專利名稱：：自身免疫病的診斷和治療靶標(biāo)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大致涉及自身抗原靶標(biāo)的鑒定，具體來說是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自身抗原靶標(biāo)，更具體的說，蛋白ZnT8作為新的自身抗原，本文描述了基于所述自身抗原的治療、診斷及預(yù)后工具和方法。
背景技術(shù)：
：自身免疫病是由抗機(jī)體自身組織的免疫應(yīng)答引起的疾病。自身免疫病導(dǎo)致一種或多種機(jī)體組織的破壞、器官的異常生長或器官功能的變化。所述疾病可能只影響一種器官或組織類型，或可能影響多種器官和組織。人和NOD小鼠模型中的1型自身免疫性糖尿病(T1D)是一種多基因T細(xì)胞依賴性自身免疫病,其特征為胰島(3細(xì)胞的選擇性破壞(l-3)，源于易感個(gè)體中對(duì)p細(xì)胞抗原耐受性的障礙，所述易感個(gè)體在關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面具有先天缺陷(5)(例如，對(duì)自身顯示致病性而不是保護(hù)性免疫應(yīng)答的個(gè)體)。與(3細(xì)胞具有相同發(fā)育譜系(developmentallineage)并且經(jīng)常直接接觸卩細(xì)胞的胰腺外分泌和內(nèi)分泌細(xì)胞基本上不受影響，并且一旦P細(xì)胞損失則胰島炎消退,這表明自身免疫性靶標(biāo)主要是(3細(xì)胞特異性的。許多已知的糖尿病自身抗原(諸如胰島素和IGRP)反映了這種細(xì)胞特異性,但是，已知免疫靶標(biāo)的列表是無論如何也不全面的。這尤其涉及被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞武器識(shí)別的抗原，但是盡管進(jìn)行了十多年的研究，但主要CD4+致糖尿病T細(xì)胞的靶標(biāo)仍然是不清楚的。近年來利用免疫篩選步驟只出現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)新靶標(biāo)，所述免疫篩選步驟最初鑒定出這類分子為GAD65、IA-2和ICA69。一個(gè)糖尿病成員時(shí)，50%的這種雙生兒保持不一致)，而非種系編碼的因素顯著影響T1D進(jìn)展的速度(7)。這種低的外顯率和易變的自然史表明環(huán)境因素以及免疫應(yīng)答自身隨機(jī)性質(zhì)的重要性。將這種平衡向更易致耐受(tolemgenic)9環(huán)境遷移的治療策略具有防止或減緩自身免疫向破壞性胰島炎進(jìn)展的潛能。在NOD小鼠的早期胰腺浸潤中出現(xiàn)有限數(shù)量的胰島細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞克隆(16;17)，疾病進(jìn)展看起來涉及表位傳播(18)和早期T細(xì)胞應(yīng)答的親和力成熟(19)以及新的自身抗原的募集(20)。已經(jīng)從前期糖尿病或新近糖尿病NOD小鼠的脾、淋巴結(jié)或胰島浸潤中分離出許多胰島特異性004+和008+T細(xì)胞克隆(21-25)，所述小鼠的同源抗原很難確定，看起來不對(duì)應(yīng)于任何人類糖尿病自身免疫的任一已知血清學(xué)標(biāo)記物，諸如GAD65,胰島素顆粒膜蛋白ICA512(IA匿2)和phogrin(IA隱2(3)(20)，羧肽酶E(26),ICA69(27)和石克酸糖脂(28)。自體反應(yīng)性T細(xì)胞的分子靶標(biāo)可以包括(3細(xì)胞未經(jīng)確認(rèn)的組分，或本質(zhì)上不會(huì)引發(fā)體液免疫的已知P細(xì)胞蛋白。因此，確定它們的同源抗原仍然是一個(gè)重要目標(biāo)，隨著基因組和蛋白質(zhì)組技術(shù)的最新發(fā)展，現(xiàn)在其是一個(gè)現(xiàn)實(shí)的目標(biāo)。因此，利用對(duì)從NIT1胰島素瘤細(xì)胞的H-2Kd分子洗脫的蛋白質(zhì)組肽進(jìn)行的敏感生物測定和分析的組合(29)，最近證明被徹底研究的NY8.3CD8+克隆的靶標(biāo)(23)是源自(3細(xì)胞蛋白IGRP(胰島葡糖6-磷酸酶相關(guān)蛋白)的肽。盡管體液免疫自身對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理可能不起什么作用(30),但B-淋巴細(xì)胞分子靶標(biāo)的鑒定仍是一個(gè)重要目標(biāo)，因?yàn)锽細(xì)胞在T1D的抗原呈遞中起作用(31)。此外，循環(huán)的自身抗體為糖尿病自身免疫提供有效的臨床前標(biāo)記物。高親和力抗體的產(chǎn)生是T依賴性過程，因此有理由預(yù)期被自身抗體識(shí)別的分子還將是自體反應(yīng)性致糖尿病T細(xì)胞的靶標(biāo)。該假設(shè)至少對(duì)于胰島素、phogrin和GAD65來說是正確的(32-34)。已知靶標(biāo)的列表盡管很長，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠全面的。這被以下事實(shí)突出顯示:通過人胰腺的免疫組化確定的前-T1D的血清學(xué)診斷仍然是最靈敏的指標(biāo)，僅僅因?yàn)樗x了不屬于分子術(shù)語中確定的自身抗原的其他靶標(biāo)。關(guān)于在T1D及其他自身免疫病中是否存在初始或起始自身抗原還存在持續(xù)的爭論。對(duì)于TID來說，目前NOD小鼠中最佳候選物是胰島素(33;35-38)，但基于胰島浸潤中識(shí)別該抗原的T細(xì)胞的前體頻率還表明IGRP可能也起著重要作用(29;39;40)。另一種看法是該疾病由正常致耐受片幾制的石皮壞導(dǎo)致的多克隆活化引起，所述機(jī)制將另外產(chǎn)生針對(duì)相同分子的調(diào)控細(xì)胞(41)。考慮到后一情況，本發(fā)明人假設(shè)作為T1D中自身免疫重要靶標(biāo)的任意分子是基于抗原療法的候選物?；谟靡葝u素(42;43)、GAD65(44-48)、HSP65(49)和IGRP(50)的天然表位免疫的NOD小鼠中的有效免疫耐受策略看起來證明了這點(diǎn)。此外，本發(fā)明人對(duì)IA-2和phogrin的初步研究表明，當(dāng)給初生NOD小鼠施用時(shí)，已知的小鼠和人肽表位(肽7(51))同樣延緩疾病的出現(xiàn)。在這方面，其他已知的T細(xì)胞靶標(biāo)，包括IAPP(52)、IMOGEN38(53-57)看起來還未被表征。自身抗原和病毒蛋白間推定的分子模擬性質(zhì)的實(shí)例是基于科學(xué)文獻(xiàn)中大量的序列同源性(58)。例如，就T1D來說，已經(jīng)提出過GAD65與柯薩奇B3P2-C蛋白(59)或人巨細(xì)胞病毒主要DNA結(jié)合蛋白(60)的交叉反應(yīng)性，及IA-2與輪狀病毒VP7(61)或柯薩奇B4VP1(62)的交叉反應(yīng)性。類似地，還假定了胰島素原與GAD65的模擬(63)。能夠想象得到，通過建立并加強(qiáng)免疫網(wǎng)絡(luò)，與分子模擬物的接觸可以引發(fā)自身免疫或者預(yù)防該分子模擬物。對(duì)由傳染原引發(fā)的人自身免疫的流行病學(xué)研究還不是特別有益的，這可能是因?yàn)榧膊〉拈L期前驅(qū)癥狀及無法鑒定涉及的特定生物(或常見病原體的罕見血清型)(14)。本質(zhì)上對(duì)"衛(wèi)生假說，，非常重要的保護(hù)性應(yīng)答是更難建立的。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是目前人T1D最好的模型(8)，其中疾病進(jìn)展的三個(gè)階段是明顯的，即，自體反應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增("檢查點(diǎn)0")，它們向胰島的歸巢("檢查點(diǎn)l")，及從良性的胰島周圍炎向?qū)е纶嗉?xì)胞損傷的侵襲性胰島炎轉(zhuǎn)變('"險(xiǎn)查點(diǎn)2")(9)。已經(jīng)假定通過"4全查點(diǎn)O，，與小島細(xì)胞凋亡的波動(dòng)一致，所述小島細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胰淋巴結(jié)中細(xì)胞抗原呈遞的增強(qiáng)。相關(guān)假設(shè)表明此時(shí)(當(dāng)存在斷奶時(shí))接觸腸中的新抗原導(dǎo)致Thl極化T細(xì)胞的活化，所述T細(xì)胞隨后遷移至胰腺并干擾引流區(qū)淋巴結(jié)，這樣的話引起針對(duì)小島細(xì)胞抗原的免疫原性應(yīng)答。在人T1D中還表明存在生后小島細(xì)胞凋亡(10)、先天性卩細(xì)胞異常(11)及飲食(12;13)或腸病毒(14)引發(fā)的類似參與，盡管目前，它們的相對(duì)作用(如果有的話)及作為偶然因素的普遍性仍存在爭論。盡管如此，很明顯小島細(xì)胞抗原對(duì)疾病過程非常重要(15)，對(duì)其分子特征的詳細(xì)了解對(duì)于免疫治療的合理設(shè)計(jì)及監(jiān)測并鑒定高危個(gè)體非常重要。僅在美國就有超過2百萬1型糖尿病患者，他們都需要終身多次每日給藥胰島素以維持生命。這些個(gè)體中的大多數(shù)將在其一生中患有糖尿病并發(fā)癥，據(jù)估計(jì)在任何年齡，他們的壽命可以減少直至三分之一。因此預(yù)防或甚至減緩疾病的進(jìn)展將具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。存在大量針對(duì)糖尿病預(yù)防和逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)性方法，它們在T1D的嚙齒類動(dòng)物模型中被證明非常有效，目前正處于臨床試驗(yàn)階段。例如，利用抗CD3單克隆抗體的初步發(fā)現(xiàn)是尤其有希望的。為了能夠有效，任何基于免疫的療法都需要診斷性試驗(yàn)來確定介入是否是合適的以及什么時(shí)候相對(duì)于疾病的分期實(shí)施治療。一旦治療開始，必須評(píng)價(jià)其短期和長期效果?；卺槍?duì)自身抗原的體液或細(xì)胞自身反應(yīng)性的診斷測試(用于監(jiān)測疾病進(jìn)展)對(duì)于做出治療患者的任何決定及治療結(jié)果的后續(xù)監(jiān)測非常重要。因此，在本領(lǐng)域一直需要改進(jìn)的針對(duì)T1D的診斷分析，以及新的基于疾病靶標(biāo)的免疫治療。此外，在一種自身免疫病諸如T1D中鑒定的許多靶標(biāo)還是其他自身免疫病的靶標(biāo)，從而擴(kuò)展了各種自身免疫病的可用診斷和治療方法。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8的各種片段。一方面，所述片段包括ZnT8的至少10個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少10個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少IO個(gè)C端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少25個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少25個(gè)C端氨基酸組成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少50個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少50個(gè)C端氨基酸組成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少75個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少75個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少75個(gè)C端氨基酸組成。仍在另一方面，所述片段包括ZnT8的至少100個(gè)C端氨基酸,基本上由ZnT8的至少100個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少IOO個(gè)C端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少101個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少101個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少101個(gè)C端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少102個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少102個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少102個(gè)C端氨基酸組成。仍在另一方面，所述片段包括ZnT8的至少104個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少104個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少104個(gè)C端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少350個(gè)C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少350個(gè)C端氨基酸組成，或由ZnT8的至少350個(gè)C端氨基酸組成。另一方面，所述片段包括至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQIDNO:2的346-353位)，基本上由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQIDNO:2的346-353位)組成，或由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQIDNO:2的346-353位)組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少IO個(gè)N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少IO個(gè)N端氨基酸組成，或由ZnT8的至少IO個(gè)N端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少25個(gè)N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25個(gè)N端氨基酸組成，或由ZnT8的至少25個(gè)N端氨基酸組成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少50個(gè)N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50個(gè)N端氨基酸組成，或由ZnT8的至少50個(gè)N端氨基酸組成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少74個(gè)N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少74個(gè)N端氨基酸組成，或由ZnT8的至少74個(gè)N端氨基酸組成。在本發(fā)明上述方面中的任意一項(xiàng)，所述片段可以包括選自E352和S353的氨基酸位置(相對(duì)于SEQIDNO:2)。在本發(fā)明上述方面中的任意一項(xiàng)，ZnT8可以是人ZnT8(SEQIDNO:2)。一方面，所述片段包括SEQIDNO:2的位置325。另一方面，ZnT8是SEQIDNO:2的多態(tài)性變體。另一方面，所述片段包括SEQIDNO:2的位置325，在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，325位的氨基酸是色氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8的片段，包括SEQIDNOs:8-24或40-65中任一所示片段，基本上由SEQIDNOs:8-24或40-65中任一所示片段組成，或由SEQIDNOs:8-24或40-65中任一所示片段組成。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及嵌合蛋白，包括本文所述的任意兩個(gè)或更多個(gè)片段，基本上由本文所述的任意兩個(gè)或更多個(gè)片段組成,或由本文所述的任意兩個(gè)或更多個(gè)片段組成。一方面，嵌合蛋白包括ZnT8的N端片段和ZnT8的C端片段。另一方面,嵌合蛋白包括ZnT8的兩個(gè)C端片段,其中每一片段包括氨基酸325位，并且其中每一片段在325位包括不同的氨基酸。一方面,一個(gè)片段包括325位的精氨酸,其中第二片段包括325位的色氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8的片段或同系物，包括被抗ZnT8抗體選擇性結(jié)合的至少一個(gè)ZnT8表位。一方面，抗ZnT8抗體是獲自特定個(gè)體的抗體。一方面，所述個(gè)體患有或被懷疑患有I型糖尿病。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8的片段或同系物，包括被ZnT8特異性T細(xì)胞受體特異性識(shí)別的至少一個(gè)ZnT8表位。一方面，權(quán)利要求3013的ZnT8的片段或同系物，其中所述個(gè)體患有或被懷疑患有I型糖尿病。在上述實(shí)施方案的任意一項(xiàng)中，一方面，所述片段或嵌合蛋白與至少一個(gè)耙向基團(tuán)復(fù)合以將該片段或嵌合蛋白靶向到組織或機(jī)體的細(xì)胞或部位。一方面，所述把向基團(tuán)把向于T細(xì)胞。另一方面，靶向基團(tuán)靶向于ZnT8特異性自體反應(yīng)T細(xì)月包。在上述實(shí)施方案中的任意一項(xiàng)中，一方面，所述片段或嵌合蛋白與毒素復(fù)合，以在T細(xì)胞或B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，或另外對(duì)T細(xì)胞或B細(xì)胞是有毒性的。在上述實(shí)施方案的任意一項(xiàng)中，一方面，所述片段或嵌合蛋白與可檢測的標(biāo)記物連4妻。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8的同系物，包括與天然存在的ZnT8蛋白具有低于99%同一性并且與SEQIDNO:2具有至少卯％同一性的蛋白。一方面，所述蛋白與SEQIDNO:2具有至少95%同一性。另一方面，所述蛋白包括SEQIDNO:2的位置325,其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包括ZnT8或其變體或片段的疫苗，其中所述疫苗引發(fā)抑制或消除個(gè)體中ZnT8特異性自體反應(yīng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及抗體或其抗原結(jié)合片段，它們選擇性結(jié)合ZnT8或其片段或變體，并抑制或降低個(gè)體中ZnT8特異性自身免疫應(yīng)答。一方面，所述抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種診斷易患或正患有自身免疫病的個(gè)體的方法，包括檢測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與陰性對(duì)照相比，如果檢測到個(gè)體中抗體的增加表明個(gè)體易患或正患有自身免疫病。一方面，所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種診斷易患或正患有自身免疫病的個(gè)體的方法，包括檢測個(gè)體試樣中ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，其中與陰性對(duì)照相t匕，如果4全測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增加表明個(gè)體易患或正患有自身免疫病。一方面，所述方法包括卩險(xiǎn)測對(duì)包含325位精氨酸的人ZnT8特異的T細(xì)胞應(yīng)答。一方面，所述方法包括檢測對(duì)人ZnT8特異的T細(xì)胞應(yīng)答，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。在上述方法的任意一項(xiàng)中，當(dāng)個(gè)體易患或正患有自身免疫病時(shí)，所述方法可以進(jìn)一步包括給該個(gè)體施用靶向于個(gè)體的ZnT8表位的治療劑，所述ZnT8表位包括325位的氨基酸。一方面，所述治療劑個(gè)體中ZnT8的是蛋白、肽或激動(dòng)劑，它們使個(gè)體的免疫應(yīng)答耐受ZnT8蛋白。一方面，所述治療劑刺激抗ZnT8蛋白的免疫應(yīng)答。在上述方法的任意一項(xiàng)中，一方面，自身免疫病是I型糖尿病。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種監(jiān)測個(gè)體的I型糖尿病自身免疫從最初的良性自身反應(yīng)性到破壞性胰島炎的進(jìn)展的方法，包括檢測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與相同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體的增加表明該個(gè)體正向破壞性胰島炎發(fā)展。一方面，所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種監(jiān)測個(gè)體的I型糖尿病自身免疫從最初的良性自身反應(yīng)性到破壞性胰島炎的進(jìn)展的方法，包括檢測個(gè)體試樣中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答，其中與相同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增加表明該個(gè)體正向破壞性胰島炎發(fā)展。