專利名稱：高效透氣裝置及培養(yǎng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法和裝置。它們包括透氣培養(yǎng)室的 使用，在維持均勻的培養(yǎng)條件時(shí)可減少空間的使用，并且更適合液體的向 動(dòng)處理。它們包括將透氣材料集成到傳統(tǒng)的多層形式內(nèi)，以解決細(xì)胞培養(yǎng) 條件不均勻的問題。它們包括使用由透氣的、充有等離子體的硅酮構(gòu)成的 表面，它們還能與傳統(tǒng)的附著表面，例如由傳統(tǒng)的經(jīng)組織培養(yǎng)處理(tissue culture treated)的聚苯乙烯構(gòu)成的那些表面，集成為 -體。它們包括將透 氣、透液的膜集成為一體的培養(yǎng)裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)的核心部分。組織培養(yǎng)瓶是細(xì)胞培養(yǎng)常用的裝置，因?yàn)樗鼈兛梢耘囵B(yǎng)粘附性細(xì)胞類型也可以培養(yǎng)非粘附性細(xì)胞類型，是一次 性的，并且可在靜態(tài)方式下工作而無需灌注培養(yǎng)基的設(shè)備。傳統(tǒng)瓶有一個(gè) 培養(yǎng)室。它們的設(shè)計(jì)要求在裝置內(nèi)存在供培養(yǎng)物氣體交換的氣-液界面。培 養(yǎng)基的駐留高度必須很低，使得向細(xì)胞的氧傳遞不會(huì)受到削弱。對(duì)于組織 培養(yǎng)瓶，建議的培養(yǎng)基高度為2mm 3mm。然而，瓶體必須足夠大以保持 氣體，并允許使用(通常是)移液管吸取培養(yǎng)基。因此，相對(duì)其盛裝的培 養(yǎng)基體積，培養(yǎng)瓶具有較大的裝置體積。例如，常用的T一175培養(yǎng)瓶具有 大約長(zhǎng)23cm、寬llcm的底面，大約高3.7cm，并因此需占936cm3的空間。 但是，其工作時(shí)培養(yǎng)基通常為約50ml。因此，相對(duì)培養(yǎng)瓶瓶體所占的空間 (936cm3)，在瓶體中的培養(yǎng)基(50ml)顯示僅有瓶容積的約5%被培養(yǎng) 基占用。而且，將由培養(yǎng)瓶瓶體占用的空間(936cm3)的容積除以供細(xì)胞 駐留在上面的表面區(qū)域(175cm2)，表明由培養(yǎng)瓶占用的空間的容積是其 提供給細(xì)胞駐留其上的表面積的5倍以上。培養(yǎng)瓶制造成具有各種數(shù)量的 供細(xì)胞駐留其上的表面積，通常的面積為25 cm2 225 cm2，因此，只有 較小的培養(yǎng)容量。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)放大期間使用越來越多的培養(yǎng)瓶，相對(duì)于它 們提供的較小的培養(yǎng)基體積和有限的培養(yǎng)表面積，它們占用的整個(gè)空間量 導(dǎo)致了固有的對(duì)于空間的低效利用，這加重了培養(yǎng)過程的負(fù)擔(dān)，因?yàn)榕c運(yùn) 輸、滅菌、儲(chǔ)藏、培養(yǎng)箱空間以及廢棄處理相關(guān)的成本過高。工作量以及 污染風(fēng)險(xiǎn)的大幅增加進(jìn) 一 步加深了這個(gè)問題。
多層培養(yǎng)瓶，如NUNCTM Cell Factory (美國(guó)專利No. 5,310，676)和 Corning CellSTACK⑧(美國(guó)專利No. 6,569,675)，試圖通過以垂直方向堆疊 培養(yǎng)層以在一各培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)形成多個(gè)培養(yǎng)室，來解決培養(yǎng)瓶放大效率低的問 題。這在一個(gè)裝置內(nèi)形成了更多的表面積，并且這使得可以有比傳統(tǒng)培養(yǎng) 瓶中更多的細(xì)胞駐留在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。這樣， 一個(gè)多層培養(yǎng)瓶可以代替多 個(gè)傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶。該多層培養(yǎng)瓶可設(shè)置成使得培養(yǎng)基可以通過共用匯集點(diǎn)取 放，從而不需要用移液轉(zhuǎn)通向A個(gè)培養(yǎng)室。這使得與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的^度相 比，多層培養(yǎng)瓶的各層之間的距離可以減低。例如，NUNCtm Cell Factory 的培養(yǎng)層之間的空間為約1.4cm，相對(duì)常用的T-175培養(yǎng)瓶的底部和頂部之 間3.7cm的距離，在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、滅菌、培養(yǎng)和廢棄處理空間的利用方面 有了一些改養(yǎng)。多層培養(yǎng)瓶中通氣口允許與環(huán)境大氣之間的氣體交換，以 調(diào)節(jié)pH、供氧以及有助于維持溫度控制。然而，在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的任意給 定位置的氣體與通氣口位置的距離不同。由于在放大時(shí)多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng) 室數(shù)量增多，離通氣口最遠(yuǎn)點(diǎn)的氣體和最近點(diǎn)的氣體之間的距離隨之增大， 在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的全部氣體中會(huì)形成C02和02濃度梯度。閑此，多層培養(yǎng)瓶設(shè)計(jì)本身具有在整個(gè)裝置內(nèi)存在不均勻的培養(yǎng)條件不均勻的可能性， 該問題在放大時(shí)更加嚴(yán)重。
有許多靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)裝置，它們通過使裝置的下壁透氣來實(shí)現(xiàn)氣體傳 遞。氣體通過透氣下壁擴(kuò)散，以響應(yīng)形成在培養(yǎng)基和環(huán)境氣體之間形成的 濃度梯度。這種方式不以氣-液界面作為唯一的氣體交換源。因?yàn)榧?xì)胞駐留 其上的表面是透氣的，與所述多層培養(yǎng)瓶相比會(huì)存在更均勻的培養(yǎng)條件。 培養(yǎng)袋是靜態(tài)透氣裝置，其包含單一培養(yǎng)室。為了放大培養(yǎng)，培養(yǎng)袋必須 沿水平方向伸長(zhǎng)，以獲得供細(xì)胞駐留其上的更大表面積。因此，在放大時(shí)，
它們很快變得難以處理并且超出細(xì)胞培養(yǎng)箱的尺寸。OriGen Biomedical Group (OriGen PermaLife Bags)、 Baxter (Lifecell X-FolcFM涉及美國(guó)專利 4,829,002, 4,937， 194, 5,935,847, 6，297,046B1)、 Medtronic(Si-Culture ,美國(guó) 專禾U No. 5,686,304)、 Biovectra (VectraCell )以及American Fluoroseal (VueLife Culture Bag System,由美國(guó)專利4,847,462和4,945,203保護(hù)) 有市售培養(yǎng)袋。透氣培養(yǎng)器是和培養(yǎng)袋以同樣的方式工作的裝置，區(qū)別在 于它們具有剛性的側(cè)壁。市售透氣培養(yǎng)器包括CLINIcell Culture Cassettes (由Laboratories MABIO-International 提供)禾卩Opticell 透氣培養(yǎng)器 (美國(guó)專利6,455,310和6,410,309)(山BioChrystal Ltd.提供)。對(duì)于培養(yǎng)袋， 為了提供更多供細(xì)胞駐留其上的表面積，這些裝置必須在水平方向伸11 。 在美國(guó)專利No. 6,821,772中，Opticel產(chǎn)的發(fā)明人提出了多個(gè)透氣培養(yǎng)室。 不幸的是，這種方案僅僅增加了水平方向上的培養(yǎng)室數(shù)量。因此，無論培 養(yǎng)室的數(shù)量是多少，為了增加這些裝置的培養(yǎng)容量，它們必須在水平方向 上制作得更大。這勝透氣裝置都不能在垂直方向放大。
在更有效地利用空間的努力中，美國(guó)專利No. 6,673,595記載了通過在 垂直方向堆疊獨(dú)立的物理上不同的培養(yǎng)器，并且以非常復(fù)雜的自動(dòng)化系統(tǒng) 來操作各獨(dú)立培養(yǎng)器，來放大Opticell 透氣培養(yǎng)器。這種放大方式明顯背 離了傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶A有的簡(jiǎn)單性。
美國(guó)專利No. 6，759，245記載了 一種多層透氣培養(yǎng)裝置，其通過采用透 氣不透液膜將氧輸送和培養(yǎng)基輸送相分離。該發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，如果 通過透氣不透液膜將液體培養(yǎng)基和含氧流體的流動(dòng)分開，且細(xì)胞附著于膜 的液體側(cè)生長(zhǎng)，那么裝置可用于利用穿過所述膜的氧傳輸來培養(yǎng)細(xì)胞，而 無需考慮液體培養(yǎng)基經(jīng)過裝置的流量。其優(yōu)點(diǎn)在于液體培養(yǎng)基的流量不再 依賴于將氧攜帶至細(xì)胞的需求。然而，雖然培養(yǎng)基的流動(dòng)大幅降低，因?yàn)?其僅需要攜帶如葡萄糖之類的物質(zhì)，其失去了培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的能力，因?yàn)?在使用時(shí)懸浮細(xì)胞會(huì)被從裝置洗出。在這種方式中，細(xì)胞必須附著于膠原基體。另外的缺陷是需要灌注氣體空間和/或液體空間。這需要泵、流體管 道，與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶相比大大提高了復(fù)雜程度。因此，這種方式還沒有 商業(yè)化。
共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/961,814 (Wilson等)記載了一種更有效 地利用空間的透氣裝置。Wilson等的'814記載的所述透氣裝置允許在垂直 方向放大，同時(shí)保留傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的簡(jiǎn)單性。例如，Wilson等的'814 記載了透氣裝置的垂直放大，所述透氣裝置由一個(gè)一個(gè)堆疊的供細(xì)胞駐留 其上的培養(yǎng)層構(gòu)成。氣體傳遞通過裝置的壁進(jìn)行。與傳統(tǒng)透氣裝置的放大 不同，可通過增加裝置在垂直方向而非水平方向的尺寸來增加培養(yǎng)規(guī)模。 因?yàn)椴恍枰獨(dú)?液界面，這使得在垂直放大培養(yǎng)規(guī)模時(shí)優(yōu)化了空間效率。得 到了相對(duì)所述多層培養(yǎng)瓶更加緊湊的裝置。存在傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中不可能 的特性。例如，所述裝置可以倒轉(zhuǎn)，以使得粘附細(xì)胞可以在堆疊培養(yǎng)層的 上表面和下表面上培養(yǎng)以進(jìn)一步優(yōu)化空間效率。本文記載的發(fā)明在共同未 決申請(qǐng)Wilson等的'314上進(jìn)一步發(fā)展，得到了新的幾何形狀，其為傳統(tǒng)多 層培養(yǎng)瓶提供了優(yōu)良的替代方式。
本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置和方法，將整個(gè)裝置內(nèi)存在 不均勻培養(yǎng)條件的可能性降到最低，允許對(duì)粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞進(jìn)行空間 效率較高的培養(yǎng)放大，易于使用，可在無需灌注培養(yǎng)基或氣體的前提下工 作，并使得使用者可以有效利用各培養(yǎng)室的上、下或側(cè)壁表面。通過隨后 的說明和附圖可以使進(jìn) 一 步的目的和優(yōu)點(diǎn)變得清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過集成至少兩個(gè)透氣培養(yǎng)室，克服了現(xiàn)有靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)裝置 的許多缺點(diǎn)，所述培養(yǎng)室至少部分地將氣體空間保持在它們之間，以使得 氣體可以與培養(yǎng)室的透氣區(qū)域接觸。這使得各培養(yǎng)室可以與鄰近該培養(yǎng)室 的氣體空間直接交換氣體，將培養(yǎng)條件不均勻的可能性降到顯低。培養(yǎng)室 的選定表面可以制成是透氣的，以在與細(xì)胞相對(duì)和/或靠近細(xì)胞的表面上進(jìn) 行氣體交換。培養(yǎng)室內(nèi)的表面可山各種材料構(gòu)成，以提供供細(xì)胞駐留其上 的最佳表面。如果有需耍(例如在培養(yǎng)粘附細(xì)胞或在三維基體中生長(zhǎng)的細(xì) 胞的情況下可能需要)，培養(yǎng)室內(nèi)的表面積可以增大。細(xì)胞還可以直接駐 留在培養(yǎng)室的透氣材料上。通過增加培養(yǎng)室使得氣體空間至少部分地處在 各培養(yǎng)室之間，以允許氣體與培養(yǎng)室的透氣區(qū)域接觸，來實(shí)現(xiàn)裝置的放大。 通過一個(gè)或多個(gè)共用集流腔，或通向各培養(yǎng)室的獨(dú)立通路，可以實(shí)現(xiàn)與培 養(yǎng)室的通路。憑借這種構(gòu)造，可以用簡(jiǎn)單的方式放人培養(yǎng)規(guī)模，這種方式易于使用，有效利用空間，并將發(fā)生培養(yǎng)條件不均勻的可能性降到最低。 可以包括各種部件，并可以設(shè)置成各種構(gòu)造，以提供附加的優(yōu)點(diǎn)，包括使 得裝置可以在一種以上的狀態(tài)下操作，允許培養(yǎng)粘附細(xì)胞，允許培養(yǎng)懸浮 細(xì)胞，允許共培養(yǎng)，防止日常操作期間細(xì)胞離開它們各自的培養(yǎng)室，將補(bǔ) 料頻次減到最低，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的操作方式，允許在培養(yǎng)期間增加或減 少共細(xì)胞駐留其上的表面積，允許在培養(yǎng)期間增加或減少培養(yǎng)基體積與共 細(xì)胞駐留其上的表面積的比率，以及/或允許細(xì)胞駐留在替代材料上或駐留 在替代材料附近。
