專利名稱：高效裝置及培養(yǎng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法和裝置。它們包括透氣培養(yǎng)室的使用，在維持均勻的培養(yǎng)條件時(shí)可減少空間的使用，并且更適個(gè)液體的自動(dòng)處理。它們包括將透氣材料集成到傳統(tǒng)的多層形式內(nèi)，以解決細(xì)胞培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。它們包括使用由透氣的、充有等離子體的硅酮構(gòu)成的表面，它們還能與傳統(tǒng)的附著表面，例如由傳統(tǒng)的經(jīng)組織培養(yǎng)處理(tissueculture treated)的聚苯乙烯構(gòu)成的那些表面，集成為一體。它們包括將透氣、透液的膜集成為一體的培養(yǎng)裝置。

背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)的核心部分。組織培養(yǎng)瓶是細(xì)胞培養(yǎng)常用的裝置，因?yàn)樗鼈兛梢耘囵B(yǎng)粘附性細(xì)胞類型也可以培養(yǎng)非粘附性細(xì)胞類型，是一次性的，并且可在靜態(tài)方式下工作而無(wú)需灌注培養(yǎng)基的設(shè)備。傳統(tǒng)瓶有一個(gè)培養(yǎng)室。它們的設(shè)計(jì)要求在裝置內(nèi)存在供培養(yǎng)物氣體交換的氣-液界面。培養(yǎng)基的駐留高度必須很低，使得向細(xì)胞的氧傳遞不會(huì)受到削弱。對(duì)于組織培養(yǎng)瓶，建議的培養(yǎng)基高度為2mm～3mm。然而，瓶體必須足夠大以保持氣體，并允許使用(通常是)移液管吸取培養(yǎng)基。因此，相對(duì)其盛裝的培養(yǎng)基體積，培養(yǎng)瓶具有較大的裝置體積。例如，常用的T-175培養(yǎng)瓶具有大約長(zhǎng)23cm、寬11cm的底面，大約高3.7cm，并因此需占936cm3的空間。但是，其工作時(shí)培養(yǎng)基通常為約50ml。因此，相對(duì)培養(yǎng)瓶瓶體所占的空間(936cm3)，在瓶體中的培養(yǎng)基(50ml)顯示僅有瓶容積的約5％被培養(yǎng)基占用。而且，將由培養(yǎng)瓶瓶體占用的空間(936cm3)的容積除以供細(xì)胞駐留在上面的表面區(qū)域(175cm2)，表明由培養(yǎng)瓶占用的空間的容積是其提供給細(xì)胞駐留其上的表面積的5倍以上。培養(yǎng)瓶制造成具有各種數(shù)量的供細(xì)胞駐留其上的表面積，通常的面積為25cm2～225cm2，因此，只有較小的培養(yǎng)容量。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)放大期間使用越來(lái)越多的培養(yǎng)瓶，相對(duì)于它們提供的較小的培養(yǎng)基體積和有限的培養(yǎng)表面積，它們占用的整個(gè)空間量導(dǎo)致了固有的對(duì)于空間的低效利用，這加重了培養(yǎng)過(guò)程的負(fù)擔(dān)，因?yàn)榕c運(yùn)輸、滅菌、儲(chǔ)藏、培養(yǎng)箱空間以及廢棄處理相關(guān)的成本過(guò)高。工作量以及污染風(fēng)險(xiǎn)的大幅增加進(jìn)一步加深了這個(gè)問(wèn)題。
多層培養(yǎng)瓶，如NUNCTM Cell Factory(美國(guó)專利No.5,310,676)和

(美國(guó)專利No.6,569,675)，試圖通過(guò)以垂直方向堆疊培養(yǎng)層以在一各培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)形成多個(gè)培養(yǎng)室，來(lái)解決培養(yǎng)瓶放大效率低的問(wèn)題。這在一個(gè)裝置內(nèi)形成了更多的表面積，并且這使得可以有比傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中更多的細(xì)胞駐留在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。這樣，一個(gè)多層培養(yǎng)瓶可以代替多個(gè)傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶。該多層培養(yǎng)瓶可設(shè)置成使得培養(yǎng)基可以通過(guò)共用匯集點(diǎn)取放，從而不需要用移液管通向各個(gè)培養(yǎng)室。這使得與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的高度相比，多層培養(yǎng)瓶的各層之間的距離可以減低。例如，NUNCTM Cell Factory的培養(yǎng)層之間的空間為約1.4cm，相對(duì)常用的T-175培養(yǎng)瓶的底部和頂部之間3.7cm的距離，在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、滅菌、培養(yǎng)和廢棄處理空間的利用方面有了一些改善。多層培養(yǎng)瓶中通氣口允許與環(huán)境大氣之間的氣體交換，以調(diào)節(jié)pH、供氧以及有助于維持溫度控制。然而，在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的任意給定位置的氣體與通氣口位置的距離不同。由于在放大時(shí)多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)室數(shù)量增多，離通氣口最遠(yuǎn)點(diǎn)的氣體和最近點(diǎn)的氣體之間的距離隨之增大，在多層培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的全部氣體中會(huì)形成CO2和O2濃度梯度。因此，多層培養(yǎng)瓶設(shè)計(jì)本身具有在整個(gè)裝置內(nèi)存在不均勻的培養(yǎng)條件不均勻的可能性，該問(wèn)題在放大時(shí)更加嚴(yán)重。
有許多靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)裝置，它們通過(guò)使裝置的下壁透氣來(lái)實(shí)現(xiàn)氣體傳遞。氣體通過(guò)透氣下壁擴(kuò)散，以響應(yīng)形成在培養(yǎng)基和環(huán)境氣體之間形成的濃度梯度。這種方式不以氣-液界面作為唯一的氣體交換源。因?yàn)榧?xì)胞駐留其上的表面是透氣的，與所述多層培養(yǎng)瓶相比會(huì)存在更均勻的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)袋是靜態(tài)透氣裝置，其包含單一培養(yǎng)室。為了放大培養(yǎng)，培養(yǎng)袋必須沿水平方向伸長(zhǎng)，以獲得供細(xì)胞駐留其上的更大表面積。因此，在放大時(shí)，它們很快變得難以處理并且超出細(xì)胞培養(yǎng)箱的尺寸。OriGen BiomedicalGroup(OriGen PermaLifeTM Bags)、Baxter(

X-FoldTM涉及美國(guó)專利4,829,002，4,937,194，5,935,847，6,297,046B1)、Medtronic(Si-CultureTM，美國(guó)專利No.5,686,304)、Biovectra(VectraCellTM)以及American Fluoroseal(VueLifeTM Culture Bag System，由美國(guó)專利4,847,462和4,945,203保護(hù))有市售培養(yǎng)袋。透氣培養(yǎng)器是和培養(yǎng)袋以同樣的方式工作的裝置，區(qū)別在于它們具有剛性的側(cè)壁。市售透氣培養(yǎng)器包括

Culture Cassettes(由Laboratories MABIO-

提供)和

透氣培養(yǎng)器(美國(guó)專利6,455,310和6,410,309)(由BioChrystal Ltd.提供)。對(duì)于培養(yǎng)袋，為了提供更多供細(xì)胞駐留其上的表面積，這些裝置必須在水平方向伸長(zhǎng)。在美國(guó)專利No.6,821,772中，

的發(fā)明人提出了多個(gè)透氣培養(yǎng)室。不幸的是，這種方案僅僅增加了水平方向上的培養(yǎng)室數(shù)量。因此，無(wú)論培養(yǎng)室的數(shù)量是多少，為了增加這些裝置的培養(yǎng)容量，它們必須在水平方向上制作得更大。這些透氣裝置都不能在垂直方向放大。
在更有效地利用空間的努力中，美國(guó)專利No.6,673,595記載了通過(guò)在垂直方向堆疊獨(dú)立的物理上不同的培養(yǎng)器，并且以非常復(fù)雜的自動(dòng)化系統(tǒng)來(lái)操作各獨(dú)立培養(yǎng)器，來(lái)放大

透氣培養(yǎng)器。這種放大方式明顯背離了傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶具有的簡(jiǎn)單性。
美國(guó)專利No.6,759,245記載了一種多層透氣培養(yǎng)裝置，其通過(guò)采用透氣不透液膜將氧輸送和培養(yǎng)基輸送相分離。該發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，如果通過(guò)透氣不透液膜將液體培養(yǎng)基和含氧流體的流動(dòng)分開(kāi)，且細(xì)胞附著于膜的液體側(cè)生長(zhǎng)，那么裝置可用于利用穿過(guò)所述膜的氧傳輸來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，而無(wú)需考慮液體培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)裝置的流量。其優(yōu)點(diǎn)在于液體培養(yǎng)基的流量不再依賴于將氧攜帶至細(xì)胞的需求。然而，雖然培養(yǎng)基的流動(dòng)大幅降低，因?yàn)槠鋬H需要攜帶如葡萄糖之類的物質(zhì)，其失去了培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的能力，因?yàn)樵谑褂脮r(shí)懸浮細(xì)胞會(huì)被從裝置洗出。在這種方式中，細(xì)胞必須附著于膠原基體。另外的缺陷是需要灌注氣體空間和/或液體空間。這需要泵、流體管道，與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶相比大大提高了復(fù)雜程度。因此，這種方式還沒(méi)有商業(yè)化。
共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/961,814(Wilson等)記載了一種更有效地利用空間的透氣裝置。Wilson等的‘814記載的所述透氣裝置允許在垂直方向放大，同時(shí)保留傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的簡(jiǎn)單性。例如，Wilson等的‘814記載了透氣裝置的垂直放大，所述透氣裝置由一個(gè)一個(gè)堆疊的供細(xì)胞駐留其上的培養(yǎng)層構(gòu)成。氣體傳遞通過(guò)裝置的壁進(jìn)行。與傳統(tǒng)透氣裝置的放大不同，可通過(guò)增加裝置在垂直方向而非水平方向的尺寸來(lái)增加培養(yǎng)規(guī)模。因?yàn)椴恍枰獨(dú)?液界面，這使得在垂直放大培養(yǎng)規(guī)模時(shí)優(yōu)化了空間效率。得到了相對(duì)所述多層培養(yǎng)瓶更加緊湊的裝置。存在傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中不可能的特性。例如，所述裝置可以倒轉(zhuǎn)，以使得粘附細(xì)胞可以在堆疊培養(yǎng)層的上表面和下表面上培養(yǎng)以進(jìn)一步優(yōu)化空間效率。本文記載的發(fā)明在共同未決申請(qǐng)Wilson等的‘314上進(jìn)一步發(fā)展，得到了新的幾何形狀，其為傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶提供了優(yōu)良的替代方式。
本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置和方法，將整個(gè)裝置內(nèi)存在不均勻培養(yǎng)條件的可能性降到最低，允許對(duì)粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞進(jìn)行空間效率較高的培養(yǎng)放大，易于使用，可在無(wú)需灌注培養(yǎng)基或氣體的前提下工作，并使得使用者可以有效利用各培養(yǎng)室的上、下或側(cè)壁表面。通過(guò)隨后的說(shuō)明和附圖可以使進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)變得清楚。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)集成至少兩個(gè)透氣培養(yǎng)室，克服了現(xiàn)有靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)裝置的許多缺點(diǎn)，所述培養(yǎng)室至少部分地將氣體空間保持在它們之間，以使得氣體可以與培養(yǎng)室的透氣區(qū)域接觸。這使得各培養(yǎng)室可以與鄰近該培養(yǎng)室的氣體空間直接交換氣體，將培養(yǎng)條件不均勻的可能性降到最低。培養(yǎng)室的選定表面可以制成是透氣的，以在與細(xì)胞相對(duì)和/或靠近細(xì)胞的表面上進(jìn)行氣體交換。培養(yǎng)室內(nèi)的表面可由各種材料構(gòu)成，以提供供細(xì)胞駐留其上的最佳表面。如果有需要(例如在培養(yǎng)粘附細(xì)胞或在三維基體中生長(zhǎng)的細(xì)胞的情況下可能需要)，培養(yǎng)室內(nèi)的表面積可以增大。細(xì)胞還可以直接駐留在培養(yǎng)室的透氣材料上。通過(guò)增加培養(yǎng)室使得氣體空間至少部分地處在各培養(yǎng)室之間，以允許氣體與培養(yǎng)室的透氣區(qū)域接觸，來(lái)實(shí)現(xiàn)裝置的放大。通過(guò)一個(gè)或多個(gè)共用集流腔，或通向各培養(yǎng)室的獨(dú)立通路，可以實(shí)現(xiàn)與培養(yǎng)室的通路。憑借這種構(gòu)造，可以用簡(jiǎn)單的方式放大培養(yǎng)規(guī)模，這種方式易于使用，有效利用空間，并將發(fā)生培養(yǎng)條件不均勻的可能性降到最低。可以包括各種部件，并可以設(shè)置成各種構(gòu)造，以提供附加的優(yōu)點(diǎn)，包括使得裝置可以在一種以上的狀態(tài)下操作，允許培養(yǎng)粘附細(xì)胞，允許培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，允許共培養(yǎng)，防止日常操作期間細(xì)胞離開(kāi)它們各自的培養(yǎng)室，將補(bǔ)料頻次減到最低，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的操作方式，允許在培養(yǎng)期間增加或減少共細(xì)胞駐留其上的表面積，允許在培養(yǎng)期間增加或減少培養(yǎng)基體積與共細(xì)胞駐留其上的表面積的比率，以及/或允許細(xì)胞駐留在替代材料上或駐留在替代材料附近。
本發(fā)明的一個(gè)方面中，各培養(yǎng)室包括第一壁和相對(duì)的第二壁，所述第一壁和/或第二壁由透氣材料構(gòu)成，且氣體空間存在于各培養(yǎng)室的至少一部分之間。
在本發(fā)明的另一方面中，各培養(yǎng)室包括多個(gè)壁，包括但不限于第一壁和相對(duì)的第二壁，第三壁和相對(duì)的第四壁，以及第五壁，所述第一壁和/或第二壁和/或第三壁和/或第四壁和/或第五壁由透氣材料構(gòu)成，氣體空間靠近各培養(yǎng)室的至少透氣部分。
在本發(fā)明的另一方面中，所述培養(yǎng)室由一集流腔平行連接。所述集流腔可設(shè)置成防止氣體置換保持在培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基，并且/或者可以設(shè)置成在操作期間將細(xì)胞保留在培養(yǎng)室內(nèi)，并且/或者可以設(shè)置成將培養(yǎng)基和氣體保留在培養(yǎng)室內(nèi)。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室由超過(guò)一個(gè)集流腔平行連接。
在本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室的高度可以改變。
在本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室支架位于培養(yǎng)室之間，以將培養(yǎng)室保持在基本上水平狀態(tài)，并且/或者使得氣體可以與培養(yǎng)室的透氣表面接觸。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室的壁包括于其相鄰培養(yǎng)室中的至少一個(gè)接觸的突起部，以將培養(yǎng)室保持在基本上水平的狀態(tài)，并使得氣體可以與培養(yǎng)室的透氣表面接觸。
本發(fā)明的另一方面中，提供了防止培養(yǎng)室的壁與相鄰的培養(yǎng)室壁接觸的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室串聯(lián)連接。
本發(fā)明的另一方面中，可以直接通向各培養(yǎng)室。
本發(fā)明的另一方面中，環(huán)境氣體和透氣多層裝置的氣體空間之間的接觸可以有選擇地被終止，限制或不受限制。
本發(fā)明的另一方面中，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)室擴(kuò)展到多個(gè)培養(yǎng)室是可能的。
本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)透氣多層培養(yǎng)裝置被定向成使得細(xì)胞駐留在培養(yǎng)室最下方的培養(yǎng)表面上，一個(gè)培養(yǎng)室的至少部分沒(méi)有培養(yǎng)室直接位于其上，以方便顯微鏡評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)透氣多層培養(yǎng)裝置被定向成使得細(xì)胞駐留在培養(yǎng)室最下方的培養(yǎng)表面上，最下面的培養(yǎng)室和位于其上的培養(yǎng)室之間的氣體空間使得光可以存在在最下方培養(yǎng)室上，以方便用倒置式顯微鏡對(duì)最下方培養(yǎng)室的評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的另一方面中，通過(guò)將細(xì)胞接種到培養(yǎng)表面，并且重新定位裝置以使細(xì)胞的另一接種物沉降到不同培養(yǎng)表面，可以實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一方面中，通過(guò)僅僅轉(zhuǎn)動(dòng)裝置來(lái)一個(gè)表面一個(gè)表面地重新定位細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)在特定表面、在特定氧壓力、和特定培養(yǎng)基高度、和/或在特定的培養(yǎng)基體積與表面積之比率下培養(yǎng)細(xì)胞的方法。還可以培養(yǎng)至少5種不同的細(xì)胞系，各細(xì)胞系駐留在培養(yǎng)室的不同壁上。
本發(fā)明的另一方面中，培養(yǎng)室被制造成整體單元以將密封件的數(shù)量減到最少。
本發(fā)明的另一方面中，透氣多層裝置可設(shè)置成保留市售的傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的結(jié)構(gòu)，同時(shí)解決培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。
本發(fā)明的另一方面中，公開(kāi)了采用透氣不透液材料，用于包括培養(yǎng)室支架以及氣體空間與環(huán)境氣體之間的無(wú)菌屏障的透氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
本發(fā)明的另一方面中，公開(kāi)了用充等離子體的硅酮構(gòu)造透氣裝置，以將其向其它表面的遷移減到最低。



