燥。由超嗜熱菌酶制得的支化葡聚糖具有5.3%的平均支化度，同時由小浜紅嗜熱鹽菌酶制得的產(chǎn)物具有9.5%的支化度。酶活性分析分支酶活性量通過測定^/碘化物/直鏈淀粉復合物因分支酶反應而在640nm處的吸收值變化來判定。測試程序如下在適宜溫度(超嗜熱菌8(TC,小浜紅嗜熱鹽菌60°C)下，將150^1的0.125%直鏈淀粉溶液(SigmaA0512,III型，馬鈴薯)與50jil在適宜稀釋劑(10~15U/ml)中的酶共孵育15分鐘。使用未加入酶的直鏈淀粉溶液作為參照。在冰上筒單冷卻樣品(1~3秒)且渦流后將它們置于室溫中。取出15jil樣品并將其與150)!l碘溶液(每升中940gCaCl2,lgKI,O.lg12)在聚氯乙烯微量滴定板(ICN)中混合。5~IO分鐘后，測定640nm處的消光度。由吸收的降低，根據(jù)以下公式計算酶活性:爿直鏈淀粉/100Zminr酶活性=以1;為單位的活性/附鵬^4=吸收/消光A/4&p=^直鏈淀粉一爿a印P-體積OZ)P總=「酶+7底物Kf^酶稀釋因子支化度分析支化度通過用酶異淀粉酶去支化后測定形成的還原端基量來分析。分析進行如下將100mg樣品與10ml軟化水混合，然后將該混合物在100。C的爐中加熱1小時，同時通過轉(zhuǎn)動混合。在將其冷卻至35。C后等待15分鐘，用1M乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5。然后加入0.875U異淀粉酶溶液(Megazyme,威克洛，愛爾蘭)并接著在35。C孵育20小時。通過將反應混合物沸騰2分鐘來停止反應，將樣品在3600rpm離心分離(MSE離心才幾)30分鐘。用Nelson-Somogyi測定法測定上層清液中的還原糖量(G.Spiro:Analysisofsugarsfoundinglycoproteins,inMei/iodsEn^ymoZ.S(Ed.E.F.Neufeld,V.Ginsburg)AcademicPress,1966)。支鏈組成支化葡聚糖的支鏈組成通過用異淀粉酶去支化接著用HPLC分析低聚糖來測定。支化葡聚糖通過添加微生物去分支酶異淀粉酶去支化。將待分析樣品的pH用1M乙酸調(diào)節(jié)至4.5,加入0.875U異淀粉酶溶液(Megazyme)接著在40。C孵育1小時。反應通過將反應混合物沸騰2分鐘來終止。在HPLC分析之前，將樣品在80%DMSO中稀釋五倍，在卯。C加熱120分鐘，同時旋轉(zhuǎn)混合以得到澄清溶液并隨后用0.45|imMillex過濾器(Millipore,Billerica，摩洛哥，美國)過濾。然后直鏈低聚糖用裝有20(il注射環(huán)、CarboPacPa-115保護柱和Pa-l柱、四元梯度泵、使用氦氣的洗脫液脫氣裝置和含有黃金電極的脈沖電流檢測器的含有脈沖電流檢測器的高效離子交換色譜(HPAEC-PAD;Dionex，Sunnyvale,加利福尼亞，美國)分析。電極電勢編程如下0~0.4秒O.IV，然后0.41-0.61秒0.7V,最后0.61~1.00秒0.1V;0.20.4秒集成信號。Englyst測定用Englyst分斗斤'法(Englyst，H.N.，Kingman,S.M.,andJ.H.Cummings.1992.Classificationandmeasurementofnutritionallyimportantstarchfractions.Eur.J.Clin.Nutr.46:33-50),可估定快速降解淀粉和緩慢降解淀粉的量。在試管中模擬人體胃部和小腸，通過將樣品與胰酶、轉(zhuǎn)化酶和淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)的混合物共孵育，測定20分鐘(快速降解淀粉，RDS)和120分鐘(緩慢降解淀粉，SDS)后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的量。同時，測定作為由a-淀粉酶和AMG得到的葡萄糖量的淀粉總量(TG)。由淀粉總量與降解淀粉量之差計算抗性淀粉量。就高支化葡聚糖而言，淀粉葡萄糖香酶的使用(水解支化點)對分析有不利影響。因此，將Englyst法作輕微修改在孵育混合物中省去淀粉葡萄糖苷酶和轉(zhuǎn)化酶，并改變轉(zhuǎn)化淀粉量的分析。已轉(zhuǎn)化的淀粉量定義為制得的至多麥芽五糖的麥芽低聚糖(maltooliogosaccharide)總量。對所用Englyst法的第二改變?yōu)樵谄渲惺褂酶蛣┝康囊让讣案嗟臉悠贰Ｋ袠悠酚肎OPOD法通過離子交換HPLC(不檢測支化產(chǎn)物)以及通過HPAEC-PAD(纟全測直鏈和支鏈產(chǎn)物)進行葡萄糖分析。分析制備"像被吃過一樣的"樣品。這通過將5ml水加入0.6g淀粉中，將其在100。C加熱10分鐘，并冷卻至37。C來進行。