本發(fā)明的一個(gè)方面中，各培養(yǎng)室包括第一壁和相對(duì)的第二壁，所述第 一壁和/或第二壁由透氣材料構(gòu)成，且氣體空間存在于各培養(yǎng)室的至少一部 分之間。
在本發(fā)明的另一方面中，各培養(yǎng)室包括多個(gè)壁，包括但不限于第一壁 和相對(duì)的第二壁，第三壁和相對(duì)的第四壁，以及第五壁，所述第一壁和/或 第二壁和/或第三壁和/或第四壁和/或第五壁由透氣材料構(gòu)成，氣體空間靠 近各培養(yǎng)室的至少透氣部分。
在本發(fā)明的另一方面中，所述培養(yǎng)室由一集流腔平行連接。所述集流 腔可設(shè)胃成防止氣體置換保持在培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基，并且/或者可以設(shè)賈成 在操作期間將細(xì)胞保留在培養(yǎng)室內(nèi)，并且/或者可以設(shè)置成將培養(yǎng)基和氣體 保留在培養(yǎng)室內(nèi)。
本發(fā)明的另 一方面中，培養(yǎng)室由超過一個(gè)集流腔平行連接。
在本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室的高度可以改變。
在本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室支架位于培養(yǎng)室之間，以將培養(yǎng)室保 持在基本上水平狀態(tài)，并且/或者使得氣體可以與培養(yǎng)室的透氣表面接觸。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室的壁包括于其相鄰培養(yǎng)室中的至少一個(gè) 接觸的突起部，以將培養(yǎng)室保持在基本上水平的狀態(tài)，并使得氣體可以與 培養(yǎng)室的透氣表面接觸。
本發(fā)明的另一方面中，提供了防止培養(yǎng)室的壁與相鄰的培養(yǎng)室壁接觸 的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室串聯(lián)連接。
本發(fā)明的另 一方面中，可以直接通向各培養(yǎng)室。
本發(fā)明的另一方面中，環(huán)境氣體和透氣多層裝置的氣體空間之間的接 觸可以有選擇地被終止，限制或不受限制。
本發(fā)明的另一方面中，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)室擴(kuò)展到多個(gè)培養(yǎng)室是可能的。
9本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)透氣多層培養(yǎng)裝置被定向成使得細(xì)胞駐留在 培養(yǎng)室最下方的培養(yǎng)表面上， 一個(gè)培養(yǎng)室的至少部分沒有培養(yǎng)室直接位于 其上，以方便顯微鏡評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)透氣多層培養(yǎng)裝置被定向成使得細(xì)胞駐留在 培養(yǎng)室最下方的培養(yǎng)表面上，最下面的培養(yǎng)室和位于其上的培養(yǎng)室之間的 氣體空間使得光可以存在在最下方培養(yǎng)室上，以方便用倒置式顯微鏡對(duì)最 下方培養(yǎng)室的評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的另一方面中，通過將細(xì)胞接種到培養(yǎng)表面，并且重新定位裝 置以使細(xì)胞的另一接種物沉降到不同培養(yǎng)表面，可以實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)細(xì)胞的方 法。
本發(fā)明的另一方面中，通過僅僅轉(zhuǎn)動(dòng)裝置來一個(gè)表面一個(gè)表面地重新 定位細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)在特定表面、在特定氧壓力、和特定培養(yǎng)基高度、和/ 或在特定的培養(yǎng)基體積與表面積之比率下培養(yǎng)細(xì)胞的方法。還可以培養(yǎng)至 少5種不同的細(xì)胞系，各細(xì)胞系駐留在培養(yǎng)室的不同壁上。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室被制造成整體單元以將密封件的數(shù)量減 到最少。
本發(fā)明的另一方面中，透氣多層裝置可設(shè)置成保留市售的傳統(tǒng)多層培 養(yǎng)瓶的結(jié)構(gòu)，同時(shí)解決培養(yǎng)條件不均勻的問題。
本發(fā)明的另一方面中，公開了采用透氣不透液材料，用于包括培養(yǎng)室 支架以及氣體空間與環(huán)境氣體之間的無菌屏障的透氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
本發(fā)明的另一方面中，公開了用充等離子體的硅酮構(gòu)造透氣裝置，以 將其向其它表面的遷移減到最低。


圖1A和圖1B示出了一種透氣多層裝置的實(shí)施方式，該裝置設(shè)置成使 氣體交換直接通過培養(yǎng)室的壁進(jìn)行。該培養(yǎng)室通過集流腔平行連接以形成 完整單元，該單元包括存在于培養(yǎng)室之間的氣體空間。通行端口允許流體 進(jìn)出透氣多層裝置。
圖2示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視閣，該裝置設(shè)置成允 許氣體通過培養(yǎng)室的第一壁傳遞，以允許通過處于離細(xì)胞最遠(yuǎn)距離的培養(yǎng) 基的表面進(jìn)行氣體交換。
圖3示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視閣，該裝置設(shè)胃成允 許氣體通過培養(yǎng)室的第二壁傳遞，以允許細(xì)胞附近的氣體交換。
圖4示出了透氣多層裝置的 -種實(shí)施方式的剖視閣，該裝賈被設(shè)置成允許通過培養(yǎng)室的第一壁和通過培養(yǎng)室的第二壁進(jìn)行氣體傳遞，以增加用 于氣體交換的表面積。
圖5A、 5B和5C示出了透氣多層裝置的立體圖，所述裝置被設(shè)置成具
有第一壁和相對(duì)的第二壁，第三壁和相對(duì)的第四壁，以及第五壁。通過有 選擇地制造具有預(yù)定長(zhǎng)度、寬度、表面積和材料成分的各個(gè)壁，以及具有 預(yù)定材料和表面積的各培養(yǎng)表面，使用者可以從多種培養(yǎng)方式種進(jìn)行選擇。 因此，通過僅僅改變所述透氣多層裝置的朝向，使用者可以使細(xì)胞處于各 種培養(yǎng)表面類型、培養(yǎng)表面積、氧壓力和培養(yǎng)基體積與培養(yǎng)表面積之比率。
例如，當(dāng)透氣多層裝置定向成如圖5B所示時(shí)，培養(yǎng)基可以處于比透氣多層 裝置定向成如圖5A所示時(shí)更高的高度。當(dāng)透氣多層裝置定向成如圖5C所 示，培養(yǎng)基會(huì)所處的高度可以超過當(dāng)裝置定向成如圖5A或圖5B中所示時(shí) 可能達(dá)到的高度。
圖6示出了透氣多層裝置的剖視圖，該裝置設(shè)置有氣阱，以防止氣體 從培養(yǎng)室內(nèi)部置換培養(yǎng)基。
圖7A和7B示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，其設(shè)置成 防止細(xì)胞在日常操作時(shí)離開培養(yǎng)室。圖7C、 7D和7E示出了透氣多層裝置 的一種實(shí)施方式的剖視圖，其被設(shè)置成使得培養(yǎng)基和氣體以預(yù)定的體積處 f培養(yǎng)室內(nèi)。
閣8A、8B、8C和8C-1示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖， 該裝置設(shè)置有兩個(gè)集流腔。培養(yǎng)室平行地連接在集流腔之間，形成包括鄰 近各培養(yǎng)室的氣體空間的整體爭(zhēng)元。圖8D和8E示出了在培養(yǎng)過程前或培 養(yǎng)過程中如何改變培養(yǎng)基體積和/或透氣表而積與培養(yǎng)室容積的比率。
圖9A和9B示出了培養(yǎng)室支架的用途，用于使得氣體與培養(yǎng)室的透氣 材料接觸，并且/或者用于將培養(yǎng)室保持在基本上水平狀態(tài)，以使得細(xì)胞均 勻地分布在培養(yǎng)室內(nèi)。
圖IO示出了培養(yǎng)室支架的用途，所述支架呈從培養(yǎng)室的壁部突出的突 起部形式，用于使得氣體與培養(yǎng)室的透氣材料接觸，并且/或者用于將培養(yǎng) 室保持在基木上水平狀態(tài)，以使得細(xì)胞均勻地分布在培養(yǎng)室內(nèi)。
圖11示出了處于培養(yǎng)室內(nèi)的內(nèi)部間隔件的作用，其用于防止壁以及/ 或者培養(yǎng)表面互相接觸。
圖12示出了透氣多J3裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，其中培養(yǎng)室與進(jìn) 口和出口以串聯(lián)方式連接。培養(yǎng)室形成整體單元，并包括鄰近各培養(yǎng)室的 氣體空間。
圖13示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，所述裝置設(shè)覽有
11獨(dú)立的培養(yǎng)室和鄰近各培養(yǎng)室的氣體空間。其還示出了如何有選擇地控制 環(huán)境氣體至氣體空間的通路。
圖14示出了透氣多層裝置的另一種實(shí)施方式，其被設(shè)置為控制環(huán)境氣 體至氣體空間的通路。
圖15示出了透氣多層裝置的另一種實(shí)施方式，其被設(shè)置為控制環(huán)境氣 體至氣體空間的通路。
圖16A和16B示出了使用透氣多層裝置從一個(gè)培養(yǎng)室向多個(gè)培養(yǎng)室擴(kuò) 展細(xì)胞的方法。
圖17A示出了由硅酮成型的整體培養(yǎng)室，其將可能泄漏的連接件數(shù)量 減到最少。圖17B示出了作為單個(gè)工件制造的培養(yǎng)室整體組合。圖17C示 出了透氣多層裝置的分解圖，其包括整體培養(yǎng)室，包覆成型法蘭、兩個(gè)集 流腔和培養(yǎng)室支架。
圖18A示出了傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶制造商推薦的用于解決培養(yǎng)條件不均勻 問題的方式。圖18B示出了該方式的放大圖。圖18C、 18D禾B18E示出了 透氣多層裝置的實(shí)施方式，所述裝置設(shè)置成解決培養(yǎng)條件不均勻的問題， 同時(shí)集成了市售的傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的特點(diǎn)。在一實(shí)施方式中，氣體傳遞通 過裝置的壁直接進(jìn)行，使得在各培養(yǎng)室上的氣體與周圍環(huán)境的氣體可以直 接進(jìn)行氣體交換。在另一實(shí)施方式中，氣體空間位于裝置內(nèi)，使得裝置內(nèi) 的氣體的氣體交換通過氣體空間的壁進(jìn)行。氣體空間的上壁可適用于使得 氣體交換獨(dú)立于氣-液界面，并凡/或者氣體空間的下壁可適用于使得氣體通 過氣-液界面?zhèn)鬟f到培養(yǎng)物。在另一實(shí)施方式中，氣體空間通過透氣裝置的 壁與環(huán)境氣體連通，氣體空間的透氣上壁作為培養(yǎng)室下壁，使得氣體向培 養(yǎng)物的傳遞獨(dú)立于氣-液界面而進(jìn)行。
圖19不出了從胰島細(xì)胞培養(yǎng)中采集的數(shù)據(jù)的柱狀圖，閑胰島細(xì)胞高的 氧需求，胰島細(xì)胞培養(yǎng)是一種非常具有挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)類型。良好的結(jié)果證 實(shí)，將有利的幾何結(jié)構(gòu)包括到其培養(yǎng)室支架中，透氣多層裝置獨(dú)特的容量 節(jié)約了空間，并提供了均勻的培養(yǎng)條件。
圖20示出了 -種試驗(yàn)裝置的剖視圖，該裝置用于證實(shí)在將透氣多層裝 胃暴露于諸如伽馬輻射之類的常用無菌處理之前，對(duì)由硅酮構(gòu)成的材料充 等離子體以將硅酮向其它表面的遷移減到最少的作用。
具體實(shí)施例方式
圖1A和圖1B用于圖示本發(fā)明的一些基本特征。在圖示巾，透氣多S 裝置1集成了兩個(gè)透氣培養(yǎng)室20，這兩個(gè)培養(yǎng)室部分地由氣體空間50隔開。示出的兩個(gè)培養(yǎng)室可說明一些基本的透氣多層裝置特征，但是可以設(shè)置任 意的附加數(shù)量的培養(yǎng)室。圖1A為立體圖，去除了側(cè)壁以暴露培養(yǎng)室20的
內(nèi)部。圖IB示出了透氣多層裝置1的剖視圖。培養(yǎng)室20包括第一壁110 和相對(duì)的第二壁120。第一壁110、第二壁120、或第一壁110和第二壁120 兩者，可包括透氣材料。象傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)袋一樣，第一壁IIO和第二壁 120可固定在一起而無需側(cè)壁。然而，最好具有側(cè)壁，使得在整個(gè)培養(yǎng)室范 圍內(nèi)，培養(yǎng)室的第一和第二壁之間的距離相同。還有，當(dāng)所選的壁和側(cè)壁 包括透氣材料時(shí)，透氣多層培養(yǎng)裝置的朝向可設(shè)置成使其能以多種位置工 作，包括第一壁朝下、第二壁卓U或任意側(cè)壁朝下。這使得細(xì)胞可駐留于 (靠近)任意壁。當(dāng)培養(yǎng)室的長(zhǎng)度、高度和寬度的尺寸不同時(shí)，透氣多層 培養(yǎng)裝置通過在接種和/或培養(yǎng)期間改變其位置，可提供獨(dú)特的細(xì)胞上培養(yǎng) 基高度以及/或者獨(dú)特的培養(yǎng)基與表面積的比率。根據(jù)接種時(shí)的朝向，細(xì)胞 會(huì)沉降到培養(yǎng)室內(nèi)的任意表面。例如，處于圖1B的位置時(shí)，細(xì)胞朝第二壁 120沉降。細(xì)胞接觸的表面可以僅僅是培養(yǎng)室壁的內(nèi)表面。然而，細(xì)胞駐留 其上的材料的期望成分和幾何結(jié)構(gòu)可以不是培養(yǎng)室壁的表面所代表的材料 成分和幾何結(jié)構(gòu)。這樣，任意能提供期望的材料和幾何結(jié)構(gòu)的部件、插件、 基體等可構(gòu)造成透氣多層裝胃。因此，培養(yǎng)表面130可以僅僅是給定的培 養(yǎng)室壁的內(nèi)表面，或者可以是任意位于培養(yǎng)室內(nèi)的部件、插件、基體等。 僅僅為方便起見，在本申請(qǐng)通篇中，培養(yǎng)表面130被描述為在裝置壁的內(nèi) 表面上，但這不限制本發(fā)明的范圍。