一方面，所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的人ZnT8特異的T細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種監(jiān)測用于預(yù)防I型糖尿病、延緩I型糖尿病發(fā)病或改善前驅(qū)糖尿病個(gè)體的自身免疫的治療效果的方法，包括^r測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與相同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體水平降低或基本上相同表明所述治療是有效的，其中與同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體增加表明所述治療是無效的。一方面，所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種監(jiān)測用于預(yù)防I型糖尿病、延緩I型糖尿病發(fā)病或改善前驅(qū)糖尿病個(gè)體的自身免疫的治療效果的方法，包括;險(xiǎn)測個(gè)體試樣中ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，其中與相同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答水平降低或基本上相同表明所述治療是有效的，其中與同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答增加表明所述治療是無效的。一方面，所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的人ZnT8特異的T細(xì)胞應(yīng)答。在上述檢測抗體方法的任意一項(xiàng)中的一方面，所述方法可以包括使用以下分析法，其選自但不限于放射免疫沉淀分析，ELISA，時(shí)間分辨熒光分析和發(fā)光分析。一方面，所述方法包括使用竟?fàn)幮凿B分析。在上述一企測T細(xì)胞應(yīng)答方法的任意一項(xiàng)中的一方面，所述方法可以包括使用以下分析法，其選自但不限于T細(xì)胞增殖分析，利用可溶性MHC四聚體的結(jié)合分析，利用可溶性T細(xì)胞受體的結(jié)合分析，和ELISPOT分析。在上述確定方法的任意一項(xiàng)中，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用ZnT8或其片段或變體，包括但不限于，本文描述的任一ZnT8片段。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于進(jìn)行本文所述任意方法的分析試劑盒。所述試劑盒包括(a)ZnT8蛋白或其變體或片段；(b)用于檢測選擇性結(jié)合ZnT8的抗體的試劑；和/或用于檢測ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫(包括改善該疾病的任意一種或多種癥狀)的方法，包括給需要其的個(gè)體施用引發(fā)ZnT8特異性免疫應(yīng)答的藥劑，所述ZnT8特異性免疫應(yīng)答保護(hù)患者被自身免疫病靶向的細(xì)胞或組織。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述藥劑保護(hù)胰島的P細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫(包括改善該疾病的任意一種或多種癥狀)的方法，包括給需要其的個(gè)體施用藥劑，所述藥劑靶向于個(gè)體的ZnT8特異性T細(xì)胞，并誘導(dǎo)ZnT8特異性T細(xì)胞的壞死或凋亡。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述藥劑誘導(dǎo)ZnT8特異性T細(xì)胞的壞死或凋亡。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫(包括改善該疾病的任意一種或多種癥狀)的方法，包括給需要其的個(gè)體施用誘導(dǎo)個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞耐受性的藥劑。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述藥劑誘導(dǎo)個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞的耐受性。在上述治療方法的任意一項(xiàng)中，一方面，所述藥劑是ZnT8、其同系物、其片段或其合成模擬物。一方面，所述藥劑是如本文任意地方所述的片段或嵌合蛋白，同系物，或其片段。一方面，所述藥劑是與個(gè)體的天然自身抗體竟?fàn)幗Y(jié)合個(gè)體的ZnT8的抗體。一方面，所述藥劑對(duì)包含325位精氨酸的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。一方面，所述藥劑對(duì)包含325位色氨酸的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。一方面，所述藥劑對(duì)包含325位谷氨酰胺的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及ZnT8、其變體、其片段、其合成模擬物或結(jié)合所述ZnT8的抗體、其同系物或其片段在基本上如本文所述的診斷、預(yù)后或治療方法中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及基本上如本文所述的任意方法、藥劑、ZnT8片段、同系物、變體、嵌合蛋白、融合蛋白或編碼上述物質(zhì)的核酸，或選擇性結(jié)合上述物質(zhì)的抗體。本發(fā)明的附圖簡述圖1是顯示針對(duì)Slc30A8的糖尿病特異性自身抗體的圖示。圖2A和2B顯示果蠅S2細(xì)胞中膜結(jié)合的糖尿病自身抗原的表達(dá)和純化。圖2A是數(shù)字化圖象，顯示mIGRPV5His構(gòu)建體的表達(dá)在S2細(xì)胞中被誘導(dǎo)，以及用抗V5抗體印跡的細(xì)胞膜組分(CMF)。圖2B是顯示對(duì)IGRP-CMFT細(xì)胞雜交瘤(克隆l-76-54)進(jìn)行應(yīng)答分析的圖示。圖3顯示基于EST序列變異修正的ZnT8的基因結(jié)構(gòu)及預(yù)測的選擇性翻譯產(chǎn)物。對(duì)于顯示的選擇性翻譯產(chǎn)物，MYHCH的"起始"序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的50-54位，MEFLER的"起始，，序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的1-6位。圖4A顯示人ZnT8的氨基酸序列(SEQIDNO:2),其中用暗灰色突出顯示預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域。圖4B顯示預(yù)測的ZnT8的膜拓樸結(jié)構(gòu)，并顯示環(huán)的氨基酸位置。圖5顯示針對(duì)ZnT8C端探針的標(biāo)準(zhǔn)分析。圖6是顯示利用不同ZnT8構(gòu)建體的盲DASP研究結(jié)果的圖示。圖7證明ZnT8檢測患者的自身抗體，所述患者對(duì)ICA和金標(biāo)準(zhǔn)生化抗體是陰性的。圖8A-8C是一系列圖表，顯示在新發(fā)病群體中就胰島素(圖8A)、GAD(圖8B)和IA2(圖8C)而言自身抗體與ZnT8的關(guān)系。17圖9A-9D是一系列圖表，顯示相對(duì)于年齡來說，疾病發(fā)病時(shí)自身抗體的表達(dá)(圖9A=ZnT8;圖9B=GAD;圖9C=胰島素；圖9D=IA2)。圖IOA和10B是顯示在兩個(gè)不同患者中使用ZnT8自身抗體作為T1D預(yù)測標(biāo)記物，表明在圖IOA和10B中顯示。圖11是顯示疾病發(fā)病時(shí)T1D患者的糖尿病自身抗體狀況的表才各。圖12A和12B是顯示ZnT8抗體分析的受試者工作特性(receiveroperatorcharacteristics)的圖示(圖12A顯示免測沉淀指數(shù)，圖12B顯示靈敏度)。圖13是顯示與ZnT80RF、C端和N端反應(yīng)性的關(guān)系的圖示。圖14A和14B顯示研究ZnT8的N端和C端是否能夠相互作用產(chǎn)生新的表位的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；該實(shí)驗(yàn)利用作為免測沉淀分析中標(biāo)準(zhǔn)品的2個(gè)糖尿病血清庫進(jìn)行，第一個(gè)基于針對(duì)C端探針的強(qiáng)應(yīng)答來選擇(圖14A),第二個(gè)基于N端的反應(yīng)性(圖14B)。圖15A顯示小鼠Slc30A8(頂部；顯示的是SEQIDNO:4的267-367位)、人Slc30A8(中間;顯示的是SEQIDNO:2的268-369位)和小鼠Slc30A3(底部；序列是SEQIDNO:25)比對(duì)的序列。圖15B顯示對(duì)于自身抗體反應(yīng)來說，對(duì)C端探針修飾的作用(引用序列顯示限制性酶切位點(diǎn)是SEQIDNO:2的336-369位)。圖15C顯示對(duì)于自身抗體反應(yīng)來說，在帶電殘基處(K340，H345和E352)具有點(diǎn)突變的C端探針的影響。圖16顯示對(duì)于自身反應(yīng)性非常重要的ZnT8C端的殘基。圖17顯示利用缺失突變體和小鼠/人嵌合體的表位繪圖。顯示的小鼠ZnT8序列是SEQIDNO:4的267-367位；顯示的人ZnT8序列是SEQIDNO:2的268-369位。圖18顯示用于直接誘變研究的分子模型。圖19顯示被T1D自身抗體靶向的區(qū)域中ZnT8殘基的保守性(MseN端序列是SEQIDNO:4的1-74位；HumN端序列是SEQIDNO:2的1-75位；XenN端序列是SEQIDNO:38;MseC端序列是SEQIDNO:4的267-367;HumC端序列是SEQIDNO:2的268-369位；XenC端序列是SEQIDNO:39)。圖20顯示人Slc30A家族成員之間的序列同源性。圖21A-2C顯示根據(jù)CR限制性自身抗體應(yīng)答(圖21A)、CW限制性自身抗體應(yīng)答(圖21B)和CQ自身抗體應(yīng)答(圖21C),小鼠ZnT8的定點(diǎn)誘變鑒定結(jié)構(gòu)中的主要表位。圖22A-22D顯示小鼠ZnT8的多位點(diǎn)突變概括了與hCArg反應(yīng)性血清的人ZnT8反應(yīng)(圖22A=與hCArg反應(yīng)性血清的mCArg探針；圖22B=mCArg(ArgGluLysLys);圖22C=與hCTrp反應(yīng)性血清的mCTrp探針；圖22D=與hCTrp反應(yīng)性血清的mCArg(ArgGluLysLys)探針)。圖23A-23D顯示用人多態(tài)性探針檢測的抗體水平與小鼠定點(diǎn)突變體之間的關(guān)系(圖23A顯示hCArg-Gln指數(shù)對(duì)mCArg指數(shù)；圖23B顯示mCArg，hCArg和hCArg-Gln指數(shù)；圖23C顯示mCTrp指數(shù)對(duì)hCTrp-Gln指數(shù)；圖23D顯示mCTrp,hCTrp和hCTrp-Gin指數(shù))。圖24A-24D顯示Slc30A8aa325多態(tài)性與ZnT8A的關(guān)系。圖24D顯示顯示對(duì)普通Arg和Trp變體應(yīng)答之間的關(guān)系，基于只對(duì)Trp(垂直的)和Arg(水平的)應(yīng)答的95%截?cái)鄬⑵浞譃?個(gè)區(qū)，對(duì)角線代表針對(duì)分析中兩種探針假定15%CV的等同應(yīng)答±3SD的邊界。圖24A和24B在檢查針對(duì)Gln探針及Arg和Trp探針的應(yīng)答之間的關(guān)系時(shí)使用相同分層。圖25顯示相對(duì)于編碼aa325的基因型ZnT8A的發(fā)生率。圖27顯示與糖尿病發(fā)病年齡有關(guān)的Slc30A8基因型。圖28A-B顯示Slc30A8基因型與抗體水平比較(圖28A顯示相對(duì)于基因型的SIc30A8自身抗體反應(yīng)水平；圖28B顯示相對(duì)于基因型的其他自身抗體反應(yīng)水平)。圖29顯示現(xiàn)有ZnT8分析的概述。圖30顯示針對(duì)組合N端、C端、腔環(huán)(luminalloops)、細(xì)胞溶質(zhì)環(huán)和多態(tài)性殘基的不同ZnT8構(gòu)建體的自身反應(yīng)性。圖31A-31F顯示發(fā)病后0-2年的抗體與C-肽比較(圖31A-C與C-肽比較；圖31D-F與GADA和IA-2A比較)。圖32A顯示發(fā)病后5-10年的ZnT8A和C-肽水平。圖33A顯示檢出率變化的原則(黑色為檢出ZnT8;白色未檢出)。圖33B顯示增加ZnT8抗體測量的不同效果。圖34顯示，人胎兒胰腺的實(shí)時(shí)PCR顯示高胰島特異性。圖35顯示，新確診的T1D患者顯示針對(duì)ZnT8合成肽的外周T細(xì)胞應(yīng)答。圖36顯示自身抗體預(yù)吸附實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了利用重組蛋白來區(qū)別不同的ZnT8表位。發(fā)明詳述本發(fā)明廣泛涉及自身抗原靶標(biāo)的鑒定，具體的是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自身抗原靶標(biāo)，更具體的是蛋白ZnT8作為新的自身抗原，本文描述了基于所述自身抗原的治療、診斷及預(yù)后工具和方法。本發(fā)明還涉及ZnT8中遺傳變異的鑒定，本文描述了所述遺傳變異在疾病過程的起始和自身免疫性向臨床糖尿病的進(jìn)展中起著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)允許本發(fā)明人提供新的診斷工具，所述診斷工具可用于提高對(duì)病程的預(yù)后評(píng)價(jià)及監(jiān)測在疾病的臨床前期治療介入的有效性。所述分子本身、衍生的肽、肽類似物和第二免疫藥劑還作為預(yù)防發(fā)病或自身免疫性向臨床疾病進(jìn)展的治療介入的基礎(chǔ)。當(dāng)個(gè)體一出生就能確定其基因型的能力為實(shí)施治療性檢測提供獨(dú)特的優(yōu)勢，因?yàn)轭A(yù)防自身免疫性過程的出現(xiàn)比一旦其確立再讓其逆轉(zhuǎn)要容易。過去，正如以上討論的，胰島素被定義為基于其組織結(jié)合的候選基因，GAD65和IA-2來自于患者血清免疫沉淀來自放射性標(biāo)記的胰島的蛋白的能力(64-66)，和IGRP作為結(jié)合MHCH-2Kd(刺激源自自發(fā)性糖尿病小鼠的T細(xì)胞克隆)的肽。本發(fā)明人已經(jīng)回答了以下問題基于現(xiàn)在關(guān)于自身抗原的細(xì)胞和分子生物學(xué)的理解，以及可用的通過微陣列分析在不同組織中研究和分析基因組范圍表達(dá)的工具，是否能夠開發(fā)出更加系統(tǒng)化的方法來鑒定靶向自身抗原。目標(biāo)是產(chǎn)生一系列將包括至關(guān)重要的糖尿病自身抗原的候選基因，其可能從在P細(xì)胞中表達(dá)的15,000個(gè)或類似基因轉(zhuǎn)錄物中具有超過50答。本研究的結(jié)果在下文描述，尤其著重于新的靶向自身抗原(即ZnT8)的發(fā)現(xiàn)。更具體地，抗原呈遞和T細(xì)胞識(shí)別的結(jié)構(gòu)生物學(xué)為新的T1D自身抗原的鑒定提供相對(duì)較少的線索，因?yàn)镸HC和T細(xì)胞受體分子均具有較寬的肽結(jié)合特異性范圍和相對(duì)較低的親和力。已經(jīng)證明很難鑒定天然表位，即使已經(jīng)詳細(xì)了解模擬位肽的結(jié)合特性，這只是因?yàn)榻佑|殘基的數(shù)量較少并且保守的氨基酸取代可以輕易被接受。本發(fā)明人在本文中描述了在基因組范圍勤出上鑒定候選自身抗原的基于知識(shí)的算法的開發(fā)。最初基于實(shí)驗(yàn)信息假設(shè)"理想，，自身抗原的大量主要和次要屬性，然后據(jù)此評(píng)估。然后評(píng)估抗原與每一理想屬性的一致性以獲得"自身抗原分?jǐn)?shù)"，從而得到最佳候選物的有序表。然后在開始鑒定候選物的短列表之前(基于NOD小鼠中自發(fā)性和激發(fā)的細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性應(yīng)答及NOD小鼠和人血清中測定的體液自身反應(yīng)性)，考慮基于基因本體論功能和信息諸如基因位置的中間分析。支持該方法的微陣列數(shù)據(jù)已經(jīng)被大量獲得。因此，首先通過人類受試者的血清學(xué)分析篩選候選抗原，然后利用轉(zhuǎn)基因小鼠的HLA-DR3、-DR4、DQ2-和-DQ8HLAA2及其他I型HLA糖尿病易感性等位基因篩選針對(duì)候選抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。利用該方法，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白(ZnT8，亦稱為Slc30A8)作為用于與T1D有關(guān)的預(yù)后、診斷和治療方法的新的自身抗原靶標(biāo)。ZnT8是一種看起來是被限定于人和小鼠胰島的胰島素生成P細(xì)胞中的蛋白。本發(fā)明人已經(jīng)證明，ZnT8是患有TlD的人類受試者中自身抗體的靶標(biāo)，并且已經(jīng)鑒定出ZnT8的多態(tài)性變體作為1型糖尿病易感性、自身免疫性狀況、自身抗體特異性和疾病進(jìn)展及嚴(yán)重性的遺傳標(biāo)志物。ZnT8的自身抗體在臨床疾病發(fā)展前出現(xiàn)，4皮認(rèn)為是初期糖尿病的新標(biāo)記物。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ZnT8自身抗體靶向于分子的兩個(gè)不同區(qū)域，這些區(qū)域中的一個(gè)包括3個(gè)不同氨基酸(在確定免疫應(yīng)答的特異性和程度方面均起重要作用)之一。在自身免疫性和糖尿病發(fā)展之前的任何時(shí)間利用單核苷酸多態(tài)性分析確定個(gè)體的基因型提供關(guān)于編碼的變體氨基酸的信息，因此可用于做出關(guān)于治療和護(hù)理的臨床決定。此外，本發(fā)明允許準(zhǔn)確分析針對(duì)ZnT8的自身抗體的特異性，并進(jìn)一步才艮據(jù)免疫系統(tǒng)靶向的ZnT8的變體形式對(duì)抗體進(jìn)行分類。目前，取決于分子的325位變體氨基酸的同一性(Arg、Trp或Gln)的3種主要形式(在本文中被稱為"異表位(isoepitopes)")及包括保守氨基酸(aa325不依賴的)的第四表位已^皮識(shí)別。個(gè)體的應(yīng)答可以;陂分為8種不同的應(yīng)答之一:(l)無；(2)Arg325-限制性的；(3)Trp325-限制性的；(4)Gln325-限制性的；(5)Arg325-和Trp325-限制性的；(6)Arg325-和Gln325-限制性的；(7)Trp325-和Gln325-限制性的；和(8)氨基酸325-不依賴的。在本文中提出自身抗體應(yīng)答的這種層化以提供有關(guān)疾病進(jìn)展的信息，對(duì)于決定如何利用抗原特異性治療劑來治療T1D自身免疫性非常重要。21更具體地，本發(fā)明人表明60%的新發(fā)病TID患者對(duì)于針對(duì)ZnT8的自身抗體是陽性的；20-30%的T1D患者對(duì)于針對(duì)ZnT8的自身抗體是陽性的，而通過生化(GAD、Ins和IA2自身抗體)或組織學(xué)手段(胰島細(xì)胞質(zhì)自身抗體)測量，所述患者對(duì)其他自身抗體是陰性的；*針對(duì)ZnT8的自身抗體的鑒定使患者從低風(fēng)險(xiǎn)(高于l)變?yōu)楦唢L(fēng)險(xiǎn)類型(高于2);*在利用GAD的單一分析形式中，抗ZnT8分析;險(xiǎn)測到90%的新發(fā)病T1D患者；*本發(fā)明能夠大規(guī)模篩選患者；ZnT8自身抗體靶向于分子的兩個(gè)不同區(qū)域(N端和C端)，其后者包括3個(gè)不同氨基酸(在確定免疫應(yīng)答的特性和程度方面均起重要作用)之一。*針對(duì)上面鑒定位點(diǎn)的自身抗體復(fù)合基因編碼的序列，因此確實(shí)是自身反應(yīng)性的，等位基因以高(75%)、中(25%)和低(1%)頻率存在，在人種間顯示顯著變異；*在3歲前患有糖尿病的幼兒具有比預(yù)期更高ZnT8的CC(對(duì)于Arg325基因型是純合的)頻率(75%vs55%)和更低的ZnT8的CT基因型(對(duì)于Arg325和Trp3"基因型是雜合的)頻率(35%vs40%)。年齡更大的兒童顯示與正態(tài)群體中報(bào)道的類似的基因型頻率。因此，CC基因型可以被認(rèn)為是糖尿病的危險(xiǎn)因素。在本發(fā)明之前，在為了鑒定與胰腺P細(xì)胞特異性相關(guān)的分子的出版物中鑒定和報(bào)道了編碼ZnT8—部分的部分核苷酸序列，作為mRNA其在胰腺P細(xì)胞中比在oc細(xì)胞、肝或腎中的表達(dá)更高(Neophytouetal.,1996,Diabetes45:127-133)。兩個(gè)克隆的部分核苦酸序列保存于GENBANK⑧，登錄號(hào)為Z47772(克隆23)和Z47779(克隆41)。但是，該出版物沒有鑒定出ZnT8的全長核苷酸或氨基酸序列，該出版物也沒有鑒定或證明所述部分序列編碼潛在的自身抗原。完整的ZnT8分子最初在2004年由瑞士的一個(gè)小組克隆，該小組主要研究重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(參見Chimientietal.,Biometals2005Aug;18(4):313-7;Chimientietal.，Diabetes2004Sep;53(9):2330畫7;和Seveetal.,BMCGenomics2004May23;5(1):32，每篇均在此完整引入作為參考)。利用生物信息學(xué)方法和免疫組織化學(xué)，Chimienti等觀察到分子在胰島中表達(dá)，他們還報(bào)道了其與胰島素分泌顆粒的結(jié)合。