圖1A和圖1B示出了一種透氣多層裝置的實(shí)施方式，該裝置設(shè)置成使氣體交換直接通過(guò)培養(yǎng)室的壁進(jìn)行。該培養(yǎng)室通過(guò)集流腔平行連接以形成完整單元，該單元包括存在于培養(yǎng)室之間的氣體空間。通行端口允許流體進(jìn)出透氣多層裝置。
圖2示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，該裝置設(shè)置成允許氣體通過(guò)培養(yǎng)室的第一壁傳遞，以允許通過(guò)處于離細(xì)胞最遠(yuǎn)距離的培養(yǎng)基的表面進(jìn)行氣體交換。
圖3示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，該裝置設(shè)置成允許氣體通過(guò)培養(yǎng)室的第二壁傳遞，以允許細(xì)胞附近的氣體交換。
圖4示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，該裝置被設(shè)置成允許通過(guò)培養(yǎng)室的第一壁和通過(guò)培養(yǎng)室的第二壁進(jìn)行氣體傳遞，以增加用于氣體交換的表面積。
圖5A、5B和5C示出了透氣多層裝置的立體圖，所述裝置被設(shè)置成具有第一壁和相對(duì)的第二壁，第三壁和相對(duì)的第四壁，以及第五壁。通過(guò)有選擇地制造具有預(yù)定長(zhǎng)度、寬度、表面積和材料成分的各個(gè)壁，以及具有預(yù)定材料和表面積的各培養(yǎng)表面，使用者可以從多種培養(yǎng)方式種進(jìn)行選擇。因此，通過(guò)僅僅改變所述透氣多層裝置的朝向，使用者可以使細(xì)胞處于各種培養(yǎng)表面類型、培養(yǎng)表面積、氧壓力和培養(yǎng)基體積與培養(yǎng)表面積之比率。例如，當(dāng)透氣多層裝置定向成如圖5B所示時(shí)，培養(yǎng)基可以處于比透氣多層裝置定向成如圖5A所示時(shí)更高的高度。當(dāng)透氣多層裝置定向成如圖5C所示，培養(yǎng)基會(huì)所處的高度可以超過(guò)當(dāng)裝置定向成如圖5A或圖5B中所示時(shí)可能達(dá)到的高度。
圖6示出了透氣多層裝置的剖視圖，該裝置設(shè)置有氣阱，以防止氣體從培養(yǎng)室內(nèi)部置換培養(yǎng)基。
圖7A和7B示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，其設(shè)置成防止細(xì)胞在日常操作時(shí)離開(kāi)培養(yǎng)室。圖7C、7D和7E示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，其被設(shè)置成使得培養(yǎng)基和氣體以預(yù)定的體積處于培養(yǎng)室內(nèi)。
圖8A、8B、8C和8C-1示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，該裝置設(shè)置有兩個(gè)集流腔。培養(yǎng)室平行地連接在集流腔之間，形成包括鄰近各培養(yǎng)室的氣體空間的整體單元。圖8D和8E示出了在培養(yǎng)過(guò)程前或培養(yǎng)過(guò)程中如何改變培養(yǎng)基體積和/或透氣表面積與培養(yǎng)室容積的比率。
圖9A和9B示出了培養(yǎng)室支架的用途，用于使得氣體與培養(yǎng)室的透氣材料接觸，并且/或者用于將培養(yǎng)室保持在基本上水平狀態(tài)，以使得細(xì)胞均勻地分布在培養(yǎng)室內(nèi)。
圖10示出了培養(yǎng)室支架的用途，所述支架呈從培養(yǎng)室的壁部突出的突起部形式，用于使得氣體與培養(yǎng)室的透氣材料接觸，并且/或者用于將培養(yǎng)室保持在基本上水平狀態(tài)，以使得細(xì)胞均勻地分布在培養(yǎng)室內(nèi)。
圖11示出了處于培養(yǎng)室內(nèi)的內(nèi)部間隔件的作用，其用于防止壁以及/或者培養(yǎng)表面互相接觸。
圖12示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，其中培養(yǎng)室與進(jìn)口和出口以串聯(lián)方式連接。培養(yǎng)室形成整體單元，并包括鄰近各培養(yǎng)室的氣體空間。
圖13示出了透氣多層裝置的一種實(shí)施方式的剖視圖，所述裝置設(shè)置有獨(dú)立的培養(yǎng)室和鄰近各培養(yǎng)室的氣體空間。其還示出了如何有選擇地控制環(huán)境氣體至氣體空間的通路。
圖14示出了透氣多層裝置的另一種實(shí)施方式，其被設(shè)置為控制環(huán)境氣體至氣體空間的通路。
圖15示出了透氣多層裝置的另一種實(shí)施方式，其被設(shè)置為控制環(huán)境氣體至氣體空間的通路。
圖16A和16B示出了使用透氣多層裝置從一個(gè)培養(yǎng)室向多個(gè)培養(yǎng)室擴(kuò)展細(xì)胞的方法。
圖17A示出了由硅酮成型的整體培養(yǎng)室，其將可能泄漏的連接件數(shù)量減到最少。圖17B示出了作為單個(gè)工件制造的培養(yǎng)室整體組合。圖17C示出了透氣多層裝置的分解圖，其包括整體培養(yǎng)室，包覆成型法蘭、兩個(gè)集流腔和培養(yǎng)室支架。
圖18A示出了傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶制造商推薦的用于解決培養(yǎng)條件不均勻問(wèn)題的方式。圖18B示出了該方式的放大圖。圖18C、18D和18E示出了透氣多層裝置的實(shí)施方式，所述裝置設(shè)置成解決培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題，同時(shí)集成了市售的傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的特點(diǎn)。在一實(shí)施方式中，氣體傳遞通過(guò)裝置的壁直接進(jìn)行，使得在各培養(yǎng)室上的氣體與周圍環(huán)境的氣體可以直接進(jìn)行氣體交換。在另一實(shí)施方式中，氣體空間位于裝置內(nèi)，使得裝置內(nèi)的氣體的氣體交換通過(guò)氣體空間的壁進(jìn)行。氣體空間的上壁可適用于使得氣體交換獨(dú)立于氣-液界面，并且/或者氣體空間的下壁可適用于使得氣體通過(guò)氣-液界面?zhèn)鬟f到培養(yǎng)物。在另一實(shí)施方式中，氣體空間通過(guò)透氣裝置的壁與環(huán)境氣體連通，氣體空間的透氣上壁作為培養(yǎng)室下壁，使得氣體向培養(yǎng)物的傳遞獨(dú)立于氣-液界面而進(jìn)行。
圖19示出了從胰島細(xì)胞培養(yǎng)中采集的數(shù)據(jù)的柱狀圖，因胰島細(xì)胞高的氧需求，胰島細(xì)胞培養(yǎng)是一種非常具有挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)類型。良好的結(jié)果證實(shí)，將有利的幾何結(jié)構(gòu)包括到其培養(yǎng)室支架中，透氣多層裝置獨(dú)特的容量節(jié)約了空間，并提供了均勻的培養(yǎng)條件。
圖20示出了一種試驗(yàn)裝置的剖視圖，該裝置用于證實(shí)在將透氣多層裝置暴露于諸如伽馬輻射之類的常用無(wú)菌處理之前，對(duì)由硅酮構(gòu)成的材料充等離子體以將硅酮向其它表面的遷移減到最少的作用。