在該溶液中加入10ml阿拉伯糖/胃蛋白酶/瓜爾溶液(20g/L的阿拉伯糖在25%的含有0.05M氯化鈉的飽和硼酸中的溶液，其中加入有5g/L胃蛋白酶[SigmanoP-7000]和瓜爾膠[SigmanoG-4129])并將該溶液在37°C脬育30分鐘。加入5ml乙酸鈉(0.5M)和5個玻璃球后，將整個懸浮液緩和混合并置于37。C平衡。然后在試管中將5ml酶溶液(3g胰酶[SigmanpoP-7545]加入120ml超純水中，混合均勻并以1500xg離心，然后將4ml淀粉葡萄糖普酶[Novozyme的AMG400LLP型]和6ml轉(zhuǎn)化酶[Merckno390203D]加入到90ml上層清液中)加入試管中的懸浮液中，然后在37。C將其水平置于震蕩水浴中同時以100rpm混合。每20分鐘，從各個試管取出0.2ml樣品然后將其加入4ml無水乙醇中。孵育結束時，將這些試管徹底混合以分離所有顆粒，然后將它們置于裝有沸水的水浴中30分鐘。短暫混合后，將這些試管置于水水上15分鐘。將10ml氫氧化鉀(7M)加入這些試管中，然后將該溶液在冰水中孵育30分鐘，同時以100rpm混合。從各個試管中取出0.2ml樣品，并加入lml乙酸(1M)和40|il淀粉葡萄糖苦酶溶液(1:7稀釋的Novozyme的AMG400LLP型)。將該樣品在70匸孵育30分鐘然后置于沸水中IO分鐘。然后將這些試管在冰水中冷卻至室溫并在各個試管中加入12ml無水乙醇。后一種樣品中的葡萄糖量表示上述酶孵育后剩下的葡萄糖總量。各樣品中的葡萄糖量測定如下將樣品在1500xg下第一離心分離5分鐘，根據(jù)生產(chǎn)商說明將葡萄糖作為標準，葡萄糖量用GOPOD測定法(Megazyme,K-Gluc)在上層清液中測定。結果支化產(chǎn)物由小浜紅嗜熱鹽菌和超嗜熱菌酶制得的支化葡聚糖產(chǎn)物分別具有9~9.5%和5.3~5.5%的支化度。這些支化葡聚糖的支鏈分布表明了至多DP30范圍內(nèi)的差異。特別表明小浜紅嗜熱鹽菌產(chǎn)物比超嗜熱菌產(chǎn)物具有更多較短支鏈(參見表6和圖1)。消化性對超嗜熱菌產(chǎn)物(5.3%支化)和小浜紅嗜熱鹽菌產(chǎn)物(9.5%支化)進行詳細的Englyst分析。在120分鐘的時間區(qū)間內(nèi)，每20分鐘取出樣品并測定游離葡萄糖量。其結果示于表2中。這些結果表明在第一個20分鐘內(nèi)用作10%干固體懸浮物的約90%的小浜紅嗜熱鹽菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成葡萄糖。超嗜熱菌產(chǎn)物一定程度上降解更快(在第一個20分鐘內(nèi)95%)。40分鐘后兩種產(chǎn)物幾乎完全降解。在第一個20分鐘內(nèi)，麥芽糖完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在第一個20分鐘內(nèi)，蠟樣馬鈴薯淀粉樣品轉(zhuǎn)化了96%,并在40分鐘后完全降解。當將小浜紅嗜熱鹽菌產(chǎn)物用作50%干固體溶液時，在笫一個20分鐘內(nèi)只有67%降解。120分鐘后，這些產(chǎn)物也完全降解。由表3可看出，80%降解了的小浜紅嗜熱鹽菌作為短低聚糖回收。對于超嗜熱菌產(chǎn)物和蠟樣馬鈴薯淀粉，約卯％降解了的材料作為短低聚糖回收。只有80%已轉(zhuǎn)化的小浜紅嗜熱鹽菌材料作為至多DP5的低聚糖回收，而對于超嗜熱菌產(chǎn)物和蠟樣馬鈴薯淀粉，94%~97%可回收。這些結果表明要求相對較高的支化度來獲得更少的降解?；谶@些觀察，初步結論為需要大于9%的支化度以提供更低的降解性。另外，在通過oc-淀粉酶的淀粉消化之后，緊接著麥芽糖和麥芽三糖之后形成所謂oc極限糊精(參見Beers等，1995,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.30:197-262)。支化產(chǎn)物的ct極限糊精含量可從表3得出。在該表中，DPI~3的形成作為總碳水化合物的百分比給出。HPLC分析顯示了DP4或更高的低聚糖都是非直鏈的，暗示它們都包含至少一個a-(l,6)-葡萄糖支化點，因此為a極限糊精。因此，a極限糊精等于100%減去DPI~3含量，這得到了對于PaselliSA2(它近似模仿了未改性淀粉)20。/。的a極限糊精含量以及對于超嗜熱菌、小浜紅嗜熱鹽菌和耐輻射異常球菌分別為36%、43%和58%。因此，本發(fā)明的淀粉還可定義為可緩慢消化的貯存碳水化合物，具有至少8.5~9%的支化度，優(yōu)選至少10%,更優(yōu)選至少11%，以及至少35。/。的a極限糊精，優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少45%,且最優(yōu)選至少50%。表2.