如圖1B所不，集流腔60形成培養(yǎng)室20之間的流體通道。通行口 70 使得可以加入或移除流體和細(xì)胞。在該圖示中，通行U70包括頸部和以傳 統(tǒng)培養(yǎng)瓶的方式覆蓋通行口 70的蓋f 30。然i(ij，通行U可以是任意構(gòu)造， 并且I '了以位于任意位置，只要能夠?qū)崿F(xiàn)將流體移入和移出透氣多層裝置的 n的。細(xì)胞培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，可以有很多方 法來實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，包括許多封閉系統(tǒng)構(gòu)造，封閉系統(tǒng)構(gòu)造可包括使用設(shè)賈 成可無菌插接的隔板、快拆配件、或管道。
氣體空間50不需要是裝置的密封部分。該氣體空間不需要具有強(qiáng)制氣 流，或適合于強(qiáng)制氣流，來使裝置工作。在該最簡(jiǎn)單和優(yōu)化的形式中，僅 僅是環(huán)境氣體與裝賈的任意或全部透氣部分相接觸。然而，可以有一個(gè)或 多個(gè)壁包圍該氣體空間。
在簡(jiǎn)單的操作方法中，將培養(yǎng)基和細(xì)胞送入透氣多層裝置內(nèi)，并將透 氣多G裝置放至lj標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，該裝置的朝向設(shè)置成使得細(xì)胞沉降 到期望的表面。在較復(fù)雜的操作方式中，可進(jìn)行追加接種，使得細(xì)胞沉降到另外的表面。例如，在接種時(shí)定期地對(duì)裝置重新定位，細(xì)胞會(huì)駐留在所 有的培養(yǎng)表面。
各培養(yǎng)表面130可以是任意合適的材料、任意可用于培養(yǎng)細(xì)胞的形狀， 所述表面可以與也可以不與細(xì)胞培養(yǎng)室的壁成為一體。例如，培養(yǎng)表面可 以僅僅是包括了培養(yǎng)室的壁的內(nèi)表面，也可以是經(jīng)或不經(jīng)組織培養(yǎng)處理。
該材料可以是如專利號(hào)為5,935,847的美國(guó)專利記載的，層積于培養(yǎng)室的壁 的材料。可以是與培養(yǎng)室的壁物理分離的材料，如位于壁上方的由聚苯乙 烯制成的分離部，可以是固定或不固定于壁，如以纖粘蛋白或膠原蛋白為 基質(zhì)的插入件。如細(xì)胞和組織培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，對(duì)任意培養(yǎng)表 面的采用沒有限制。
圖2示出了怎樣利用跨過培養(yǎng)室20的透氣第一壁110的氣體交換來實(shí) 現(xiàn)均勻的培養(yǎng)條件。氧氣流箭頭IOO示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50 之間的氧濃度梯度的結(jié)果，氧怎樣跨過透氣的第一壁IIO輸送到利用培養(yǎng) 基80駐留在培養(yǎng)表面B0上的細(xì)胞90。根據(jù)第一壁IIO的透氣程度，最多 事實(shí)上培養(yǎng)基的整個(gè)上表面可同時(shí)暴露于包圍著裝置的環(huán)境氣體，不象傳 統(tǒng)的多層燒瓶，環(huán)境氣體在位于離裝置內(nèi)各培養(yǎng)基位置不同距離的單一透 氣部位進(jìn)入裝置。如本文所述，在一些實(shí)施方式中，透氣多層裝置被構(gòu)造 成可以使氣體和培養(yǎng)基駐留在培養(yǎng)室內(nèi)。因此，運(yùn)行期間，氣體可駐留在 透氣第一壁110的兩側(cè)。通常，氣體岡氣體空間和培養(yǎng)室內(nèi)流體之間的分 壓差而進(jìn)出培養(yǎng)室。
.圖3示出了跨過培養(yǎng)室的透氣第—壁120的氣體交換。氧氣流箭頭100 示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50之間的濃度梯度的結(jié)果，氧怎樣通 過透氣第二壁120輸送到駐留于培養(yǎng)室20內(nèi)的細(xì)胞90。這樣，各細(xì)胞室中 的細(xì)胞比傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞離環(huán)境氣體可以更近。應(yīng)注意確保構(gòu)成 培養(yǎng)表面130的材料對(duì)氣體傳遞的阻礙，不會(huì)影響到對(duì)期望的細(xì)胞量進(jìn)行 供氧的需求和維持合適的pH的需求。例如，如果透氣第二壁120山高透1 性的材料勿1 二甲基硅酮構(gòu)成，而透1性較低的培養(yǎng)表向—如聚苯乙烯位J'-該 硅酮上，則向細(xì)胞的氣體傳遞會(huì)被阻礙。通常，位f細(xì)胞和環(huán)境氣體源之 間的、對(duì)氣體傳輸?shù)淖璧K程度最高的材料將成為限速因素。因此，為了優(yōu) 化透氣多層裝置的功能，設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮用于構(gòu)建透氣壁的材料的透氣性， 被使用的任意附加培養(yǎng)表面的透1性，以及培養(yǎng)物的氧需求。透氣的多層 裝置為提供合意的氣體交換和合意的供細(xì)胞駐留的材料考慮到了許多可選 方案。然而，如果期望使用將會(huì)限制培養(yǎng)物氣體交換的材料作為培養(yǎng)表面， 可以通過培養(yǎng)室的相對(duì)壁和/或側(cè)壁來加強(qiáng)氣體交換。圖4示出了跨過培養(yǎng)室的透氣第二膜120和跨過透氣第一壁110的氣 體交換。氧氣流箭頭100示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50之間的濃 度梯度的結(jié)果，氧怎樣通過透氣第二壁120和透氣第一壁110輸送到培養(yǎng) 室20。這樣，各培養(yǎng)室都可以實(shí)現(xiàn)高水平的氣體傳遞。
雖然圖2，圖3和圖4示出了通過特殊的壁的氣體傳遞，但透氣多層裝 置的任意壁可以是透氣性的。由于氧可直接通過細(xì)胞駐留的表面，和/或通 過培養(yǎng)室的側(cè)壁，以及/或通過集流腔壁輸送至細(xì)胞，從而可以獲得各種優(yōu) 點(diǎn)。Wilson等的'814記載了通過增加可駐留在透氣培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基高度 可以獲得的優(yōu)點(diǎn)。透氣多層裝置中的培養(yǎng)基高度的增加可遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)培養(yǎng) 瓶的2mm 3mm的限度，從而將培養(yǎng)基更換的頻次降低到最低，減少工作 量并減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如果可以進(jìn)行跨越培養(yǎng)室的透氣壁的氣體傳 遞，有利的是，將培養(yǎng)室構(gòu)造成使得透氣壁和相對(duì)壁之間的距離允許增加 培養(yǎng)基高度。最佳距離取決于培養(yǎng)物的代謝需求和期望的培養(yǎng)基更換頻次。
圖5A、圖5B和圖5C示出了透氣多層裝置的放置方式的例子，這些放 置方式提供了許多可供選擇的培養(yǎng)方式。例如，當(dāng)?shù)谝槐?10、和/或第二 壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126由具有不同 透氣件的材料構(gòu)成時(shí)，通過將透氣多層裝置2定向成給定的狀態(tài)，細(xì)胞會(huì) 處于不同的氧壓力下。然而，不必使用不同的透氣材料來進(jìn)行費(fèi)力的操作 方式。在第一壁110、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、 和/或第五壁126附近的、與之成為一體或未成為一體的培養(yǎng)表面，其材料 或表面積可以不同。當(dāng)?shù)谝槐?10、禾ll/或第二壁122禾口/或第五壁126的大 小不同時(shí)，將透氣多)3裝置2朝向任意方位，也可提供了在培養(yǎng)之前或期 間的任京:時(shí)刻變更培養(yǎng)基的最大卨度。對(duì)培養(yǎng)室的形狀進(jìn)行改變甚至可產(chǎn) 生見多的可選方式。例如，由于裝置朝向的變換，八角形為細(xì)胞提供了額 外的可駐留其h的表面。
為達(dá)到在透氣多層裝置內(nèi)實(shí)現(xiàn)均勻的培養(yǎng)條件的R標(biāo)，設(shè)計(jì)應(yīng)包含這 樣的目標(biāo)將基本等量的細(xì)胞放置在各培養(yǎng)室內(nèi)，并促使各培養(yǎng)室內(nèi)的那 些細(xì)胞基本均勻地分布于整個(gè)培養(yǎng)室內(nèi)。使各培養(yǎng)室的兒何結(jié)構(gòu)基本相同、 將各培養(yǎng)室的相對(duì)的壁構(gòu)造成基本平行、并使得培養(yǎng)室可放置成水平狀態(tài)，
以使得細(xì)胞可均勻地沉降到培養(yǎng)表面上，這樣會(huì)有助于達(dá)成該n標(biāo)。然后，
當(dāng)接種期間細(xì)胞處'j:均勻懸浮狀態(tài)，且培養(yǎng)表面具有 一 致的幾何結(jié)構(gòu)時(shí)， 接種物會(huì)以均勻的體積駐留在各培養(yǎng)室的培養(yǎng)表面上，且細(xì)胞會(huì)以均勻的 分布沉積在各培養(yǎng)室的培養(yǎng)表面上。在培養(yǎng)表面不平坦，例如，存在起皺 的表面的情況下，將培養(yǎng)室設(shè)置成在每單位培養(yǎng)表向.上具有相同的空間體積，可有助于接種期間均勻的細(xì)胞分布。例如，如果培養(yǎng)表面起鮍，且相 對(duì)壁也起皺，該起皺的相對(duì)壁與培養(yǎng)表面之間的空間體積沿培養(yǎng)室的長(zhǎng)度 方向會(huì)保持恒定。無論培養(yǎng)表面是怎樣的幾何結(jié)構(gòu)，將培養(yǎng)室構(gòu)造成使得 該培養(yǎng)室內(nèi)的任意給定區(qū)域存在基本等體積的接種物，可有助于實(shí)現(xiàn)均勻 的細(xì)胞分布。
優(yōu)選地，當(dāng)利用集流腔向培養(yǎng)室輸送培養(yǎng)基時(shí)，該集流腔應(yīng)構(gòu)造成使 得接種物均勻地分配到各培養(yǎng)室中，并使得沉積在集流腔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量最 少。使集流腔容積不大于能讓培養(yǎng)基快速并容易地充入培養(yǎng)室所需的大小， 這是有利的，因?yàn)轳v留在滯留于集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞會(huì)沉積到集流 腔的底部，并與駐留在培養(yǎng)室內(nèi)的細(xì)胞處于不同的培養(yǎng)條件。雖然在接種 期間集流腔容積應(yīng)最小化，以防止細(xì)胞沉積至不希望的區(qū)域，但是，允許 過量的培養(yǎng)基駐留在集流腔內(nèi)以減少裝置高度可能是有用的，因?yàn)槟切┡?養(yǎng)基會(huì)有助于提高各培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基體積與表面積的比率。換句話說， 集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基體積會(huì)使駐留在細(xì)胞室內(nèi)的細(xì)胞獲取基質(zhì)。
圖6示出了透氣多層裝置3的剖視圖，該裝置被設(shè)置成使裝置內(nèi)可能
出現(xiàn)的氣體進(jìn)入不會(huì)對(duì)均勻培養(yǎng)條件的建立造成破壞的區(qū)域。集流腔60包 括氣阱61。氣阱61的至少一部分高于最上面的培養(yǎng)室20。在該圖示中， 通行口 70由隔片72覆蓋。裝置巾的過量氣體升到氣阱61內(nèi)，由此防止培 養(yǎng)基被置換出仟意的培養(yǎng)室。
在一些應(yīng)用場(chǎng)合，期望在使用期間改變集流腔的形狀或體積。將集流 腔構(gòu)造成改變形狀或體積應(yīng)該以不會(huì)導(dǎo)致染菌的方式進(jìn)行，例如可以通過 撓性壁或釆用墊圏或O形圈來實(shí)現(xiàn)。例如，期望通過共用柒流腔將細(xì)胞送 入培養(yǎng)室，并且防止細(xì)胞從 -個(gè)培養(yǎng)室移動(dòng)到另一培養(yǎng)室或從培養(yǎng)室移動(dòng) 到集流腔內(nèi)。當(dāng)以這樣的方式操作裝置時(shí)，可能會(huì)使培養(yǎng)室定向至?xí)恍?心使細(xì)胞離開培養(yǎng)室的狀態(tài)。堵塞培養(yǎng)室的一個(gè)或多個(gè)開U可以防止這種 情況發(fā)生。作為另一例子，譬如當(dāng)細(xì)胞已附著在培養(yǎng)室內(nèi)時(shí)，在使用期間 定期改變駐留在集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基的量是有利的，并且更多的培養(yǎng)基有利 于將補(bǔ)料頻次降低到雖低。這樣，可將柒流腔設(shè)S成具有更火的容積。在 其它應(yīng)用場(chǎng)合，譬如當(dāng)所期望的培養(yǎng)表面積與培養(yǎng)基體積的比率要求培養(yǎng) 基的駐留高度應(yīng)該低于培養(yǎng)室高度吋，培養(yǎng)基最好不充滿整個(gè)培養(yǎng)室。
閣7A和圖7B示出了實(shí)現(xiàn)這些n標(biāo)的方式的圖不。在圖7A巾，透氣 多層裝置4的集流腔壁62處于第-狀態(tài)，允許將細(xì)胞和培養(yǎng)基經(jīng)通行口 70 通過集流腔60導(dǎo)入培養(yǎng)室20。圖7B示出了處于第二狀態(tài)的集流腔壁，其 中集流腔60縮進(jìn)，坫塞了培養(yǎng)室20的開U，防止細(xì)胞或培養(yǎng)基流出培養(yǎng)室20。培養(yǎng)室20可部分地盛有培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)室20內(nèi)駐留有培養(yǎng)基和 氣體，并且集流腔壁62可移動(dòng)到圖7B的狀態(tài)以防止培養(yǎng)基流失到集流腔 60內(nèi)。然而，該實(shí)施方式也允許透氣多層裝置4被培養(yǎng)基完全充滿，而無 需移動(dòng)集流腔壁62。
圖7C、圖7D和圖7E示出了用培養(yǎng)基部分填充培養(yǎng)室的例子。圖7C 示出了透氣多層裝置4處于集流腔60朝向培養(yǎng)室20下方的狀態(tài)，并且處 于其內(nèi)部駐留有預(yù)定量的培養(yǎng)基80的第一開啟狀態(tài)。該預(yù)定量的培養(yǎng)基體 積少于各培養(yǎng)室的總?cè)莘e。圖7D示出了集流腔60被壓縮，將培養(yǎng)基80 從集流腔60趕入培養(yǎng)室20。圖7E示出了透氣多層裝置4呈水平朝向，使 得各培養(yǎng)室內(nèi)駐留有培養(yǎng)基80和氣體。當(dāng)集流腔被閉合時(shí)，透氣多層裝置 的內(nèi)部容積減少，壓力升高。壓力升高和培養(yǎng)室內(nèi)氣體與液體的比率、培 養(yǎng)室壁的撓性以及集流腔容積與裝置容積的比率有關(guān)。壓力的降低最終取 決于培養(yǎng)室的哪些表面是透氣性的。然而，集流腔隨著其容積減小而產(chǎn)生 的無菌通風(fēng)可以更快地釋放壓力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，有許多 方法將集流腔構(gòu)造成符合這些目標(biāo)，包括采用撓性壁、在徑向密封構(gòu)造中 設(shè)置有0形圈的剛性壁、以及其它方法(包括Wilson的美國(guó)專利No. 7,229,820中記載的)。