具體實(shí)施例方式 圖1A和圖1B用于圖示本發(fā)明的一些基本特征。在圖示中，透氣多層裝置1集成了兩個(gè)透氣培養(yǎng)室20，這兩個(gè)培養(yǎng)室部分地由氣體空間50隔開(kāi)。示出的兩個(gè)培養(yǎng)室可說(shuō)明一些基本的透氣多層裝置特征，但是可以設(shè)置任意的附加數(shù)量的培養(yǎng)室。圖1A為立體圖，去除了側(cè)壁以暴露培養(yǎng)室20的內(nèi)部。圖1B示出了透氣多層裝置1的剖視圖。培養(yǎng)室20包括第一壁110和相對(duì)的第二壁120。第一壁110、第二壁120、或第一壁110和第二壁120兩者，可包括透氣材料。象傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)袋一樣，第一壁110和第二壁120可固定在一起而無(wú)需側(cè)壁。然而，最好具有側(cè)壁，使得在整個(gè)培養(yǎng)室范圍內(nèi)，培養(yǎng)室的第一和第二壁之間的距離相同。還有，當(dāng)所選的壁和側(cè)壁包括透氣材料時(shí)，透氣多層培養(yǎng)裝置的朝向可設(shè)置成使其能以多種位置工作，包括第一壁朝下、第二壁朝下或任意側(cè)壁朝下。這使得細(xì)胞可駐留于(靠近)任意壁。當(dāng)培養(yǎng)室的長(zhǎng)度、高度和寬度的尺寸不同時(shí)，透氣多層培養(yǎng)裝置通過(guò)在接種和/或培養(yǎng)期間改變其位置，可提供獨(dú)特的細(xì)胞上培養(yǎng)基高度以及/或者獨(dú)特的培養(yǎng)基與表面積的比率。根據(jù)接種時(shí)的朝向，細(xì)胞會(huì)沉降到培養(yǎng)室內(nèi)的任意表面。例如，處于圖1B的位置時(shí)，細(xì)胞朝第二壁120沉降。細(xì)胞接觸的表面可以僅僅是培養(yǎng)室壁的內(nèi)表面。然而，細(xì)胞駐留其上的材料的期望成分和幾何結(jié)構(gòu)可以不是培養(yǎng)室壁的表面所代表的材料成分和幾何結(jié)構(gòu)。這樣，任意能提供期望的材料和幾何結(jié)構(gòu)的部件、插件、基體等可構(gòu)造成透氣多層裝置。因此，培養(yǎng)表面130可以僅僅是給定的培養(yǎng)室壁的內(nèi)表面，或者可以是任意位于培養(yǎng)室內(nèi)的部件、插件、基體等。僅僅為方便起見(jiàn)，在本申請(qǐng)通篇中，培養(yǎng)表面130被描述為在裝置壁的內(nèi)表面上，但這不限制本發(fā)明的范圍。
如圖1B所示，集流腔60形成培養(yǎng)室20之間的流體通道。通行口70使得可以加入或移除流體和細(xì)胞。在該圖示中，通行口70包括頸部和以傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的方式覆蓋通行口70的蓋子30。然而，通行口可以是任意構(gòu)造，并且可以位于任意位置，只要能夠?qū)崿F(xiàn)將流體移入和移出透氣多層裝置的目的。細(xì)胞培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，可以有很多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，包括許多封閉系統(tǒng)構(gòu)造，封閉系統(tǒng)構(gòu)造可包括使用設(shè)置成可無(wú)菌插接的隔板、快拆配件、或管道。
氣體空間50不需要是裝置的密封部分。該氣體空間不需要具有強(qiáng)制氣流，或適合于強(qiáng)制氣流，來(lái)使裝置工作。在該最簡(jiǎn)單和優(yōu)化的形式中，僅僅是環(huán)境氣體與裝置的任意或全部透氣部分相接觸。然而，可以有一個(gè)或多個(gè)壁包圍該氣體空間。
在簡(jiǎn)單的操作方法中，將培養(yǎng)基和細(xì)胞送入透氣多層裝置內(nèi)，并將透氣多層裝置放到標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，該裝置的朝向設(shè)置成使得細(xì)胞沉降到期望的表面。在較復(fù)雜的操作方式中，可進(jìn)行追加接種，使得細(xì)胞沉降到另外的表面。例如，在接種時(shí)定期地對(duì)裝置重新定位，細(xì)胞會(huì)駐留在所有的培養(yǎng)表面。
各培養(yǎng)表面130可以是任意合適的材料、任意可用于培養(yǎng)細(xì)胞的形狀，所述表面可以與也可以不與細(xì)胞培養(yǎng)室的壁成為一體。例如，培養(yǎng)表面可以僅僅是包括了培養(yǎng)室的壁的內(nèi)表面，也可以是經(jīng)或不經(jīng)組織培養(yǎng)處理。該材料可以是如專利號(hào)為5,935,847的美國(guó)專利記載的，層積于培養(yǎng)室的壁的材料。可以是與培養(yǎng)室的壁物理分離的材料，如位于壁上方的由聚苯乙烯制成的分離部，可以是固定或不固定于壁，如以纖粘蛋白或膠原蛋白為基質(zhì)的插入件。如細(xì)胞和組織培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，對(duì)任意培養(yǎng)表面的采用沒(méi)有限制。
圖2示出了怎樣利用跨過(guò)培養(yǎng)室20的透氣第一壁110的氣體交換來(lái)實(shí)現(xiàn)均勻的培養(yǎng)條件。氧氣流箭頭100示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50之間的氧濃度梯度的結(jié)果，氧怎樣跨過(guò)透氣的第一壁110輸送到利用培養(yǎng)基80駐留在培養(yǎng)表面130上的細(xì)胞90。根據(jù)第一壁110的透氣程度，最多事實(shí)上培養(yǎng)基的整個(gè)上表面可同時(shí)暴露于包圍著裝置的環(huán)境氣體，不象傳統(tǒng)的多層燒瓶，環(huán)境氣體在位于離裝置內(nèi)各培養(yǎng)基位置不同距離的單一透氣部位進(jìn)入裝置。如本文所述，在一些實(shí)施方式中，透氣多層裝置被構(gòu)造成可以使氣體和培養(yǎng)基駐留在培養(yǎng)室內(nèi)。因此，運(yùn)行期間，氣體可駐留在透氣第一壁110的兩側(cè)。通常，氣體因氣體空間和培養(yǎng)室內(nèi)流體之間的分壓差而進(jìn)出培養(yǎng)室。
圖3示出了跨過(guò)培養(yǎng)室的透氣第二壁120的氣體交換。氧氣流箭頭100示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50之間的濃度梯度的結(jié)果，氧怎樣通過(guò)透氣第二壁120輸送到駐留于培養(yǎng)室20內(nèi)的細(xì)胞90。這樣，各細(xì)胞室中的細(xì)胞比傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞離環(huán)境氣體可以更近。應(yīng)注意確保構(gòu)成培養(yǎng)表面130的材料對(duì)氣體傳遞的阻礙，不會(huì)影響到對(duì)期望的細(xì)胞量進(jìn)行供氧的需求和維持合適的pH的需求。例如，如果透氣第二壁120由高透氣性的材料如二甲基硅酮構(gòu)成，而透氣性較低的培養(yǎng)表面如聚苯乙烯位于該硅酮上，則向細(xì)胞的氣體傳遞會(huì)被阻礙。通常，位于細(xì)胞和環(huán)境氣體源之間的、對(duì)氣體傳輸?shù)淖璧K程度最高的材料將成為限速因素。因此，為了優(yōu)化透氣多層裝置的功能，設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮用于構(gòu)建透氣壁的材料的透氣性，被使用的任意附加培養(yǎng)表面的透氣性，以及培養(yǎng)物的氧需求。透氣的多層裝置為提供合意的氣體交換和合意的供細(xì)胞駐留的材料考慮到了許多可選方案。然而，如果期望使用將會(huì)限制培養(yǎng)物氣體交換的材料作為培養(yǎng)表面，可以通過(guò)培養(yǎng)室的相對(duì)壁和/或側(cè)壁來(lái)加強(qiáng)氣體交換。
圖4示出了跨過(guò)培養(yǎng)室的透氣第二膜120和跨過(guò)透氣第一壁110的氣體交換。氧氣流箭頭100示出了，作為培養(yǎng)基80和氣體空間50之間的濃度梯度的結(jié)果，氧怎樣通過(guò)透氣第二壁120和透氣第一壁110輸送到培養(yǎng)室20。這樣，各培養(yǎng)室都可以實(shí)現(xiàn)高水平的氣體傳遞。
雖然圖2，圖3和圖4示出了通過(guò)特殊的壁的氣體傳遞，但透氣多層裝置的任意壁可以是透氣性的。由于氧可直接通過(guò)細(xì)胞駐留的表面，和/或通過(guò)培養(yǎng)室的側(cè)壁，以及/或通過(guò)集流腔壁輸送至細(xì)胞，從而可以獲得各種優(yōu)點(diǎn)。Wilson等的‘814記載了通過(guò)增加可駐留在透氣培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基高度可以獲得的優(yōu)點(diǎn)。透氣多層裝置中的培養(yǎng)基高度的增加可遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的2mm～3mm的限度，從而將培養(yǎng)基更換的頻次降低到最低，減少工作量并減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如果可以進(jìn)行跨越培養(yǎng)室的透氣壁的氣體傳遞，有利的是，將培養(yǎng)室構(gòu)造成使得透氣壁和相對(duì)壁之間的距離允許增加培養(yǎng)基高度。最佳距離取決于培養(yǎng)物的代謝需求和期望的培養(yǎng)基更換頻次。
圖5A、圖5B和圖5C示出了透氣多層裝置的放置方式的例子，這些放置方式提供了許多可供選擇的培養(yǎng)方式。例如，當(dāng)?shù)谝槐?10、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126由具有不同透氣性的材料構(gòu)成時(shí)，通過(guò)將透氣多層裝置2定向成給定的狀態(tài)，細(xì)胞會(huì)處于不同的氧壓力下。然而，不必使用不同的透氣材料來(lái)進(jìn)行費(fèi)力的操作方式。在第一壁110、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126附近的、與之成為一體或未成為一體的培養(yǎng)表面，其材料或表面積可以不同。當(dāng)?shù)谝槐?10、和/或第三壁122和/或第五壁126的大小不同時(shí)，將透氣多層裝置2朝向任意方位，也可提供了在培養(yǎng)之前或期間的任意時(shí)刻變更培養(yǎng)基的最大高度。對(duì)培養(yǎng)室的形狀進(jìn)行改變甚至可產(chǎn)生更多的可選方式。例如，由于裝置朝向的變換，八角形為細(xì)胞提供了額外的可駐留其上的表面。
為達(dá)到在透氣多層裝置內(nèi)實(shí)現(xiàn)均勻的培養(yǎng)條件的目標(biāo)，設(shè)計(jì)應(yīng)包含這樣的目標(biāo)將基本等量的細(xì)胞放置在各培養(yǎng)室內(nèi)，并促使各培養(yǎng)室內(nèi)的那些細(xì)胞基本均勻地分布于整個(gè)培養(yǎng)室內(nèi)。使各培養(yǎng)室的幾何結(jié)構(gòu)基本相同、將各培養(yǎng)室的相對(duì)的壁構(gòu)造成基本平行、并使得培養(yǎng)室可放置成水平狀態(tài)，以使得細(xì)胞可均勻地沉降到培養(yǎng)表面上，這樣會(huì)有助于達(dá)成該目標(biāo)。然后，當(dāng)接種期間細(xì)胞處于均勻懸浮狀態(tài)，且培養(yǎng)表面具有一致的幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，接種物會(huì)以均勻的體積駐留在各培養(yǎng)室的培養(yǎng)表面上，且細(xì)胞會(huì)以均勻的分布沉積在各培養(yǎng)室的培養(yǎng)表面上。在培養(yǎng)表面不平坦，例如，存在起皺的表面的情況下，將培養(yǎng)室設(shè)置成在每單位培養(yǎng)表面上具有相同的空間體積，可有助于接種期間均勻的細(xì)胞分布。例如，如果培養(yǎng)表面起皺，且相對(duì)壁也起皺，該起皺的相對(duì)壁與培養(yǎng)表面之間的空間體積沿培養(yǎng)室的長(zhǎng)度方向會(huì)保持恒定。無(wú)論培養(yǎng)表面是怎樣的幾何結(jié)構(gòu)，將培養(yǎng)室構(gòu)造成使得該培養(yǎng)室內(nèi)的任意給定區(qū)域存在基本等體積的接種物，可有助于實(shí)現(xiàn)均勻的細(xì)胞分布。
優(yōu)選地，當(dāng)利用集流腔向培養(yǎng)室輸送培養(yǎng)基時(shí)，該集流腔應(yīng)構(gòu)造成使得接種物均勻地分配到各培養(yǎng)室中，并使得沉積在集流腔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量最少。使集流腔容積不大于能讓培養(yǎng)基快速并容易地充入培養(yǎng)室所需的大小，這是有利的，因?yàn)轳v留在滯留于集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞會(huì)沉積到集流腔的底部，并與駐留在培養(yǎng)室內(nèi)的細(xì)胞處于不同的培養(yǎng)條件。雖然在接種期間集流腔容積應(yīng)最小化，以防止細(xì)胞沉積至不希望的區(qū)域，但是，允許過(guò)量的培養(yǎng)基駐留在集流腔內(nèi)以減少裝置高度可能是有用的，因?yàn)槟切┡囵B(yǎng)基會(huì)有助于提高各培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)基體積與表面積的比率。換句話說(shuō)，集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基體積會(huì)使駐留在細(xì)胞室內(nèi)的細(xì)胞獲取基質(zhì)。
圖6示出了透氣多層裝置3的剖視圖，該裝置被設(shè)置成使裝置內(nèi)可能出現(xiàn)的氣體進(jìn)入不會(huì)對(duì)均勻培養(yǎng)條件的建立造成破壞的區(qū)域。集流腔60包括氣阱61。氣阱61的至少一部分高于最上面的培養(yǎng)室20。在該圖示中，通行口70由隔片72覆蓋。裝置中的過(guò)量氣體升到氣阱61內(nèi)，由此防止培養(yǎng)基被置換出任意的培養(yǎng)室。
在一些應(yīng)用場(chǎng)合，期望在使用期間改變集流腔的形狀或體積。將集流腔構(gòu)造成改變形狀或體積應(yīng)該以不會(huì)導(dǎo)致染菌的方式進(jìn)行，例如可以通過(guò)撓性壁或采用墊圈或O形圈來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，期望通過(guò)共用集流腔將細(xì)胞送入培養(yǎng)室，并且防止細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)室移動(dòng)到另一培養(yǎng)室或從培養(yǎng)室移動(dòng)到集流腔內(nèi)。當(dāng)以這樣的方式操作裝置時(shí)，可能會(huì)使培養(yǎng)室定向至?xí)恍⌒氖辜?xì)胞離開(kāi)培養(yǎng)室的狀態(tài)。堵塞培養(yǎng)室的一個(gè)或多個(gè)開(kāi)口可以防止這種情況發(fā)生。作為另一例子，譬如當(dāng)細(xì)胞已附著在培養(yǎng)室內(nèi)時(shí)，在使用期間定期改變駐留在集流腔內(nèi)的培養(yǎng)基的量是有利的，并且更多的培養(yǎng)基有利于將補(bǔ)料頻次降低到最低。這樣，可將集流腔設(shè)置成具有更大的容積。在其它應(yīng)用場(chǎng)合，譬如當(dāng)所期望的培養(yǎng)表面積與培養(yǎng)基體積的比率要求培養(yǎng)基的駐留高度應(yīng)該低于培養(yǎng)室高度時(shí)，培養(yǎng)基最好不充滿整個(gè)培養(yǎng)室。
圖7A和圖7B示出了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的方式的圖示。在圖7A中，透氣多層裝置4的集流腔壁62處于第一狀態(tài)，允許將細(xì)胞和培養(yǎng)基經(jīng)通行口70通過(guò)集流腔60導(dǎo)入培養(yǎng)室20。圖7B示出了處于第二狀態(tài)的集流腔壁，其中集流腔60縮進(jìn)，堵塞了培養(yǎng)室20的開(kāi)口，防止細(xì)胞或培養(yǎng)基流出培養(yǎng)室20。培養(yǎng)室20可部分地盛有培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)室20內(nèi)駐留有培養(yǎng)基和氣體，并且集流腔壁62可移動(dòng)到圖7B的狀態(tài)以防止培養(yǎng)基流失到集流腔60內(nèi)。然而，該實(shí)施方式也允許透氣多層裝置4被培養(yǎng)基完全充滿，而無(wú)需移動(dòng)集流腔壁62。
圖7C、圖7D和圖7E示出了用培養(yǎng)基部分填充培養(yǎng)室的例子。圖7C示出了透氣多層裝置4處于集流腔60朝向培養(yǎng)室20下方的狀態(tài)，并且處于其內(nèi)部駐留有預(yù)定量的培養(yǎng)基80的第一開(kāi)啟狀態(tài)。該預(yù)定量的培養(yǎng)基體積少于各培養(yǎng)室的總?cè)莘e。圖7D示出了集流腔60被壓縮，將培養(yǎng)基80從集流腔60趕入培養(yǎng)室20。圖7E示出了透氣多層裝置4呈水平朝向，使得各培養(yǎng)室內(nèi)駐留有培養(yǎng)基80和氣體。當(dāng)集流腔被閉合時(shí)，透氣多層裝置的內(nèi)部容積減少，壓力升高。壓力升高和培養(yǎng)室內(nèi)氣體與液體的比率、培養(yǎng)室壁的撓性以及集流腔容積與裝置容積的比率有關(guān)。壓力的降低最終取決于培養(yǎng)室的哪些表面是透氣性的。然而，集流腔隨著其容積減小而產(chǎn)生的無(wú)菌通風(fēng)可以更快地釋放壓力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，有許多方法將集流腔構(gòu)造成符合這些目標(biāo)，包括采用撓性壁、在徑向密封構(gòu)造中設(shè)置有O形圈的剛性壁、以及其它方法(包括Wilson的美國(guó)專利No.7,229,820中記載的)。
當(dāng)在使用期間培養(yǎng)基的溫度下降時(shí)，移動(dòng)集流腔壁62可能也是有利的。例如，胰島細(xì)胞的培養(yǎng)的初始溫度通常為37℃，然后降低至22℃。當(dāng)透氣多層裝置是封閉體且盛有培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)隨溫度下降而收縮。許多透氣材料是高撓性的。因此，當(dāng)培養(yǎng)基收縮時(shí)，所述裝置的壁會(huì)發(fā)生移動(dòng)，以保持與培養(yǎng)基的接觸。當(dāng)所述壁移動(dòng)，且細(xì)胞均勻地分布在壁上時(shí)，細(xì)胞會(huì)從均勻狀態(tài)移動(dòng)至不受控制的密度，并因此會(huì)損傷培養(yǎng)物的活力。因此，改變集流腔的容積以適應(yīng)培養(yǎng)基體積的降低可以防止細(xì)胞從其均勻狀態(tài)遷移。
如有需要，底腳135可以升高透氣多層裝置。底腳135使得氣體可到達(dá)裝置下側(cè)并且/或者防止劃傷第二壁120。底腳135可以是任何形式，裝置的上壁適于可將一個(gè)裝置以聯(lián)鎖方式放置在另一個(gè)裝置之上。
將培養(yǎng)室與一個(gè)以上的集流腔平行連接，可使氣體更容易被進(jìn)入裝置的液體置換。例如，當(dāng)一個(gè)集流腔被使用時(shí)，在培養(yǎng)基進(jìn)入集流腔的相反方向，氣體被置換。帶有一個(gè)集流腔的透氣多層裝置中，隨著培養(yǎng)室高度的降低，變得有必要傾斜該透氣多層裝置以加速氣體置換。形成附加的集流腔使得氣體能以培養(yǎng)基進(jìn)入裝置方向之外的方向置換，并可減低或消除傾斜的必要性，由此簡(jiǎn)化自動(dòng)流體處理。在測(cè)試裝置中，作了判定是否無(wú)需傾斜所述裝置就可以灌滿培養(yǎng)室的評(píng)估，當(dāng)集流腔中的培養(yǎng)基體積為測(cè)試裝置中總?cè)莘e的約7.0％時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)灌滿而無(wú)需傾斜。圖8A、圖8B和圖8C示出了采用兩個(gè)集流腔的一實(shí)施方式。圖8A示出了透氣多層裝置5，刪去了壁以暴露培養(yǎng)室20。氣體空間50位于培養(yǎng)室20之間。在該圖示中，氣體空間50為穿通透氣多層裝置5的整個(gè)主體的開(kāi)口。圖8B示出了透氣多層裝置5，有部分被刪去以暴露培養(yǎng)室20、第一壁110和集流腔60。圖8C和圖8C-1示出了圖8A中沿8C-8C線的剖視圖，露出了培養(yǎng)室20、氣體空間50和集流腔60。在該實(shí)施方式中，液體進(jìn)入通行口70并灌滿集流腔60和培養(yǎng)室20，氣體經(jīng)由培養(yǎng)室20的遠(yuǎn)端上的另一集流腔60和第二通行口70被置換。