此外，Chimienti等人教導(dǎo)了當(dāng)在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，ZnT8導(dǎo)致胞內(nèi)嚢泡中的鋅積聚，表明ZnT8是參與細(xì)胞質(zhì)鋅向胞內(nèi)嚢泡轉(zhuǎn)運(yùn)的ZnT。但是，在這些報(bào)告中未提及ZnT8是潛在的自身抗原，因此，也未提及其在如本文描述的那些診斷或治療方法中的用途。本發(fā)明人對(duì)ZnT8作為1型糖尿病中自身抗原的重要作用的發(fā)現(xiàn)基于在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的一系列新近實(shí)驗(yàn)，其具體解決了以下問題在新發(fā)病的1型糖尿病患者中ZnT8是否是體液自身反應(yīng)性的靶標(biāo)。本發(fā)明人進(jìn)行的初步研究提示，大約10%患者對(duì)ZnT8顯示中等自身反應(yīng)性(參見實(shí)施例)。所述分析法的進(jìn)一步發(fā)展(利用分子的COOH末端(C端)片段取代全長ZnT8的)(如下所述)顯著增加該分析法的靈敏性，這樣的話在疾病發(fā)病時(shí)直至70%的T1D受試者被檢測是陽性的(相對(duì)低于1%的配對(duì)對(duì)照)。與目前在T1D受試者中使用的基于公知分子胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD65)和IA-2(PTrN)的體液自身反應(yīng)性分析法相比，這種靈敏性與其相當(dāng)或更好。本發(fā)明人還證明ZnT8是獨(dú)立的疾病標(biāo)記物，因此，完善并擴(kuò)展了基于抗體的分析法的靈敏性。通過檢查10年間收集的一系列樣品，顯示在前驅(qū)糖尿病的發(fā)展過程中ZnT8抗體出現(xiàn)得比其他抗體更晚，因此它可以指示胰島炎的最終破壞期，所以它是早期臨床疾病的標(biāo)記物。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ZnT8自身抗體靶向于分子的兩個(gè)不同區(qū)域，這些區(qū)域中的一個(gè)包括3個(gè)不同氨基酸(在確定免疫應(yīng)答的特性和程度方面均起重要作用)之一。因?yàn)榭梢酝ㄟ^基因組的核苷酸序列確定變體氨基酸序列，因此有可能確定編碼的變體氨基酸。本發(fā)明人第一次證明，針對(duì)該位點(diǎn)的自身抗體匹配基因編碼的序列，因此確實(shí)是自身反應(yīng)性的。所述基因顯示3個(gè)已知的等位基因，其以高(75%)、中(25%)和低(1%)頻率存在，并在人種間顯示顯著的變異。這對(duì)如何診斷自身免疫性及如何指導(dǎo)治療性檢測有啟示作用，因?yàn)楦鶕?jù)所需結(jié)果，針對(duì)正確(自身)或錯(cuò)誤(非自身)編碼的序列是有益或有害的。例如，免疫治療的目的可以是誘導(dǎo)免疫耐受性，或相反，分別通過使用或去除免疫元件來編排免疫系統(tǒng)，諸如破壞性效應(yīng)T細(xì)胞或保護(hù)性調(diào)控T細(xì)月包。在本發(fā)明之前，沒有理由懷疑ZnT8可能是被免疫系統(tǒng)的抗體或細(xì)胞武器識(shí)別的自身抗原。實(shí)際上，就本發(fā)明人所知，ZnT8還沒有在自身免疫性糖尿病背景下一皮研究，在免疫學(xué)范圍內(nèi)也沒有關(guān)于該分子的其他公開凝:據(jù)。如上所述，在其他自身免疫病和糖尿病范圍內(nèi)存在關(guān)于使用自身抗原作為診斷劑和治療劑的文獻(xiàn)報(bào)告。但是，這些指向分子諸如胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD65)、IA2、phogrin和熱休克蛋白60,它們從結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫觀點(diǎn)看均與ZnT8無關(guān)。此外,盡管通過例如磷酸化或瓜氨酸化(citrullination)鑒定蛋白的單氨基酸差異或單氨基酸的翻譯后改造是以前就有的,但沒有理由懷疑這種變化將是如本發(fā)明人顯示的自身抗體特異性的具體決定因素。實(shí)際上,單核苷酸多態(tài)性(SNP)編號(hào)rsl3266634和rsl6889462,其編碼人ZnT8編碼序列的非同義變化,已公開于國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。該SNP編碼ZnT8中氨基酸325位的選擇性Arg或Trp(SEQIDNO:2),其與本發(fā)明人研究中鑒定的多態(tài)性變體一致。但是,就本發(fā)明人所知，之前還沒有鑒定出該SNP與1型糖尿病(T1D)的關(guān)系。基因組范圍的關(guān)聯(lián)研究鑒定出ZnT8包含大量與2型糖尿病相關(guān)的SNPs,包括上面引用的rsl3266634(Sladeketal.,2007，Nature.2007Feb22;445(7130):881-5.電子出版2007Febll)，最近還發(fā)表了ZnT8多態(tài)性與P細(xì)胞功能之間關(guān)系的在線報(bào)告(Staigeretal.,2007，PLoSONE.2007Sep5;2(9):e832)。但是，2型糖尿病不是自身免疫病,就本發(fā)明人所知,之前還沒有鑒定出該SNP與1型糖尿病的關(guān)系。此外，沒有證明2型糖尿病患者顯示ZnT8自身抗體。已經(jīng)鑒定出其他T1D自身抗原(即GAD65和IA2)序列中的多態(tài)性變體；但是，在1型糖尿病中這些都不涉及這些自身抗原的自身反應(yīng)性的變化。在IA2中，似乎有mRNA的選擇性剪接，其以組織特異性方式存在，可以想象得到導(dǎo)致逃脫免疫監(jiān)視。但是，這不等同于本發(fā)明人在本文中報(bào)道的遺傳變異類型，即，與自身抗體對(duì)分子的特異性識(shí)別有關(guān)的單氨基酸改變。因此，本發(fā)明人的所述發(fā)現(xiàn)是沒有前例的。本文描述了以下發(fā)現(xiàn)，由普通多態(tài)性編碼的ZnT8的兩種形式定性誘導(dǎo)不同的免疫應(yīng)答，從而將自身抗體測定提高到新的水平。它還提示，分子的不同形式可用于靶向于免疫系統(tǒng)的不同組分，以引起不同的免疫結(jié)果。因此，本發(fā)明人在本文中描述了編碼ZnT8的基因、其衍生的核酸分子、所述基因和核酸分子編碼的ZnT8蛋白或其片段以及所述基因和蛋白的同系24物及相關(guān)藥劑(例如，抗體，激動(dòng)劑，拮抗劑)，和ZnT8的多態(tài)性變體在開發(fā)各種診斷和治療工具及分析法中的用途，和所述基因、核酸、蛋白、同系物、和/或相關(guān)藥劑和/或包括上述物質(zhì)的組合物或制劑在開發(fā)各種診斷和治療工具及分析法中的用途或靶向作用。所述工具及分析法包括，但不限于1.在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中用于檢測糖尿病相關(guān)自身免疫性的分析法，基于針對(duì)ZnT8的抗體應(yīng)答，分子的特定結(jié)構(gòu)域及衍生自該蛋白的肽。這種分析法以放射免疫沉淀分析法、ELISAs、時(shí)間分辨焚光和化學(xué)發(fā)光(luminescence)分析法的形式提供，盡管本發(fā)明還包括其他形式。這種分析法可用于a.預(yù)測個(gè)體或受試者組中對(duì)1型糖尿病患病的易感性；b.監(jiān)測自身免疫性從初始的良性自身反應(yīng)性向破壞性胰島炎的進(jìn)展；和/或c.監(jiān)測目的在于預(yù)防或改善前驅(qū)糖尿病狀況下自身免疫性的治療的效果。這種治療可以基于廣泛的潛在免疫抑制性藥劑，包括那些根據(jù)ZnT8分子本身設(shè)計(jì)的藥劑。2.在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中用于檢測糖尿病相關(guān)自身免疫性的表位特異性自身抗體分析法，基于針對(duì)ZnT83種變體形式的探針，并使用編碼所述3種形式的重組蛋白作為竟?fàn)巹┗蜃钄鄤?。這種分析法可以采用放射免疫沉淀分析法、ELISAs、時(shí)間分辨熒光和化學(xué)發(fā)光分析法的形式，盡管本發(fā)明還包括其他形式。這種分析法可用于a.如上文(l)，通常根據(jù)抗體的發(fā)生率、應(yīng)答水平、抗體滴度或應(yīng)答的親合力、親和性或克隆形成能力預(yù)測個(gè)體和受試者組中對(duì)1型糖尿病患病的易感性；b.在特定個(gè)體中確定3個(gè)表位中哪個(gè)作為靶標(biāo)，及在疾病和治療過程中確定應(yīng)答特異性的變化以便測量進(jìn)展和針對(duì)治療的應(yīng)答；c.通過基因型的組合確定免疫應(yīng)答的可能靶向表位特異性，從而預(yù)先確定最佳治療形式；和/或d.監(jiān)測目的在于預(yù)防或改善前驅(qū)糖尿病狀況下自身免疫性的治療的效果。這種治療可以基于廣泛的潛在免疫抑制性藥劑，包括那些根據(jù)ZnT8分子本身設(shè)計(jì)的藥劑。3.在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中用于檢測糖尿病相關(guān)自身免疫性的分析法，基于針對(duì)所述蛋白和衍生肽的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性，利用淋巴細(xì)胞增殖性應(yīng)答、MHCI型和II型四聚體試劑和ELISPOT分析。4.針對(duì)抗原的標(biāo)記抗體，基于自身抗體與標(biāo)記抗體的竟?fàn)幍臏y定作為分析工具。5.抗自發(fā)性抗體作為配體的模擬物。7.基于ZnT8的試劑用于進(jìn)一步的診斷目的。這些包括針對(duì)所述分子、肽、肽模擬物和變異肽的多克隆及單克隆抗體，當(dāng)它們在體內(nèi)施用時(shí)，能夠影響病程，或可以在體外使用以刺激來自自身免疫受試者的T細(xì)胞采取不同表型，從而變得更具有耐受性。8.抗原特異性免疫治療劑(基于同源肽表位或結(jié)合其MHC分子的變異肽)及對(duì)T細(xì)胞有毒性的試劑(它們將與肽/MHC復(fù)合物結(jié)合)，或識(shí)別抗原肽的單克隆抗體，或模擬物諸如分離的分子或與另一分子組分復(fù)合的分子(諸如肽/MHC復(fù)合物或肽/T細(xì)胞受體復(fù)合物，它們將作為正常肽相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑或拮抗劑)。根據(jù)個(gè)體的基因型和當(dāng)時(shí)優(yōu)勢抗體的表位特異性，治療劑可以符合抗體的特異性，或不符合以刺激可選的免疫應(yīng)答。9.使用ZnT8分子作為重組蛋白，以保護(hù)性而不是破壞性的方式改變免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。這包括使用重組蛋白，該蛋白的化學(xué)或物理改造形式，衍生自該蛋白的肽序列，化學(xué)或物理改造的肽及肽同系物，可以用作疫苗。10.制備含ZnT8表位特異性肽或試劑(諸如小分子或抗體)的效應(yīng)分子的偶聯(lián)物或組合，以高度特異性的靶向于維持自身免疫反應(yīng)的免疫過程。這基于以下原理，抗體是特異性B細(xì)胞的產(chǎn)物，B細(xì)胞還充當(dāng)針對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，而T細(xì)胞反過來提供信號(hào)以活化B細(xì)胞并造成其分化。11.基于人和小鼠ZnT8mRNA的cDNA構(gòu)建體，包括缺失，嵌合構(gòu)建體，單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變以改變編碼序列，及使用這種構(gòu)建體作為診斷劑或研究免疫應(yīng)答的特異性；12.表位標(biāo)記的融合蛋白，包括GFP、GST、NUS和聚組氨酸序列，在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中表達(dá)ZnT8的載體中，及使用這種構(gòu)建體作為診斷劑或研究免疫應(yīng)答的特異性。13.用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)ZnT8的腺病毒構(gòu)建體，包括多態(tài)性變體及表位標(biāo)記的報(bào)告蛋白構(gòu)建體，及使用這種構(gòu)建體作為診斷劑或研究免疫應(yīng)答的特異性。圖20顯示在人類中識(shí)別的Slc30A基因的IO種變體的比較，盡管這些中的1種(Slc30A9)可能不是真正的同系物，考慮到其低的氨基酸序列同一性和相似性(在上文括號(hào)中顯示)。ZnT8的最接近親緣物是Slc30A2(溶酶體蛋白)、Slc30A3(與突觸小泡有關(guān)的蛋白)和Slc30A4。用Slc30A8激發(fā)的兔抗體顯示與Slc30A3的交叉反應(yīng)性，這表明反應(yīng)性或交叉反應(yīng)性還可能存在于其他人類自身免疫病中，像多發(fā)性硬化。相反，針對(duì)Slc30A8反應(yīng)性T細(xì)胞的糖尿病Slc30A8自身抗體還可能以其他組織作為靶標(biāo)，從而導(dǎo)致糖尿病的并發(fā)癥。因此，本發(fā)明的工具和方法被認(rèn)為適用于T1D以外的自身免疫病，諸如但不限于，全身性紅斑狼瘡，重癥肌無力，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，乳糜瀉，自身免疫性曱狀腺炎，艾迪生氏病，格雷夫斯氏病和風(fēng)濕性心臟炎。本發(fā)明的方法適用于任意自身免疫病，其中Slc30A8(ZnT8)或同系物是靶標(biāo)或自身抗原(自身抗體或T細(xì)胞自身抗原)。此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明，在一些情況下含有ZnT8自身抗體的個(gè)體顯示對(duì)Slc30A基因家族(編碼其他ZnT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的其他成員的反應(yīng)性。例如，本發(fā)明人證明對(duì)ZnT3的一些反應(yīng)性，ZnT3通常被認(rèn)為是神經(jīng)元特異的亞型。該發(fā)現(xiàn)的重要啟示在于，這種反應(yīng)性在胰腺外的組織中可能造成病理性結(jié)果。眾所周知糖尿病尤其是l型糖尿病與周圍神經(jīng)病有關(guān)，而抗原的交叉反應(yīng)性可能體現(xiàn)這些疾病之間的聯(lián)系。因此，本發(fā)明的工具和方法被認(rèn)為適用于通過抗原交叉反應(yīng)性聯(lián)系的其他疾病，包括但不限于，周圍神經(jīng)病。本文顯示的本發(fā)明方面包括下列臨床觀察前馬區(qū)沖唐尿病(prediabetes):-ZnT8自身抗體通常出現(xiàn)較早，在GADA和IAA及IA2A之后-其出現(xiàn)不存在嚴(yán)格的先后(hierarchy)，ZnT8可以比糖尿病早1-12年新發(fā)病(newonset)-發(fā)病2-3年后ZnT8的流行增加，60-80%在16-18年達(dá)到最大發(fā)病后(postonset)-通過C肽測量，ZnT8在發(fā)病后下降，半衰期為l年，可能與P細(xì)胞群的損失平行。-ZnT8的持續(xù)性低于GAD或IA2。-在沒有可測量的C肽情況下ZnT8可以持續(xù)，反之亦然。z"rs核磁，蛋力，,在遂^沐，^發(fā)，戎體，和jg合浙27絲u，裙錄郝麟/y在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用編碼ZnT8的基因，以及源自或包括該基因的編碼區(qū)和/或調(diào)控區(qū)一部分的核酸分子，和包括該基因的任意多態(tài)性變體的核酸分子。本發(fā)明還包括使用任意ZnT8蛋白，其同系物或片段，包括其任意多態(tài)性變體，或其激動(dòng)劑或拮抗劑，包括由上述引用的基因或核酸分子編碼的那些。新的ZnT8核酸分子和蛋白(包括各種新的ZnT8的同系物，變體，片段，融合蛋白，和嵌合蛋白)及其激動(dòng)劑和拮抗劑，均被本發(fā)明包括為物質(zhì)的組成。本發(fā)明進(jìn)一步包括可用于本發(fā)明各種方法的ZnT8抗體，其抗原結(jié)合片段和抗原結(jié)合肽。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白8(ZnT8，亦稱為Slc30A8)是由ZnT8基因編碼的369個(gè)氨基酸的蛋白。與其他ZnT蛋白一樣，ZnT8包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在跨膜結(jié)構(gòu)域IV和V之間包含組氨酸富集環(huán)(參見Chimientietal.，2004，Diabetes,上文，和本文所示圖4)。該蛋白只在胰腺中轉(zhuǎn)錄，更具體的，只在胰島的P細(xì)胞中表達(dá)。如Chimienti等所述，同上，ZnT8基因位于染色體8q24.ll上，包含8個(gè)外顯子，跨越37kb。人ZnT-8蛋白的cDNA和推定氨基酸序列提供于Chimienti等，同上，該出版物顯示人ZnT8的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和推定的剪接(參見Chimienti等的圖1A,同上)。編碼人ZnT8的cDNA序列和推定的氨基酸序列顯示于Chimienti等(同上)的圖IB,其中還顯示了預(yù)測的ZnT8跨膜結(jié)構(gòu)域。Chimienti等(同上)的圖1C顯示了hsZnT-8、mmZnT-8和mZnT-8氨基酸序列的比較，用黑色框標(biāo)明相同的殘基。在本文中編碼人ZnT8的核酸序列用SEQIDNO:l表示。SEQIDNO:l編碼人ZnT8蛋白，其氨基酸序列在本文中用SEQIDNO:2表示。小鼠ZnT8也是本領(lǐng)域公知的。編碼小鼠ZnT8的核酸序列用SEQIDNO:3表示。SEQIDNO:3編碼小鼠ZnT8蛋白，其氨基酸序列在本文中用SEQIDNO:4表示。編碼人ZnT8的核芬酸序列還描述于國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)NM—173851(gi:64762488)。人ZnT8的氨基酸序列也可參見NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)NP—776250(gi:64762489)。編碼大鼠ZnT8的核苷酸序列也是已知的。本文引用的數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)和出版物中包含的所有信息也在此S1入作為參考。這些序列的各種多態(tài)性變體、片段、嵌合蛋白和融合蛋白在本文其他地方描述，也包括在本發(fā)明中。Chimienti等，同上，圖3A-D，提供ZnT8結(jié)構(gòu)分析的進(jìn)一步描述，包28括預(yù)測的ZnT8跨膜結(jié)構(gòu)域和組氨酸富集域的位置，所述組氨酸富集域是ZnT家族的其他成員共有的(參見Chimienti等)。這些結(jié)構(gòu)模體在大鼠和小鼠ZnT-8中是保守的。在人ZnT8蛋白中，相對(duì)于SEQIDNO:2，保守的組氨酸出現(xiàn)在197、203和205位。在小鼠中，SEQIDNO:4196位的組氨酸對(duì)應(yīng)人Hisl97，SEQIDNO:4204位的組氨酸對(duì)應(yīng)人His205。因此，在本發(fā)明之前可以獲得大量有關(guān)ZnT8核酸和氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能信息。本發(fā)'效逸括的z"rs的^7系參、f沐、^度和襲位本發(fā)明還包括許多天然存在和合成得到的ZnT8變體(同系物)，包括基因中的核苷酸和氨基酸多態(tài)性，通過選擇性起始位點(diǎn)編碼的蛋白，和各種片段，融合蛋白及嵌合蛋白，和編碼所述片段、融合蛋白及嵌合蛋白的核酸分子。這些多核苷酸和蛋白或肽可用于本發(fā)明的各種診斷、治療和研究應(yīng)用，如下文所述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本文所述任意方法的ZnT8的同系物或變體包括下列氨基酸序列，基本上由下列氨基酸序列組成，由下列氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與野生型ZnT8蛋白的氨基酸序列、尤其是本文描述的人ZnT8蛋白(參加上文的討論)至少約45%，或至少約50%,或至少約55%，或至少約60%，或至少約65%，或至少約70%,或至少約75%,或至少約80%，或至少約85%,或至少約90%,或至少約95%相同，或至少約95%相同，或至少約96%相同，或至少約97%相同，或至少約98%相同，或至少約99%相同(或45%到99%之間的任意百分比同一性，全整數(shù)增加)。在一個(gè)實(shí)施方案中，同系物包括下列氨基酸序列，基本上由下列氨基酸序列組成，或由下列氨基S吏序列組成，所述氨基酸序列與ZnT8蛋白天然存在的氨基酸序列低于100%相同，低于約99%相同，低于約98°/。相同，低于約97%相同，低于約96%相同，低于約95°/。相同，等等，按1%增加，到低于約70%相同。本發(fā)明還包括各種天然存在和合成得到的ZnT8變體，它們是通過選擇性起始位點(diǎn)編碼的蛋白，以及其片段(肽)，融合蛋白，或其嵌合蛋白，可用于本文描述的任意診斷、治療或研究方法。例如，具有選擇性起始位點(diǎn)的人ZnT8的天然變體在本文中用SEQIDNO:5表示。該蛋白跨越SEQIDNO:2的氨基酸50到367位。參照圖3，顯示的基因結(jié)構(gòu)是本發(fā)明人通過比對(duì)公開的EST序列和基因推斷的。但是它不同于被認(rèn)為是"正常的"8外顯子基因結(jié)構(gòu)。具體來說，評(píng)價(jià)大約210個(gè)EST序列，并鑒定顯著的剪接位點(diǎn)變化，其可能導(dǎo)致組織表達(dá)的潛在變化，因?yàn)?，UTR被改變。在外顯子4被剪接的情況下，序列越過閱讀框和截短的轉(zhuǎn)錄物，通常是MEFLERAYLVNDKAAKMYAFTLERRSCK*(SEQIDNO:6)，盡管另一種截短形式是用SEQIDNO:7歸FLERTYLVNDKAAKMYAFTLERRSRK"表示，其中第7位是蘇氨酸取代丙氨酸，第27位是精氨酸取代半胱氨酸?？雌饋硐掠蜯et可以用作選擇性起始位點(diǎn)，產(chǎn)生該序列NH2末端的截短型。如果這以組織特異性方式(例如在胸腺而不在胰腺中)存在，然后出現(xiàn)可以被免疫系統(tǒng)靶向的隱蔽表位。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室有證據(jù)證明，這種出現(xiàn)有助于針對(duì)其他糖尿病相關(guān)自身抗原(IA-2和IGRP)的自身反應(yīng)性。