當(dāng)在使用期間培養(yǎng)基的溫度下降時(shí)，移動(dòng)集流腔壁62可能也是有利的。 例如，胰島細(xì)胞的培養(yǎng)的初始溫度通常為37°C，然后降低至22"C。當(dāng)透氣 多層裝置是封閉體且盛有培養(yǎng)某時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)隨溫度下降而收縮。許多透 氣材料是高撓性的。丙此，當(dāng)培養(yǎng)基收縮時(shí)，所述裝置的壁會(huì)發(fā)生移動(dòng)， 以保持與培養(yǎng)基的接觸。當(dāng)所述壁移動(dòng)，且細(xì)胞均勻地分布在壁上時(shí)，細(xì) 胞會(huì)從均勻狀態(tài)移動(dòng)至不受控制的密度，并因此會(huì)損傷培養(yǎng)物的活力。因 此，改變集流腔的容積以適應(yīng)培養(yǎng)基體積的降低I 'J以防止細(xì)胞從其均勻狀 態(tài)遷移。
如有需要，底腳135可以升高透氣多層裝置。底腳135使得氣體可到 達(dá)裝界下側(cè)并且/或者防止劃傷第二壁120。底腳135可以是任何形式，裝 宵的上壁適于可將一個(gè)裝賈以聯(lián)鎖方式放賈在另個(gè)裝置之上。
將培養(yǎng)室與-個(gè)以上的集流腔平行連接，可使氣體更容易被進(jìn)入裝胃 的液體賈換。例如，當(dāng)-個(gè)集流腔被使用時(shí)，在培養(yǎng)基進(jìn)入集流腔的相反 方向，氣體被置換。帶有一個(gè)集流腔的透氣多層裝置中，隨若培養(yǎng)室^度 的降低，變得有必要傾斜該透氣多層裝覽以加速氣體置換。形成附加的集 流腔使得氣體能以培養(yǎng)基進(jìn)入裝置方向之外的方向置換，并可減低或消除 傾斜的必要性，山此簡(jiǎn)化A動(dòng)流體處理。在測(cè)試裝胃中，作了判定是否無
17需傾斜所述裝置就可以灌滿培養(yǎng)室的評(píng)估，當(dāng)集流腔中的培養(yǎng)基體積為測(cè)
試裝置中總?cè)莘e的約7.0%時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)灌滿而無需傾斜。圖8A、圖8B和 圖8C示出了采用兩個(gè)集流腔的一實(shí)施方式。圖8A示出了透氣多層裝置5， 刪去了壁以暴露培養(yǎng)室20。氣體空間50位于培養(yǎng)室20之間。在該圖示中， 氣體空間50為穿通透氣多層裝置5的整個(gè)主體的開口。圖8B示出了透氣 多層裝置5，有部分被刪去以暴露培養(yǎng)室20、第一壁110和集流腔60。圖 8C和圖8C-1示出了圖8A中沿8C-8C線的剖視圖，露出了培養(yǎng)室20、氣 體空間50和集流腔60。在該實(shí)施方式中，液體進(jìn)入通行口 70并灌滿集流 腔60和培養(yǎng)室20，氣體經(jīng)由培養(yǎng)室20的遠(yuǎn)端上的另一集流腔60和第二通 行口 70被置換。
培養(yǎng)室的高度可以改變，以提供更多的操作方式。例如，如果將胰蛋白酶 的使用量減到最少，或增加培養(yǎng)基的高度，可能是有利的。圖8D和圖8E示 出了一種構(gòu)造，其通過簡(jiǎn)單地由可打褶的撓性材料制作所述裝置來實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)室 高度改變，使得培養(yǎng)室20的高度可以上升或下降。例如，界定氣體空間的外 殼和/或材料可以是撓性的。這樣，透氣多層裝置可以膨脹，以使各培養(yǎng)室內(nèi)的 容積更大或更小，這會(huì)有利于降低補(bǔ)料頻次、減少胰蛋白酶和/或PBS的使用、 以及/或改變透氣表面積與培養(yǎng)室容積之比。在該圖示中，集流腔壁62是起皺 的，但所述裝置可適于通過多種其它方式允許培養(yǎng)室高度的變化，包括美國(guó)專 利No. 7,229,820記載的方式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到實(shí)現(xiàn)這種特性的 多種方式。
透氣多層裝置的優(yōu)化性能中的一種因素是使用期間培養(yǎng)室的朝向。在 使用期間，透氣多層裝置最好應(yīng)該處于基本上水平的狀態(tài)，以使細(xì)胞均勻 地分布到細(xì)胞培養(yǎng)表面上。培養(yǎng)室支撐架可以象圖5A所不的培養(yǎng)室支撐架 40那樣簡(jiǎn)中-。這樣，培養(yǎng)室支架40只提供簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)支撐以防止培養(yǎng)室互 相坍縮。然而，根據(jù)構(gòu)成培養(yǎng)室的壁的材料的剛性，最好形成更加精心制 作的培養(yǎng)室支架。例如， 一些重要的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用最好在非常受控的兒何 結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行，其涉及分布非常均勻細(xì)胞沉積物，如胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞和多 能成體機(jī)細(xì)胞(multipotent adult progenitor cell)的培養(yǎng)。例如，胰島細(xì)胞 在高表面密度處接觸時(shí)會(huì)發(fā)生聚集，多能成體祖細(xì)胞如果它們互相之間太 接近可能會(huì)發(fā)生分化。肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞還需要高的氣體傳輸速率來維持 健康。因此，最堅(jiān)固的培養(yǎng)室支架應(yīng)該通過把有細(xì)胞向其沉降的壁保持在 基本水平的狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)均勾分布，并且不會(huì)過度地限制氣體傳輸。為實(shí)現(xiàn) 這些優(yōu)點(diǎn)，培養(yǎng)室支架應(yīng)與培養(yǎng)室的壁接觸。接觸點(diǎn)的數(shù)量、接觸點(diǎn)之間
的距離和與培養(yǎng)室支架直接接觸的透氣材料的表面積的大小屬r設(shè)計(jì)所需考慮的因素。實(shí)施例1和實(shí)施例2提供了進(jìn)一步的指導(dǎo)。
雖然可以將培養(yǎng)室支架永久固定于透氣多層裝置，但并非必須這樣。 當(dāng)使用者需要變換所述裝置以適合更加受控的應(yīng)用，或需要減低制造成本
時(shí)，這樣做是較佳的。圖9A和圖9B示出了一種實(shí)施方式，其中培養(yǎng)室支 架是可重復(fù)使用的，并且透氣多層裝置的主體是一次性的。在圖9A中，示 出了培養(yǎng)室支架42從透氣多層裝置6分離。在圖9B中，培養(yǎng)室支架42被 放置成與透氣多層裝置6接觸。突起部131從培養(yǎng)室支架42突出。突起部 131的高度及它們之間的距離應(yīng)設(shè)計(jì)成它們可與透氣多層裝置的培養(yǎng)室充 分接觸，以將細(xì)胞培養(yǎng)室保持在基本水平的狀態(tài)，使得能在接種期間實(shí)現(xiàn) 均勻的細(xì)胞沉積。然而，與透氣表面的接觸會(huì)減少氣體傳遞量。因此，必 須考慮實(shí)現(xiàn)水平狀態(tài)的期望和想要的氣體傳遞程度之間的平衡。根據(jù)被培 養(yǎng)的細(xì)胞類型，可以有不止一種優(yōu)化設(shè)計(jì)。當(dāng)希望與環(huán)境條件更好地連通 時(shí)，可以設(shè)置氣體通行開口 132。在沒有氣體通行開口 132時(shí)，氣體會(huì)在突 出有突起部131的表面，例如表面133之間移動(dòng)，并且培養(yǎng)室氣體交換的 阻力是突起部的數(shù)量、突起部的高度以及裝置寬度的函數(shù)。在該圖示中， 為了說明設(shè)計(jì)選項(xiàng)的多樣性，最上面的培養(yǎng)室的第一壁沒有處于被培養(yǎng)室 支架42保持的狀態(tài)。如果培養(yǎng)室處于水平狀態(tài)，如果盛有流體或受壓流體， 或者如果它(該第一壁)山剛性材料構(gòu)成，那種狀態(tài)是可以的。還有，培 養(yǎng)室的第二壁120，如果其由剛性足夠的材料構(gòu)成而能在培養(yǎng)基處于其內(nèi)部 的時(shí)候保持其形狀，就不必與培養(yǎng)室支架接觸。
培養(yǎng)室它們白身可構(gòu)造成能起到使得環(huán)境氣體可以與相鄰培養(yǎng)室連通 的作用，同時(shí)保持期望的幾何結(jié)構(gòu)。Wilson等的美國(guó)專利No. 5,693,537記 載了具有突起部的壁可用于為培養(yǎng)室的相鄰的壁提供支撐。圖IO為剖視圖， 其提供了一個(gè)如何保持期望的形狀的例T。在該例子中，透氣多層裝置7 的第一壁110由剛性材料形成，并且透氣第二壁120由如二甲基硅酮之類 的撓性材料構(gòu)成。壁突起部150從第二壁120的表向-突出，以保持氣體空 間50。 Wilson等的美國(guó)專利No. 5,714,384示出了突起部可ffl于增加氣體傳 遞的表面積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述突起部可從第二壁(或者 從上壁和第二壁)的表面突出與相鄰培養(yǎng)室的第一壁接觸。作為選擇力-式， 從培養(yǎng)室的壁的外側(cè)表面突出的突起部可以在突起部之間互鎖，或者與培 養(yǎng)室支架互鎖。在另一方式中，所有的壁可以是撓性的，并且它們能在培 養(yǎng)基充入培養(yǎng)室時(shí)獲得期望的形狀。
給定培養(yǎng)室的上、下壁以及/或上下培養(yǎng)表面不應(yīng)相互接觸。例如，當(dāng) 一培養(yǎng)表面是經(jīng)組織培養(yǎng)處理的，且與相對(duì)壁接觸，可能潛在地影響所述經(jīng)組織培養(yǎng)處理的表面，可以在培養(yǎng)室內(nèi)放置內(nèi)部隔離物來確保阻止接觸。 內(nèi)部隔離物可以是任意生物相容材料，并且應(yīng)該設(shè)置成使得培養(yǎng)基和流體 可以容易地移入和移出培養(yǎng)室。所述內(nèi)部隔離物無需是獨(dú)立部件，可以通 過從上壁和/或下壁、以及/或者上培養(yǎng)表面和/或下培養(yǎng)表面突出的突起部， 而實(shí)現(xiàn)在任意壁和/或培養(yǎng)表面之間保持希望的空間。圖11示出了示范性的
例子，其中透氣多層裝置8的內(nèi)部隔離物160是從培養(yǎng)表面130或壁110
突起的凸起部。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，內(nèi)部隔離物可通過多種方 式構(gòu)造，只要那些方法不會(huì)阻止培養(yǎng)基進(jìn)入培養(yǎng)室或從培養(yǎng)室離開。 當(dāng)培養(yǎng)室成豎向堆疊時(shí)，由于光線減少，對(duì)培養(yǎng)物中的細(xì)胞的顯微鏡
觀察會(huì)受到妨礙。因此，如共同未決Wilson等的'814，中記載的那樣，將 培養(yǎng)室從堆疊中偏移，對(duì)于允許采用倒置顯微鏡可能是有用的。另一可選 的方式是使所述氣體空間能夠接收光線，使得可以用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。 為此，培養(yǎng)室之間的距離應(yīng)該足夠大，以使光源可以照亮最下面的培養(yǎng)室 的內(nèi)容物。光強(qiáng)度取決于培養(yǎng)室的材料和培養(yǎng)基的高度。優(yōu)選使用透光性 好的材料。
圖12示出了一種實(shí)施方式，其將培養(yǎng)室20串聯(lián)連接。通過通行口70 輸送進(jìn)透氣多層裝置9的液體通過另一通行口 70置換氣體，并且駐留在任 總期望數(shù)量的培養(yǎng)室20內(nèi)。與環(huán)境氣體連通的氣體空間50處于培養(yǎng)室20 之間，并鄰近透氣材料。在該圖示中，氣體空間50處于穿通透氣多層裝置 9的整個(gè)主體的開口中。
在一些情況下，例如3各培養(yǎng)室含有不同的細(xì)胞類型或含有用于冋一 細(xì)胞類型的不同培養(yǎng)基組成時(shí)，可能期望個(gè)別地通向各培養(yǎng)室，即使它們 被集成為同一裝置?？梢杂卸喾N構(gòu)造來實(shí)現(xiàn)這種方式。優(yōu)選地，與各培養(yǎng) 室的通路被構(gòu)造成使得可通過標(biāo)準(zhǔn)的液體操作方法(如移液或灌汴)或者 無菌或封閉體系方法(如隔膜或無菌管件連接)來實(shí)現(xiàn)這種方式。閣13示 出了 .種選擇。在該以隔膜形式示出的圖不中，可通過通行口70個(gè)別地通 向透氣多/3裝置10的培養(yǎng)室20。一個(gè)或多個(gè)通行U 70與各培養(yǎng)室20連接。 在該閣示中，氣體空間50被設(shè)置成使得使用者可以將該氣體空間與環(huán)境氣 體連通，或阻.lh與環(huán)境氣體連通。氣體空間50由氣體空間外殼51封閉。 氣體空問外殼51中的氣體空間通行開口 55使得氣體空間50可以與周圍環(huán) 境連通。氣體空間通行開口 55 11」構(gòu)造成根據(jù)需耍開啟和閉合。對(duì)氣體空間 50和環(huán)境氣體之問的氣體運(yùn)動(dòng)有選擇地進(jìn)行終止、限制或開啟這樣的功能， 可能是有用的。這種特征可存在于任意實(shí)施方式。例如，當(dāng)透氣多層裝置 臨時(shí)從C02環(huán)境移出時(shí)，關(guān)閉或限制氣體空間通行開口 55可防止或延緩pH的變化。在另一例子中，給定細(xì)胞系的細(xì)胞可放置在各培養(yǎng)室中，與給 定培養(yǎng)室連通的氣體空間可注入預(yù)定氧濃度，該氣體空間可以封閉，且可 以對(duì)各種氧濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或功能的影響進(jìn)行研究。本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，有很多種用于開啟或關(guān)閉氣體空間通行開口 55的方法，包括
魯爾(luer)接頭和塞子、端口和蓋子等。