培養(yǎng)室的高度可以改變，以提供更多的操作方式。例如，如果將胰蛋白酶的使用量減到最少，或增加培養(yǎng)基的高度，可能是有利的。圖8D和圖8E示出了一種構(gòu)造，其通過(guò)簡(jiǎn)單地由可打褶的撓性材料制作所述裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)室高度改變，使得培養(yǎng)室20的高度可以上升或下降。例如，界定氣體空間的外殼和/或材料可以是撓性的。這樣，透氣多層裝置可以膨脹，以使各培養(yǎng)室內(nèi)的容積更大或更小，這會(huì)有利于降低補(bǔ)料頻次、減少胰蛋白酶和/或PBS的使用、以及/或改變透氣表面積與培養(yǎng)室容積之比。在該圖示中，集流腔壁62是起皺的，但所述裝置可適于通過(guò)多種其它方式允許培養(yǎng)室高度的變化，包括美國(guó)專利No.7,229,820記載的方式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到實(shí)現(xiàn)這種特性的多種方式。
透氣多層裝置的優(yōu)化性能中的一種因素是使用期間培養(yǎng)室的朝向。在使用期間，透氣多層裝置最好應(yīng)該處于基本上水平的狀態(tài)，以使細(xì)胞均勻地分布到細(xì)胞培養(yǎng)表面上。培養(yǎng)室支撐架可以象圖5A所示的培養(yǎng)室支撐架40那樣簡(jiǎn)單。這樣，培養(yǎng)室支架40只提供簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)支撐以防止培養(yǎng)室互相坍縮。然而，根據(jù)構(gòu)成培養(yǎng)室的壁的材料的剛性，最好形成更加精心制作的培養(yǎng)室支架。例如，一些重要的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用最好在非常受控的幾何結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行，其涉及分布非常均勻細(xì)胞沉積物，如胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞和多能成體祖細(xì)胞(multipotent adult progenitor cell)的培養(yǎng)。例如，胰島細(xì)胞在高表面密度處接觸時(shí)會(huì)發(fā)生聚集，多能成體祖細(xì)胞如果它們互相之間太接近可能會(huì)發(fā)生分化。肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞還需要高的氣體傳輸速率來(lái)維持健康。因此，最堅(jiān)固的培養(yǎng)室支架應(yīng)該通過(guò)把有細(xì)胞向其沉降的壁保持在基本水平的狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)均勻分布，并且不會(huì)過(guò)度地限制氣體傳輸。為實(shí)現(xiàn)這些優(yōu)點(diǎn)，培養(yǎng)室支架應(yīng)與培養(yǎng)室的壁接觸。接觸點(diǎn)的數(shù)量、接觸點(diǎn)之間的距離和與培養(yǎng)室支架直接接觸的透氣材料的表面積的大小屬于設(shè)計(jì)所需考慮的因素。實(shí)施例1和實(shí)施例2提供了進(jìn)一步的指導(dǎo)。
雖然可以將培養(yǎng)室支架永久固定于透氣多層裝置，但并非必須這樣。當(dāng)使用者需要變換所述裝置以適合更加受控的應(yīng)用，或需要減低制造成本時(shí)，這樣做是較佳的。圖9A和圖9B示出了一種實(shí)施方式，其中培養(yǎng)室支架是可重復(fù)使用的，并且透氣多層裝置的主體是一次性的。在圖9A中，示出了培養(yǎng)室支架42從透氣多層裝置6分離。在圖9B中，培養(yǎng)室支架42被放置成與透氣多層裝置6接觸。突起部131從培養(yǎng)室支架42突出。突起部131的高度及它們之間的距離應(yīng)設(shè)計(jì)成它們可與透氣多層裝置的培養(yǎng)室充分接觸，以將細(xì)胞培養(yǎng)室保持在基本水平的狀態(tài)，使得能在接種期間實(shí)現(xiàn)均勻的細(xì)胞沉積。然而，與透氣表面的接觸會(huì)減少氣體傳遞量。因此，必須考慮實(shí)現(xiàn)水平狀態(tài)的期望和想要的氣體傳遞程度之間的平衡。根據(jù)被培養(yǎng)的細(xì)胞類型，可以有不止一種優(yōu)化設(shè)計(jì)。當(dāng)希望與環(huán)境條件更好地連通時(shí)，可以設(shè)置氣體通行開(kāi)口132。在沒(méi)有氣體通行開(kāi)口132時(shí)，氣體會(huì)在突出有突起部131的表面，例如表面133之間移動(dòng)，并且培養(yǎng)室氣體交換的阻力是突起部的數(shù)量、突起部的高度以及裝置寬度的函數(shù)。在該圖示中，為了說(shuō)明設(shè)計(jì)選項(xiàng)的多樣性，最上面的培養(yǎng)室的第一壁沒(méi)有處于被培養(yǎng)室支架42保持的狀態(tài)。如果培養(yǎng)室處于水平狀態(tài)，如果盛有流體或受壓流體，或者如果它(該第一壁)由剛性材料構(gòu)成，那種狀態(tài)是可以的。還有，培養(yǎng)室的第二壁120，如果其由剛性足夠的材料構(gòu)成而能在培養(yǎng)基處于其內(nèi)部的時(shí)候保持其形狀，就不必與培養(yǎng)室支架接觸。
培養(yǎng)室它們自身可構(gòu)造成能起到使得環(huán)境氣體可以與相鄰培養(yǎng)室連通的作用，同時(shí)保持期望的幾何結(jié)構(gòu)。Wilson等的美國(guó)專利No.5,693,537記載了具有突起部的壁可用于為培養(yǎng)室的相鄰的壁提供支撐。圖10為剖視圖，其提供了一個(gè)如何保持期望的形狀的例子。在該例子中，透氣多層裝置7的第一壁110由剛性材料形成，并且透氣第二壁120由如二甲基硅酮之類的撓性材料構(gòu)成。壁突起部150從第二壁120的表面突出，以保持氣體空間50。Wilson等的美國(guó)專利No.5,714,384示出了突起部可用于增加氣體傳遞的表面積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述突起部可從第二壁(或者從上壁和第二壁)的表面突出與相鄰培養(yǎng)室的第一壁接觸。作為選擇方式，從培養(yǎng)室的壁的外側(cè)表面突出的突起部可以在突起部之間互鎖，或者與培養(yǎng)室支架互鎖。在另一方式中，所有的壁可以是撓性的，并且它們能在培養(yǎng)基充入培養(yǎng)室時(shí)獲得期望的形狀。
給定培養(yǎng)室的上、下壁以及/或上下培養(yǎng)表面不應(yīng)相互接觸。例如，當(dāng)一培養(yǎng)表面是經(jīng)組織培養(yǎng)處理的，且與相對(duì)壁接觸，可能潛在地影響所述經(jīng)組織培養(yǎng)處理的表面，可以在培養(yǎng)室內(nèi)放置內(nèi)部隔離物來(lái)確保阻止接觸。內(nèi)部隔離物可以是任意生物相容材料，并且應(yīng)該設(shè)置成使得培養(yǎng)基和流體可以容易地移入和移出培養(yǎng)室。所述內(nèi)部隔離物無(wú)需是獨(dú)立部件，可以通過(guò)從上壁和/或下壁、以及/或者上培養(yǎng)表面和/或下培養(yǎng)表面突出的突起部，而實(shí)現(xiàn)在任意壁和/或培養(yǎng)表面之間保持希望的空間。圖11示出了示范性的例子，其中透氣多層裝置8的內(nèi)部隔離物160是從培養(yǎng)表面130或壁110突起的凸起部。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，內(nèi)部隔離物可通過(guò)多種方式構(gòu)造，只要那些方法不會(huì)阻止培養(yǎng)基進(jìn)入培養(yǎng)室或從培養(yǎng)室離開(kāi)。
當(dāng)培養(yǎng)室成豎向堆疊時(shí)，由于光線減少，對(duì)培養(yǎng)物中的細(xì)胞的顯微鏡觀察會(huì)受到妨礙。因此，如共同未決Wilson等的‘814，中記載的那樣，將培養(yǎng)室從堆疊中偏移，對(duì)于允許采用倒置顯微鏡可能是有用的。另一可選的方式是使所述氣體空間能夠接收光線，使得可以用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。為此，培養(yǎng)室之間的距離應(yīng)該足夠大，以使光源可以照亮最下面的培養(yǎng)室的內(nèi)容物。光強(qiáng)度取決于培養(yǎng)室的材料和培養(yǎng)基的高度。優(yōu)選使用透光性好的材料。
圖12示出了一種實(shí)施方式，其將培養(yǎng)室20串聯(lián)連接。通過(guò)通行口70輸送進(jìn)透氣多層裝置9的液體通過(guò)另一通行口70置換氣體，并且駐留在任意期望數(shù)量的培養(yǎng)室20內(nèi)。與環(huán)境氣體連通的氣體空間50處于培養(yǎng)室20之間，并鄰近透氣材料。在該圖示中，氣體空間50處于穿通透氣多層裝置9的整個(gè)主體的開(kāi)口中。
在一些情況下，例如當(dāng)各培養(yǎng)室含有不同的細(xì)胞類型或含有用于同一細(xì)胞類型的不同培養(yǎng)基組成時(shí)，可能期望個(gè)別地通向各培養(yǎng)室，即使它們被集成為同一裝置。可以有多種構(gòu)造來(lái)實(shí)現(xiàn)這種方式。優(yōu)選地，與各培養(yǎng)室的通路被構(gòu)造成使得可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的液體操作方法(如移液或灌注)或者無(wú)菌或封閉體系方法(如隔膜或無(wú)菌管件連接)來(lái)實(shí)現(xiàn)這種方式。圖13示出了一種選擇。在該以隔膜形式示出的圖示中，可通過(guò)通行口70個(gè)別地通向透氣多層裝置10的培養(yǎng)室20。一個(gè)或多個(gè)通行口70與各培養(yǎng)室20連接。在該圖示中，氣體空間50被設(shè)置成使得使用者可以將該氣體空間與環(huán)境氣體連通，或阻止與環(huán)境氣體連通。氣體空間50由氣體空間外殼51封閉。氣體空間外殼51中的氣體空間通行開(kāi)口55使得氣體空間50可以與周圍環(huán)境連通。氣體空間通行開(kāi)口55可構(gòu)造成根據(jù)需要開(kāi)啟和閉合。對(duì)氣體空間50和環(huán)境氣體之間的氣體運(yùn)動(dòng)有選擇地進(jìn)行終止、限制或開(kāi)啟這樣的功能，可能是有用的。這種特征可存在于任意實(shí)施方式。例如，當(dāng)透氣多層裝置臨時(shí)從CO2環(huán)境移出時(shí)，關(guān)閉或限制氣體空間通行開(kāi)口55可防止或延緩pH的變化。在另一例子中，給定細(xì)胞系的細(xì)胞可放置在各培養(yǎng)室中，與給定培養(yǎng)室連通的氣體空間可注入預(yù)定氧濃度，該氣體空間可以封閉，且可以對(duì)各種氧濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或功能的影響進(jìn)行研究。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，有很多種用于開(kāi)啟或關(guān)閉氣體空間通行開(kāi)口55的方法，包括魯爾(luer)接頭和塞子、端口和蓋子等。
圖14示出了透氣多層裝置的另一實(shí)施方式，該裝置被設(shè)置成，當(dāng)該裝置從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)箱取出以在福樂(lè)罩(flow hood)中進(jìn)行液體操作時(shí)，可以限制pH變化的速度。氣體空間外殼51封閉透氣多層裝置11的氣體空間50。通過(guò)在從培養(yǎng)箱取出之前關(guān)閉開(kāi)口55的氣體通行蓋53，可以將氣體空間50與環(huán)境氣體隔離，從而在氣體空間50內(nèi)保留期望的CO2水平。優(yōu)選地，氣體空間50內(nèi)的氣體容量足以支撐氣體通行蓋53關(guān)閉期間培養(yǎng)物的氧需求。因此，所述裝置中的細(xì)胞或組織的數(shù)量以及氧需求，是確定最佳容量時(shí)需要考慮的。
圖15示出了透氣多層裝置的另一實(shí)施方式，該裝置被設(shè)置成，當(dāng)該裝置從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)箱取出以在福樂(lè)罩(flow hood)中進(jìn)行液體操作時(shí)，可以限制pH變化的速度。這種情況下，氣體空間50沿該透氣多層裝置的一側(cè)向環(huán)境氣體開(kāi)放。氣體交換控制緣57從透氣多層裝置12的該側(cè)延伸，在該圖示中作為氣體空間外殼51的結(jié)構(gòu)件。當(dāng)透氣多層裝置12朝向?yàn)椋沟脷怏w交換控制緣57與平坦表面，例如層流罩的底板平齊時(shí)，氣體空間50和環(huán)境氣體之間的氣體交換被終止或基本上被限制，以此降低pH變化速度。當(dāng)透氣多層裝置不具有控制pH變化的結(jié)構(gòu)并且從培養(yǎng)箱被移出時(shí)，使pH變化速度最小化的另一種簡(jiǎn)單的方法是，將其放置于密閉空間，例如帶蓋的箱體內(nèi)。為提供該優(yōu)點(diǎn)，所述蓋不必是氣密性的。只要所述蓋和箱體之間的氣體通道的剖面開(kāi)口小于氣體空間和環(huán)境氣體之間的剖面開(kāi)口，就會(huì)產(chǎn)生對(duì)氣體交換速度的限制以及pH變化的延緩。當(dāng)透氣多層裝置位于箱體內(nèi)部時(shí)，箱體內(nèi)的氣體體積應(yīng)該減到最小。而且，在將透氣多層裝置放入箱體內(nèi)之前，可對(duì)箱體做預(yù)先處理，使其包含培養(yǎng)箱的氣體組成。
新的透氣多層裝置允許在傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中不可能的操作方式。例如，細(xì)胞可從一層擴(kuò)展到其它層。接種、擴(kuò)展和收集粘附細(xì)胞這樣的循環(huán)(其不受剩余的胰蛋白酶的不利影響)，提供了該封閉體系過(guò)程如何發(fā)揮功能的一個(gè)例子。圖16A示了透氣多層裝置13的剖視圖，培養(yǎng)基80和細(xì)胞處于其下層培養(yǎng)室20內(nèi)。為了將粘附細(xì)胞擴(kuò)展至如圖16B所示的多個(gè)培養(yǎng)室內(nèi)，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作順序。首先，移除培養(yǎng)基80。然后將PBS引入下層培養(yǎng)室以沖洗殘留培養(yǎng)基。隨后移除PBS。然后，將胰蛋白酶或任意其它脫壁材料(detachment material)引入下層培養(yǎng)室，以從附著表面釋放細(xì)胞。然后，可通過(guò)加入培養(yǎng)基80將細(xì)胞再分布到上培養(yǎng)室，這將胰蛋白酶稀釋至不會(huì)影響細(xì)胞附著的水平。如果細(xì)胞受到任何殘留胰蛋白酶的影響，可以移除細(xì)胞并用常規(guī)手段離心出殘留的胰蛋白酶。然后，可將細(xì)胞再引入到適當(dāng)體積的培養(yǎng)基中，使得它們駐留在期望數(shù)量的培養(yǎng)室內(nèi)。對(duì)于懸浮細(xì)胞，只要添加適量體積的培養(yǎng)基就可以容易地?cái)U(kuò)展至另外的培養(yǎng)室。這樣，相對(duì)傳統(tǒng)的多層培養(yǎng)瓶，可以將用來(lái)形成接種物的輔助裝置的采用最少化。由于透氣多層裝置可設(shè)置成適合密閉的體系通路(closedsystem access)，也可以降低污染的可能性。
細(xì)胞駐留于側(cè)壁表面上的能力也可形成優(yōu)點(diǎn)，所述優(yōu)點(diǎn)包括使細(xì)胞從具有一尺寸的表面區(qū)域擴(kuò)展到尺寸更大的表面上的能力。例如，當(dāng)通過(guò)使透氣多層裝置定向成如圖5C所示的狀態(tài)，可利用少量的接種物開(kāi)始培養(yǎng)，該接種物將駐留在壁126附近。然后，當(dāng)培養(yǎng)物的數(shù)量擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)將所述裝置重新定向至圖5B的狀態(tài)，可以獲得更多的表面積。如果需要，細(xì)胞可以在重定向前從壁126被胰蛋白酶化以增加表面積。如果需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可再對(duì)所述裝置進(jìn)行重新定向至圖5A的狀態(tài)。接著，通過(guò)前面段落描述的方法可以進(jìn)一步擴(kuò)增。
通常與細(xì)胞培養(yǎng)裝置或醫(yī)療器械相關(guān)的任意材料可用于遍及所述透氣多層裝置。優(yōu)選地，選用的材料符合USP(美國(guó)藥典)VI和/或ISO 10993的相容性標(biāo)準(zhǔn)。還有，最好具有透光性，因?yàn)檫@使得可以對(duì)污染和pH進(jìn)行目視檢測(cè)。為了形成可以通過(guò)倒置型顯微鏡觀察的表面，優(yōu)選SPE 2(球概率誤差2)或更高。
用于使得氣體可以傳遞進(jìn)/出透氣多層裝置透氣材料的透氣材料可由透氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置所使用的，或者如前面記載的用于透氣細(xì)胞培養(yǎng)裝置的任意膜、薄膜、材料或所用材料的組合構(gòu)成，例如硅酮、氟乙烯聚丙烯(flouroethylenepolypropylene)、聚烯烴、聚苯乙烯薄膜，以及乙烯-醋酸乙烯共聚物?？梢垣@得很多用來(lái)了解透氣材料及其細(xì)胞培養(yǎng)中的用途的指南資料，包括但不限于美國(guó)專利No.5,693,537、美國(guó)專利No.6,455,310、美國(guó)專利No.6,297,046、國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)WO 01/92462和共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/961,814。其它的信息來(lái)源可以在Plastic Design Library，William Andrew Publishing，“Permeability and Other Film Properties ofPlastics and Elastomers”，1995中找到。本說(shuō)明書(shū)通篇使用的詞語(yǔ)硅酮包括美國(guó)專利No.6,045,877中記載的制劑。
如Wilson等的美國(guó)專利5,693,537記載，透氣材料可以是透液性材料。這些材料包括其整個(gè)橫截面為親水性的膜，例如由纖維素、醋酸纖維素和再生纖維素構(gòu)成的膜。然而，在評(píng)價(jià)這些材料的效用的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)最好采取防止污染的措施，這在Wilson等的‘537沒(méi)有預(yù)期。應(yīng)小心確保選用的材料的透液性足夠的低，以在培養(yǎng)室內(nèi)保持期望體積的培養(yǎng)基。而且，液體損失會(huì)使摩爾滲透壓濃度升高到有害的水平。優(yōu)選地，在給定的培養(yǎng)基靜壓力條件下，在補(bǔ)料間隔期，選用的材料能夠?qū)⒋笥诩s90％的培養(yǎng)基體積保持在培養(yǎng)室內(nèi)。在補(bǔ)料期間，摩爾滲透壓濃度得以恢復(fù)。在補(bǔ)料間隔為兩天的情況下，由靜壓力導(dǎo)致的液體損失因此最好應(yīng)該限制于培養(yǎng)裝置內(nèi)的培養(yǎng)基體積每天損失的比率小于約5％。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基體積為每cm2膜至少對(duì)應(yīng)10.16ml培養(yǎng)基的情況下，截留分子量為10,000的80M