選擇性翻譯產(chǎn)物也可以作為"外來"肽表位被呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)。此外，已經(jīng)鑒定了全長ZnT8蛋白的天然多態(tài)性變體，其包括但不限于，用組氨酸取代SEQIDNO:218位的酪氨酸，用纈氨酸取代SEQIDNO:2261位的丙氨酸，和用色氨酸或谷氨酰胺取代SEQIDNO:2325位的精氨酸。本發(fā)明特別對(duì)ZnT8的多態(tài)性變體(尤其是在325位)感興趣，將在下文詳細(xì)描述。包括所述多態(tài)性的蛋白、變體、片段、嵌合蛋白和融合蛋白，及編碼它們的核苷酸均被本發(fā)明包括。參照圖4A和4B，預(yù)測NH2和COOH末端位于膜的相同一側(cè)。就參考序列而言，N末端是74aa，就具有選擇性起始位點(diǎn)的亞型而言，N末端是25aa。94aa的COOH末端包括1型糖尿病中的主要體液免疫決定簇。該表位隱含于全長分子，位于aa268和358之間，這是通過去除最后15aa造成的對(duì)抗原性的最小影響來證明的。令人驚訝的是，這是一個(gè)在不同物種的ZnT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白間高度保守的區(qū)域。因此，有可能產(chǎn)生抗ZnT8蛋白的自身反應(yīng)性(只針對(duì)胰腺P細(xì)胞)，其還可以通過傳染性生物的同源蛋白產(chǎn)生。對(duì)于另一糖尿病自身抗原IA2已經(jīng)觀察到類似的聯(lián)系(未公開的工作)。這是一個(gè)通則，然后就可以假設(shè)T1D中的自身免疫性可能由含類似Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的微生物的輕度感染引發(fā)。同樣，有可能用傳染原的指定表位進(jìn)行免疫。第二更弱的表位位于不保守的N末端。鑒定出的表位看起來位于細(xì)胞內(nèi)部，就像自身抗原IA2和GAD65—樣。參照圖4B,位于附圖頂端的短環(huán)(包括用97-105;164-168和239-252位表示的位置)將可能朝向分泌途徑的細(xì)胞元件的內(nèi)腔。這有可能包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，胰島素分泌顆粒和最終包括細(xì)胞間隙。有可能它們暴露于細(xì)胞表面，30在胰島素顆粒的正常胞吐作用期間、正常分泌期間或如果細(xì)胞以某些方式#皮損傷。因此本文包括針對(duì)呈現(xiàn)這些環(huán)的肽的抗體用于檢測ZnT8，它從而可以用作體內(nèi)成像p細(xì)胞群的生物標(biāo)記物，以測定細(xì)胞活性(分泌更多等于更暴露)和在正常發(fā)育期間監(jiān)測從其他來源諸如干細(xì)胞的p細(xì)胞生成。本發(fā)明的一種抗體被提議激發(fā)抗小鼠ZnT8的腔結(jié)構(gòu)域2序列(SEQIDNO:4的163-183位，或ERLLYPDYQIQAGIMITVSGC)用于細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用。此夕卜，已經(jīng)制備出針對(duì)人C末端(作為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白)的抗體(參見下文)。利用本文提供的教導(dǎo)，可以產(chǎn)生針對(duì)N端和C端區(qū)域序列的其他抗肽抗體。還可以制備抗磷酸肽抗體。在第二胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和C端環(huán)中存在分子磷酸化的潛在位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的磷酸化可以決定分子在細(xì)胞中的定位及其作為Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。新一代治療劑以蛋白激酶作為靶標(biāo)，因此有可能通過藥物施用調(diào)節(jié)體內(nèi)的蛋白活性。第三胞內(nèi)環(huán)(描述為圖4B中SEQIDNO:2的殘基196-215)富含組氨酸殘基(SEQIDNO:2的197、203和205位)，其在結(jié)合Zn和其他重金屬中可能是重要的。這可能屬于分子將鋅從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到包膜小室內(nèi)腔(構(gòu)成分泌途徑)的機(jī)制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包括ZnT8的片段用于診斷和治療方法，或用于抗體的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，ZnT8蛋白、蛋白部分(片段，部分，結(jié)構(gòu)域，等等)或蛋白區(qū)域或表位的大小底限是足以作為產(chǎn)生抗體的表位或保守結(jié)合表面或作為體外分析的靶標(biāo)的大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白長度為至少約4，5，6，7或8個(gè)氨基酸(例如，適合作為抗體表位或作為分析法中的可檢測肽)，或長度為至少約25個(gè)氨基酸，或長度為至少約50個(gè)氨基酸，或長度為至少約100個(gè)氨基酸，或長度為至少約150個(gè)氨基酸，等等，在4個(gè)氨基酸和直到ZnT8蛋白全長或其部分或更長之間的任意長度，為全整凄t(例如，8，9,10，...25，26，...300，301,...)。就《壬意物種的ZnT8蛋白而言，本發(fā)明包括任意長度的任意N端片段、C端片段、其嵌合體或缺失片段，其中人ZnT8是優(yōu)選的，包括其任意多態(tài)形式。表1和圖15-19、21和25,例如，描述了有關(guān)ZnT8的表位和異表位定位的其他信息，包括對(duì)于自身反應(yīng)性非常重要的C末端殘基的鑒定。所述信息允許在本文描述的任意診斷、預(yù)后和治療方法中設(shè)計(jì)、產(chǎn)生和使用ZnT8的各種片段和同系物。正如以上的討論，圖4A和4B顯示預(yù)測的ZnT8蛋白的^,膜結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域給分析法的設(shè)計(jì)提出一個(gè)問題，因?yàn)樗鼈兺ǔ１恢|(zhì)圍繞并且非常有粘性，所以該蛋白或者沉淀或者不折疊。這類區(qū)域可能是T細(xì)胞的靶標(biāo)，因此被包括用于本發(fā)明的片段，但它們不太可能是抗體的靶標(biāo)。全長序列顯示對(duì)循環(huán)抗體的反應(yīng)性，并且所述反應(yīng)性在糖尿病中比在對(duì)照中更高。但是該分析法只檢測了新近發(fā)病個(gè)體中的10-20%。因此，本發(fā)明人提供選擇性探針，即下文闡述的N端、C端和Zn結(jié)合環(huán)探針。用于本發(fā)明的尤其優(yōu)選的ZnT8蛋白片段是ZnT8的任意N端或C端片段，其中C端片段是特別優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的ZnT8片段是ZnT8N端和C端片段的混合物或雜交物(嵌合體)。尤其優(yōu)選的ZnT8片段包括來自人ZnT8的約C端110殘基到約C端8殘基的任意C端片段，基本上由來自人ZnT8的約C端110殘基到約C端8殘基的任意C端片段組成，或由來自人ZnT8的約C端110殘基到約C端8殘基的任意C端片段組成。尤其優(yōu)選的C端片段包括人ZnT8的101和102C端殘基?？捎糜诒景l(fā)明各種實(shí)施方案的各種蛋白、變體、嵌合蛋白和片段顯示下文的表l。任何蛋白、變體、嵌合蛋白或片段可添加一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基(例如，在片段N端的甲硫氨酸，如對(duì)于下文的C端片段所示)。此外，根據(jù)提供的這些構(gòu)建體和實(shí)施例提供的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地產(chǎn)生其他構(gòu)建體，其中添加的氨基酸被缺失，嵌合體結(jié)構(gòu)域的順序^^皮逆轉(zhuǎn)，或本文描述的兩個(gè)或更多個(gè)片段或其部分被組合產(chǎn)生其他嵌合蛋白。表1N3探針(N端片段)SEQIDNO:2的aa1-74Mr=8576pl=6.72MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKL(SEQIDNO:8)C4Probe(C端片段)SEQIDNO:2的aa268-369Mr11235Pl=4.95MKDFSILLMEGVPKSLN丫SGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:9)截短的C端探針1(在本文描述的分析法中是有活性的)MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMES(SEQIDNO:10)截短的C端探針2(在本文描述的分析法中是無活性的)MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTM(SEQIDNO:")突變的C端探針(在本文描迷的分析法中是具有降低的活性)MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSASFTMASLTIQMAAPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:12)鋅結(jié)合環(huán)VLTWLHQRCLGHNHKEVQANASVRA(SEQIDNO:13)M275探針SEQIDNO:2的aa275-369Mr10414Pl=5.21MEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:14)M282探針SEQIDNO:2的aa283-369Mr9703Pl=5,15MNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:15)M282探針SEQIDNO:2的aa290-369Mr8699Pl=5.08MILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:16)M300探針SEQIDNO:2的aa300-369Mr7845Pl=5.50MHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:17)M305探針SEQIDNO:2的aa300-369Mr7257Pl=4.74MWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:化)C4探針SEQIDNO:2的Aaa293-369Mr2827Pl=4.68(Sail切割)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILA(SEQIDNO:19)C4探針SEQIDNO:2的Aaa325-369Mr6109Pl=6.13(Hpall切割)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAAS(SEQIDNO:20)C4探針SEQIDNO:2的Aaa344-369Mr8282Pl=8.87(HphI切割)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFT(SEQIDNO:21)33C4探針SEQIDNO:2的Aaa351-369Mr9093Pl=8.87(BstXI切割)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:22)C4探針SEQIDNO:2的Aaa357-369Mr9752Pl=6,86(BstNI切割)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVD(SEQIDNO:23)C4野生型SEQIDNO:2的aa268-369Mr11235PI-4.95(突變用下劃線表示)MDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDN。:24)其他C4突變探針(SEQIDNO:9，含有相對(duì)于SEQIDNO:2位置的突變)K340A;Mr=11177pl=4.74H345A;Mr=11168pl=4.74E352A;Mr="176pl=5.17S353A;Mr=11218pl=4.95S353D;Mr=11262pl=4.77三元組K340A,H345A，E345A;Mr=11053pl=4.67小鼠ZnT8M酸序列變體mSLC30a8C端Met266,Gln324MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASQDSQSVRTGIAQALSSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:40)mSLC30a8C端Met266,Arg324MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASRDSQSVRTGIAQALSSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:41)mSLC30a8C端Met266，Trp324MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASWDSQSVRTGIAQALSSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:42)mSLC30a8C端Met266'Lys339(插入)MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASQDSQSVRTGIAQALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:43)mSLC30a8C端Met266，Arg324，Lys339(插入)MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASRDSQSVRTGIAQALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:44)mSLC30a8C端Met266，Trp324，Lys339(插入)MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASWDSQSVRTGIAQALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:45)Met266REKK突變體TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVK曰ILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASQDSQSVRREIAKALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:46)Met266RREKK突變體(R325;TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASRDSQSVRREIAKALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:47)Met266WREKK突變體(R325;TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340MKDFSILLMEGVPKGLSYNSVKEIILAVDGVISVHSLHIWSLTVNQVILSVHVATAASWDSQSVRREIAKALSKSFDLHSLTIQIESAADQDPSCLLCEDPQD(SEQIDNO:48)人ZnT8^J^酸序列變體hSLC30a8C端267Met，325ArgMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:49)hSLC30a8C端267Met,325GlnMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:50)hSLC30a8C端267Met,325TrpMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:51)hSLC30A8連接子序列PSTPPGSSGGG(SEQIDNO:52)hSLC30a8C端二聚體1Met,59Arg,連接子，172Arg(59和172位對(duì)應(yīng)于野生型中的aa325)MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:53)hSLC30a8C端二聚體1Met，59Arg,連接子，172GlnMKDFSILLMEAHVATAASRDPCDPSTPPGSHIWSLTMNQVGVPKSLNYSGSQWRREIAKSGGGKDFSILILSAHVATAAVKELILAVDGALSKSFTMHSLMEGVPKSLNSQDSQWRREPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:54)VLSVHSLHIWLTIQMESPVDYSGVKELILAIAKALSKSFTSLTMNQVILSQDPDCLFCEDVDGVLSVHSLMHSLTIQMEShSLC30a8C端二聚體1Met,59Arg,連接子，172TrpMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:55)hSLC30a8C端二聚體1Met,59Gln,連接子，172GlnMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGAHVATAASQDSQWRREIAKALSKSFTMHSPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSQWRREPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:56)VLSVHSLHIWLTIQMESPVDYSGVKELILAIAKALSKSFTSLTMNQVILSQDPDCLFCEDVDGVLSVHSLMHSLTIQMEShSLC30a8C端二聚體1Met,59Gln，連接子，172ArgMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILWDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:57)hSLC30a8C端二聚體1Met，59Gln,連接子，172Trp(59和172位對(duì)應(yīng)于野生型中的aa325)MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSWWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:58)hSLC30a8C端二聚體1Met,59Trp,連接子，172TrpMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:59)VLSVHSLHIWLTIQMESPVDYSGVKELILAIAKALSKSFTSLTMNQVILSQDPDCLFCEDVDGVLSVHSLMHSLTIQMEShSLC30a8C端二聚體1Met,59Trp,連接子，172ArgMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:60)VLSVHSLHIWLTIQMESPVDYSGVKELILAIAKALSKSFTSLTMNQVILSQDPDCLFCEDVDGVLSVHSLMHSLTIQMEShSLC30a8C端二聚體1Met，59Trp,連接子，172GlnMKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSPCDPSTPPGSSGGGKDFSILLMEGVPKSLNHIWSLTMNQVILSAHVATAASQDSQWRREPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:61)VLSVHSLHIWLTIQMESPVDYSGVKELILAIAKALSKSFTSLTMNQVILSQDPDCLFCEDVDGVLSVHSLMHSLTIQMEShSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325變體MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKLCSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:62)37hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325變體MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKLCSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDN〇:63)hSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325變體-選擇性起始密碼子MYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKLCSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:64)hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325變體-選擇性起始密碼子MYHCHSGSKPTEKGANEYAYA隨KLCSGGGKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:65)hSLC30a8C端/N端融合野生型Arg325變體MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILWDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDGGGMEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKLCS(SEQIDNO:66)序列hSLC30a8無TM節(jié)段Trp325變體MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKLCSASDAAHLUDSSKPPSKRLTFGWHRAECERLLYPDYQIQATLHQRCLGHNHKEVQANASVRKPEYKKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDSQWRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQIDNO:67)表1列出的序列由本發(fā)明人設(shè)計(jì)，以檢測患者自身反應(yīng)性的各種特征，并設(shè)計(jì)分析法，其能夠更好的在患者之間進(jìn)行鑒別，或相反地，是泛反應(yīng)性的。