圖14示出了透氣多層裝置的另一實(shí)施方式，該裝置被設(shè)置成，當(dāng)該裝 置從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)箱取出以在福樂罩(flow hood)中進(jìn)行液體操作時(shí)，可 以限制pH變化的速度。氣體空間外殼51封閉透氣多層裝置11的氣體空間 50。通過在從培養(yǎng)箱取出之前關(guān)閉開口 55的氣體通行蓋53，可以將氣體空 間50與環(huán)境氣體隔離，從而在氣體空間50內(nèi)保留期望的CO2水平。優(yōu)選 地，氣體空間50內(nèi)的氣體容量足以支撐氣體通行蓋53關(guān)閉期間培養(yǎng)物的 氧需求。因此，所述裝置中的細(xì)胞或組織的數(shù)量以及氧需求，是確定最佳 容量時(shí)需要考慮的。
圖15示出了透氣多層裝置的另一實(shí)施方式，該裝置被設(shè)置成，當(dāng)該裝 置從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)箱取出以在福樂罩(flow hood)中進(jìn)行液體操作時(shí)，可 以限制pH變化的速度。這種情況下，氣體空間50沿該透氣多層裝置的一 側(cè)向環(huán)境氣體開放。氣體交換控制緣57從透氣多層裝置12的該側(cè)延伸， 在該圖示中作為氣體空問外殼51的結(jié)構(gòu)件。當(dāng)透氣多層裝置12朝向?yàn)椋?使得氣體交換控制緣57與平坦表面，例如層流罩的底板平齊時(shí)，氣體空間 50和環(huán)境氣體之間的氣體交換被終止或基本上被限制，以此降低pH變化 速度。當(dāng)透氣多層裝置不具有控制pH變化的結(jié)構(gòu)并且從培養(yǎng)箱被移出時(shí)， 使pH變化速度最小化的另一種簡(jiǎn)單的方法是，將其放置于密閉空間，例如 帶蓋的箱體內(nèi)。為提供該優(yōu)點(diǎn)，所述蓋不必是氣密性的。只耍所述蓋和箱 體之間的氣體通道的剖面卩「 口小于氣體空間和環(huán)境氣體之間的剖面開口 ， 就會(huì)產(chǎn)生對(duì)氣體交換速度的限制以及pH變化的延緩。當(dāng)透氣多層裝置位于 箱體內(nèi)部時(shí)，箱體內(nèi)的氣體體積應(yīng)該減到最小。而且，在將透氣多層裝置 放入箱體內(nèi)之前，可對(duì)箱體做預(yù)先處斑，使其包含培養(yǎng)箱的氣體組成。
新的透氣多層裝置允許在傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中不可能的操作方式。例如， 細(xì)胞可從一層擴(kuò)展到其它層。接種、擴(kuò)展和收集粘附細(xì)胞這樣的循環(huán)(其 不受剩余的胰蛋白酶的不利影響)，提供了該封閉體系過程如何發(fā)揮功能 的一個(gè)例子。圖16A示出了透氣多層裝置13的剖視圖，培養(yǎng)基80和細(xì)胞 處于其下層培養(yǎng)室20內(nèi)。為了將粘附細(xì)胞擴(kuò)展至如圖16B所示的多個(gè)培養(yǎng) 室內(nèi)，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作順序。首先，移除培養(yǎng)基80。然后將PBS引入 下層培養(yǎng)室以沖洗殘留培養(yǎng)基。隨后移除PBS。然后，將胰蛋白,或仟意其它脫壁材料(detachment material)引入下層培養(yǎng)室，以從附著表面釋放 細(xì)胞。然后，可通過加入培養(yǎng)基80將細(xì)胞再分布到上培養(yǎng)室，這將胰蛋白 酶稀釋至不會(huì)影響細(xì)胞附著的水平。如果細(xì)胞受到任何殘留胰蛋白酶的影 響，可以移除細(xì)胞并用常規(guī)手段離心出殘留的胰蛋白酶。然后，可將細(xì)胞 再引入到適當(dāng)體積的培養(yǎng)基中，使得它們駐留在期望數(shù)量的培養(yǎng)室內(nèi)。對(duì) 于懸浮細(xì)胞，只要添加適量體積的培養(yǎng)基就可以容易地?cái)U(kuò)展至另外的培養(yǎng) 室。這樣，相對(duì)傳統(tǒng)的多層培養(yǎng)瓶，可以將用來形成接種物的輔助裝置的 采用最少化。由于透氣多層裝置可設(shè)置成適合密閉的體系通路(closed system access)，也可以降低污染的可能性。
細(xì)胞駐留于側(cè)壁表面上的能力也可形成優(yōu)點(diǎn)，所述優(yōu)點(diǎn)包括使細(xì)胞從 具有一尺寸的表面區(qū)域擴(kuò)展到尺寸更大的表面上的能力。例如，當(dāng)通過使 透氣多層裝置定向成如圖5C所示的狀態(tài)，可利用少量的接種物開始培養(yǎng)， 該接種物將駐留在壁126附近。然后，當(dāng)培養(yǎng)物的數(shù)量擴(kuò)增時(shí)，通過將所 述裝置重新定向至圖5B的狀態(tài)，可以獲得更多的表面積。如果需要，細(xì)胞 可以在重定向前從壁126被胰蛋白酶化以增加表面積。如果需要進(jìn)一步擴(kuò) 增，可再對(duì)所述裝置進(jìn)行重新定向至圖5A的狀態(tài)。接著，通過前面段落描 述的方法可以進(jìn)一步擴(kuò)增。
通常與細(xì)胞培養(yǎng)裝置或醫(yī)療器械相關(guān)的任意材料可用子遍及所述透氣 多層裝置。優(yōu)選地，選用的材料符合USP(美國(guó)藥典)VI和/或ISO 10993 的相容性標(biāo)準(zhǔn)。還有，敁好具有透光性，閃為這使得可以對(duì)污染和pH進(jìn)行 目視檢測(cè)。為了形成可以通過倒置型顯微鏡觀察的表面，優(yōu)選SPE2(球概 率誤差2)或更"。
用于使得氣體「' J以傳遞進(jìn)/出透氣多層裝置透氣材料的透氣材料t' J由透 氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置所使用的，或者如前面記載的用于透氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置的任 意膜、薄膠、材料或所用材料的組合構(gòu)成，例如硅酮、氟乙烯聚丙烯 (flouroethylenepolypropylene)、聚烯烴、聚苯乙烯薄膜，以及乙烯-醋酸 乙烯共聚物。f' J以獲得很多用來了解透氣材料及其細(xì)胞培養(yǎng)中的ffl途的指 南資料，包括但不限于美,專利No. 5,693,537、美W專利No. 6,455,310、 美國(guó)專利No. 6,297,046、[，際專利申請(qǐng)公開WO 01/92462和共同未決美國(guó) 專利申諾No. 10/961,814。其它的信息來源可以在Plastic Design Library, William Andrew Publishing, "Permeability and Other Film Properties of Plastics and Elastomers", 1995中找到。本說明書通篇使用的詞語硅酮包括美 國(guó)專利No. 6,045,877中記載的制劑。
如Wilson等的美國(guó)專利5,693,537記載，透氣材料可以是透液件材料。這些材料包括其整個(gè)橫截面為親水性的膜，例如由纖維素、醋酸纖維素和 再生纖維素構(gòu)成的膜。然而，在評(píng)價(jià)這些材料的效用的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)最好
采取防止污染的措施，這在Wilson等的'537沒有預(yù)期。應(yīng)小心確保選用
的材料的透液性足夠的低，以在培養(yǎng)室內(nèi)保持期望體積的培養(yǎng)基。而且， 液體損失會(huì)使摩爾滲透壓濃度升高到有害的水平。優(yōu)選地，在給定的培養(yǎng)
基靜壓力條件下，在補(bǔ)料間隔期，選用的材料能夠?qū)⒋笥诩s90%的培養(yǎng)基 體積保持在培養(yǎng)室內(nèi)。在補(bǔ)料期間，摩爾滲透壓濃度得以恢復(fù)。在補(bǔ)料間 隔為兩天的情況下，由靜壓力導(dǎo)致的液體損失因此最好應(yīng)該限制于培養(yǎng)裝 置內(nèi)的培養(yǎng)基體積每天損失的比率小于約5%。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基 體積為每cm2膜至少對(duì)應(yīng)10.16ml培養(yǎng)基的情況下，截留分子量為10,000 的80M Cupraphan⑧膜是可以接受的材料。所述材料可以是薄的且能提供充 分的氣體傳遞。在由Wilson Wolf Manufacturing制造的CELLine CLIOOO 細(xì)胞培養(yǎng)器產(chǎn)品中進(jìn)行的試驗(yàn)中，使用由80MCupraphan⑧構(gòu)成的低透氣材 料，證明了在其上培養(yǎng)至少400xl06個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞的能力。除了不使用 80M Cupraphan⑧作為低透氣膜，所述裝置的所有其它方面與市售產(chǎn)品相同， 其集成了不透液的透氣膜。在該試驗(yàn)中，表面密度至少為4x106個(gè)細(xì)胞/cm2 透氣膜。然而，雖然在培養(yǎng)室內(nèi)沒有檢測(cè)到污染，但膜外側(cè)被污染了。因 此，用透氣透液材料制造透氣多層裝置最好應(yīng)該通過采用由無菌過濾器保 護(hù)的、通向氣體空間的氣體空間通路開口來限制通向氣體空間的通路?？?以采用通常用于防止污染的任意透氣過濾材料，例如微孔膜。為了最大程 度地防止污染，孔徑可以在0.45pm以下，最好為0.2)im。然而，采用透氣 透液材料并不限于僅僅是所述透氣多層裝置的實(shí)施方式。其它透氣結(jié)構(gòu)， 包括象例如Opticell 產(chǎn)品(在美國(guó)專利No. 6,821,772巾有部分記載)那 樣簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，可以集成至少一種透氣透液膜(例如Cupraphan )。作為 其它例子，通過配置包括與兩透析膜或任一透析膜接觸的氣體空間的優(yōu)選 結(jié)構(gòu)，并通過采用由無菌過濾器保護(hù)的通向氣體空間的氣體空間通路開口 ， 通常與細(xì)胞培養(yǎng)無關(guān)的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (美國(guó)專利No. 5,503,741)可以作為培養(yǎng)裝置使用。
當(dāng)將透氣多層裝置設(shè)置成，其可被定向成其中培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的第一狀 態(tài)，或者其可被定向成其中培養(yǎng)粘附細(xì)胞的另一狀態(tài)時(shí)，構(gòu)造透氣多層裝 背的優(yōu)選設(shè)置應(yīng)該使得細(xì)胞培養(yǎng)室的一個(gè)培養(yǎng)表面是疏水的，而另一表面 是親水的。可通過任意的剖視圖來闡述實(shí)例。例如，參考圖4，第一壁110 可以是透氣的且其內(nèi)表面可以經(jīng)組織培養(yǎng)處理以形成一培養(yǎng)表面，而第二 壁120的內(nèi)表面可以是疏水的，以形成另一培養(yǎng)表面。因此，為培養(yǎng)粘附細(xì)胞，操作透氣多層裝置時(shí)可以使第一壁IIO位于第二壁120下方。因此，
為培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，操作透氣多層裝置時(shí)可以使第二壁120位于第一壁110 下方。如果粘附細(xì)胞附著于第一壁110，然后對(duì)裝置重新定向以使懸浮細(xì)胞 可以處于第二壁120上，可以進(jìn)行共培養(yǎng)?？捎糜谄渖吓囵B(yǎng)懸浮細(xì)胞的材 料為硅酮，可用于在其上培養(yǎng)粘附細(xì)胞的典型材料為經(jīng)組織處理的聚苯乙 烯。因此，在本實(shí)例中，優(yōu)選的實(shí)施方式可以是，第二壁120由硅酮構(gòu)成， 而第一壁110的培養(yǎng)表面由經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯構(gòu)成。然而，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)，如果使用硅酮，其會(huì)在伽馬輻射或電子束殺菌期間發(fā)生遷移，并且 覆蓋培養(yǎng)室內(nèi)經(jīng)組織處理的表面。這使得該經(jīng)組織處理的表面變得不是最 適合粘附細(xì)胞。因此，在存在該最有用的材料時(shí)，常用的滅菌方法變得不 實(shí)用。其它的滅菌方法也會(huì)有問題。例如，ETO (環(huán)氧乙垸)會(huì)保留在硅 酮中，且不經(jīng)很大范圍的毒素沖洗，就會(huì)存在對(duì)細(xì)胞有害的環(huán)境。化學(xué)手 段滅菌也需要沖洗。通過向硅酮添加色素、禾口/或改變固化溫度和時(shí)間、禾口/ 或?qū)⒐柰A(yù)先暴露于高劑量的伽馬輻射、和/或改變硅酮至聚苯乙烯的距離 來解決問題的努力并沒有消除問題。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在使所述裝置經(jīng)受 伽馬輻射之前用等離子體充硅酮，并可以將硅酮遷移到聚苯乙烯表面上的 問題減到最小或者消除該問題。因此，在存在經(jīng)組織培養(yǎng)處理的表而(優(yōu) 選聚苯乙烯)的情況下，采用硅酮的優(yōu)選丄藝是，確保在伽馬輻射之前對(duì) 硅酮充等離子體。這種形成細(xì)胞培養(yǎng)裝置的方法不限于透氣多層裝置。這 種方法使得任意透氣培養(yǎng)裝置可以在存在經(jīng)組織處理表面的情況下集成充 有等離子體的硅酮，其好處站可以防止硅酮在使用如伽馬輻射或電丫-束之 類的傳統(tǒng)滅菌方法期間發(fā)生遷移。例如，通過在存在處理表面的情況下采 用充有等離子體fi卡酮，對(duì)Wilson等的'814或美國(guó)專利No. 6,821,772巾記 載的裝置是有益的。例如，市售的OpticellTM產(chǎn)品可以集成一經(jīng)組織培養(yǎng) 處理的聚苯乙烯表面和相對(duì)的由充有等離子體硅酮構(gòu)成的透氣表面。這樣， 當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法滅齒時(shí)，可以在由硅酮構(gòu)成的表面上培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，并且/或 者可以在由聚苯乙烯構(gòu)成的表面上培養(yǎng)粘附細(xì)胞。該產(chǎn)品能將膜之間的慣 常距離整合在一起，就像現(xiàn)在的情況，或者將如Wilson等的'814記載的 增加的距離整合在一起。