膜是可以接受的材料。所述材料可以是薄的且能提供充分的氣體傳遞。在由Wilson Wolf Manufacturing制造的CELLine CL1000細(xì)胞培養(yǎng)器產(chǎn)品中進(jìn)行的試驗(yàn)中，使用由80M

構(gòu)成的低透氣材料，證明了在其上培養(yǎng)至少400×106個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞的能力。除了不使用80M

作為低透氣膜，所述裝置的所有其它方面與市售產(chǎn)品相同，其集成了不透液的透氣膜。在該試驗(yàn)中，表面密度至少為4×106個(gè)細(xì)胞/cm2透氣膜。然而，雖然在培養(yǎng)室內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到污染，但膜外側(cè)被污染了。因此，用透氣透液材料制造透氣多層裝置最好應(yīng)該通過(guò)采用由無(wú)菌過(guò)濾器保護(hù)的、通向氣體空間的氣體空間通路開(kāi)口來(lái)限制通向氣體空間的通路?？梢圆捎猛ǔＳ糜诜乐刮廴镜娜我馔笟膺^(guò)濾材料，例如微孔膜。為了最大程度地防止污染，孔徑可以在0.45μm以下，最好為0.2μm。然而，采用透氣透液材料并不限于僅僅是所述透氣多層裝置的實(shí)施方式。其它透氣結(jié)構(gòu)，包括象例如OpticellTM產(chǎn)品(在美國(guó)專利No.6,821,772中有部分記載)那樣簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，可以集成至少一種透氣透液膜(例如