下面列表顯示本發(fā)明人如何根據(jù)患者自身反應(yīng)性(患者血清樣品)將如上所述的序列分類。不在括號(hào)內(nèi)的序列表示鑒定出針對(duì)包含該序列的構(gòu)建體的患者反應(yīng)性；括號(hào)內(nèi)顯示的序列表示降低的活性或者改變的活性，這可能是還有待確定的其他特異性造成的。對(duì)于一個(gè)特定樣品類型來說，序列號(hào)識(shí)別的缺失表示缺乏反應(yīng)性。就Gln325限制性反應(yīng)性來說，信息是有限的，因?yàn)樵谝呀?jīng)檢驗(yàn)的超過500位患者中迄今為止只鑒定出1位患者血清。*N端反應(yīng)性樣品:SEQIDNOs:8，63,64，65*Arg325-限制性反應(yīng)性:SEQIDNOs:9,10，(11),(12)，14，15,(16到21)，(22),23，(24to30)，(40)，41，(42)，(43)，44,47，49，(52)，53,54，55,57,60，63，65*Trp325-限制性反應(yīng)性:SEQIDNOs:(40)，(41),42,(43)，45,48，51，(52),55，58，59，60,61,62,64*Gln325-限制性反應(yīng)性:SEQIDNOs:40,(41)，(42),50*氨基酸325非依賴的:SEQIDNOs:9to16,(17到21),22,23，24，(25到30)，(40，41),42，(43),47到51，(52)，53到65本發(fā)明還包括ZnT8蛋白，其包括抗原肽或T細(xì)胞表位(也稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合肽)，基本上由抗原肽或T細(xì)胞表位(也稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合肽)組成，或由抗原肽或T細(xì)胞表位(也稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合肽)組成。這類肽包括能夠以下列方式結(jié)合MHC蛋白的任意肽，所述方式使得MHC-肽復(fù)合物能夠結(jié)合T細(xì)胞受體(TcR),在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答(例如，刺激性或致耐受應(yīng)答，如下所述)。MHC-結(jié)合肽(結(jié)合MHC分子，并且與MHC分子一起被T細(xì)胞受體識(shí)另")被認(rèn)為是抗原肽。實(shí)際上，在抗原結(jié)合MHC蛋白前，通過抗原水解產(chǎn)生的肽先經(jīng)歷水解。I型MHC蛋白通常呈遞來自細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中主動(dòng)合成蛋白的抗原肽。與此相反，II型MHC蛋白通常呈遞來自外源蛋白(進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞途徑)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中合成蛋白的抗原肽。胞內(nèi)運(yùn)輸使得抗原肽與MHC蛋白結(jié)合。所獲MHC肽復(fù)合物然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，在那里它被提供與TcR相互作用。肽與MHC肽結(jié)合溝的結(jié)合可以控制被TcR識(shí)別的MHC和/或肽氨基酸殘基的空間排列。這種空間控制部分是由肽和MHC蛋白之間形成的氬^t造成的。優(yōu)選的，T細(xì)胞表位的長度為約5到約40個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選的為約6到約30個(gè)氨基酸殘基,和甚至更優(yōu)選的為約8到約20個(gè)氨基酸殘基，和甚至更優(yōu)選的在約9到11個(gè)氨基酸殘基之間，包括長度為5到40個(gè)氨基酸之間的任意大小肽，全整數(shù)增加(即，5，6,7,8，9...40)。盡管天然MHCII型結(jié)合肽在約9-40個(gè)氨基酸之間變化，在幾乎所有的情況下，所述肽可以截短到約9-11個(gè)氨基酸核心，而不損失MHC結(jié)合活性或T細(xì)胞識(shí)別。與多核芬^^蛋冷成應(yīng)^"^的一凝定乂和實(shí)滋才黃除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)，核酸化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這類技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有詳盡解釋，諸如，MethodsofEnzymology(酶學(xué)方法)，Vol.194,Guthrieetal.，eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1990);MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第二版(Sambrooketal.,1989)和MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第三版(SambrookandRussel,2001)，(本文中統(tǒng)稱為"Sambrook，，)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)(RM.Ausubeletal"eds.，1987，包括直到2001的補(bǔ)充)；PCR:ThePolymeraseChainReaction(PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，(Mullisetal.,eds.,1994);HarlowandLane(1988)Antibodies,ALaboratoryManualG元體，實(shí)馬全手冊)，ColdSpringHarborPublications,NewYork;HarlowandLane(1999)UsingAntibodies:ALaboratoryManual《吏用抗體實(shí)-驗(yàn)手冊)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(本文中統(tǒng)稱為"HarlowandLane"),Beaucageetal.eds.,CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2000)。根據(jù)本發(fā)明，分離的多核苷酸(還稱為分離的核酸分子)是已經(jīng)從其天然環(huán)境轉(zhuǎn)移(例如，已經(jīng)過人工處理)的核酸分子，其天然環(huán)境是自然界中發(fā)現(xiàn)所述核酸分子的基因組或染色體。因此，"分離的"不是必需反映核酸分子純化的程度，但表示該分子不包括完整的基因組或完整的染色體(其中發(fā)現(xiàn)自然界中的該核酸分子)。用于本發(fā)明的多核苷酸通常是本發(fā)明基因(正義或非正義鏈)的一部分，它們適合用作鑒定指定樣品中全長基因(或其部分)的雜交探針或PCR引物，或適用于編碼ZnT8蛋白或其片段，或適合作為治療劑(例如，反義或適體)。分離的核酸分子可以包括基因或基因的一部分(例如，調(diào)控區(qū)或啟動(dòng)子)，例如，以產(chǎn)生報(bào)告構(gòu)建體或重組蛋白。包括基因的分離的核酸分子不是包括該基因的染色體的片段，而是包括該基因相關(guān)的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)，但沒有相同染色體上天然存在的其他基因。分離的核酸分子還可以包括側(cè)翼(即，序列的5'和/或3'端)有額外核酸的指定核酸序列，所述額外的核酸在自然界中通常不在指定核酸序列的側(cè)翼(即，異源序列)。分離的核酸分子可以包括DNA,RNA(例如，mRNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如，CDNA)。盡管短語"核酸分子"主要是指物理上的核酸分子，短語"核酸序列"主要是指核酸分子中核苷酸的序列，但這兩個(gè)短語可以互換使用，尤其是當(dāng)其涉及能夠編碼蛋白的核酸分子或核^列時(shí)。優(yōu)選的，利用DNA重組技術(shù)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成來產(chǎn)生本發(fā)明的分離的核酸分子。本發(fā)明核酸分子或多核苷酸的大小底限如下足以編碼具有所需生物活性的蛋白，足以形成探針或寡核苷酸引物，所述探針或寡核苷酸引物能夠與編碼天然蛋白的核酸分子的互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定的雜交物(例如，在中等、高或非常高的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下)，或另外在本文所述的分析法或任意治療方法中用作靶標(biāo)或藥劑。如果多核苷酸是寡核苷酸探針或引物，該多核香酸的大小取決于核酸組成，核酸分子與互補(bǔ)序列之間的百分比同源性或同一性，以及雜交條件本身(例如，溫度，鹽濃度，和曱酰胺濃度)。用作寡核苷酸探針或引物的多核苷酸的大小底限是長度為至少約5個(gè)核苷酸，優(yōu)選的范圍為約5到約50或約500個(gè)核苷酸或更多(1000,2000,等等)，包括其中的任意長度，整數(shù)增加(即，5，6，7，8，9,10，…33，34,...256，257，…500…1000…)，和優(yōu)選的為約10到約40個(gè)核苷酸，和最優(yōu)選的長度為約15到約40個(gè)核苷酸。一方面，如果核酸分子是富含GC的，則寡核苷酸引物或探針的長度為至少約12到約15個(gè)核芬酸，如果它們是富含AT的，則長度為至少約15到約18個(gè)堿基。除了實(shí)際極限外，對(duì)本發(fā)明核酸分子的最大值沒有限制，因?yàn)樗龊怂岱肿涌梢园ǖ鞍拙幋a序列的一部分或編碼全長蛋白的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸探針(或簡單地，探針)是大小范圍最常見從長約8個(gè)核香酸到數(shù)百個(gè)核苷酸的核酸分子。這種分子通常被用于鑒定樣品中的靶核酸序列，通過在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與所述靶核酸序列雜交。如本文使用的，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指標(biāo)準(zhǔn)雜交條件，在該條件下核酸分子用于鑒定類似的核酸分子。這類才示)焦條4牛7A開于，i"列i口，Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)-驗(yàn)手冊)，ColdSpringHarborLabsPress,1989.Sambrooketal.,同上，在此完整引入作為參考(具體參見，第9.31-9.62頁)。此外，計(jì)算合適雜交和洗滌條件(以實(shí)現(xiàn)允許不同錯(cuò)配程度的核苷酸雜交)的7>式/>開于，例如Meinkothetal.，1984，Anal.Biochem.138，267-284;Meinkothetal.,同上，在此完整引入作為參考。41更具體的，本文涉及的中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件，是指在雜交反應(yīng)中允許與核酸分子具有至少約70%核酸序列同一性的核酸分子分離的條件(即，該條件允許核普酸的約30%或更低錯(cuò)配)。本文涉及的高嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件，是指在雜交反應(yīng)中允許與核酸分子具有至少約80%核酸序列同一性的核酸分子分離的條件(即，該條件允許核苷酸的約20%或更低錯(cuò)配)。本文涉及的非常高嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件，是指在雜交反應(yīng)中允許與核酸分子具有至少約90%核酸序列同一性的核酸分子分離的條件(即，該條件允許核苷酸的約10%或更低錯(cuò)配)。正如以上的討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用Meinkoth等(同上)的公式計(jì)算合適的雜交和洗滌條件以實(shí)現(xiàn)所述特定水平的核苷酸錯(cuò)配。這類條件將取決于形成的是DNA:RNA或DNA:DNA雜交物而不同。計(jì)算出的DNA:DNA雜交物的解鏈溫度比DNA:RNA雜交物〗氐10°C。在具體實(shí)施方案中，DNA:DNA雜交物的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括在以下條件雜交:離子強(qiáng)度為6XSSC(0.9MNa+)，溫度為約20。C到約35°C(低嚴(yán)謹(jǐn))，更優(yōu)選的，約28。C到約恥。C(更嚴(yán)謹(jǐn))，甚至更優(yōu)選的，約WC到約M。C(甚至更嚴(yán)謹(jǐn))，并利用合適的洗滌條件。在具體實(shí)施方案中，DNA:DNA雜交物的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括在以下條件雜交:離子強(qiáng)度為6XSSC(0.9MNa+)，溫度為約30。C到約45。C，更優(yōu)選的，約38。C到約5(TC，甚至更優(yōu)選的，約45。C到約55。C,并利用類似的嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件。這些值基于對(duì)大于約100個(gè)核苷酸的分子、0%曱酰胺和約40%的G+C含量的解鏈溫度的計(jì)算?；蛘撸梢园碨ambrook等所述(上文，第9.31到9.62頁)通過經(jīng)驗(yàn)計(jì)算Tm。通常，洗滌條件應(yīng)當(dāng)盡可能嚴(yán)謹(jǐn)，并與選擇的雜交條件相適應(yīng)。例如，雜交條件可以包括鹽和溫度條件(低于計(jì)算的具體雜交物的Tm約20-25。C)的組合，洗滌條件通常包括鹽和溫度條件(低于計(jì)算的具體雜交物的Tm約12-20。C)的組合。適用于DNA:DNA雜交物的雜交條件的實(shí)例包括，在約42°C6XSSC(50%曱酰胺)中雜交2-24小時(shí)，然后是洗滌步驟(包括室溫下用約2XSSC—次或多次洗滌)，繼之以在更高溫度和更低離子強(qiáng)度下另外洗滌(例如，在約37°C約0.1X-0.5XSSC中至少一次洗滌，然后在約68°C約0.1X-0.5XSSC中至少一次洗滌)。PCR引物也是核酸序列，盡管PCR引物通常是用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的長度相當(dāng)短的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用來自靶序列的序列信息，能夠輕易地開發(fā)和制備PCR引物和雜交探針。(參見，例如，Sambrooketal.,上文或"MolecularBiotechnology(分子生物技術(shù))，"第二版，Glick和Pasternak,ASMPress,WashingtonD.C.,1998,第555-590頁)。制備所述核酸分子的拷貝和/或(b)獲得包括所述核酸分子至少一部分的核酸分子(例如，包括全長基因、全長編碼區(qū)、調(diào)節(jié)性調(diào)控序列、截短編碼區(qū)的核酸分子)。這種核酸分子可以通過各種方式獲得，包括傳統(tǒng)的克隆技術(shù)，利用寡核香酸探針篩選相應(yīng)文庫或DNA,及利用寡核普酸引物PCR擴(kuò)增相應(yīng)文庫或DNA。待篩選或從其擴(kuò)增核酸分子的優(yōu)選文庫包括哺乳動(dòng)物基因組DNA文庫?？寺『蛿U(kuò)增基因的技術(shù)7>開于，例如，Sambrook等，如上。如本文使用的，反義核酸分子被定義為通過高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼蛋白的基因雜交，降低該蛋白表達(dá)的分離的核酸分子。這種核酸分子與編碼蛋白的基因足夠類似，使得該分子能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼天然蛋白的基因或RNA的編碼或互補(bǔ)鏈雜交。RNA千擾(RNAi)是一種方法，其中雙鏈RNA和在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，短干擾RNA(siRNA)，用于抑制或沉默互補(bǔ)基因的表達(dá)。在靶細(xì)胞中，siRNA展開并與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合，其然后被引導(dǎo)到與siRNA互補(bǔ)的mRNA序列，由此RISC切割mRNA。核酶是一種RNA片段，其通過結(jié)合靶標(biāo)RNA基團(tuán)并使其滅活(通過在特定切割位點(diǎn)切割磷酸二酯主鏈)發(fā)揮作用。核酶可以作為核酸分子的靶向運(yùn)輸載體，或可選4奪的，核酶可以例如靶向和結(jié)合編碼生物標(biāo)記物的RNA，從而有效抑制所述生物標(biāo)記物的翻i奪。適體是合成核酸(通常是RNA，也可以是DNA)的短鏈，根據(jù)它們以高親和力和特異性結(jié)合預(yù)定具體靶分子的能力，選自隨機(jī)組合核酸文庫。適體呈現(xiàn)指定的三維結(jié)構(gòu)，能夠區(qū)別結(jié)構(gòu)上有細(xì)微差別的化合物。重組核酸分子是包括編碼ZnT8蛋白或本文描述的其他蛋白的任意核酸序列中至少之一的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組核酸分子被可操作的連接到至少一個(gè)表達(dá)調(diào)控序列，其在宿主細(xì)胞中能夠有效調(diào)節(jié)核酸分子的表達(dá)。優(yōu)選的，利用DNA重組技術(shù)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)產(chǎn)生重組核酸分子。重組核酸分子包括重組載體，其是任意核酸序列，通常是異源序列，被可操作的連接到編碼蛋白(例如，ZnT8)的分離的核酸分子，其能夠啟動(dòng)蛋白的重組生成，或能夠在體夕卜(invitro)、離體(exvivo)或體內(nèi)(invivo)43將核酸分子輸送入本發(fā)明的宿主細(xì)胞。這類載體可以包含不是在插入載體的分離核酸分子附近天然存在的核酸序列。載體可以是RNA或DNA，原核或真核的，在本發(fā)明中優(yōu)選的是病毒或者質(zhì)粒。重組載體可用于核酸分子的克隆、測序和/或在其他方面控制。優(yōu)選的重組載體被用于核酸分子的表達(dá)，其還可以被稱作表達(dá)載體。優(yōu)選的重組載體能夠在轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)，具體來說，在轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。在本發(fā)明的重組分子中，核酸分子被可操作的連接到包含調(diào)控序列的表達(dá)載體，所述調(diào)控序列諸如轉(zhuǎn)錄控制序列，翻譯控制序列，復(fù)制起點(diǎn)及其他調(diào)控序列，它們與宿主細(xì)胞相容并控制本發(fā)明核酸分子的表達(dá)。短語"可操作的連結(jié)"是指采用以下方式將核酸分子連結(jié)到表達(dá)控制序列，該方式使得當(dāng)所述分子被轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)入宿主細(xì)胞時(shí)可以表達(dá)。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的起始、延伸和終止的序列。尤其重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和抑制序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括可以在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中起作用的任意轉(zhuǎn)錄控制序列。各種合適的轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。尤其優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，組織特異性啟動(dòng)子(例如，胰島素啟動(dòng)子)和增強(qiáng)子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄控制序列還可以包括天然存在的轉(zhuǎn)錄控制序列，其在分離前與待表達(dá)蛋白天然結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄控制序列包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一類可用于本發(fā)明重組核酸分子的重組載體是重組病毒載體。這種載體包括編碼本發(fā)明ZnT8蛋白的重組核^列，其被包裝在病毒包膜中，在施用后所述重組核酸序列可以在動(dòng)物的宿主細(xì)胞或體外表達(dá)?？梢允褂酶鞣N重組病毒載體，包括但不限于，那些基于曱病毒，痘病毒，腺病毒，皰滲病毒，慢病毒，腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組病毒載體。尤其優(yōu)選的病毒栽體是基于腺病毒和腺相關(guān)病毒的病毒載體。