不同類型支化葡聚糖及一些具有及時制得的游離葡萄糖量的參照產(chǎn)物的標準Englyst分析結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3.與參照產(chǎn)品(PaselliSA2)相比，用不同微生物分支酶制得的支化產(chǎn)品的離體消化結果。離體測定法是基于Englyst等說明的方法(如上)，但改變所加酶合劑的量。按時形成的小低聚糖量用所述用于支鏈組成的DionexHPLC法測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4.用不同測定法在多種淀粉中檢測支化°/0<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注普通正常馬鈴薯淀粉來自AVEBE,批號40389。表6.支鏈分布<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權利要求1、一種可緩慢消化的貯存碳水化合物，具有至少8.5～9％，優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少11％的支化度，且具有包括至少10％，優(yōu)選至少15％且更優(yōu)選至少20％的DP5～7的支鏈成分。2、根據(jù)權利要求1所述的可緩慢消化的貯存碳水化合物，其特征為具有約60~約150kD的分子量。3、根據(jù)權利要求1或2所述的可緩慢消化的貯存碳水化合物，其中所述貯存碳水化合物可被人體或動物腸道酶水解，所述水解速度不大于相同條件下麥芽糖水解速度的0.9倍，優(yōu)選0.1~0.9倍之間，更優(yōu)選0.3~0.7倍之間。4、一種制造可緩慢消化的貯存碳水化合物的方法，通過用分支酶處理天然來源的貯存碳水化合物，所述可緩慢消化的貯存碳水化合物具有至少9%，優(yōu)選至少10，更優(yōu)選至少11%的支化度，且具有包括至少10%,優(yōu)選至少15%,更優(yōu)選至少20%的DP5~7支鏈成分。5、根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述分支酶是源自微生物的酶，優(yōu)選是具有E.C.2.4丄18所述活性的酶，優(yōu)選是源自紅嗜熱鹽菌和/或異常球菌科或異常球菌-棲熱菌類的微生物的酶或它們的任何同源或突變體酶，更優(yōu)選是源自選自由小浜紅嗜熱鹽菌、海洋紅嗜熱鹽菌、耐輻射異常球菌或地熱異常球菌組或小浜紅嗜熱鹽菌，或源自耐輻射異常球菌或小浜紅嗜熱鹽菌的酶。6、根據(jù)權利要求4或5所述的方法，其中所述天然來源為含淀粉的植物材料，優(yōu)選根或塊莖，更優(yōu)選馬鈴薯塊莖。7、根據(jù)權利要求3~5中任意一項所述的方法，其中所述天然來源的貯存碳水化合物至少包括90%的支鏈淀粉。8、由根據(jù)權利要求47中任意一項所述方法制備的可緩慢消化的貯存碳水化合物。9、根據(jù)權利要求1~3或權利要求8所述的可緩慢消化的貯存碳水化合物作為食品或喂養(yǎng)產(chǎn)品的應用，優(yōu)選用于糖尿病人食品、嬰兒食品，特殊的膳食配方和/或運動食品和飲料。10、根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征是所述可緩慢消化的貯存碳水化合物以至少10wt。/。的量加入到所述食品、喂養(yǎng)產(chǎn)品或々大料中。11、源自微生物的糖原分支酶在制備可緩慢消化的貯存碳水化合物中的應用，其所述可緩慢消化的貯存碳水化合物具有至少8.5-9%,優(yōu)選至少10%,更優(yōu)選至少11%的支化度，且具有包括至少10%、優(yōu)選至少15%、最優(yōu)選至少20%的DP5~7的支鏈成分；所述酶為源自選自由紅嗜熱鹽菌和/或異常球菌科或異常球菌-棲熱菌類構成的組中的微生物的酶，更優(yōu)選為源自選自由小浜紅嗜熱鹽菌、海洋紅嗜熱鹽菌、耐輻射異常球菌或地熱異常球菌構成的組中的微生物的酶，或所述酶的具有糖原分支活性的任何同源或突變體酶。全文摘要本發(fā)明涉及可緩慢消化的貯存碳水化合物(淀粉、糖原)，其具有至少8.5％的支化度和包括至少10％的DP5～7的支鏈成分。所述可緩慢消化的碳水化合物可通過用糖原分支酶處理天然來源的底物(糖原、淀粉)來制造，所述糖原分支酶源自小浜紅嗜熱鹽菌、海洋紅嗜熱鹽菌、耐輻射異常球菌或地熱異常球菌。文檔編號A23L1/0522GK101631474SQ200780050480公開日2010年1月20日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權日2006年12月29日發(fā)明者多伊德·哈科博·賓納瑪,彼得·利克爾·布瓦爾德,彼得·桑得斯,辛迪·塞梅因,馬爾克·喬斯·埃利塞·科爾內(nèi)利斯·凡德馬雷拉申請人:荷蘭應用科學研究組織