)。作為其它例子，通過(guò)配置包括與兩透析膜或任一透析膜接觸的氣體空間的優(yōu)選結(jié)構(gòu)，并通過(guò)采用由無(wú)菌過(guò)濾器保護(hù)的通向氣體空間的氣體空間通路開(kāi)口，通常與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(美國(guó)專利No.5,503,741)可以作為培養(yǎng)裝置使用。
當(dāng)將透氣多層裝置設(shè)置成，其可被定向成其中培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的第一狀態(tài)，或者其可被定向成其中培養(yǎng)粘附細(xì)胞的另一狀態(tài)時(shí)，構(gòu)造透氣多層裝置的優(yōu)選設(shè)置應(yīng)該使得細(xì)胞培養(yǎng)室的一個(gè)培養(yǎng)表面是疏水的，而另一表面是親水的?？赏ㄟ^(guò)任意的剖視圖來(lái)闡述實(shí)例。例如，參考圖4，第一壁110可以是透氣的且其內(nèi)表面可以經(jīng)組織培養(yǎng)處理以形成一培養(yǎng)表面，而第二壁120的內(nèi)表面可以是疏水的，以形成另一培養(yǎng)表面。因此，為培養(yǎng)粘附細(xì)胞，操作透氣多層裝置時(shí)可以使第一壁110位于第二壁120下方。因此，為培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，操作透氣多層裝置時(shí)可以使第二壁120位于第一壁110下方。如果粘附細(xì)胞附著于第一壁110，然后對(duì)裝置重新定向以使懸浮細(xì)胞可以處于第二壁120上，可以進(jìn)行共培養(yǎng)。可用于其上培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的材料為硅酮，可用于在其上培養(yǎng)粘附細(xì)胞的典型材料為經(jīng)組織處理的聚苯乙烯。因此，在本實(shí)例中，優(yōu)選的實(shí)施方式可以是，第二壁120由硅酮構(gòu)成，而第一壁110的培養(yǎng)表面由經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯構(gòu)成。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果使用硅酮，其會(huì)在伽馬輻射或電子束殺菌期間發(fā)生遷移，并且覆蓋培養(yǎng)室內(nèi)經(jīng)組織處理的表面。這使得該經(jīng)組織處理的表面變得不是最適合粘附細(xì)胞。因此，在存在該最有用的材料時(shí)，常用的滅菌方法變得不實(shí)用。其它的滅菌方法也會(huì)有問(wèn)題。例如，ETO(環(huán)氧乙烷)會(huì)保留在硅酮中，且不經(jīng)很大范圍的毒素沖洗，就會(huì)存在對(duì)細(xì)胞有害的環(huán)境?；瘜W(xué)手段滅菌也需要沖洗。通過(guò)向硅酮添加色素、和/或改變固化溫度和時(shí)間、和/或?qū)⒐柰A(yù)先暴露于高劑量的伽馬輻射、和/或改變硅酮至聚苯乙烯的距離來(lái)解決問(wèn)題的努力并沒(méi)有消除問(wèn)題。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在使所述裝置經(jīng)受伽馬輻射之前用等離子體充硅酮，并可以將硅酮遷移到聚苯乙烯表面上的問(wèn)題減到最小或者消除該問(wèn)題。因此，在存在經(jīng)組織培養(yǎng)處理的表面(優(yōu)選聚苯乙烯)的情況下，采用硅酮的優(yōu)選工藝是，確保在伽馬輻射之前對(duì)硅酮充等離子體。這種形成細(xì)胞培養(yǎng)裝置的方法不限于透氣多層裝置。這種方法使得任意透氣培養(yǎng)裝置可以在存在經(jīng)組織處理表面的情況下集成充有等離子體的硅酮，其好處是可以防止硅酮在使用如伽馬輻射或電子束之類的傳統(tǒng)滅菌方法期間發(fā)生遷移。例如，通過(guò)在存在處理表面的情況下采用充有等離子體硅酮，對(duì)Wilson等的‘814或美國(guó)專利No.6,821,772中記載的裝置是有益的。例如，市售的OpticellTM產(chǎn)品可以集成一經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯表面和相對(duì)的由充有等離子體硅酮構(gòu)成的透氣表面。這樣，當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法滅菌時(shí)，可以在由硅酮構(gòu)成的表面上培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，并且/或者可以在由聚苯乙烯構(gòu)成的表面上培養(yǎng)粘附細(xì)胞。該產(chǎn)品能將膜之間的慣常距離整合在一起，就像現(xiàn)在的情況，或者將如Wilson等的‘814記載的增加的距離整合在一起。
圖17A示出了由硅酮成型的培養(yǎng)室，其使導(dǎo)致泄漏的連接件數(shù)量最少。采用二甲基硅酮是有利的，因?yàn)樗梢猿尚统蓮?fù)雜的幾何樣式，并且這對(duì)許多懸浮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用是有益的。培養(yǎng)室20’包括法蘭21。在該構(gòu)造中，可以省去壁交叉處的連接件。這樣，它是一體化培養(yǎng)室，其可以進(jìn)行模塊化裝置設(shè)計(jì)。法蘭21可以膠粘到其它硅酮表面，或固定于任意表面，從而可制成一連串培養(yǎng)室用于裝配至集流腔壁?；蛘?，一連串的培養(yǎng)室可以預(yù)制，以裝配到集流腔壁，所述裝配至集流腔壁通過(guò)下述方法進(jìn)行在法蘭前面設(shè)置剛性板，在法蘭后面設(shè)置剛性板，將這些剛性板連接在一起，然后將該子配件裝配至集流腔壁。在裝配之前，可以在培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)置任意替換的培養(yǎng)表面。該一體化培養(yǎng)室不必限于只有一個(gè)培養(yǎng)室?？梢詫⒁粋€(gè)以上的培養(yǎng)室成型為整體件以形成也可以進(jìn)行模塊化裝配的一體化培養(yǎng)室。雖然對(duì)于高需求的培養(yǎng)，氣體傳遞區(qū)域中的厚度希望優(yōu)選為小于或等于約0.022英寸，更優(yōu)選地小于或等于0.010英寸，且最好小于約0.008英寸，當(dāng)細(xì)胞沒(méi)有呈現(xiàn)出高的氧需求時(shí)，更大的厚度也是可以采用的。在制造過(guò)程中，較厚的硅酮截面可能是有利的。通常，硅酮越厚，其越容易制造。然而，上壁和下壁為約0.007英寸厚的一體化的二甲基硅酮培養(yǎng)室是可以制造的。側(cè)壁為約0.004英寸厚的一體化的二甲基硅酮培養(yǎng)室也是可以制造的。雖然圖中示出了不止一個(gè)法蘭，但一體化培養(yǎng)室不必有一個(gè)以上的法蘭。因此，當(dāng)希望只有一個(gè)集流腔時(shí)，培養(yǎng)室的一端可以封死。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，所有培養(yǎng)室模制成整體件，該整體件帶有可固定于集流腔壁的共用法蘭。圖17B示出了一體化培養(yǎng)室20”，其是包括法蘭152的一連串成型的透氣材料培養(yǎng)室(最好是二甲基硅酮)。作為法蘭支承件的塑料(例如聚碳酸酯)剛性件可直接成型(即，包覆成型)到法蘭上，以作為后續(xù)進(jìn)一步裝配的墊板。在該圖示中，法蘭支承件153包覆成型到各法蘭152上。如圖17C的分解裝配圖所示，法蘭支承件153以液體不能滲透的方式配合至集流腔壁62，以形成位于培養(yǎng)室各端部的集流腔。在評(píng)價(jià)將二甲基硅酮粘結(jié)至剛性塑料的能力時(shí)，獲得二甲基硅酮和生物相容性聚碳酸酯之間的不透液粘結(jié)。所述聚碳酸酯材料放置于模具中，并將硅酮以液體注射成型工藝直接配合至所述聚碳酸酯?？梢约尤肱囵B(yǎng)室支架，所述支架可以是例如本文記載的和/或圖10和圖11所示的任意結(jié)構(gòu)。如果形成為如圖11所示的那樣，突起部可以是延伸穿越整個(gè)培養(yǎng)室的肋部。在圖17C的圖示中，存在一系列培養(yǎng)室支架42’。對(duì)于多種懸浮細(xì)胞而言，這是一種有用的構(gòu)造，甚至不需要通過(guò)引入培養(yǎng)表面作進(jìn)一步改造。然而，增加培養(yǎng)表面仍然是可選方式。當(dāng)預(yù)定的應(yīng)用可能包括使用粘附細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選地，硅酮的內(nèi)表面覆蓋有適合被培養(yǎng)細(xì)胞類型的典型粘附表面。對(duì)多種粘附細(xì)胞而言，插入經(jīng)組織處理的聚苯乙烯作為培養(yǎng)表面可能是有利的。這使得可以進(jìn)行多種培養(yǎng)方式。例如，為培養(yǎng)粘附細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩者，所述裝置可定向成使得粘附細(xì)胞可以沉降到經(jīng)組織處理的培養(yǎng)表面，并且在附著后，旋轉(zhuǎn)180度以使懸浮細(xì)胞可以駐留在相對(duì)的硅酮壁上。
如果圖17的構(gòu)造希望形成為包括經(jīng)組織處理培養(yǎng)表面而非硅酮，通過(guò)用不同的培養(yǎng)表面覆蓋所有硅酮內(nèi)表面，對(duì)硅酮充等離子體以防止電子束或伽馬滅菌期間的遷移能夠避免。例如，可插入薄的經(jīng)組織處理聚苯乙烯，使其覆蓋全部硅酮。當(dāng)集流腔壁不是會(huì)發(fā)生遷移的材料時(shí)，經(jīng)處理聚苯乙烯表面將保持為適合粘附性培養(yǎng)物。雖然所述培養(yǎng)表面(本實(shí)例中為聚苯乙烯)提供了供細(xì)胞附著的表面，與假如它只是硅酮的情況相比，它會(huì)阻止氣體傳遞進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)室。因此，期望細(xì)胞駐留其上的培養(yǎng)表面(或多個(gè)表面)應(yīng)該是薄的，以使氣體傳遞仍然是充分的。優(yōu)選地，在細(xì)胞駐留其上的聚苯乙烯區(qū)域的厚度為約0.003英寸或更薄。這種方式減少了連接件的數(shù)量并降低了滲漏的可能性，同時(shí)提供適合任意給定應(yīng)用的培養(yǎng)表面。
圖18C、圖18D和圖18E示出了另一實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)，其使得培養(yǎng)室可以部分地盛有培養(yǎng)基，并且/或者使胰蛋白酶、PBS或任意其它與從細(xì)胞室移除細(xì)胞有關(guān)的液體的體積最小。在該實(shí)施方式中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)被直接整合至傳統(tǒng)的多層培養(yǎng)瓶(諸如NUNCTM Cell Factory、NUNCTM TripleFlask和