適于基因輸送的病毒載體是本領(lǐng)域公知的，可由技術(shù)人員選擇用于本發(fā)明?，F(xiàn)有病毒載體的詳細(xì)討論提供于"MolecularBiotechnology(分子生物技術(shù)),"第二版，Glick和Pasternak,ASMPress,WashingtonD.C.,1998，第555-590頁，其內(nèi)容在此完整引入作為參考。用于轉(zhuǎn)染本發(fā)明重組核酸分子的合適宿主細(xì)胞包括可以被轉(zhuǎn)染的任意微生物，昆蟲，或動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或已經(jīng)轉(zhuǎn)染至少一種核酸分子的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用于表示能夠?qū)⑼庠春怂岱肿?即，重組核酸分子)插入細(xì)胞的任意方法。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"可以與術(shù)語"轉(zhuǎn)染"互換使用，其條件是當(dāng)該術(shù)語用于表示將核酸分子導(dǎo)入微生物細(xì)胞(諸如細(xì)菌和酵母)時(shí)。在微生物系統(tǒng)中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"用于描述由于微生物獲得外源核酸造成的遺傳性改變，并與術(shù)語"轉(zhuǎn)染"是基本上同義的。但是，在動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化具有第二種含義，例如，它可以表示細(xì)胞變?yōu)榘┬院笈囵B(yǎng)物中細(xì)胞生長特性的變化。因此，為避免混淆，術(shù)語"轉(zhuǎn)染"優(yōu)選的是指將外源核酸導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，術(shù)語"轉(zhuǎn)染"在本文中使用時(shí)通常包括動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而使得該術(shù)語涉及外源核酸向細(xì)胞的導(dǎo)入。因此，轉(zhuǎn)染技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)化，電穿孔，顯孩"主射，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，吸附，感染和原生質(zhì)體融合。如本文使用的，就包括ZnT8蛋白的本發(fā)明分離的蛋白或多肽來說，它是一種已從其天然環(huán)境轉(zhuǎn)移的蛋白(即，已經(jīng)過人工處理)，包括全長蛋白，融合或嵌合蛋白，或該蛋白的任意片段或同系物。這類蛋白可以包括，但不限于，純化的蛋白，部分純化的蛋白，重組產(chǎn)生的蛋白，合成產(chǎn)生的蛋白，膜結(jié)合蛋白，與脂質(zhì)復(fù)合的蛋白，可溶性蛋白及與其他蛋白結(jié)合的分離的蛋白。這樣的話，"分離的"不表示蛋白被純化的程度。優(yōu)選的，本發(fā)明分離的蛋白是重組產(chǎn)生的。此外，再次舉例來說，"人ZnT8蛋白"或"源自"人ZnT8蛋白的蛋白是指來自人(智人)的ZnT8蛋白(通常包括天然存在的ZnT8蛋白的同系物)，或根據(jù)已知的天然存在的智人ZnT8蛋白的結(jié)構(gòu)(例如，序歹'J)以及也可能是功能另外產(chǎn)生的ZnT8蛋白。換言之，人ZnT8蛋白包括任意ZnT8蛋白，如本文詳細(xì)所述，其與天然存在的智人ZnT8蛋白具有基本上類似的結(jié)構(gòu)及功能，或是天然存在的智人ZnT8蛋白的活性(即，具有生物活性)同系物。這樣的話，人ZnT8蛋白可以包括純化的，部分純化的，重組的，突變/改變的及合成的蛋白。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"改變，，和"突變"可以可以互換使用，尤其當(dāng)涉及本文描述的蛋白的氨基酸序列(或核酸序列)的改變/突變時(shí)。可用作本發(fā)明拮抗劑或激動(dòng)劑的分離的蛋白可以從其天然來源分離，重組產(chǎn)生或合成產(chǎn)生。本發(fā)明還包括融合蛋白和嵌合蛋白。融合蛋白是通過將本發(fā)明的蛋白或肽(例如，ZnT8或其變體或片段)與融合伴倡(融合部分)結(jié)合(通常是重組的，盡管本發(fā)明包括化學(xué)及其他類型的結(jié)合)產(chǎn)生的蛋白。用于本發(fā)明的合適融合伴侶包括，但不限于，具有以下功能的融合伴侶增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性；增強(qiáng)或允許蛋白從宿主細(xì)胞分泌；提供其他生物活性；和/或協(xié)助從宿主細(xì)胞純化蛋白(例如，通過親和層析)。合適的融合伴侶可以是具有所需功能(例如，賦予增加的穩(wěn)定性、溶解性、作用或活性；提供其他活性；和/或簡化蛋白的純化)的蛋白或其任意大小的結(jié)構(gòu)域或片段。融合伴侶可以連接到感興趣蛋白(例如，ZnT8)的氨基和/或羧基端，并且容易被切割，以便能夠直接回收表達(dá)的外源蛋白。嵌合蛋白類似于融合蛋白，上述術(shù)語可以互換使用，除了在嵌合蛋白的情況下，融合伴侶最常見的是感興趣的第二蛋白(或其片段)，諸如具有所需生物活性的第二蛋白。因此，嵌合蛋白可能具有所述蛋白/肽組分中每種/兩種的活性，或由蛋白結(jié)構(gòu)域組合產(chǎn)生的新活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用體外翻譯系統(tǒng)(諸如基于網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、小麥胚芽、酵母和細(xì)菌的系統(tǒng))產(chǎn)生蛋白(包括肽和同系物)。該系統(tǒng)優(yōu)選的正確翻譯后加工蛋白，例如，通過蛋白水解和/或糖基化。體外翻譯系統(tǒng)的產(chǎn)物是本發(fā)明方法最常使用的，盡管本發(fā)明不限于這類產(chǎn)物。如本文使用的，術(shù)語"同系物"或"變體"用于表示通過對(duì)天然存在的蛋白或肽的較小改變而不同于天然存在的蛋白或肽(即，"原型"或"野生型"蛋白)的蛋白或肽，其保持天然存在形式的基本蛋白和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。這種改變包括，除了不限于在l，2,3,4，5,6，7,8,9，IO或更多幾條氨基酸側(cè)鏈中的改變；改變l，2,3，4，5，6，7,8，9，IO或更多幾個(gè)氨基酸，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；1個(gè)或幾個(gè)原子立體化學(xué)的改變；和/或次要衍生，包括但不限于曱基化，糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻酰化，異戊烯化，棕櫚酸化(palmitation),酰胺化和/或糖基化磷脂酰肌醇的添加。與天然存在的蛋白或肽相比，同系物可以具有增強(qiáng)、降低或基本上類似的特性。同系物可以包括蛋白的激動(dòng)劑或蛋白的拮抗劑。同系物可以是天然等位基因變異或遺傳多態(tài)性，或任意自然突變的結(jié)果。編碼蛋白的核酸的天然存在的等位基因變體或遺傳多態(tài)性是與編碼該蛋白的基因存在于在基因組中基本上相同基因座的基因，但由于天然變異，其具有類似但不相同的序列。等位基因變體通常編碼與被比較的基因編碼的蛋白具有類似活性的蛋白。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是當(dāng)基因紐中的單核苷酸在物種成員之間或個(gè)體的配對(duì)染色體之間不同時(shí)存在的DNA序列變異。由于人群間的變異，在一個(gè)地理或種族中常見的SNP等位基因可能在另一種族中更罕見。此外，人DNA序列的變異可能影響人如何患有疾病及如何對(duì)病原體、化學(xué)制劑、藥物、疫苗和其他試劑產(chǎn)生應(yīng)答，這已經(jīng)被本文中針對(duì)ZnT8基因中存在的多態(tài)性的自身抗體應(yīng)答所作證。一類等位基因變體可以編碼相同的蛋白，但由于遺傳密碼的簡并性所以具有不同的核酸序列。等位基因變體還可以包括基因的5'或3'未翻譯區(qū)(例如，在調(diào)控性控制區(qū))。等位基因變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。同系物可以利用本領(lǐng)域已知的用于蛋白制備的技術(shù)產(chǎn)生，包括但不限于，對(duì)分離的天然存在蛋白的直接改變，直接蛋白合成，或利用例如經(jīng)典或重組DNA技術(shù)來影響隨機(jī)或靶向誘變，對(duì)編碼蛋白的核酸序列進(jìn)行改變。根據(jù)本發(fā)明，分離的蛋白(包括其生物活性的同系物或片段)，具有活性野生型或天然存在的對(duì)照蛋白的至少一種生物活性特征(其可以不同，取決于所述同系物或片段是否是蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑，或是否描述了蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑模擬物)。通常，蛋白的生物活性或生物作用是指由蛋白顯示或行使的任意功能，其歸因于蛋白的天然存在形式，通過體內(nèi)(即，在蛋白的天然生理環(huán)境中)或體外(即，在實(shí)驗(yàn)室條件下)測量或觀察得到。本發(fā)明ZnT8蛋白的生物活性包括將鋅輸送出細(xì)胞，或?qū)\固定在胞內(nèi)小室。更具體的，本發(fā)明的ZnT8生物活性包括將細(xì)胞質(zhì)鋅轉(zhuǎn)移到胰島P細(xì)胞的胞內(nèi)嚢泡。用于本發(fā)明的ZnT8的其他生物學(xué)活性包括誘導(dǎo)抗ZnT8的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，以及在分析法中被結(jié)合劑識(shí)別的能力(例如，形成可以被ZnT8特異結(jié)合劑識(shí)別的初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象表位)。導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低或蛋白活性降低的修飾、活性或相互作用被稱作滅活(完全或部分的)，下調(diào)，作用減弱，或蛋白的作用或活性降4氐。類似地，導(dǎo)致蛋白表達(dá)增加或蛋白活性增加的修飾、活性或相互作用被稱作蛋白的擴(kuò)增、過量產(chǎn)生、活化、增強(qiáng)、上調(diào)或作用增加。本發(fā)明蛋白尤其是ZnT8蛋白的生物活性可以利用本領(lǐng)域已知的用于蛋白生物活性的任意分析法進(jìn)行測量或評(píng)價(jià)。這類分析可以包括，但不限于，結(jié)合分析(包括各種免疫分析)，確定蛋白和/或相關(guān)蛋白的內(nèi)化或定位的分析，鋅運(yùn)輸分析(例如，zinquin分析，描述于Chimientietal.,2004,Diabetes,上文)和/或用于測定下游細(xì)胞事件(由蛋白的活性造成)的分析。如本文使用的,除非另作說明，百分比(％)同一性是指利用以下方法進(jìn)行同源性鑒定:(l)BLAST2.0BasicBLAST同源性搜索,利用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)的用47于氨基酸搜索的blastp和用于核酸搜索的blastn，其中利用默認(rèn)值對(duì)詢問序列進(jìn)行低復(fù)雜性區(qū)域過濾(描述于Altschul，S.F.，Madden,T丄.，Sch膽ffer，A.A.，Zhang,J.,Zhang,Z.，Miller,W.&Lipman，D丄(1997)"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白數(shù)據(jù)庫搜索程序)."NucleicAcidsRes.25:3389-3402,在此完整引入作為參考)；(2)BLAST2比對(duì)(利用如下所述的參數(shù))；(3)和/或PSI-BLAST,利用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)(位置特異性迭代BLAST(Position-SpecificIteratedBLAST))。應(yīng)注意到由于BLAST2.0BasicBLAST和BLAST2之間標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的一些差異,利用BLAST2程序有兩條特定序列被識(shí)別為具有顯著的同源性，而在BLAST2.0BasicBLAST中利用其中一條序列作為詢問序列進(jìn)行的搜索未能在最佳配對(duì)(topmatches)中鑒定出第二序列。此外,PSI-BLAST提供自動(dòng)化、易于使用形式的"模式"搜索,這是一種尋找序列同系物的靈敏方法。該程序首先進(jìn)行缺口BLAST數(shù)據(jù)庫搜索。PSI-BLAST程序利用返回的來自任意顯著比對(duì)的信息構(gòu)建位置特異性分?jǐn)?shù)矩陣,其取代詢問序列用于下一輪數(shù)據(jù)庫搜索。因此,應(yīng)了解可以利用這些程序中的任意一項(xiàng)確定百分比同一性。如Tatusova和Madden所述,(1999)，"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences(Blast2sequences隱一種用于t匕專殳蛋白和核香酸序列的新工具)"，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.174:247-250，在此完整《I入作為參考，可以利用BLAST2Sequence對(duì)兩條特定序列進(jìn)行彼此比對(duì)。BLAST2序列比對(duì)是在blastp或blastn中利用BLAST2.0算法進(jìn)行，在兩條序列之間進(jìn)行缺口BLAST搜索(BLAST2.0)以便在所獲比對(duì)中導(dǎo)入缺口(缺失和插入)。為了闡明本文，BLAST2序列比對(duì)利用下列標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)進(jìn)行。對(duì)于blastn,利用0BLOSUM62矩陣:配對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)=1錯(cuò)配罰分=-2開放缺口(5)和延伸缺口(2)罰分缺口x—降低(50)預(yù)期(IO)字大小(ll)過濾(開)對(duì)于blastp,利用0BLOSUM62矩陣開放缺口(1l)和延伸缺口(l)罰分缺口x—降低(50)預(yù)期(IO)字大小(3)過濾(開)。如本文使用的，指定蛋白的"激動(dòng)劑"是指特征為具有激動(dòng)(例如，刺48激，誘導(dǎo)，增加，增強(qiáng)，或模擬)天然存在蛋白的生物活性的能力的任意化合物，包括任意同系物、結(jié)合蛋白(例如，抗體)、試劑(它們與蛋白或被蛋白結(jié)合的受體相互作用)，或藥物/化合物/肽設(shè)計(jì)或篩選的任意合適產(chǎn)物，它們的特征在于具有以類似于天然激動(dòng)劑(其是對(duì)照蛋白)的方式激動(dòng)(例如，刺激，誘導(dǎo)，增加，增強(qiáng))天然存在蛋白的生物活性的能力。類似地，"拮抗劑"是指抑制(例如，拮抗，降低，減少，阻斷，逆轉(zhuǎn)，或改變)上述蛋白的指定激動(dòng)劑(包括該蛋白自身)作用的任意化合物。更具體的，拮抗劑能夠以與蛋白活性有關(guān)的方式發(fā)揮作用，這樣的話天然激動(dòng)劑或?qū)φ盏鞍椎纳锘钚砸詫?duì)該蛋白的天然作用拮抗(例如，抗、逆轉(zhuǎn)或相反)的方式被降低。這種拮抗劑可以包括，但不限于，蛋白，肽，或核酸(包括核酶，RNAi，適體，和反義)，抗體及其抗原結(jié)合片段，或提供拮抗效應(yīng)的藥物/化合物/肽設(shè)計(jì)或篩選的產(chǎn)物。指定蛋白諸如ZnT8的同系物，包括肽和非肽激動(dòng)劑和拮抗劑(類似物)，可以是藥物設(shè)計(jì)或篩選的產(chǎn)物，也可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生。這種同系物可以被稱作模擬物。可用于本發(fā)明設(shè)計(jì)或挑選模擬物或其他治療化合物的藥物設(shè)計(jì)的各種方法公開于Mauliketal.，1997，MolecularBiotechnology:TherapeuticApplicationsandStrategies(分子生4勿才支術(shù)'治療應(yīng)用和策略)，Wiley-Liss,Inc.，其在此完整《1入作為參考。如本文使用的，模擬物是指能夠模擬天然存在肽的生物作用的任意肽或非肽化合物，通常是因?yàn)槟M物具有模擬天然存在肽的基本結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)，和/或具有天然存在肽的顯著生物學(xué)特性。模擬物可以包括，但不限于與原型具有實(shí)質(zhì)改變的肽，諸如與天然存在的肽沒有側(cè)鏈相似性(這種改變，例如，可能降低其對(duì)降解的敏感性)；抗個(gè)體基因型和/或催化抗體，或其片段；分離的蛋白的非蛋白部分(例如，碳水化合物結(jié)構(gòu))；或合成或天然的有機(jī)分子，包括例如通過組合化學(xué)鑒定的核酸和藥物。可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法設(shè)計(jì)、選擇和/或另外鑒定這類模擬物。可以獲得模擬物，例如，利用分子多樣性策略(允許快速構(gòu)建大的、化學(xué)多樣性分子文庫的相關(guān)策略的組合)，天然或合成化合物的文庫，尤其是利用化學(xué)或組合文庫(即，序列或大小不同但具有類似結(jié)構(gòu)單元的化合物的文庫)，或通過推理性、定向或隨才幾藥物i殳計(jì)。參見例如，Mauliketal.，上文。在分子多樣性策略中，利用生物學(xué)、酶學(xué)和/或化學(xué)方法，例如從肽、寡核香酸、碳水化合物和/或合成有機(jī)分子合成大的化合物文庫。開發(fā)分子多樣性策略中的臨界參數(shù)包括亞基多樣性、分子大小和文庫多樣性。篩選這種文庫的一般目標(biāo)是利用組合篩選的連續(xù)應(yīng)用以獲得所需靶標(biāo)的高親和力配體，然后通過隨機(jī)或者定向設(shè)計(jì)策略優(yōu)化先導(dǎo)分子。分子多樣性的方法詳細(xì)描述于Maulik,etal.，如上。在推理性藥物設(shè)計(jì)步驟中，可以通過例如，核磁共振(NMR)或X-射線晶體衍射法分析調(diào)節(jié)化合物的三維結(jié)構(gòu)。然后可以使用該三維結(jié)構(gòu)預(yù)測潛在化合物的結(jié)構(gòu)，諸如通過例如計(jì)算枳4莫擬預(yù)測潛在的調(diào)節(jié)劑。預(yù)測的化合物結(jié)構(gòu)可用于優(yōu)化衍生的前導(dǎo)化合物，例如，通過分子多樣性方法。此外，預(yù)測的化合物結(jié)構(gòu)可以通過以下方法產(chǎn)生，例如，化學(xué)合成，DNA重組技術(shù)，或通過從天然來源(例如，植抹，動(dòng)物，細(xì)菌和真菌)分離模擬位。Maulik等還公開了，例如，定向設(shè)計(jì)的方法，其中用戶指導(dǎo)從相應(yīng)挑選片段的片段文庫產(chǎn)生新分子的步驟；隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中用戶使用遺傳或其他方性；和基于網(wǎng)格的方法，其中用戶計(jì)算三維受體結(jié)構(gòu)和小片段探針之間的相互作用能，然后將良好探針位點(diǎn)結(jié)合到一起。本發(fā)'效的在雄和戎^潛合伴/g本發(fā)明還包括抗體及其抗原結(jié)合片段(它們選擇性結(jié)合ZnT8)，以及這種抗體及其抗原結(jié)合片段在本文描述的任意一項(xiàng)方法中的用途。可以利用從蛋白獲得的結(jié)構(gòu)信息(例如，蛋白至少一部分的氨基酸序列)產(chǎn)生選擇性結(jié)合蛋白的抗體。如本文使用的，術(shù)語"選擇性結(jié)合"是指一種蛋白與另一種(例如，抗體，其片段，或抗原的結(jié)合伴侶)的特異性結(jié)合，其中通過任意標(biāo)準(zhǔn)分析(例如，免疫分析)測定，結(jié)合水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于該分析的背景對(duì)照。例如，當(dāng)進(jìn)行免疫分析時(shí)，對(duì)照通常包括只包含抗體或抗原結(jié)合片段(即，沒有抗原)的反應(yīng)孔/管，其中無抗原時(shí)抗體或其抗原結(jié)合片段的反應(yīng)性量(例如，與孔的非特異性結(jié)合)被認(rèn)為是背景。可以利用本領(lǐng)域的各種方法標(biāo)準(zhǔn)4企測結(jié)合，包括但不限于Western印跡，免疫印跡，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，免測沉淀，表面等離子體共振，化學(xué)發(fā)光，焚光極化，磷光，免疫組織化學(xué)分析，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法，微細(xì)胞計(jì)數(shù)法，微陣列，顯微鏡檢查，熒光活化細(xì)胞分選(FACS)，和流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，指定蛋白或肽或其他分子的"表位"通常被定義為(對(duì)抗體來說)更大分子的部分或位點(diǎn)，抗體或其抗原結(jié)合片段將與該分子結(jié)合，并且將產(chǎn)生的抗體抗該分子。術(shù)語表位可以與術(shù)語指定蛋白或抗原的"抗原決定簇"、"抗體結(jié)合位點(diǎn)"或"保守結(jié)合表面"互換使用。更具體地，表位可以用參與抗體結(jié)合的氨基酸殘基以及它們在三維空間的構(gòu)象(例如，構(gòu)象表位或保守結(jié)合表面)來定義。表位可以小至約4-6個(gè)氨基酸殘基包括在肽中，或包括在蛋白的更大部分，當(dāng)涉及表位的三維結(jié)構(gòu)(尤其是涉及抗體結(jié)合表位)時(shí)，無需由鄰接氨基酸殘基組成。抗體結(jié)合表位通常是構(gòu)象表位而不是連續(xù)表位(即，線性表位)，或換言之，由氨基酸殘基限定的表位在蛋白或多肽(抗體與其結(jié)合)的表面三維空間內(nèi)排列。