圖17A示出了由硅酮成型的培養(yǎng)室，其使導(dǎo)致泄漏的連接件數(shù)量最少。 釆用二甲基硅酮是有利的，因?yàn)樗梢猿尚统蓮?fù)雜的幾何樣式，并且這對(duì) 許多懸浮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用是有益的。培養(yǎng)室20'包括法蘭21。在該構(gòu)造中， 可以省去壁交叉處的連接件。這樣，它是一體化培養(yǎng)室，其可以進(jìn)行模塊 化裝置設(shè)計(jì)。法蘭21可以膠粘到其它硅酮表面，或同定于任意表面，從而可制成一連串培養(yǎng)室用于裝配至集流腔壁?；蛘撸?一連串的培養(yǎng)室可以預(yù) 制，以裝配到集流腔壁，所述裝配至集流腔壁通過下述方法進(jìn)行在法蘭 前面設(shè)置剛性板，在法蘭后面設(shè)置剛性板，將這些剛性板連接在一起，然 后將該子配件裝配至集流腔壁。在裝配之前，可以在培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)置任意替 換的培養(yǎng)表面。該一體化培養(yǎng)室不必限于只有一個(gè)培養(yǎng)室?？梢詫⒁粋€(gè)以 上的培養(yǎng)室成型為整體件以形成也可以進(jìn)行模塊化裝配的一體化培養(yǎng)室。 雖然對(duì)于高需求的培養(yǎng)，氣體傳遞區(qū)域中的厚度希望優(yōu)選為小于或等于約
0.022英寸，更優(yōu)選地小于或等于0.010英寸，且最好小于約0.008英寸， 當(dāng)細(xì)胞沒有呈現(xiàn)出高的氧需求時(shí)，更大的厚度也是可以采用的。在制造過 程中，較厚的硅酮截面可能是有利的。通常，硅酮越厚，其越容易制造。 然而，上壁和下壁為約0.007英寸厚的一體化的二甲基硅酮培養(yǎng)室是可以制 造的。側(cè)壁為約0.004英寸厚的一體化的二甲基硅酮培養(yǎng)室也是可以制造 的。雖然圖中示出了不止一個(gè)法蘭，但一體化培養(yǎng)室不必有一個(gè)以上的法 蘭。因此，當(dāng)希望只有一個(gè)集流腔時(shí)，培養(yǎng)室的一端可以封死。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，所有培養(yǎng)室模制成整體件，該整體件帶有可固定 于集流腔壁的共用法蘭。圖17B示出了一體化培養(yǎng)室20，，，其是包括法蘭 152的一連串成型的透氣材料培養(yǎng)室(最好是二甲基硅酮)。作為法蘭支承 件的塑料(例如聚碳酸酯)剛性件可直接成型(即，包覆成型)到法蘭上， 以作為后續(xù)進(jìn)一步裝配的墊板。在該圖示中，法蘭支承件153包覆成型到 各法蘭152上。如圖17C的分解裝配圖所示，法蘭支承件153以液體不能 滲透的方式配合至集流腔壁62，以形成位于培養(yǎng)室各端部的集流腔。在評(píng) 價(jià)將二甲基硅酮粘結(jié)至剛性塑料的能力時(shí)，獲得二甲基硅酮和生物相容性 聚碳酸酯之間的不透液粘結(jié)。所述聚碳酸酯材料放置于模具中，并將硅酮 以液體注射成型工藝直接配合至所述聚碳酸酯。可以加入培養(yǎng)室支架，所 述支架可以是例如本文記載的和/或圖10和圖11所示的任意結(jié)構(gòu)。如果形 成為如圖1所示的那樣，突起部可以是延伸穿越整個(gè)培養(yǎng)室的肋部。在圖 17C的閣示中，存在一系列培養(yǎng)室支架42'。對(duì)于多種懸浮細(xì)胞而言，這是 -種有用的構(gòu)造，甚至不需耍通過引入培養(yǎng)表面作進(jìn)一步改造。然而，增 加培養(yǎng)表面仍然是可選方式。當(dāng)預(yù)定的應(yīng)用可能包括使用粘附細(xì)胞時(shí)，優(yōu) 選地，硅酮的內(nèi)表面覆蓋有適合被培養(yǎng)細(xì)胞類型的典型粘附表面。對(duì)多種 粘附細(xì)胞而言，插入經(jīng)組織處理的聚苯乙烯作為培養(yǎng)表面可能是有利的。 這使得可以進(jìn)行多種培養(yǎng)方式。例如，為培養(yǎng)粘附細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩者， 所述裝置可定向成使得粘附細(xì)胞可以沉降至lj經(jīng)組織處理的培養(yǎng)表面，并且 在附著后，旋轉(zhuǎn)180度以使懸浮細(xì)胞可以駐留在相對(duì)的硅酮壁上。如果圖17的構(gòu)造希望形成為包括經(jīng)組織處理培養(yǎng)表面而非硅酮，通過 用不同的培養(yǎng)表面覆蓋所有硅酮內(nèi)表面，對(duì)硅酮充等離子體以防止電子束 或伽馬滅菌期間的遷移能夠避免。例如，可插入薄的經(jīng)組織處理聚苯乙烯， 使其覆蓋全部硅酮。當(dāng)集流腔壁不是會(huì)發(fā)生遷移的材料時(shí)，經(jīng)處理聚苯乙 烯表面將保持為適合粘附性培養(yǎng)物。雖然所述培養(yǎng)表面(本實(shí)例中為聚苯 乙烯)提供了供細(xì)胞附著的表面，與假如它只是硅酮的情況相比，它會(huì)阻 止氣體傳遞進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)室。因此，期望細(xì)胞駐留其上的培養(yǎng)表面(或多個(gè) 表面)應(yīng)該是薄的，以使氣體傳遞仍然是充分的。優(yōu)選地，在細(xì)胞駐留其 上的聚苯乙烯區(qū)域的厚度為約0.003英寸或更薄。這種方式減少了連接件的 數(shù)量并降低了滲漏的可能性，同時(shí)提供適合任意給定應(yīng)用的培養(yǎng)表面。
圖18C、圖18D和圖18E示出了另一實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)，其使得培養(yǎng)室 可以部分地盛有培養(yǎng)基，并且/或者使胰蛋白酶、PBS或任意其它與從細(xì)胞 室移除細(xì)胞有關(guān)的液體的體積最小。在該實(shí)施方式中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)被直 接整合至傳統(tǒng)的多層培養(yǎng)瓶(諸如NUNCTM Cell Factory、 NUNC Triple Flask和Corning CellSTACK )的形式。圖18A是NUNCTM在網(wǎng)站上的 示圖，描繪了它們的Cell Factory for Active Gassing的運(yùn)行，其期望克服氣 體組成不均勻的問題。該氣體處理系統(tǒng)使丁藝復(fù)雜化，其需要ft道連接件、 無菌過濾器、獨(dú)立的氣體供給和備用的增濕過程，岡為干燥氣休混合物的 持續(xù)流動(dòng)會(huì)使培養(yǎng)基很快蒸發(fā)，并使摩爾滲透壓濃度增加到影響細(xì)胞生長(zhǎng) 和功能的水平。圖18B是圖18A的NUNC 方式的放大圖，具有表示強(qiáng) 制氣流的箭頭，并標(biāo)出了壁224和222以供參考。該透氣多層培養(yǎng)瓶可以 解決氣體組成不均勻的問題，而不需要傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶必須的輔助設(shè)備或 強(qiáng)制氣流。圖18C、圖18D和圖18E所/K-的實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是，它們可以 集成傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶(例如市售的培養(yǎng)瓶，以及例如美國(guó)專利No. 5,310,676、美國(guó)專利No. 6,569,675和英國(guó)專利說明書GB 1539263A中記載 的那些培養(yǎng)瓶)的結(jié)構(gòu)特征，包括使得培養(yǎng)基可以等量地被分配至各層的 任意或全部結(jié)構(gòu)特征。圖18C示出了透氣多層培養(yǎng)瓶200的實(shí)施方式，其 中無需傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶必需的輔助裝晉或強(qiáng)制氣流就可以實(shí)現(xiàn)均勻的培養(yǎng) 條件。至少壁224禾ll/或壁222的一部分是透氣的，允L亇氣體空間250與環(huán) 境氣體之間的氣體連通。傳統(tǒng)培養(yǎng)室可位于該裝置內(nèi)，優(yōu)選地，具有由聚 苯乙烯構(gòu)成的培養(yǎng)層220。培養(yǎng)室壁220被構(gòu)造成處在傳統(tǒng)的高度以保持培 養(yǎng)基和細(xì)胞，使得，作為在培養(yǎng)基80和氣體空間250之問的界面氣體傳遞 的結(jié)果，細(xì)胞90接收氧。集流腔260可構(gòu)造成如在傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶巾那樣。對(duì) 于透氣材料而言，二甲基硅酮是好的選擇，因?yàn)槠淇梢砸后w注射成型成殼
26體，或者，其可以包覆成型到如聚碳酸酯之類的剛性壁上。然而，如前所 述，在預(yù)期使用伽馬輻射的情況下，硅酮應(yīng)該是充有等離子體。優(yōu)選地， 壁的透氣面積以相等的幾何關(guān)系分布于各培養(yǎng)室，從而使得各培養(yǎng)室可以 獲得相等的氣體傳遞。換言之，各培養(yǎng)室與透氣材料的間距應(yīng)該相等。在 透氣材料區(qū)域，可以設(shè)置防止損壞的保護(hù)裝置和結(jié)構(gòu)支架，只要提供這些 特性的構(gòu)件允許氣體可以通向氣體空間。因此，可選用的側(cè)壁支架240起
到該功能。其由氣體通行開口 242和/或突起部241構(gòu)成。優(yōu)選地，側(cè)壁支 架是剛性的透明材料。
圖18D示出了另一種消除對(duì)強(qiáng)制通氣的需求的方式，在傳統(tǒng)多層裝置 中，強(qiáng)制通氣是作為一種提供均勻培養(yǎng)條件的方式。該構(gòu)造將透氣材料集 成在裝置本體內(nèi)。氣體空間251是穿過透氣多層裝置201的至少一部分本 體的開口。因此，氣體空間251由上氣體空間壁210和下氣體空間壁215 限定。它可以是貫穿整個(gè)本體的開口，類似于圖8A和圖8B示出的圖示。 它不需要完全穿過裝置，而可以在裝置內(nèi)終止。它的任意壁可以是透氣的。 然而，上氣體空間壁210不必是透氣的來克服傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)條 件不均勻的問題。當(dāng)氣體空間251的任意其它壁由透氣材料構(gòu)成時(shí)，就可 解決該問題。例如，氣體空間壁210可以是聚苯乙烯，其厚度不提供足夠 的氣體傳遞，只要?dú)怏w空間251的至少其它一個(gè)壁或兒個(gè)壁由確實(shí)提供足 夠氣體傳遞的材料構(gòu)成。在裝置本體內(nèi)均衡的區(qū)域進(jìn)行氣體傳遞，為利用 1液界面進(jìn)行氣體交換的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)提供了比傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶更加均勻 的氣體環(huán)境。透氣多層裝置不需耍僅以傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的方式操作。如果 上氣體空間壁210由透氣材料構(gòu)成，氣體傳遞可獨(dú)立于氣液界面而進(jìn)行。 上"t體空間壁210可與側(cè)壁225緊密配合以形成細(xì)胞培養(yǎng)室。然后，例如， 如果期望增加培養(yǎng)基高度以將補(bǔ)料頻次減到最少或延緩由蒸發(fā)引起的摩爾 滲透壓濃度的變化，可將培養(yǎng)基加至任意期望高度，只要培養(yǎng)室側(cè)壁225 的高度相應(yīng)增加，如WUson等的'314記載。
圖18E示出了改造傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶形成透氣多層培養(yǎng)瓶的圖示，該透 氣多層培養(yǎng)瓶設(shè)有透氣壁，當(dāng)通過裝置的側(cè)壁發(fā)生氣體傳遞時(shí)，該透氣壁 供細(xì)胞駐留其上。與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶相比，這提供了為培養(yǎng)方法提供了更 多的選擇，并解決了培養(yǎng)條件不均勻的問題。透氣多層培養(yǎng)瓶202設(shè)置為 它的壁(如側(cè)壁224和222)的至少一部分由透氣材料構(gòu)成。如果需要，透 氣區(qū)域應(yīng)該象圖18C描述的那樣被支撐。再參見圖18E，培養(yǎng)室底部245 由透1材料構(gòu)成，并最好由培養(yǎng)室支架243支撐，所述支架可包括突起部 241和/或氣體通行開口 242。培養(yǎng)室壁225可以是允許培養(yǎng)基80處于期望高度所需的任意高度。集流腔260可構(gòu)造成如傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶那樣。 實(shí)施例
實(shí)施例1和實(shí)施例2評(píng)估了培養(yǎng)室支架的交替幾何結(jié)構(gòu)，以定量地表
明透氣多層培養(yǎng)瓶可以解決傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的對(duì)貨運(yùn)、滅菌、存儲(chǔ)、培養(yǎng)箱和 處理空間的資源利用過多的問題，同時(shí)將存在不均勻培養(yǎng)條件的可能性降 到最低。
實(shí)施例3記載了伽馬輻射之前充有等離子的硅酮能限制或防止其遷移
到經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯表面，以此使得硅酮和經(jīng)組織培養(yǎng)處理的塑 料可以共存在同一培養(yǎng)室內(nèi)而仍可利用標(biāo)準(zhǔn)滅菌工藝。
實(shí)施例1
用于氧需求非常高的培養(yǎng)物的培養(yǎng)室支架結(jié)構(gòu) 通過構(gòu)建試驗(yàn)裝置來展示培養(yǎng)室支架的物理結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以改善胰 島細(xì)胞培養(yǎng)(已知是氧需求最高的類型之一)，所述裝置的下壁由測(cè)得的
平均厚度為0.0072英寸、表面積為98cm2的成型二甲基硅酮片構(gòu)成。 MOCON (Minneapolis, MN)利用他們的Oxtran 2/21 Instrument,根據(jù)美同材 料試驗(yàn)協(xié)會(huì)ASTM—1927測(cè)得的二甲基硅酮橡膠的透氣率在37'C時(shí)約為 14，300 mlo2/100 in2/24 hours。支撐二甲基硅酮的培養(yǎng)室由與所述硅酮直接 接觸的0.048cm厚、46%敞口格網(wǎng)構(gòu)成。敞口格網(wǎng)由一組聚內(nèi)烯線構(gòu)成， 所述聚丙烯線各自的直徑為0.018-0.020英寸，呈垂直和水平排列，使得毎 英寸水平距離以及每英寸垂直距離有16股線。所述格網(wǎng)由厚度為0.19cm 的聚碳酸酯成型塑料板保持在其位置上，具有均勻分布的突起，所述突起 將格網(wǎng)架高在所述片上方，使得氣體空間位于所述膜下面。各突起部為統(tǒng) '的"Y"形，而"Y"的各個(gè)邊成120度分開。各個(gè)邊的長(zhǎng)度為0.45cm，且寬 度為0.127cm。因此，各突起部的、可用于支撐格網(wǎng)的表面積為約0.175cm2。 每cm、h有約1.1個(gè)突起部。因此，可用于支撐格網(wǎng)的突起部的累積表面積 為約18.87cm2。各突起部白塑料板起的高度為0.127cm。氣體空間處于硅酮 底部和塑料板頂部之間。被突起部取代的累積氣體體積為2.4cm3。被格網(wǎng) 取代的累積氣體體積為2.54cm3。因此，處于硅酮膜下方并處于塑料板上方 的氣體為約17.2ml。處于硅酮膜下方并處于塑料板上方的氣體弓透氣膜表 面積之比為17.6%。內(nèi)塑料板包括作為氣體通行開口的通孔(各通孔的截 面定向?yàn)榕c塑料板的平面垂直)，使得環(huán)境氣體可以通過被動(dòng)擴(kuò)散與氣體 空間連通。位于所述表面積為98cm2的二甲基硅酮下面的五個(gè)均勻隔開的