)的形式。圖18A是NUNCTM在網(wǎng)站上的示圖，描繪了它們的Cell Factory for Active Gassing的運(yùn)行，其期望克服氣體組成不均勻的問(wèn)題。該氣體處理系統(tǒng)使工藝復(fù)雜化，其需要管道連接件、無(wú)菌過(guò)濾器、獨(dú)立的氣體供給和備用的增濕過(guò)程，因?yàn)楦稍餁怏w混合物的持續(xù)流動(dòng)會(huì)使培養(yǎng)基很快蒸發(fā)，并使摩爾滲透壓濃度增加到影響細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的水平。圖18B是圖18A的NUNCTM方式的放大圖，具有表示強(qiáng)制氣流的箭頭，并標(biāo)出了壁224和222以供參考。該透氣多層培養(yǎng)瓶可以解決氣體組成不均勻的問(wèn)題，而不需要傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶必須的輔助設(shè)備或強(qiáng)制氣流。圖18C、圖18D和圖18E所示的實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是，它們可以集成傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶(例如市售的培養(yǎng)瓶，以及例如美國(guó)專利No.5,310,676、美國(guó)專利No.6,569,675和英國(guó)專利說(shuō)明書(shū)GB 1539263A中記載的那些培養(yǎng)瓶)的結(jié)構(gòu)特征，包括使得培養(yǎng)基可以等量地被分配至各層的任意或全部結(jié)構(gòu)特征。圖18C示出了透氣多層培養(yǎng)瓶200的實(shí)施方式，其中無(wú)需傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶必需的輔助裝置或強(qiáng)制氣流就可以實(shí)現(xiàn)均勻的培養(yǎng)條件。至少壁224和/或壁222的一部分是透氣的，允許氣體空間250與環(huán)境氣體之間的氣體連通。傳統(tǒng)培養(yǎng)室可位于該裝置內(nèi)，優(yōu)選地，具有由聚苯乙烯構(gòu)成的培養(yǎng)層220。培養(yǎng)室壁220被構(gòu)造成處在傳統(tǒng)的高度以保持培養(yǎng)基和細(xì)胞，使得，作為在培養(yǎng)基80和氣體空間250之間的界面氣體傳遞的結(jié)果，細(xì)胞90接收氧。集流腔260可構(gòu)造成如在傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中那樣。對(duì)于透氣材料而言，二甲基硅酮是好的選擇，因?yàn)槠淇梢砸后w注射成型成殼體，或者，其可以包覆成型到如聚碳酸酯之類的剛性壁上。然而，如前所述，在預(yù)期使用伽馬輻射的情況下，硅酮應(yīng)該是充有等離子體。優(yōu)選地，壁的透氣面積以相等的幾何關(guān)系分布于各培養(yǎng)室，從而使得各培養(yǎng)室可以獲得相等的氣體傳遞。換言之，各培養(yǎng)室與透氣材料的間距應(yīng)該相等。在透氣材料區(qū)域，可以設(shè)置防止損壞的保護(hù)裝置和結(jié)構(gòu)支架，只要提供這些特性的構(gòu)件允許氣體可以通向氣體空間。因此，可選用的側(cè)壁支架240起到該功能。其由氣體通行開(kāi)口242和/或突起部241構(gòu)成。優(yōu)選地，側(cè)壁支架是剛性的透明材料。
圖18D示出了另一種消除對(duì)強(qiáng)制通氣的需求的方式，在傳統(tǒng)多層裝置中，強(qiáng)制通氣是作為一種提供均勻培養(yǎng)條件的方式。該構(gòu)造將透氣材料集成在裝置本體內(nèi)。氣體空間251是穿過(guò)透氣多層裝置201的至少一部分本體的開(kāi)口。因此，氣體空間251由上氣體空間壁210和下氣體空間壁215限定。它可以是貫穿整個(gè)本體的開(kāi)口，類似于圖8A和圖8B示出的圖示。它不需要完全穿過(guò)裝置，而可以在裝置內(nèi)終止。它的任意壁可以是透氣的。然而，上氣體空間壁210不必是透氣的來(lái)克服傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。當(dāng)氣體空間251的任意其它壁由透氣材料構(gòu)成時(shí)，就可解決該問(wèn)題。例如，氣體空間壁210可以是聚苯乙烯，其厚度不提供足夠的氣體傳遞，只要?dú)怏w空間251的至少其它一個(gè)壁或幾個(gè)壁由確實(shí)提供足夠氣體傳遞的材料構(gòu)成。在裝置本體內(nèi)均衡的區(qū)域進(jìn)行氣體傳遞，為利用氣液界面進(jìn)行氣體交換的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)提供了比傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶更加均勻的氣體環(huán)境。透氣多層裝置不需要僅以傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的方式操作。如果上氣體空間壁210由透氣材料構(gòu)成，氣體傳遞可獨(dú)立于氣液界面而進(jìn)行。上氣體空間壁210可與側(cè)壁225緊密配合以形成細(xì)胞培養(yǎng)室。然后，例如，如果期望增加培養(yǎng)基高度以將補(bǔ)料頻次減到最少或延緩由蒸發(fā)引起的摩爾滲透壓濃度的變化，可將培養(yǎng)基加至任意期望高度，只要培養(yǎng)室側(cè)壁225的高度相應(yīng)增加，如Wilson等的‘314記載。
圖18E示出了改造傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶形成透氣多層培養(yǎng)瓶的圖示，該透氣多層培養(yǎng)瓶設(shè)有透氣壁，當(dāng)通過(guò)裝置的側(cè)壁發(fā)生氣體傳遞時(shí)，該透氣壁供細(xì)胞駐留其上。與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶相比，這提供了為培養(yǎng)方法提供了更多的選擇，并解決了培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。透氣多層培養(yǎng)瓶202設(shè)置為它的壁(如側(cè)壁224和222)的至少一部分由透氣材料構(gòu)成。如果需要，透氣區(qū)域應(yīng)該象圖18C描述的那樣被支撐。再參見(jiàn)圖18E，培養(yǎng)室底部245由透氣材料構(gòu)成，并最好由培養(yǎng)室支架243支撐，所述支架可包括突起部241和/或氣體通行開(kāi)口242。培養(yǎng)室壁225可以是允許培養(yǎng)基80處于期望高度所需的任意高度。集流腔260可構(gòu)造成如傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶那樣。
實(shí)施例 實(shí)施例1和實(shí)施例2評(píng)估了培養(yǎng)室支架的交替幾何結(jié)構(gòu)，以定量地表明透氣多層培養(yǎng)瓶可以解決傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的對(duì)貨運(yùn)、滅菌、存儲(chǔ)、培養(yǎng)箱和處理空間的資源利用過(guò)多的問(wèn)題，同時(shí)將存在不均勻培養(yǎng)條件的可能性降到最低。
實(shí)施例3記載了伽馬輻射之前充有等離子的硅酮能限制或防止其遷移到經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯表面，以此使得硅酮和經(jīng)組織培養(yǎng)處理的塑料可以共存在同一培養(yǎng)室內(nèi)而仍可利用標(biāo)準(zhǔn)滅菌工藝。
實(shí)施例1 用于氧需求非常高的培養(yǎng)物的培養(yǎng)室支架結(jié)構(gòu) 通過(guò)構(gòu)建試驗(yàn)裝置來(lái)展示培養(yǎng)室支架的物理結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以改善胰島細(xì)胞培養(yǎng)(已知是氧需求最高的類型之一)，所述裝置的下壁由測(cè)得的平均厚度為0.0072英寸、表面積為98cm2的成型二甲基硅酮片構(gòu)成。MOCON(Minneapolis，MN)利用他們的Oxtran 2/21 Instrument，根據(jù)美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)ASTM-1927測(cè)得的二甲基硅酮橡膠的透氣率在37℃時(shí)約為14,300mlO2/100in2/24hours。支撐二甲基硅酮的培養(yǎng)室由與所述硅酮直接接觸的0.048cm厚、46％敞口格網(wǎng)構(gòu)成。敞口格網(wǎng)由一組聚丙烯線構(gòu)成，所述聚丙烯線各自的直徑為0.018-0.020英寸，呈垂直和水平排列，使得每英寸水平距離以及每英寸垂直距離有16股線。所述格網(wǎng)由厚度為0.19cm的聚碳酸酯成型塑料板保持在其位置上，具有均勻分布的突起，所述突起將格網(wǎng)架高在所述片上方，使得氣體空間位于所述膜下面。各突起部為統(tǒng)一的“Y”形，而“Y”的各個(gè)邊成120度分開(kāi)。各個(gè)邊的長(zhǎng)度為0.45cm，且寬度為0.127cm。因此，各突起部的、可用于支撐格網(wǎng)的表面積為約0.175cm2。每cm2上有約1.1個(gè)突起部。因此，可用于支撐格網(wǎng)的突起部的累積表面積為約18.87cm2。各突起部自塑料板起的高度為0.127cm。氣體空間處于硅酮底部和塑料板頂部之間。被突起部取代的累積氣體體積為2.4cm3。被格網(wǎng)取代的累積氣體體積為2.54cm3。因此，處于硅酮膜下方并處于塑料板上方的氣體為約17.2ml。處于硅酮膜下方并處于塑料板上方的氣體與透氣膜表面積之比為17.6％。內(nèi)塑料板包括作為氣體通行開(kāi)口的通孔(各通孔的截面定向?yàn)榕c塑料板的平面垂直)，使得環(huán)境氣體可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散與氣體空間連通。位于所述表面積為98cm2的二甲基硅酮下面的五個(gè)均勻隔開(kāi)的通孔(各孔具有0.29cm2的截面積和0.075英寸的長(zhǎng)度)，形成1.45cm2的累積截面積。因此，通孔的截面積與硅酮膜的截面積的比率為1.45cm2/98cm2，或約1.48％。從而，通孔的截面積與處于硅酮膜和塑料板的上表面之間的氣體體積的比率為1.45cm2/17.2ml，或約8.4％。足部高出塑料板底部0.51cm。因此，位于硅酮膜下面的培養(yǎng)室支架的總高度為0.87cm。
下述定義和縮略語(yǔ)用于理解胰島細(xì)胞的評(píng)估 培養(yǎng)瓶對(duì)照依賴于氣液界面獲得氧的裝置，最大接種200 IE/cm2，IE與培養(yǎng)基之比為1000IE/ml，得到0.2cm 的最大培養(yǎng)基深度。該對(duì)照用于將GP裝置(透氣裝 置)與培養(yǎng)瓶中的標(biāo)準(zhǔn)胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法作比較。
GP裝置試驗(yàn)裝置，其底部由包括表面積98cm2的透氣二甲基 硅酮構(gòu)成并由如實(shí)施例1和實(shí)施例2中記載的結(jié)構(gòu)支 撐。
IE(胰島細(xì)胞當(dāng)量) 胰島細(xì)胞體積的度量，等于直徑150μm胰島細(xì)胞的體 積。作為具有剛剛分離的胰島皺褶的脈管系統(tǒng)，其體 積下降且其密度增加。因此，在第0天和第2天，IE 具有相同的體積，質(zhì)量不同。
由DNA計(jì)量的IE 或DNA IE 胰島細(xì)胞質(zhì)量的直接度量，等于11.4ng DNA。
IE人工計(jì)數(shù)IE數(shù)量傳統(tǒng)地由人工計(jì)數(shù)，這種方式不考慮胰島細(xì)胞 的平坦度和密度。對(duì)于18例豬胰島分離物，第0天 通過(guò)DNA計(jì)量的IE為人工計(jì)數(shù)IE的63±12％(范圍 為49-93％)。數(shù)量通常隨培養(yǎng)物中胰島細(xì)胞體積的下 降而減小，但情況并非總是如此，因?yàn)槿斯び?jì)數(shù)易于 出錯(cuò)。除非另有注明，IE指?jìng)鹘y(tǒng)地由人工計(jì)數(shù)的IE。
胰島細(xì)胞比活力存活胰島細(xì)胞量的比 胰島細(xì)胞表面密度 在給定表面積上培養(yǎng)的胰島細(xì)胞的體積，用IE/cm2 表示。150μm直徑的胰島細(xì)胞的合流方陣列具有4444 IE/cm2。
培養(yǎng)基稀釋度 培養(yǎng)基體積與駐留在裝置內(nèi)的胰島細(xì)胞數(shù)量的比例，用 μl/IE表示。
非GP裝置 一種對(duì)照裝置，具有與GP裝置相同的幾何結(jié)構(gòu)，但是 沒(méi)有透氣膜(用作試驗(yàn)對(duì)照，具有與GP裝置相同的培 養(yǎng)條件，以定量分析透氣膜結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn))。
豬分離 采用Ricordi法(Ricordi Method)從豬胰腺獲得胰島細(xì) 胞的過(guò)程。
OCR氧消耗速率，以nmol/min表示。活胰島細(xì)胞量的度 量。
OCR/DNA每DNA含量的OCR，以nmol/min·mg DNA表示。
p值報(bào)告的p值針對(duì)雙尾配對(duì)Student t檢驗(yàn)。
回收 在后來(lái)時(shí)間仍存在胰島細(xì)胞屬性(例如，DNA、IE、OCR) 的比例。
利用豬胰島細(xì)胞進(jìn)行初始評(píng)估，以確定需要什么樣的培養(yǎng)基體積對(duì)IE的比率。豬胰島細(xì)胞在二甲基硅酮表面積為18cm2的小型GP裝置內(nèi)于37℃培養(yǎng)2天，在200IE/cm2下，1μl/IE和4μl/IE的培養(yǎng)基稀釋度沒(méi)有表現(xiàn)出胰島細(xì)胞活力(通過(guò)OCR/DNA評(píng)估)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于5例豬分離樣，4μl/IE時(shí)的OCR/DNA是1μl/IE時(shí)的97.5％～102.4％，綜合平均值為101％?；谠摪l(fā)現(xiàn)，采用1μl/IE的培養(yǎng)基稀釋度進(jìn)行實(shí)施例1和實(shí)施例2中記載的批量評(píng)估。
在一系列試驗(yàn)中使用來(lái)自10例豬分離物的胰島細(xì)胞，其主要目的是確定在GP裝置內(nèi)是否可以達(dá)到超過(guò)常規(guī)方法的、范圍為約1000IE/cm2～2551IE/cm2(人工計(jì)數(shù))(DNA計(jì)數(shù)為490IE/cm2～2551IE/cm2)表面密度，而與小于約200IE/cm2(人工計(jì)數(shù))的常規(guī)表面密度下的培養(yǎng)瓶對(duì)照(即，氣液界面)相比沒(méi)有損失比活力。非GP裝置對(duì)照存在這樣的假設(shè)，培養(yǎng)室支架結(jié)構(gòu)僅僅使得細(xì)胞駐留其上的表面成水平狀態(tài)，而沒(méi)有提供氣體輸送，從而會(huì)導(dǎo)致差的胰島細(xì)胞活力。需討論的是，在設(shè)法使胰島細(xì)胞處于均勻分布而不會(huì)因聚集而損傷健康的同時(shí)，按如上所述設(shè)置的培養(yǎng)室支架允許向胰島細(xì)胞輸送足夠的氧的能力。GP裝置構(gòu)造成使得胰島細(xì)胞在98cm2的二甲基硅酮表面上均勻分布。在GP裝置內(nèi)的平均胰島細(xì)胞表面密度為1526IE/cm2(人工計(jì)數(shù))。基于GP裝置的比活力與代表性的培養(yǎng)瓶對(duì)照的比活力的比率，GP裝置表現(xiàn)出相等的活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.4％，p值為0.9987。因此，表明了培養(yǎng)室支架能使氣體被動(dòng)傳遞進(jìn)入培養(yǎng)室，所述被動(dòng)傳遞進(jìn)入的速率允許表面密度至少比傳統(tǒng)方法平均高7倍，而不損失胰島細(xì)胞的活力(通過(guò)OCR/DNA測(cè)定)。其表明，培養(yǎng)室支架可構(gòu)造成使得環(huán)境氣體可以存在于培養(yǎng)室支架的、與鄰近該培養(yǎng)室支架的透氣表面相對(duì)的相反側(cè)，沿培養(yǎng)室支架被動(dòng)地移動(dòng)，然后與細(xì)胞駐留其上的表面垂直，然后被動(dòng)地在細(xì)胞駐留于其上的透氣表面下方流通，此時(shí)以超過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置所允許的七倍提供足夠的氧傳遞來(lái)支持胰島細(xì)胞。
實(shí)施例2 在另一胰島細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中對(duì)與實(shí)施例1不同的培養(yǎng)室支架的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行考察。在本實(shí)施例中，試驗(yàn)裝置包括與實(shí)施例1中本質(zhì)上相同的透氣材料。支撐二甲基硅酮的培養(yǎng)室由與硅酮直接接觸的敞口格網(wǎng)構(gòu)成，并且機(jī)加工的聚碳酸酯塑料板將所述格網(wǎng)支撐成基本呈水平狀態(tài)。與實(shí)施例1的培養(yǎng)室支架不同，格網(wǎng)直接位于塑料板的上表面上。格網(wǎng)的幾何形狀和材料成分與實(shí)施例1的相同。對(duì)于每cm2的硅酮膜表面積，硅酮下表面和塑料底部的上表面之間的氣體體積在被格網(wǎng)取代后為0.022ml。換言之，塑料板和透氣膜之間的氣體體積與透氣膜的表面積之比為2.2％。為了使得環(huán)境氣體可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散與氣體空間連通，在塑料底部中存在作為氣體通行開(kāi)口的通孔，各通孔的截面定向?yàn)榕c格網(wǎng)的平面垂直。各通孔的直徑為0.125英寸。所述通孔在二甲基硅酮下面以柵格形式均勻隔開(kāi)，使得各孔中心之間的距離為0.375英寸。各通孔的長(zhǎng)度為0.13英寸。通孔的截面積與硅酮膜的截面積的比率為約16％。通孔的截面積與塑料板和透氣膜之間的氣體體積的比率為273％。由于格網(wǎng)的高度為0.019英寸，二甲基硅酮和處于塑料底部下面的氣體之間的總計(jì)高度為約0.15英寸。八個(gè)均勻分布的底腳，從其所處的培養(yǎng)層表面計(jì)，將塑料底部的周邊部分抬高0.41cm。底部的周長(zhǎng)為23.94cm。塑料底部下側(cè)和其處于上面的表面(該表面由此向環(huán)境氣體的運(yùn)動(dòng)開(kāi)放)之間的截面積為7.59cm2。不考慮作為氣體運(yùn)動(dòng)限流器的底腳，繞將氣體運(yùn)動(dòng)開(kāi)放至透氣二甲基硅酮位置的周邊的截面積為9.85cm2。因此，培養(yǎng)室支架的高度為約0.5英寸。
在一系列試驗(yàn)中采用來(lái)自5例豬分離的胰島細(xì)胞，主要目的是確定是否能夠在GP裝置中達(dá)到平均約1628IE/cm2(人工計(jì)數(shù))(DNA計(jì)數(shù)為927IE/cm2)的、超過(guò)常規(guī)的表面密度，而與培養(yǎng)瓶對(duì)照和非GP裝置相比不損失比活力。需討論的是，在設(shè)法使胰島細(xì)胞處于均勻分布而不會(huì)因聚集而損傷健康的同時(shí)，按如上所述設(shè)置的培養(yǎng)室支架允許向胰島細(xì)胞輸送足夠的氧的能力。如果如實(shí)施例1中所示，胰島細(xì)胞顯示出與對(duì)照類似的活力，培養(yǎng)室支架形成為替代幾何形狀的能力將得到體現(xiàn)。幾何形狀的主要差別是，實(shí)施例1采用突起部，而實(shí)施例2使得格網(wǎng)直接位于平坦的塑料底部上。為了對(duì)缺少突起部進(jìn)行補(bǔ)償，實(shí)施例2的幾何形狀中，氣體通行開(kāi)口截面積與透氣材料表面積的比率與實(shí)施例1相比增加約8倍。將胰島細(xì)胞放置到GP裝置內(nèi)，使得胰島細(xì)胞均勻地分布在二甲基硅酮表面上?；贕P裝置的比活力與代表性的培養(yǎng)瓶對(duì)照的比活力的比率，GP裝置表現(xiàn)出相等的活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.8％，p值為0.9681。因此，證實(shí)了替代幾何形狀的培養(yǎng)室支架可以使得氣體能以允許與傳統(tǒng)方法相比至少平均增加8倍的表面密度的速率被動(dòng)傳遞進(jìn)入培養(yǎng)室，而不損傷通過(guò)OCR/DNA測(cè)得的胰島細(xì)胞活力。
以與對(duì)照相比大幅度增加的表面密度(超過(guò)培養(yǎng)瓶的常規(guī)表面密度200IE/cm2約7倍至41倍)，來(lái)考驗(yàn)所述透氣試驗(yàn)裝置。以平均比培養(yǎng)瓶的傳統(tǒng)表面密度增大約18倍的表面密度，對(duì)總共20例豬分離物進(jìn)行評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)具有較大程度的可變性，GP裝置表現(xiàn)出代表性培養(yǎng)瓶對(duì)照的96.0％的平均活力，標(biāo)準(zhǔn)偏差為21.9％，p值為0.43。
圖19概括示出了與非GP裝置比較的結(jié)果，結(jié)果以培養(yǎng)瓶對(duì)照的百分比表示。顯然，僅僅將培養(yǎng)室保持水平從而均勻分布胰島細(xì)胞的培養(yǎng)室支架必須包括提供足夠氣體交換的容量，如通過(guò)隨著增加非GP裝置內(nèi)的表面密度而損傷胰島細(xì)胞健康所表明的。實(shí)施例1和實(shí)施例2說(shuō)明了至少有兩種截然不同的培養(yǎng)室支架，在被集成到透氣多層裝置設(shè)計(jì)中時(shí)，可以獲得有效利用空間的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。
該信息有利于表明透氣多層裝置相對(duì)傳統(tǒng)多層裝置的空間優(yōu)勢(shì)。例如，在胰島細(xì)胞移植來(lái)治愈I型糖尿病的領(lǐng)域中，目標(biāo)是培養(yǎng)至800,000IE(人工計(jì)數(shù))。目前的200IE/cm2表面密度的培養(yǎng)瓶方法將需要4000cm2的培養(yǎng)表面積。如果使用市售傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶，例如NUNCTM Cell Factory，形成4000cm2的培養(yǎng)表面積將需要約六個(gè)它的632cm2培養(yǎng)層。這樣構(gòu)造的NUNCTM Cell Factor將占用約416立方英寸的空間，并且胰島細(xì)胞處于可能不均勻的生長(zhǎng)條件。然而，考慮到上述實(shí)施例，透氣多層裝置可以在小得多的空間內(nèi)培養(yǎng)800,000IE。例如，其能以約1526IE/cm2～1628IE/cm2的平均表面密度培養(yǎng)胰島細(xì)胞，使得它只需要約500cm2的培養(yǎng)表面積來(lái)成功培養(yǎng)800,000IE。如果在透氣多層裝置內(nèi)采用六個(gè)培養(yǎng)層，如NUNCTM CellFactory所要求的，各層將只需要83cm2的表面積。如果培養(yǎng)基直接位于胰島細(xì)胞上，各培養(yǎng)室的高度為約1.6cm(0.63英寸)以達(dá)到與Cell Factory(即1uL/IE)相同的補(bǔ)料頻次。培養(yǎng)室支架的高度(即，培養(yǎng)室之間的垂直距離)不需超過(guò)實(shí)施例中的高度。上述實(shí)施例表明，各培養(yǎng)室支架的高度可以是0.344英寸。就尺寸而言，透氣多層裝置可以約5.8英寸高、3.6英寸寬和3.6英寸長(zhǎng)，占用空間約76英寸3。與傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶占用416英寸3空間相比，這樣可以減少超過(guò)500％的貨運(yùn)、滅菌、儲(chǔ)藏、培養(yǎng)箱以及廢棄處理空間。而且，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。注意到使用例如圖10中所示的構(gòu)造可以進(jìn)一步降低培養(yǎng)室之間的距離，就象上述實(shí)施例的培養(yǎng)室的下底腳距離所展示的的那樣。
實(shí)施例3 將伽馬輻射期間的硅酮遷移減到最低 試驗(yàn)裝置162構(gòu)造成如圖20的截面圖所示。測(cè)試樣品165由二甲基硅酮構(gòu)成，并被放置到市售聚苯乙烯組織處理六孔板167(