如上所述，構(gòu)象表位不是由氨基酸殘基的鄰接序列組成，相反，殘基可能廣泛分布于初級(jí)蛋白序列，經(jīng)由蛋白在三維空間折疊成其天然構(gòu)象而聚集形成結(jié)合表面。因此，本發(fā)明包括任意蛋白或肽，它們包括或由下列物質(zhì)組成任意ZnT8表位，以及抗體，抗原結(jié)合片段，或結(jié)合ZnT8蛋白任意表位的其他結(jié)合伴倡(結(jié)合肽)。本發(fā)明的"異表位"是以變體形式或亞型(天然或通過合成設(shè)計(jì))存在的表位，諸如包含多態(tài)性變體氨基酸位置的表位。異表位的實(shí)例在本文中描述為包含325位的ZnT8表位，其中一種異表位包含325位的精氨酸，兩種其他變體天然存在于該位置(Trp325和Gln325)。這三種變體是異表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用已知技術(shù)鑒定和/或組裝構(gòu)象表位和/或連續(xù)表位,包括突變分析(例如，定點(diǎn)誘變);防止蛋白水解降解(蛋白足跡法);模擬位分析，利用例如,合成肽和肽掃描，BIACORE或ELISA;抗體竟?fàn)幾鲌D;組合肽庫篩選;基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法;或三維模擬(例如，利用任意合適的軟件程序，包括但不限于,MOLSCRIPT2.0(AvatarSoftwareAB，Heleneborgsgatan21C,SE11731Stockholm,Sweden),圖形顯示程序O(Joneset.al"ActaCrystallography,vol.A47，p.110，1991),圖形顯示程序GRASP，圖形顯示程序INSIGHT。例如，技術(shù)人員可以使用分子取代或其他技術(shù)及相關(guān)蛋白的已知三維結(jié)構(gòu)來模擬ZnT8的三維結(jié)構(gòu)，并預(yù)測與該結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體的構(gòu)象表位。實(shí)際上,技術(shù)人員可以使用這類技術(shù)中的一種或任意組合來確定抗體結(jié)合表位。可用于本發(fā)明的抗體包括多克隆和單克隆抗體，二價(jià)和單價(jià)抗體，雙或多特異性抗體，包含該抗體的血清，已經(jīng)被不同程度純化的抗體，和完整抗體的任意功能同等物。本發(fā)明分離的抗體包括包含該抗體的血清，或已經(jīng)被不同程度純化的抗體?？蛇x擇地，完整抗體的功能同等物，諸如抗原結(jié)合片段，其中一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)構(gòu)域被截短或缺失(例如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab,Fab'，或F(ab)2片段)，以及遺傳改造的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括單鏈抗體或可以結(jié)合超過一個(gè)表位的抗體(例如，雙特異性抗體)，或可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)不同抗原的抗體(例如，雙或多特異性抗體)，也可在本發(fā)明中使用。遺傳改造的抗體包括那些通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，涉及編碼抗體可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA的操作和再表達(dá)。具體實(shí)例包括，嵌合抗體，其中抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域來自于對(duì)于抗體剩余部分來說不同的來源，和CDR移植抗體(及其抗原結(jié)合片段)，其中至少一個(gè)CDR序列和任選的至少一個(gè)可變區(qū)骨架氨基酸來來源于一個(gè)來源，可變區(qū)和恒定區(qū)的剩余部分(視情況而定)來源于不同的來源。嵌合及CDR移植抗體的構(gòu)建描述于，例如，歐洲專利申請EP-A0194276,EP-A0239400，EP-A0451216和EP-A0460617。通常，在抗體的制備中，合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，諸如，例如，但不限于，兔，綿羊，倉鼠，豚鼠，小鼠，大鼠，或雞，被暴露于抗原(要求該抗原是抗體所針對(duì)的)。通常，動(dòng)物用有效量的抗原(被注射入該動(dòng)物)免疫。抗原的有效量是指誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗體所需要的量。然后允許動(dòng)物的免疫系統(tǒng)在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答。免疫步驟可以重復(fù)，指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的抗體。為了獲得對(duì)抗原特異的多克隆抗體，從包含所需抗體的動(dòng)物收集血清(或就雞而言，可以從雞卵收集抗體)。這類血清可用作試劑。通過例如用石克酸銨處理血清，可以從血清(或雞卵)進(jìn)一步純化多克隆抗體?？梢愿鶕?jù)Kohler和Milstein的方法(Nature256:495-497,1975)產(chǎn)生單克隆抗體。例如，從免疫動(dòng)物的脾(或任意合適的組織)回收B淋巴細(xì)胞，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合得到能夠在合適培養(yǎng)基中連續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞群。通過檢測雜交瘤產(chǎn)生的抗體結(jié)合所需抗原的能力來挑選產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。本發(fā)明還擴(kuò)展到非抗體多肽，有時(shí)被稱為抗原結(jié)合伴侶或抗原結(jié)合肽，它們被設(shè)計(jì)成能選擇性結(jié)合感興趣的蛋白。設(shè)計(jì)這種多肽(具有指定的配體特異性)的實(shí)例可參見Beste等(Proc.Natl.Acad.Sci.96:1898-1903，1999)，在此完整引入作為參考。根據(jù)本發(fā)明，本文術(shù)語"抗原"常規(guī)使用涉及蛋白的任意部分(肽，52部分蛋白，全長蛋白)，其中蛋白是天然存在的或合成衍生自，細(xì)胞組成(全細(xì)胞，細(xì)胞裂解物或^C壞的細(xì)胞)，生物(完整生物，裂解物或^^壞的細(xì)胞)或碳水化合物或其他分子，或其部分，其中抗原引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)，或可選的作為耐受原，抗相同或類似的抗原(在施用該抗原的動(dòng)物的細(xì)胞和組織內(nèi)遭遇)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)需要刺激免疫應(yīng)答時(shí)，術(shù)語"抗原"可以與術(shù)語"免疫原"互換使用，在本文中用于描述引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答(即，是免疫原性的)的抗原，這樣的話給動(dòng)物施用免疫原(例如，通過本發(fā)明的疫苗)引發(fā)抗相同或類似抗原(在動(dòng)物組織內(nèi)遭遇)的抗原特異性免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)需要抑制抗指定抗原的免疫應(yīng)答時(shí)，抗原可以包括耐受原。根據(jù)本發(fā)明，"耐受原"用于描述采用以下形式、量或施用途徑提供的抗原，這樣的話存在減弱或改變的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，優(yōu)選的免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)接觸耐受原或表達(dá)或呈遞這種耐受原的細(xì)胞的應(yīng)答的無應(yīng)答性、無反應(yīng)性、其他失活或缺失。"接種抗原"可以是免疫原或耐受原，但是用于疫苗的抗原，其中生物反應(yīng)(免疫應(yīng)答、耐受性的引發(fā))由抗接種抗原引發(fā)。指定抗原的免疫原性結(jié)構(gòu)域(部分，片段，表位)可以是抗原的任意部分(例如，肽片段或亞基或抗體表位或其他構(gòu)象表位)，包含當(dāng)給動(dòng)物施用時(shí)作為免疫原(或耐受原，對(duì)于致耐受結(jié)構(gòu)域來說)的至少一個(gè)表位。例如，單個(gè)蛋白可以包含多種不同的免疫原性結(jié)構(gòu)域。就體液免疫來說，免疫原性結(jié)構(gòu)域不必是蛋白內(nèi)的線性序列。作為通稱，表位在本文中被定義為指定抗原內(nèi)的單個(gè)免疫原性位點(diǎn)(足以引發(fā)免疫應(yīng)答)，或指定抗原內(nèi)的單個(gè)致耐受位點(diǎn)(足以抑制、去除免疫應(yīng)答或使免疫應(yīng)答失活)。正如以上的討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可T細(xì)胞表位與B細(xì)胞表位在大小和組成方面不同，并且通過I型MHC途徑呈遞的表位不同于通過II型MHC途徑呈遞的表位，表位可以是線性序列或構(gòu)象表位(保守的結(jié)合區(qū)域)。這取決于免疫應(yīng)答的類型?？乖梢孕≈羻蝹€(gè)表位，或更大，可以包括多個(gè)表位。這樣的話，抗原大小可以小至約5-12個(gè)氨基酸(例如，肽)和大至全長蛋白，包括多聚體和融合蛋白，嵌合蛋白，全細(xì)胞，全微生物，或其部分(例如，全細(xì)胞的裂解物或微生物的提取物)。本發(fā)效的逸合#和劍*(7^附"/油'朋)53ZnT8蛋白，同系物(包括突變的肽)，片段，肽，肽和非肽模擬物，及抗體和其抗原結(jié)合片段可以被包含在用于本發(fā)明的組合物、制劑，尤其是疫苗中。這種組合物、制劑或疫苗，可以包括藥學(xué)上可接受的載體，其包括藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體。如本文使用的，藥學(xué)上可接受的載體是指適合將可用于本發(fā)明方法的組合物、制劑或疫苗輸送到合適的體內(nèi)或體外位點(diǎn)的任意物質(zhì)。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的載體能夠采用以下形式維持待輸送的藥劑(例如，ZnT8蛋白，同系物(包括突變的肽)，片段，肽，肽和非肽模擬物，及抗體和其抗原結(jié)合片段其)，這種形式使得藥劑到達(dá)靶細(xì)胞或靶位點(diǎn)時(shí)，該藥劑能夠作用于所述細(xì)胞或位點(diǎn)(例如能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答)。本發(fā)明的合適賦形劑包括輸送或輔助輸送的賦形劑或配方，但不是特異性的將藥劑靶向于表位(本文中還稱為非靶向載體)。藥學(xué)上可接受的賦形劑的實(shí)例包括，但不限于水，磷酸鹽緩沖液，Ringer's液，葡萄糖溶液，包含血清的溶液，Hank's液，其他水性生理平tf液，油類，酯和乙二醇。水性載體可以包含要求近似受體生理?xiàng)l件的合適輔助劑物質(zhì)，例如，通過增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和等滲性。合適的輔助劑物質(zhì)包括，例如，醋酸鈉，氯化鈉，乳酸鈉，氯化鉀，氯化鈣，及其他用于產(chǎn)生磷酸鹽緩沖液的物質(zhì)，Tris緩沖液，和碳酸氫鹽緩沖液。輔助劑物質(zhì)還可以包括防腐劑，諸如硫柳汞，m-或o-曱酚，福爾馬林和安息油醇。本發(fā)明的組合物可以通過常規(guī)方法滅菌和/或凍干。一類藥學(xué)上可接受的載體包括能夠?qū)⒈景l(fā)明的組合物緩慢釋放入動(dòng)物的控釋劑。如本文使用的，控釋劑包括可用于本發(fā)明控釋賦形劑的試劑。合適的控釋賦形劑包括，但不限于，生物相容性聚合物，其他聚合基質(zhì)，膠嚢，微膠嚢，微粒，丸劑制品，滲透泵，擴(kuò)散裝置，脂質(zhì)體，脂質(zhì)微球(lipospheres)，和透皮輸送系統(tǒng)。合適的載體還包括，但不限于脂質(zhì)體，病毒載體或其他載體，包括核酶。天然的包含脂質(zhì)的載體包括細(xì)胞和細(xì)胞膜。人工的的包含脂質(zhì)的載體包括脂質(zhì)體和微膠粒。本發(fā)明的載體可被改造靶向于患者的特定位點(diǎn)，從而使試劑靶向該位點(diǎn)并在該處使用。合適的改造包括控制載體脂質(zhì)部分的化學(xué)式，和/或向賦形劑中導(dǎo)入能夠使載體特異性靶向優(yōu)選位點(diǎn)(例如，優(yōu)選的細(xì)胞類型)的靶向劑。疫苗是用于免疫或耐受動(dòng)物抗特定抗原的特定類型的組合物。因此，疫苗包括引發(fā)針對(duì)抗原或其免疫原性或致耐受部分(作為疫苗施用的結(jié)果)的至少一種化合物或試劑。疫苗的施用優(yōu)選導(dǎo)致預(yù)防或治療效果，其中后來的暴露于抗原(或抗原的來源)引發(fā)抗抗原(或來源)的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答在動(dòng)物中減輕或預(yù)防疾病。這種免疫應(yīng)答通常增強(qiáng)或抑制針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，就ZnT8來說，優(yōu)選的疫苗抑制抗ZnT8和/或胰島P細(xì)胞的疫苗。接種的概念是本領(lǐng)域公知的。通過施用本發(fā)明的治療組合物引發(fā)的免疫應(yīng)答可以是與未施用疫苗時(shí)相比，免疫應(yīng)答任意方面(例如，細(xì)胞應(yīng)答，體液免疫，細(xì)胞因子生成)的任意可檢測變化。本發(fā)病才法本發(fā)明還包括利用鑒定ZnT8作為涉及I型糖尿病(T1D)的新自身抗原的各種方法。這種方法包括用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或治療效果的診斷分析，以及預(yù)防和治療方法，包括免疫治療方法和疫苗策略。ZnT8還可以凈皮用作鑒定可用于T1D的診斷、預(yù)防和/或治療的化合物的新靶標(biāo)。本發(fā)明的方法利用如上所述的ZnT8蛋白，肽，模擬物，同系物，抗體，或甚至核酸分子中的任意一種。在一些實(shí)施方案中，這種試劑與其他診斷或治療部分組合以增加方法的有效性。例如，除ZnT8之外其他自身抗原(例如，胰島素，胰島素瘤抗原，和/或谷氨酸脫羧酶)的檢測可以與ZnT8的檢測組合以增強(qiáng)診斷分析法的有效性、靈敏性和特異性，并且各種治療部分(例如，毒素，消炎劑，抗原)可以與ZnT8試劑組合或連接以增強(qiáng)對(duì)患者的治療效果。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及檢測糖尿病相關(guān)自身免疫性(即，I型糖尿病或T1D)的方法和分析。這種分析可以被用作診斷分析(例如，為了鑒定正患有T1D的患者或一組受試者或預(yù)測對(duì)T1D的易感性)或用作預(yù)后/監(jiān)測分析。后一分析可用于監(jiān)測患者或一組受試者中自身免疫性的進(jìn)展(從自身免疫反應(yīng)的初始良性(非破壞性的)癥狀到指示明顯T1D的破壞性胰島炎)。后一分析還可以用于監(jiān)測治療效果，其針對(duì)前驅(qū)糖尿病受試者中自身免疫性的預(yù)防和/或治療或改善。例如，可以給受試者施用一種或多種免疫抑制性或預(yù)防性試劑，包括但不限于基于ZnT8分子自身的試劑，然后可以利用本發(fā)明的分析監(jiān)測T1D的進(jìn)展或非進(jìn)展。所述分析可以基于檢測受試者中針對(duì)ZnT8的自身抗體應(yīng)答，或檢測受試者中針對(duì)ZnT8抗原表位的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性。所述分析可以單獨(dú)使用或彼此結(jié)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括抗體分析，其檢測受試者中特異性結(jié)合ZnT8的抗體的存在或缺失。本發(fā)明的方法基于患者血清中抗ZnT8抗體的水平，可用于有效鑒定或選擇最可能將患有或正患有的I型糖尿病的患者，包55括預(yù)測因素諸如發(fā)病時(shí)間，或監(jiān)測疾病的進(jìn)展或階^R。所述方法還可用于有效鑒定或選擇對(duì)具體治療方法有應(yīng)答或沒有應(yīng)答的患者(即，該方法用于指示對(duì)特定患者的治療方法或顯示對(duì)特定患者的治療方法不可取)。在本發(fā)明自身抗體分析的一個(gè)方面，檢測由ZnT8基因和蛋白多態(tài)性確定的特異性異表位。異表位特異性的診斷可以用簡單的診斷試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，所述診斷試驗(yàn)可以基于結(jié)合特異性配體(可以是完整的蛋白或源自它的肽)的抗體。特異性的進(jìn)一步分析可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)測定過量的所述蛋白的特異性變體或衍生肽與抗體竟?fàn)幒团潴w相互作用的能力。用于這種分析的分析平臺(tái)可以是放射免疫沉淀，ELISA,發(fā)光時(shí)間分辨熒光或大量其他一般分析形式。方法通常包括利用任意合適的技術(shù)檢測患者或受試者樣品(試樣)中選擇性結(jié)合ZnT8的自身抗體?；颊呖贵w結(jié)合的水平可以針對(duì)陽性對(duì)照(例如，陽性血清對(duì)照)標(biāo)準(zhǔn)化，并與實(shí)驗(yàn)測定的或預(yù)定的抗原(ZnT8)的截止值(陰性對(duì)照水平)進(jìn)行比較和分析，以便確定試樣是否包含臨床上或相反相關(guān)的抗ZnT8抗體的水平。所述分析可以包括篩選除了ZnT8之外的其他自身抗原(包括但不限于，胰島素，胰島素瘤抗原和谷氨酸脫羧酶)的能力。本發(fā)明的該方法或分析更具體的包括提供一種ZnT8抗原，可以-險(xiǎn)測抗該ZnT8抗原的患者抗體。ZnT8抗原可以是任意合適的ZnT8衍生的抗原，包括全長ZnT8蛋白，或其同系物、片段、融合蛋白、突變的肽或肽模擬物，它們可以檢測患者中抗ZnT8的血清抗體。ZnT8抗原包含至少一個(gè)抗體表位。尤其優(yōu)選的ZnT8抗原是ZnT8蛋白的C端肽，其在上文纟皮詳細(xì)描述。依照本發(fā)明，是在根據(jù)本文所述信息的預(yù)期用途能夠有效篩選抗體的條件下進(jìn)行分析。有效條件包括，但不限于，允許細(xì)胞生長的合適培養(yǎng)基、溫度、pH和氧條件。通常，在竟?fàn)幓蚍蔷範(fàn)幮詶l件下將患者的試樣與ZnT8抗原接觸，檢測、定量試樣中自身抗體與ZnT8抗原的結(jié)合并與陰性和/或陽性對(duì)照進(jìn)行比較。用于檢測樣品中抗ZnT8的自身抗體的技術(shù)可以包括任意合適的分析，包括但不限于，ELISA(直接或間接的)，放射免疫沉淀分析，時(shí)間分辨熒光和化學(xué)發(fā)光分析。這種分析形式是本領(lǐng)域公知的。用于本發(fā)明該實(shí)施方案的優(yōu)選分析是竟?fàn)幮凿B分析。這種分析已經(jīng)詳細(xì)描述于美國臨時(shí)申請?zhí)?0/822,786，其在此完整引入作為參考。該方法通常包括進(jìn)行竟?fàn)幮钥贵w分析，其中檢測方法使用銪熒光。該方法更具體的包括56以下步驟將抗原(受試者抗體與其選擇性結(jié)合)固定到基質(zhì)上，諸如分一斤板的孔或其他合適的基質(zhì)；封閉基質(zhì)上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；向板中加入試樣(例如，來自進(jìn)行抗體評(píng)價(jià)的受試者的血清樣品)，其中在存在或不存在抗原的液體形式的條件下預(yù)孵育試樣(即，竟?fàn)幉襟E)；和最終，利用基于銪的檢測系統(tǒng)檢測結(jié)合固定抗原的抗體，諸如與試劑(例如，生物素)偶聯(lián)的二抗，然后是結(jié)合第一試劑(例如，鏈霉親和素)的第二試劑(用銪標(biāo)記)。然后利用標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法檢測銪發(fā)射的焚光水平。因?yàn)樗龇治鍪蔷範(fàn)幮苑治?，從與抗原預(yù)孵育的樣品計(jì)數(shù)的焚光中減去未與抗原預(yù)孵育的樣品計(jì)數(shù)的熒光，獲得結(jié)果水平。該水平可以針對(duì)陽性對(duì)照(例如，陽性血清對(duì)照)標(biāo)準(zhǔn)化，并與實(shí)驗(yàn)測定的或預(yù)定的抗原(ZnT8)的截止值(陰性對(duì)照水平)進(jìn)行比較和分析，以便確定試樣是否包含臨床上或相反相關(guān)的抗ZnT8抗體的水平。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"試樣，，一般可用于表示任一類型的樣品，其被認(rèn)為包含或可能包含將通過本發(fā)明檢測的抗體。試樣包括準(zhǔn)備好的樣品，諸如源自天然樣品或合成產(chǎn)生的樣品，及更優(yōu)選的獲自待測受試者(個(gè)體，患者，動(dòng)物)的任意生物樣品。因此樣品包括細(xì)胞上清液，體液，組織或其他培養(yǎng)基，它們可能包含待檢測的抗體。適于取樣的體液包括，但不限于，血液，粘液和母乳，和最優(yōu)選的是血液或血清樣品，其中血清是尤其優(yōu)選的。正如以上的討論，本發(fā)明的分析可被安排用于檢測一種抗體特異性(即，ZnT8)，超過一種(例如，2,3，4，5，6，7,8，9，或IO)抗體特異性(即，檢測結(jié)合不同抗原或相同抗原的不同表位或其組合的抗體)，或多種(>10)抗體特異性。換言之，所述方法被安排用于在單次分析或?qū)嶒?yàn)中檢測一種、超過一種或多種不同的抗體(例如，通過將不同的抗原和/或抗原表位(一組抗原和/或表位)加入單個(gè)板或分析基質(zhì)的不同孔中，以便所述分析利用盡可能多的不同抗體(只要有效)篩選單個(gè)樣品)。此外，所述分析可被安排以高通量方式篩選多個(gè)受試者，以便獲得關(guān)于受試者群體的信息。本發(fā)明的方法具有數(shù)種不同的用途。