28通孔(各孔具有0.29 cm2的截面積和0.075英寸的長(zhǎng)度)，形成1.45cn^的 累積截面積。因此，通孔的截面積與硅酮膜的截面積的比率為1.45 cm2/98 cm2，或約1.48%。從而，通孔的截面積與處于硅酮膜和塑料板的上表面之 間的氣體體積的比率為1.45cm2/17.2ml，或約8.4%。足部高出塑料板底部 0.51cm。因此，位于硅酮膜下面的培養(yǎng)室支架的總高度為0.87cm。
下述定義和縮略語用于理解胰島細(xì)胞的評(píng)估 培養(yǎng)瓶對(duì)照 依賴于氣液界面獲得氧的裝置，最大接種200
IE/cm2 ， IE與培養(yǎng)基之比為1000 IE/ml，得到0.2cm 的最大培養(yǎng)基深度。該對(duì)照用于將GP裝置(透氣裝 置)與培養(yǎng)瓶中的標(biāo)準(zhǔn)胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法作比較。 GP裝置 試驗(yàn)裝置，其底部由包括表面積98cn^的透氣二甲基
硅酮構(gòu)成并由如實(shí)施例1和實(shí)施例2中記載的結(jié)構(gòu)支 撐。
IE (胰島細(xì)胞當(dāng)量)胰島細(xì)胞體積的度量，等于直徑150pm胰島細(xì)胞的體
積。作為具有剛剛分離的胰島鈹褶的脈管系統(tǒng)，其體 積下降且其密度增加。因此，在第0天和第2天，IE 具有相同的體積，質(zhì)量不同。
山DNA計(jì)量的IE 或DNA IE
IE人工計(jì)數(shù)
胰島細(xì)胞比活力 胰島細(xì)胞表面密度
培養(yǎng)基稀釋度
非GP裝置
胰島細(xì)胞質(zhì)量的直接度量，等于11.4ngDNA。 IE數(shù)量傳統(tǒng)地由人:l:計(jì)數(shù)，這種方式不考慮胰島細(xì)胞 的平坦度和密度。對(duì)于18例豬胰島分離物，第0天 通過DNA計(jì)量的IE為人工計(jì)數(shù)IE的63±12% (范圍 為49-93%)。數(shù)量通常隨培養(yǎng)物中胰島細(xì)胞體積的下 降而減小，仍情況并非總是如此，因?yàn)槿斯び?jì)數(shù)易丁-出錯(cuò)。除非另有注明，IE指?jìng)鹘y(tǒng)地由人工計(jì)數(shù)的IE。 存活胰島細(xì)胞量的比
在給定表面積上培養(yǎng)的胰島細(xì)胞的體積，用IE/cm2 表示。15 0 直徑的胰島細(xì)胞的合流方陣列具有4444 IE/cm2。
培養(yǎng)基體積與駐留在裝置內(nèi)的胰島細(xì)胞數(shù)量的比例，用 (il/IE表示。
一種對(duì)照裝置，具有與GP裝胃相同的幾何結(jié)構(gòu)，但是 沒有透氣膜(用作試驗(yàn)對(duì)照，具有與GP裝覽相同的培 養(yǎng)條件，以定量分析透氣膜結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn))。豬分離 采用Ricordi法(Ricordi Method)從豬胰腺獲得胰島細(xì)
胞的過程。
OCR 氧消耗速率，以nmol/min表示?；钜葝u細(xì)胞量的度
OCR/DNA 每DNA含量的OCR，以nmol/miivmg DNA表示。
p值 報(bào)告的p值針對(duì)雙尾配對(duì)Student t檢驗(yàn)。
回收 在后來時(shí)間仍存在胰島細(xì)胞屬性(例如，DNA、IE、OCR)
的比例。
利用豬胰島細(xì)胞進(jìn)行初始評(píng)估，以確定需要什么樣的培養(yǎng)基體積對(duì)IE 的比率。豬胰島細(xì)胞在二甲基硅酮表面積為18cn^的小型GP裝置內(nèi)于37。C 培養(yǎng)2天，在200 IE/cn^下，1 |il/IE和4 pl/IE的培養(yǎng)基稀釋度沒有表現(xiàn)出 胰島細(xì)胞活力(通過OCR/DNA評(píng)估)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于5例豬分離樣， 4 pl/IE時(shí)的OCR/DNA是1 pl/IE時(shí)的97.5% 102.4% ，綜合平均值為101 %?；谠摪l(fā)現(xiàn)，采用1 Hl/IE的培養(yǎng)基稀釋度進(jìn)行實(shí)施例1和實(shí)施例2中 記載的批量評(píng)估。
在一系列試驗(yàn)中使用來自10例豬分離物的胰島細(xì)胞，其主要目的是 確定在GP裝置內(nèi)是否可以達(dá)到超過常規(guī)方法的、范圍為約1000 IE/cm2 2551 IE/cm2 (人工計(jì)數(shù))(DNA計(jì)數(shù)為490 IE/cm2 2551 IE/cm2)表面 密度，而與小于約200 IE/cm2 (人工計(jì)數(shù))的常規(guī)表面密度下的培養(yǎng)瓶對(duì) 照(即，氣液界面)相比沒有損失比活力。非GP裝置對(duì)照存在這樣的假設(shè)， 培養(yǎng)室支架結(jié)構(gòu)僅僅使得細(xì)胞駐留其上的表面成水平狀態(tài)，而沒有提供氣 體輸送，從而會(huì)導(dǎo)致差的胰島細(xì)胞活力。需討論的是，在設(shè)法使胰島細(xì)胞 處T均勻分布而不會(huì)因聚柒lflj損傷健康的同時(shí)，按如上所述設(shè)界的培養(yǎng)室 支架允許向胰島細(xì)胞輸送足夠的氧的能力。GP裝置構(gòu)造成使得胰島細(xì)胞在 98cn^的二甲基硅酮表面上均勻分布。在GP裝置內(nèi)的平均胰島細(xì)胞表面密 度為1526 IE/cm2 (人工計(jì)數(shù))?；贕P裝置的比活力與代表性的培養(yǎng)瓶 對(duì)照的比活力的比率，GP裝胃表現(xiàn)出相等的活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.4%， p 值為0.9987。因此，表叨了培養(yǎng)室支架能使氣體被動(dòng)傳遞進(jìn)入培養(yǎng)室，所 述被動(dòng)傳遞進(jìn)入的速率允許表面密度至少比傳統(tǒng)方法平均島7倍，而不損 失胰島細(xì)胞的活力(通過OCR/DNA測(cè)定)。其表明，培養(yǎng)室支架可構(gòu)造 成使得環(huán)境氣體可以存在于培養(yǎng)室支架的、與鄰近該培養(yǎng)室支架的透氣表 面相對(duì)的相反側(cè)，沿培養(yǎng)室支架被動(dòng)地移動(dòng)，然后與細(xì)胞駐留其上的表而 垂直，然后被動(dòng)地在細(xì)胞駐留于其上的透氣表面下方流通，此時(shí)以超過傳 統(tǒng)培養(yǎng)裝置所允許的七倍提供足夠的氧傳遞來支持胰島細(xì)胞。實(shí)施例2
在另一胰島細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中對(duì)與實(shí)施例1不同的培養(yǎng)室支架的物理結(jié) 構(gòu)進(jìn)行考察。在本實(shí)施例中，試驗(yàn)裝置包括與實(shí)施例1中本質(zhì)上相同的透 氣材料。支撐二甲基硅酮的培養(yǎng)室由與硅酮直接接觸的敞口格網(wǎng)構(gòu)成，并 且機(jī)加工的聚碳酸酯塑料板將所述格網(wǎng)支撐成基本呈水平狀態(tài)。與實(shí)施例1 的培養(yǎng)室支架不同，格網(wǎng)直接位于塑料板的上表面上。格網(wǎng)的幾何形狀和 材料成分與實(shí)施例1的相同。對(duì)于每cn^的硅酮膜表面積，硅酮下表面和 塑料底部的上表面之間的氣體體積在被格網(wǎng)取代后為0.022ml。換言之，塑 料板和透氣膜之間的氣體體積與透氣膜的表面積之比為2.2%。為了使得環(huán) 境氣體可以通過被動(dòng)擴(kuò)散與氣體空間連通，在塑料底部中存在作為氣體通 行開口的通孔，各通孔的截面定向?yàn)榕c格網(wǎng)的平面垂直。各通孔的直徑為 0.125英寸。所述通孔在二甲基硅酮下面以柵格形式均勻隔開，使得各孔中 心之間的距離為0.375英寸。各通孔的長(zhǎng)度為0.13英寸。通孔的截面積與 硅酮膜的截面積的比率為約16%。通孔的截面積與塑料板和透氣膜之間的 氣體體積的比率為273%。由于格網(wǎng)的高度為0.019英寸，二甲基硅酮和處 于塑料底部下面的氣體之間的總計(jì)高度為約0.15英寸。八個(gè)均勻分布的底 腳，從其所處的培養(yǎng)層表面計(jì)，將塑料底部的周邊部分抬卨0.41cm。底部 的周長(zhǎng)為23.94cm。塑料底部下側(cè)和其處于上面的表面(該表面由此向環(huán)境 氣體的運(yùn)動(dòng)開放)之間的截面積為7.59cm2。不考慮作為氣體運(yùn)動(dòng)限流器的 底腳，繞將氣體運(yùn)動(dòng)開放至透氣二甲基硅酮位貫的周邊的截面積為 9.85cm2。因此，培養(yǎng)室支架的高度為約0.5英寸。
在一系列試驗(yàn)中采用來自5例豬分離的胰島細(xì)胞，主要y的是確定是
否能夠在GP裝置中達(dá)到平均約1628 IE/cm2 (人工計(jì)數(shù))(DNA計(jì)數(shù)為 927 IE/cm2)的、超過常規(guī)的表面密度，而與培養(yǎng)瓶對(duì)照和非GP裝置相比 不損失比活力。需討論的是，在設(shè)法使胰島細(xì)胞處于均勻分布而不會(huì)因聚 集I (l J損傷健康的同時(shí)，按如上所述設(shè)置的培養(yǎng)室支架允許向胰島細(xì)胞輸送 足夠的氧的能力。如果如實(shí)施例1中所示，胰島細(xì)胞顯示出與對(duì)照類似的 活力，培養(yǎng)室支架形成為替代幾何形狀的能力將得到體現(xiàn)。幾何形狀的主 要差別是，實(shí)施例1采用突起部，而實(shí)施例2使得格網(wǎng)宵.接位于平坦的塑 料底部上。為了對(duì)缺少突起部進(jìn)行補(bǔ)償，實(shí)施例2的幾何形狀中，氣體通 行開口截面積與透氣材料表面積的比率與實(shí)施例1相比增加約8倍。將胰 島細(xì)胞放青到GP裝置內(nèi)，使得胰島細(xì)胞均勻地分布在二甲基硅酮表面上。 基f GP裝置的比活力與代表性的培養(yǎng)瓶對(duì)照的比活力的比率，GP裝置表現(xiàn)出相等的活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.8%， p值為0.9681。因此，證實(shí)了替代幾 何形狀的培養(yǎng)室支架可以使得氣體能以允許與傳統(tǒng)方法相比至少平均增加 8倍的表面密度的速率被動(dòng)傳遞進(jìn)入培養(yǎng)室，而不損傷通過OCR/DNA測(cè)得 的胰島細(xì)胞活力。
以與對(duì)照相比大幅度增加的表面密度(超過培養(yǎng)瓶的常規(guī)表面密度200 IE/cm2約7倍至41倍)，來考驗(yàn)所述透氣試驗(yàn)裝置。以平均比培養(yǎng)瓶的傳 統(tǒng)表面密度增大約18倍的表面密度，對(duì)總共20例豬分離物進(jìn)行評(píng)價(jià)。數(shù) 據(jù)具有較大程度的可變性，GP裝置表現(xiàn)出代表性培養(yǎng)瓶對(duì)照的96.0%的平 均活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為21.9%， p值為0.43。
圖19概括示出了與非GP裝置比較的結(jié)果，結(jié)果以培養(yǎng)瓶對(duì)照的百分 比表示。顯然，僅僅將培養(yǎng)室保持水平從而均勻分布胰島細(xì)胞的培養(yǎng)室支 架必須包括提供足夠氣體交換的容量，如通過隨著增加非GP裝置內(nèi)的表面 密度而損傷胰島細(xì)胞健康所表明的。實(shí)施例1和實(shí)施例2說明了至少有兩 種截然不同的培養(yǎng)室支架，在被集成到透氣多層裝置設(shè)計(jì)中時(shí)，可以獲得 有效利用空間的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。
該信息有利于表明透氣多層裝置相對(duì)傳統(tǒng)多層裝置的空間優(yōu)勢(shì)。例如， 在胰島細(xì)胞移植來治愈I艱糖尿病的領(lǐng)域中，目標(biāo)是培養(yǎng)至800,000IE (人 工計(jì)數(shù))。目前的200 IE/cm2表面密度的培養(yǎng)瓶方法將需要4000 cm2的 培養(yǎng)表面積。如果使用市售傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶，例如NUNC Cell Factory, 形成4000 cm2的培養(yǎng)農(nóng)面積將需要約六個(gè)它的632 cm4咅養(yǎng)層。這樣構(gòu)造 的NUNC Cell Factor將占用約416立方英、j-的空間，并且胰島細(xì)胞處于 可能不均勻的生長(zhǎng)條件。然而，考慮到上述實(shí)施例，透氣多層裝置可以在 小得多的空間內(nèi)培養(yǎng)800,000IE。例如，其能以約1526 IE/cm2 1628 IE/cm2 的平均表面密度培養(yǎng)胰島細(xì)胞，使得它只需要約500cm2的培養(yǎng)表面積來成 功培養(yǎng)800，000IE。如果在透氣多層裝置內(nèi)采用六個(gè)培養(yǎng)層，如NUNCTM Cell Factory所耍求的，各層將只需耍83cm2的表面積。如果培養(yǎng)基且接位于胰 島細(xì)胞上，各培養(yǎng)室的高度為約1.6cm (0.63英寸)以達(dá)到與Cell Factory (即luL/IE)相同的補(bǔ)料頻次。培養(yǎng)室支架的卨度(即，培養(yǎng)室之問的垂 直距離)不需超過實(shí)施例中的高度。上述實(shí)施例表明，各培養(yǎng)室支架的高 度可以是0.344英寸。就尺寸而言，透氣多層裝置可以約5.8英寸高、3.6 英寸寬和3.6英寸長(zhǎng)，占用空間約76英、j' 3。與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶占用416 英、J'3空間相比，這樣可以減少超過500%的貨運(yùn)、火菌、儲(chǔ)藏、培養(yǎng)箱以 及廢棄處理空間。而且，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)條件不均勻的問題。注 意到使用例如圖10中所示的構(gòu)造可以進(jìn)一歩降低培養(yǎng)室之間的距離，就象上述實(shí)施例的培養(yǎng)室的下底腳距離所展示的的那樣。 實(shí)施例3