3516)的本體的頂部上。然后將聚苯乙烯蓋168放置到六孔板167上。通過(guò)在伽馬輻射之前對(duì)測(cè)試樣品165充等離子體，對(duì)硅酮遷移到蓋內(nèi)表面169上以及遷移到經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166上最小化的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)試樣品165位于距離經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166約1.78cm的位置，并距離蓋內(nèi)表面169小于2mm。在一次評(píng)價(jià)中，在將測(cè)試樣品165放置到試驗(yàn)裝置162內(nèi)之前，對(duì)其進(jìn)行充等離子體，通過(guò)水滴接觸角為96度以及表面能小于30達(dá)因確認(rèn)等離子體電荷的存在。在另一次評(píng)價(jià)中，在將測(cè)試樣品165放置到試驗(yàn)裝置162內(nèi)前未進(jìn)行充等離子體。在兩次評(píng)價(jià)中，對(duì)裝置依次進(jìn)行伽馬輻射。然后，實(shí)施化學(xué)分析用電子能譜法(ESCA)，以定量分析各種表面的元素組成。評(píng)估經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面166與作為對(duì)照的6孔板的經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面相比是否存在硅酮、氧和碳，所述作為對(duì)照的6孔板在沒(méi)有硅酮測(cè)試樣品165的情況下進(jìn)行伽馬輻射。對(duì)蓋內(nèi)表面169是否存在硅酮進(jìn)行評(píng)估。表1匯總了測(cè)試結(jié)果。

這些結(jié)果顯示，在伽馬輻射前將等離子電荷施加到硅酮防止了不希望的硅酮遷移，并且為細(xì)胞培養(yǎng)處理的表面保持基本不變。

六孔板，在不存在硅酮的條件下進(jìn)行伽馬輻射(即，對(duì)照)，就象集成了帶等離子體硅酮的

六孔板那樣，呈現(xiàn)出其經(jīng)組織培養(yǎng)處理表面上存在約20％的氧。相反，集成了不帶等離子體硅酮的

六孔板呈現(xiàn)出氧成分變化很大，為51％。未帶等離子體的硅酮遷移到所有表面。帶等離子體的硅酮?jiǎng)t沒(méi)有遷移到除靠近硅酮的表面之外的表面。
這為細(xì)胞培養(yǎng)裝置的新的構(gòu)造打開(kāi)了一扇門(mén)。通常，可以有簡(jiǎn)單的方法來(lái)制造細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括但不限于如圖17A和圖17B所示的那些裝置。包括硅酮表面和經(jīng)組織處理表面的培養(yǎng)裝置可以進(jìn)行伽馬輻射，通過(guò)至少對(duì)與經(jīng)組織處理表面氣體連通的硅酮表面充等離子體，經(jīng)組織處理表面無(wú)論與硅酮的距離是多少，在伽馬輻射之后基本上沒(méi)有變化。不可能遷移到經(jīng)組織處理表面的硅酮表面不需經(jīng)等離子體照射，如由硅酮構(gòu)成的培養(yǎng)室外側(cè)表面。需注意，只是部分由硅酮構(gòu)成的表面也應(yīng)該按說(shuō)明充等離子體，因?yàn)楣柰糠謺?huì)在輻射期間遷移。通常，可以有簡(jiǎn)單的方法來(lái)制造細(xì)胞培養(yǎng)裝置。例如，可以通過(guò)成型硅酮外殼并插入供細(xì)胞駐留在上面的處理后聚苯乙烯板，制造如基本培養(yǎng)瓶或OpticellTM透氣培養(yǎng)器之類的單培養(yǎng)室裝置。硅酮獨(dú)特的延伸能力使得開(kāi)口(培養(yǎng)表面穿過(guò)該開(kāi)口加入)可以小于被插入部件，并且在插入后很快恢復(fù)至端口形狀。成型的硅酮中可以存在隔膜，可以存在其它類型的通行口。對(duì)于基本培養(yǎng)瓶的情況，培養(yǎng)瓶的高度可以大幅度減低，因?yàn)橥ㄟ^(guò)采用透氣硅酮消除了以氣-液界面的途經(jīng)獲取氧的需要。參見(jiàn)圖17A，當(dāng)?shù)谝槐?10為透氣硅酮，并且培養(yǎng)表面130為如經(jīng)組織培養(yǎng)處理聚苯乙烯之類的粘附表面時(shí)，可以獲得附加的通用性。這樣，可以將裝置定向?yàn)?，第一?10朝下以培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)表面130朝下以培養(yǎng)粘附細(xì)胞，或者如前所述培養(yǎng)粘附和懸浮細(xì)胞。如果期望共同培養(yǎng)粘附細(xì)胞，可以將附加的培養(yǎng)表面，如非常薄的、透氣聚苯乙烯插入到第一壁110附近。裝置的高度可以增加，以允許各種所需的培養(yǎng)基體積與表面積之比率，以優(yōu)化培養(yǎng)。制造具有褶皺側(cè)壁的裝置，使得容積可以根據(jù)使用者的需要改變。透氣多層培養(yǎng)瓶也可以將這些優(yōu)點(diǎn)集成在一起。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可以在不脫離本發(fā)明精神的前提下對(duì)其進(jìn)行各種改動(dòng)。因此，本發(fā)明的范圍不限于所闡述或記載的具體實(shí)施方式
。而且，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求和其等價(jià)物確定。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包括
至少一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，其具有至少一透氣透液的壁；和
培養(yǎng)室支架，其與所述透氣透液的壁接觸；和
至少一個(gè)氣體通行開(kāi)口，其向所述培養(yǎng)室支架開(kāi)放；以及
透氣無(wú)菌過(guò)濾器，其覆蓋所述氣體通行開(kāi)口。
2.如權(quán)利要求2所述的裝置，包括
至少兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，各培養(yǎng)室具有至少一透氣透液的壁，并且各所述透氣、透液的壁與氣體空間接觸；和
培養(yǎng)室支架，其與所述透氣、透液的壁接觸；和
至少一個(gè)氣體通行開(kāi)口，其向所述培養(yǎng)室支架開(kāi)放；以及
透氣無(wú)菌過(guò)濾器，其覆蓋所述氣體通行開(kāi)口。
3.一種細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包括
至少一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，其至少具有第一壁和第二壁；和
至少一細(xì)養(yǎng)表面，并且
所述第一壁由包括充有等離子體的硅酮的材料組成。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述培養(yǎng)表面是經(jīng)組織培養(yǎng)處理的。
5.如權(quán)利要求4所述的裝置，其中所述培養(yǎng)表面由聚苯乙烯組成。
6.如權(quán)利要求3所述的裝置，包括至少兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室由集流腔連接。
8.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室至少部分是透氣的，且所述細(xì)胞培養(yǎng)室由氣體空間隔開(kāi)。
9.如權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室由集流腔連接。
10.一種經(jīng)改良的傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶，包括
至少一外壁，所述外壁的部分由透氣材料組成。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，包括側(cè)壁支架(240)。
12.如權(quán)利要求11所述的裝置，其中至少一培養(yǎng)室底部(245)由透氣材料組成。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述培養(yǎng)室底部(245)與培養(yǎng)室支架(243)接觸。
14.一種經(jīng)改良的傳統(tǒng)透氣多層培養(yǎng)瓶，包括
至少一個(gè)開(kāi)口，所述開(kāi)口進(jìn)入所述傳統(tǒng)多層培養(yǎng)瓶的瓶體的至少部分，所述開(kāi)口呈氣體空間(251)的形式，所述氣體空間(251)至少部分由透氣材料組成，且所述氣體空間(251)由上氣體空間壁(210)和下氣體空間壁(215)限定。
15.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述上氣體空間壁(210和側(cè)壁(225)形成細(xì)胞培養(yǎng)室。
16.如權(quán)利要求15所述的裝置，其中所述上氣體空間壁(210)由透氣材料組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法和裝置。它們包括使用透氣培養(yǎng)室，以減少空間的使用，同時(shí)維持均勻的培養(yǎng)條件，并且更適合自動(dòng)液體操作。它們包括將透氣材料集成至傳統(tǒng)的多層形式以解決培養(yǎng)條件不均勻的問(wèn)題。它們包括培養(yǎng)裝置，其使用由透氣材料構(gòu)成的表面，充有等離子體的硅酮，并且集成傳統(tǒng)的附著表面，例如由傳統(tǒng)的經(jīng)組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯構(gòu)成的那些表面。它們包括集成了透氣透液膜的培養(yǎng)裝置。這樣產(chǎn)生多種優(yōu)點(diǎn)，包括放大期間更優(yōu)化的培養(yǎng)條件，以及對(duì)存量空間、培養(yǎng)箱空間和處理空間更有效的利用。還有，可以減少工作量和污染風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/12GK101611133SQ200780051037
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者約翰·R·威爾森, 喬爾·威廉姆斯 申請(qǐng)人:威爾森沃爾夫制造公司