將伽馬輻射期間的硅酮遷移減到最低
試驗(yàn)裝置162構(gòu)造成如圖20的截面圖所示。測(cè)試樣品165由二甲基硅 酮構(gòu)成，并被放置到市售聚苯乙烯組織處理六孔板167 (COSTAR 3516) 的本體的頂部上。然后將聚苯乙烯蓋168放置到六孔板167上。通過在伽 馬輻射之前對(duì)測(cè)試樣品165充等離子體，對(duì)硅酮遷移到蓋內(nèi)表面169上以 及遷移到經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166上最小化的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)試樣品165 位于距離經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166約1.78cm的位置，并距離蓋內(nèi)表面169 小于2mm。在一次評(píng)價(jià)中，在將測(cè)試樣品165放置到試驗(yàn)裝置162內(nèi)之前， 對(duì)其進(jìn)行充等離子體，通過水滴接觸角為96度以及表面能小于30達(dá)因確 認(rèn)等離子體電荷的存在。在另一次評(píng)價(jià)中，在將測(cè)試樣品165放置到試驗(yàn) 裝置162內(nèi)前未進(jìn)行充等離子體。在兩次評(píng)價(jià)中，對(duì)裝置依次進(jìn)行伽馬輻 射。然后，實(shí)施化學(xué)分析用電子能譜法(ESCA)，以定量分析各種表面的 元素組成。評(píng)估經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166與作為對(duì)照的6孔板的經(jīng)組織培 養(yǎng)處理表面相比是否存在硅酮、氧和碳，所述作為對(duì)照的6孔板在沒有硅 酮測(cè)試樣品165的情況下進(jìn)行伽馬輻射。對(duì)蓋內(nèi)表面169是否存在硅酮進(jìn) 行評(píng)估。表1匯總了測(cè)試結(jié)果。
表1測(cè)試條件%硅酮%氧%碳
經(jīng)組織培養(yǎng)處斑表面166 (對(duì)照)2.30920.18277.508
經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166(存在充有等離 子體的硅酮測(cè)試樣品165)2.68819.54977.783
蓋內(nèi)表面169(存在充有等離子體的硅酮 測(cè)試樣品165)2.3246.90290.049
經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166(存在未充等離 子的硅酮測(cè)試樣品165)24.11650.6525.243
蓋內(nèi)表面169(存在未充等離子體硅酮測(cè) 試樣品165)16.30759.51124.183
這些結(jié)果顯示，在伽馬輻射前將等離子電荷施加到硅酮防止了不希望
33的硅酮遷移，并且為細(xì)胞培養(yǎng)處理的表面保持基本不變。Corning⑧六孔板， 在不存在硅酮的條件下進(jìn)行伽馬輻射(即，對(duì)照)，就象集成了帶等離子 體硅酮的Corning⑧六孔板那樣，呈現(xiàn)出其經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面上存在約20 %的氧。相反，集成了不帶等離子體硅酮的Corning⑧六孔板呈現(xiàn)出氧成分 變化很大，為51%。未帶等離子體的硅酮遷移到所有表面。帶等離子體的 硅酮?jiǎng)t沒有遷移到除靠近硅酮的表面之外的表面。
這為細(xì)胞培養(yǎng)裝置的新的構(gòu)造打開了一扇門。通常，可以有簡(jiǎn)單的方 法來制造細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括但不限于如圖17A和圖17B所示的那些裝置。 包括硅酮表面和經(jīng)組織處理表面的培養(yǎng)裝置可以進(jìn)行伽馬輻射，通過至少 對(duì)與經(jīng)組織處理表面氣體連通的硅酮表面充等離子體，經(jīng)組織處理表面無 論與硅酮的距離是多少，在伽馬輻射之后基本上沒有變化。不可能遷移到 經(jīng)組織處理表面的硅酮表面不需經(jīng)等離子體照射，如由硅酮構(gòu)成的培養(yǎng)室 外側(cè)表面。需注意，只是部分由硅酮構(gòu)成的表面也應(yīng)該按說明充等離子體， 因?yàn)楣柰糠謺?huì)在輻射期間遷移。通常，可以有簡(jiǎn)單的方法來制造細(xì)胞培 養(yǎng)裝置。例如，可以通過成型硅酮外殼并插入供細(xì)胞駐留在上面的處理后 聚苯乙烯板，制造如基本培養(yǎng)瓶或OpticellTM透氣培養(yǎng)器之類的單培養(yǎng)室裝
置。硅酮獨(dú)特的延伸能力使得開口 (培養(yǎng)表面穿過該開口加入)可以小于 被插入部件，并且在插入后很快恢復(fù)節(jié)端U形狀。成型的硅酮中可以存在 隔膜，可以存在其它類型的通行口。對(duì)于基本培養(yǎng)瓶的情況，培養(yǎng)瓶的高 度可以大幅度減低，因?yàn)橥ㄟ^采用透氣硅酮消除了以氣-液界面的途經(jīng)獲取 氧的需要。參見圖17A，當(dāng)?shù)?一壁110為透氣硅酮，并且培養(yǎng)表面130為 如經(jīng)組織培養(yǎng)處理聚苯乙烯之類的粘附表面時(shí)，可以獲得附加的通用性。 這樣，可以將裝置定向?yàn)?，第一?10朝下以培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)表面130 朝下以培養(yǎng)粘附細(xì)胞，或者如前所述培養(yǎng)粘附和懸浮細(xì)胞。如果期望共同 培養(yǎng)粘附細(xì)胞，可以將附加的培養(yǎng)表面，如非常薄的、透氣聚苯乙烯插入 到第一壁110附近。裝置的高度可以增加，以允許各種所需的培養(yǎng)基體積 與表面積之比率，以優(yōu)化培養(yǎng)。制造具有褶鈹側(cè)壁的裝置，使得容積可以 根據(jù)使用者的需要改變。透氣多層培養(yǎng)瓶也可以將這些優(yōu)點(diǎn)集成在-起。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可以在不脫離本發(fā)明精神的前提下對(duì)其 進(jìn)行各種改動(dòng)。因此，本發(fā)明的范圍不限于所闡述或記載的具體實(shí)施方式
。 而且，本發(fā)明的范圍山所附權(quán)利要求禾l I其等價(jià)物確定。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包括多個(gè)培養(yǎng)室，各培養(yǎng)室具有透氣不透液表面以及相對(duì)表面；以及至少一個(gè)氣體空間，其與至少一個(gè)培養(yǎng)室的至少一個(gè)透氣不透液表面連通。
2. 如權(quán)利要求l所述的裝置，其中所述至少一個(gè)氣體空間和所述多個(gè)培養(yǎng) 室組合成至少一個(gè)整體單元。
3. 如權(quán)利要求2所述的裝置，其中各所述培養(yǎng)室與所述氣體空間在連續(xù)的 方向上交替設(shè)置。
4. 如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室是毗鄰所述氣體空間的并且 與所述氣體空間連通。
5. 如權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述氣體空間允許所述培養(yǎng)室的透氣不 透液表面與外部大氣之間的氣體交換。
6. 如權(quán)利要求2所述的裝置，所述整體單元具有至少一個(gè)通向各培養(yǎng)室的 通行口。
7. 如權(quán)利要求6所述的裝究，其中至少一個(gè)通行口包括頸部。
8. 如權(quán)利耍求2所述的裝置，還包括通向所述多個(gè)培養(yǎng)室的集流腔。
9. 如權(quán)利耍求2所述的細(xì)胞牛長(zhǎng)裝置，其中所述培養(yǎng)室可被培養(yǎng)基完全填 充以優(yōu)化細(xì)胞-營(yíng)養(yǎng)交換。
10. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生K裝置，其中所述相對(duì)表面透氣不透液。
11. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中細(xì)胞生長(zhǎng)條件的均勻性包括 確定的每個(gè)單位表面積的培養(yǎng)基體積。
12. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生K裝置，其中，至少一個(gè)培養(yǎng)室偏離另外 的培養(yǎng)室以供顯微鏡觀察。
13. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中所述整體單元包括多個(gè)整體 培養(yǎng)室。
14. 如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中所述多個(gè)培養(yǎng)室以串聯(lián)方式 互相連接。
15. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中所述整體單元包括一個(gè)或多 個(gè)培養(yǎng)室支架。
16. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中所述整體單元具有基本上呈 矩形的輪廓和基本 一 致的高度。
17. 如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，其中所述基本上呈矩形的輪廓內(nèi)設(shè)置有頸部和/或帽部，所述頸部和/或帽部不超出所述整體單元的高度。
18. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，還包括從頂壁的外表面升起的和/ 或從底壁的外表面向下延伸的突起部。
19. 一種細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包括至少一個(gè)培養(yǎng)室，所述培養(yǎng)室具有透氣不透液表面以及相對(duì)表面； 至少一個(gè)氣體空間，其與所述至少一個(gè)培養(yǎng)室的至少一個(gè)透氣不透 液表面連通；并且其中所述至少一個(gè)氣體空間與外部環(huán)境連通并由氣體空間殼體限定。
20. —種在根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述透氣壁裝配成期望的構(gòu)造；將所述細(xì)胞和/或培養(yǎng)基引入所述培養(yǎng)瓶的所述培養(yǎng)室；以及 將所述培養(yǎng)瓶置于孵育條件中。
21. 如權(quán)利要求19所述的方法，還包括使所述裝置旋轉(zhuǎn)的步驟，以在所述 透氣不透液表面的相對(duì)表面上培養(yǎng)細(xì)胞。
22. 如權(quán)利要求1所述的裝置，包括至少一個(gè)培養(yǎng)室支架。
23. 如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室支架與所述透氣不透液表 面接觸，并且所述氣體駐留在所述透氣不透液表面的一部分與所述培 養(yǎng)室支架之間。
24. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室支架的高度不超過0.34 英寸。
25. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室支架與所述透氣不透液表 面接觸的部分被設(shè)置成敞口格網(wǎng)。
26. 如權(quán)利要求25所述的裝置，其中所述格網(wǎng)至少有46%的開放度。
27. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室支架包括氣休通行孔。
28. 如權(quán)利耍求27所述的裝置，其中所述氣體體積與所述透氣不透液表面 的表面積之比率至少為約2%。
29. 如權(quán)利要求l所述的裝置，其中所述透氣不透液表面由硅酮構(gòu)成。
30. 如權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室平行地位于至少兩個(gè)集流 腔之間。
31. 如權(quán)利要求30所述的裝置，其中所述集流腔的容積不超過所述培養(yǎng)室 以及所述集流腔內(nèi)的空間總?cè)莘e的約7.0 % 。
32. 如權(quán)利要求l所述的裝置，其中采用美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)ASTM-1927方 法測(cè)量，在37'C下，所述透氣不透液表面的氧傳輸速率至少為約 14，000ml /100平方英寸-24小時(shí)。
33. 如權(quán)利要求l所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室由二甲基硅酮一體成型。
34. 如權(quán)利要求33所述的裝置，其中所述透氣表面的厚度小于約0.008英 寸。
35. 如權(quán)利要求33所述的裝置，其中所述剛性塑料材料通過包覆成型附著 于所述二甲基硅酮。
36. 如權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述集流腔包括可使其處于第一狀態(tài) 和第二狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，所述第一狀態(tài)包括與所述第二狀態(tài)不同的集流腔 容積。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法和裝置。它們包括使用透氣培養(yǎng)室，以減少空間的使用，同時(shí)維持均勻的培養(yǎng)條件，并且更適合自動(dòng)液體操作。它們包括將透氣材料集成至傳統(tǒng)的多層形式以解決培養(yǎng)條件不均勻的問題。它們包括培養(yǎng)裝置，其使用由透氣材料構(gòu)成的表面，充有等離子體的硅酮，并且集成傳統(tǒng)的附著表面，例如由傳統(tǒng)的經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯構(gòu)成的那些表面。它們包括集成了透氣透液膜的培養(yǎng)裝置。這樣產(chǎn)生多種優(yōu)點(diǎn)，包括放大期間更優(yōu)化的培養(yǎng)條件，以及對(duì)存量空間、培養(yǎng)箱空間和處理空間更有效的利用。還有，可以減少工作量和污染風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/12GK101611132SQ200780051036
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者約翰·R·威爾森 申請(qǐng)人:威爾森沃爾夫制造公司