本發(fā)明的方法可用于為了任意目的檢測樣品中的抗體，包括臨床(例如，診斷、預(yù)后和治療)和研究目的。本發(fā)明的方法可以利用人或非人動(dòng)物樣品進(jìn)行。首先，所述方法可用于診斷T1D,或更重要的診斷受試者患T1D的可能性或T1D發(fā)病的時(shí)間。所述受試者可以是被懷疑患有T1D的個(gè)體，已知易患T1D的個(gè)體，或被推測是健康的但經(jīng)歷常規(guī)或診斷篩選的個(gè)體。所述受試者還可以是先前被診斷患有T1D的個(gè)體，或已經(jīng)開始治療的個(gè)體，和正監(jiān)視T1D進(jìn)展的個(gè)體。術(shù)語"診斷(diagnose,diagnosis,diagnosing)"及其變形是指疾病或病癥的鑒定(基于其體征和癥狀)。本文中，"陽性診斷"表明鑒定出疾病或病癥，或患疾病或病癥的可能性。與此相反，"陰性診斷"表明未鑒定出疾病或病癥，或患疾病或病癥的可能性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可用于選擇^皮f^測將,人T1D的治療步驟受益或不受益的患者。類似地，所述方法可用于指示對(duì)特定患者的具體治療步驟或顯示對(duì)特定患者的具體治療步驟不可取。在該實(shí)施方案中，所述方法通常包括以下步驟(a)進(jìn)行本發(fā)明的方法用于4企測本文詳細(xì)描述的抗體；(b)將患者樣品中的抗體水平與選自以下組的抗體的對(duì)照水平進(jìn)行比較(l)與對(duì)治療步驟的反應(yīng)性有關(guān)的抗體的對(duì)照水平；和(2)與對(duì)治療步驟的非反應(yīng)性有關(guān)的抗體的對(duì)照水平；和(c)挑選被預(yù)測將受益于治療步驟的患者，如果相對(duì)于與對(duì)治療步驟的非反應(yīng)性相關(guān)的抗體的對(duì)照水平，患者樣品中的抗體水平統(tǒng)計(jì)上更類似于與對(duì)治療步驟的反應(yīng)性有關(guān)的抗體的對(duì)照水平；或(d)挑選被預(yù)測將不會(huì)受益于治療步驟的患者，如果相對(duì)于與對(duì)治療步驟的反應(yīng)性相關(guān)的抗體的對(duì)照水平，患者樣品中的抗體水平統(tǒng)計(jì)上更類似于或低于與對(duì)治療步驟的非反應(yīng)性有關(guān)的抗體的對(duì)照水平。例如，這種方法可用于指示給患者施用消炎劑或施用選擇性靶向ZnT8或另一種自身抗原或其表達(dá)的試劑，或顯示給患者施用消炎劑或施用選擇性靶向ZnT8或另一種自身抗原或其表達(dá)的試劑不可取。該實(shí)施方案的其他方面對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。利用本發(fā)明的方法根據(jù)抗體檢測的陽性診斷或預(yù)后指示，樣品中存在的抗體水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于同類樣品中實(shí)驗(yàn)確定的或預(yù)定的陰性或"正常，，抗體水平(即，"正常"水平是在未患T1D的受試者中發(fā)現(xiàn)的抗體檢測水平或其平均值)。為了確定陽性診斷或預(yù)后，試樣中檢測出的抗體水平比設(shè)定或確定的基線增加的量是統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的(即，至少95%置信水平，或p<0.05)。標(biāo)準(zhǔn)化或產(chǎn)生樣品中抗體水平"指數(shù)"的方法是本領(lǐng)域已知的。利用本發(fā)明的方法根據(jù)抗體檢測的陰性診斷或預(yù)后指示，未在樣品檢測出抗體，或樣品中存在的抗體水平統(tǒng)計(jì)上沒有顯著高于(和可以低于)一種水平(該水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于實(shí)驗(yàn)確定的或預(yù)定的陰性或"正常"抗體水平)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括T淋巴細(xì)胞分析，其檢測受試者中特異性結(jié)合ZnT8的T細(xì)胞的存在或缺失。如同上面討論的抗體分析一樣，本發(fā)明的所述方法可以基于患者血清中抗ZnT8的T細(xì)胞應(yīng)答性水平有效鑒定或選擇最有可能將患有或正患有I型糖尿病的患者，包括預(yù)測以下因素，諸如發(fā)病時(shí)間，或監(jiān)測疾病的進(jìn)展或階段。所述方法還可用于有效鑒定或選^^對(duì)具體治療方法有應(yīng)答或沒有應(yīng)答的患者(即，該方法用于指示對(duì)特定患者的治療方法或顯示對(duì)特定患者的治療方法不可取)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述方法包括根據(jù)ZnT8多態(tài)性檢測本文描述的異表位。分析可以區(qū)別小肽，通常是8到20個(gè)氨基酸長度，其編碼蛋白序列，包括分子的可變區(qū)或恒定區(qū)。這種T細(xì)胞應(yīng)答通常在外周血中監(jiān)觀'J，但也可用于獲自身體其他部分的淋巴細(xì)胞群。用于這種分析的分析平臺(tái)可以基于增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生或活化的其他標(biāo)記物，它們是表面或胞內(nèi)蛋白標(biāo)記物或脂質(zhì)或碳水化合物。這些分析的判斷通常還涉及對(duì)個(gè)體的HLA1型和2型基因型的了解。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，在檢測患者試樣的ZnT8特異性T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)應(yīng)答的分析法中提供包含至少一個(gè)ZnT8T細(xì)胞表位的ZnT8抗原。包括T細(xì)胞表位的ZnT8蛋白和抗原已在上文詳細(xì)描述。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，體外翻^^系統(tǒng)的產(chǎn)物可用于本分析。分析形式可以是用于抗原的任意合適的T淋巴細(xì)胞分析，包括但不限于，T淋巴細(xì)胞增殖分析，利用MHCI型和II型四聚體試劑的分析，流式細(xì)胞分析和ELISPOT分析。因此，合適的分析可以包括基于細(xì)胞的分析和不基于細(xì)胞的分析。就后者來說，可以使用可溶性T細(xì)胞受體，例如，在檢測結(jié)合可溶性MHC分子(例如，四聚體試劑)的ZnT8抗原的結(jié)合或免疫分析中。在前一種情況下，檢測抗原與細(xì)胞表面T細(xì)胞受體的結(jié)合，通常通過檢測細(xì)胞的增殖或細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在抗體分析中，本發(fā)明的T細(xì)胞分析可用于檢測患者樣品中超過一種或多種自身抗原，和/或檢測多個(gè)受試者中的T細(xì)胞應(yīng)答。如同所述抗體分析一樣，根據(jù)ZnT8T細(xì)胞應(yīng)答的檢測的陽性診斷或預(yù)后指示，患者樣品中存在的ZnT8特異性T細(xì)胞(自體反應(yīng)性T細(xì)胞)的水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于同類樣品中實(shí)驗(yàn)確定的或預(yù)定的這種T細(xì)胞應(yīng)答的陰性或"正常"水平(即，"正常"水平是在未患T1D的受試者中發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞應(yīng)答水平或其平均值)。為了確定陽性診斷或預(yù)后，試樣中檢測出的ZnT8-特異性T細(xì)胞應(yīng)答水平比設(shè)定或確定的基線增加的量是統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的(即，至少95%置信水平，或p<0.05)。標(biāo)準(zhǔn)化或產(chǎn)生樣品中ZnT8-特異性T細(xì)胞應(yīng)答水平"指數(shù)"的方法是本領(lǐng)域已知的。利用本發(fā)明的方法根據(jù)ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答檢測的陰性診斷或預(yù)后指示，未在樣品檢測出ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答，或樣品中存在的這種應(yīng)答的水平統(tǒng)計(jì)上沒有顯著高于(和可以低于)一種水平(該水平統(tǒng)計(jì)上顯著高于實(shí)驗(yàn)確定的或預(yù)定的這種應(yīng)答的陰性或"正常，，水平)。本發(fā)明還包括用于進(jìn)行如上所述的任意一項(xiàng)診斷方法的試劑盒。所述試劑盒包括(a)ZnT8抗原(包括如上所述的任意一種蛋白、肽或才莫擬物)，用于式提供抗原)；和(b)用于檢測抗體與抗原的結(jié)合的試劑，和/或用于檢測T細(xì)胞受體與抗原的結(jié)合的試劑(在基于細(xì)胞或不基于細(xì)胞的分析中)。用于進(jìn)行所述分析的其他試劑還可以包括，諸如，但不限于，緩沖液，二抗，用于讀取所述分析的可檢測標(biāo)記和試劑，可溶性結(jié)合蛋白(例如，可溶性MHC,可溶性T細(xì)胞受體)，和其他有用的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在治療和預(yù)防性策略中基于鑒定ZnT8作為重要的自身抗原開發(fā)和使用各種試劑給受試者接種以在個(gè)體中預(yù)防、延緩或改善I型糖尿病的發(fā)病，抑制或破壞抗胰島P細(xì)胞的自體反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)更高的應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，ZnT8蛋白、肽、同系物、模擬物、ZnT8抗體或其抗原結(jié)合片段，及其他ZnT8衍生的或基于ZnT8的試劑(包括肽或抗體的化學(xué)或物理改造形式)在體外或體內(nèi)給受試者施用，以便改變T1D發(fā)展或發(fā)病的過程，和/或在受試者中誘導(dǎo)ZnT8特異性的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，其是致耐受或保護(hù)性的，而不是破壞性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種試劑作為疫苗施用。這種ZnT8相關(guān)的試劑已經(jīng)在上文描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將基于ZnT8的抗原特異性試劑(被設(shè)計(jì)成靶向于ZnT8特異性自體反應(yīng)性T細(xì)胞)以及在T細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或?qū)細(xì)胞有毒性的藥劑給受試者施用。該方法可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。例如，形成肽-結(jié)合溝的可溶性MHC分子(參見，例如，美國專利號(hào)5，820，866)與ZnT8抗原或致耐受肽0艮據(jù)該實(shí)施方案包括ZnT8的突變肽和同系物，它們結(jié)合MHC并引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答)結(jié)合。這種復(fù)合物可以與毒素或其他試劑進(jìn)一步復(fù)合(通過60任意共價(jià)或非共價(jià)技術(shù))，當(dāng)T細(xì)胞通過它們的T細(xì)胞受體結(jié)合MHC-肽復(fù)合物時(shí)，所述毒素或其他試劑將誘導(dǎo)T細(xì)胞的壞死或凋亡。適用于本發(fā)明作為與ZnT8肽和同系物復(fù)合(結(jié)合，偶聯(lián))的試劑的毒素包括對(duì)細(xì)胞有毒性的(壞死或凋亡)任意毒素或蛋白、試劑或分子，包括可用于本文所述治療環(huán)境的任意毒素。這種毒素包括，但不限于，F(xiàn)as配體，美洲商陸抗病毒蛋白，肉毒毒素，蓖麻毒，等等。此外，從本文描述的遺傳、自身抗體和T細(xì)胞分析獲得的知識(shí)可用于決定使用具體的治療方式。這種方式可基于與ZnT8或Slc30A8無關(guān)的試劑，或抗原特異性試劑，諸如單獨(dú)的或與另一試劑(例如毒素)連接的重組ZnT8蛋白、ZnT8衍生肽，細(xì)胞諸如淋巴細(xì)胞，蛋白諸如HLA分子或免疫球蛋白，或單獨(dú)的或與另一試劑連接的Slc30A8DNA。治療可基于抗原或編碼它的核酸或抑制其表達(dá)，可以根據(jù)所需結(jié)果進(jìn)行調(diào)整與異表位匹配或者不匹配。與具有自身反應(yīng)性的患者的異表位匹配可能是保護(hù)性的，通過誘導(dǎo)耐受性體質(zhì)。另一方面，與其不匹配是一種免疫形式，其也可以被控制用于有益效果。起初就知道個(gè)體的異表位狀況將是重要的，因?yàn)檫@將決定按照哪條途徑和使用哪種亞型的藥劑。這種治療方法將與目標(biāo)在于檢測治療劑效果的診斷分析結(jié)合。一些情況下這種診斷將是上文提及的自身抗體和T細(xì)胞分析的重復(fù)；但是產(chǎn)生的一些試劑可應(yīng)用于疾病特異性目標(biāo)。例如，包含或編碼治療劑的異表位可應(yīng)用于B淋巴細(xì)胞，以擴(kuò)增、活化或除去特定細(xì)胞類型。治療效果可以按照靶細(xì)胞類型的群來評(píng)價(jià)，例如，使用與熒光分子的酶偶聯(lián)的異表位肽標(biāo)記B細(xì)胞群，然后可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)和表型表征。這種步驟還可以用于這種細(xì)胞群的分離，通過篩選步驟或熒光活化的細(xì)胞分選。上述用于本發(fā)明預(yù)防和治療方法的試劑可以單獨(dú)施用，在組合物、制劑或疫苗中施用，和/或與用于TlD的預(yù)防或治療的其他試劑聯(lián)合施用(一起或連續(xù)地)。正如以上的討論，將本發(fā)明的組合物或藥劑以有效輸送該藥劑到耙細(xì)胞或耙位點(diǎn)的方式給患者施用，這樣的話所述藥劑可以作用于該位點(diǎn)和/或?qū)λ黾?xì)胞起作用。合適的施用方案包括任意體內(nèi)或體外施用方案。有效施用方案(即，以有效方式施用本發(fā)明的組合物或藥劑)包括合適的劑量參數(shù)和施用模式(在受試者或細(xì)胞中產(chǎn)生組合物或藥劑的所需活性)，諸如對(duì)自身抗原ZnT8的自體反應(yīng)性T細(xì)胞的耐受性，胰島炎的預(yù)防或減少和/或胰島P細(xì)胞的破壞，及發(fā)病的預(yù)防、延緩，或T1D嚴(yán)重性的改善。優(yōu)選的患者獲得來自所述施用的一些可測量的、可見的或感覺得到的受益?？梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)，例如，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)，體內(nèi)動(dòng)物模型，和最終，臨床試驗(yàn)(如果患者是人)，確定有效的劑量參數(shù)?？梢岳帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的針對(duì)具體疾病或病癥(患者患有或具有患病的風(fēng)險(xiǎn))的方法測定有效的劑量參數(shù)。這種方法包括，例如，存活率、副作用(即，毒性)和發(fā)病、疾病的進(jìn)展或消退的測定。給藥途經(jīng)包括體內(nèi)、體外和離體途徑。體內(nèi)途徑包括，但不限于，靜脈內(nèi)施用，腹腔內(nèi)施用，肌內(nèi)施用，節(jié)點(diǎn)內(nèi)施用，冠狀動(dòng)脈內(nèi)施用，動(dòng)脈內(nèi)施用(例如，進(jìn)入頸動(dòng)脈)，皮下施用，透皮輸送，氣管內(nèi)施用，皮下施用，關(guān)節(jié)內(nèi)施用，心室內(nèi)施用，吸入(例如，氣霧劑)，顱內(nèi)，脊柱內(nèi)，目艮內(nèi)，耳，鼻內(nèi)，口服，肺部施用，導(dǎo)管的注入，和直接注射入組織。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過腸胃外途徑(例如，皮下，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)和腹腔途徑)施用組合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和肌內(nèi)施用。耳輸送可以包括滴耳劑，鼻內(nèi)輸送可以包括滴鼻劑或鼻內(nèi)注射，和眼內(nèi)輸送可以包括滴眼劑。氣霧劑(吸入)輸送還可以利用本領(lǐng)i或木亍準(zhǔn)的方法進(jìn)4亍(參見，例i口，Striblingetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281,1992，其在此完整引入作為參考)?？梢詫⒈景l(fā)明的藥劑或組合物與載體(能夠抵抗動(dòng)物腸內(nèi)消化酶的降解)絡(luò)合，進(jìn)行口服輸送。這種載體的實(shí)例，包括塑料膠嚢或片劑，諸如本領(lǐng)域已知的那些。體外是指在患者體外進(jìn)行調(diào)控步驟的一部分，諸如通過輸送藥劑或組合物到細(xì)胞群(或?qū)⒓?xì)胞與藥劑或組合物接觸)，其中細(xì)胞已從患者取出，并將處理后的細(xì)胞返回到患者。這種細(xì)胞可以包括，例如，T細(xì)胞，其中T細(xì)胞被誘導(dǎo)改變它們在體內(nèi)接觸ZnT8時(shí)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型。給宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物施用組合物的體外和離體途徑通過以下方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，電穿孔，顯4效注射，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，吸附，原生質(zhì)體融合，蛋白載體的使用，離子載體的使用，用于細(xì)胞透化的去污劑的使用，和在培養(yǎng)物中將化合物與耙細(xì)胞和/或耙蛋白簡單混合(例如，結(jié)合)。對(duì)于蛋白、小分子(即，藥物設(shè)計(jì)的產(chǎn)物)或抗體來說，優(yōu)選的這類藥劑的單次劑量通常包括約0.01微克x千克-l到約10毫克x千克-l動(dòng)物體重。更優(yōu)選的藥劑的單次劑量包括約1微克x千克-1到約10毫克x千克-l動(dòng)物體重。更優(yōu)選的藥劑的單次劑量包括約5微克x千克-l到約7毫克x千克-1動(dòng)物體重。甚至更優(yōu)選的藥劑的單次劑量包括約10微克x千克-1到約5毫克x千克-l動(dòng)物體重。如果藥劑是腸胃外輸送，另一種尤其優(yōu)選的藥劑的單次劑量包括約0.1微克x千克-1到約10微克x千克-1動(dòng)物體重。由本文所述方法產(chǎn)生的預(yù)防或治療效果不必是治愈具體的疾病或病癥(例如，I型糖尿病)，而是還可以包括以下結(jié)果大部分情況下包括前驅(qū)糖尿病或明顯T1D的發(fā)病的延緩，或疾病破壞性方面的改善，這樣的話與沒有所述治療情況下的預(yù)期相比，完全的胰島損傷將^皮推遲更長時(shí)間，從而給予患者更長的時(shí)間來完成對(duì)胰島素療法的依賴，其他治療介入，和疾病的下游有害健康影響。如本文使用的，短語"預(yù)防疾病"是指減輕疾病的癥狀；減少疾病的出現(xiàn)或發(fā)病，和/或減輕疾病的嚴(yán)重性。保護(hù)患者是指給患者施用本發(fā)明的藥劑或組合物時(shí)，其預(yù)防疾病出現(xiàn)和/或治愈或減輕疾病癥狀、體征或病因的能力。像這樣，保護(hù)患者免患疾病包括預(yù)防或延緩疾病發(fā)生(預(yù)防性治療)和治療患有疾病或處于疾病早期的患者(治療性治療)。術(shù)語，"疾病'，泛指與哺乳動(dòng)物正常健康狀態(tài)的任何偏離，包括存在疾病癥狀時(shí)的狀態(tài)，以及其中存在偏離(胰島13細(xì)胞的破壞)但癥狀還未顯示的病癥。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種鑒定可用于本文描述的診斷分析，或本文描述的本發(fā)明預(yù)防或治療方法的化合物的方法。這種方法包括以下步驟將基于ZnT8的藥劑(例如，ZnT8核酸分子，蛋白或肽，同系物，模擬物，或抗體或其片段，或ZnT8特異性T細(xì)胞受體)與推定的調(diào)控化合物接觸，并檢測相互作用和/或由推定的調(diào)控化合物與基于ZnT8的藥劑相互作用產(chǎn)生的作用。這種分析可以是基于細(xì)胞或不基于細(xì)胞的。例如，可以利用如上所述的ZnT8蛋白(包括片段及其同系物)鑒定選擇性結(jié)合ZnT8的抗體及其抗原結(jié)合片段?？梢允褂肸nT8抗體或ZnT8特異性T細(xì)胞受體鑒定ZnT8同系物，肽模擬物，突變肽和片段，它們可用于診斷或治療分析?；赯nT8的試劑可用于設(shè)計(jì)新的合成試劑，包括模擬物，用于本文描述的診斷或治療方法。還可以使用ZnT8核酸分子，蛋白，肽，模擬物或抗體來鑒定在個(gè)體中可以抑制或改變針對(duì)ZnT8的免疫應(yīng)答的各種調(diào)控化合物。這種方法的步驟通常包括將基于ZnT8的試劑與推定的調(diào)控化合物接觸，利用各種分析測量對(duì)基于ZnT8的試劑的作用，諸如檢測ZnT8mRNA轉(zhuǎn)錄(例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)，原位雜交，Northern印跡，報(bào)告基因的序列分析或檢測)；檢測ZnT8翻譯(例如，通63過免疫印跡，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA),放射免疫分析(RIA)，免測沉淀，免疫組織化學(xué)和免疫熒光)；和/或4企測ZnT8生物活性(例如，通過4企測本文描述的任意一項(xiàng)ZnT8活性，或通過^r測這種活性的抑制或遏制)。該方法中檢測到的化合物可用于本文描述的診斷、預(yù)防或治療方法。根據(jù)本發(fā)明，本文描述的方法和分析適用于作為脊推動(dòng)物類哺乳綱成員的患者，包括但不限于，靈長類動(dòng)物，家畜和家養(yǎng)寵物(例如，伴侶動(dòng)物)。最常見，患者是人類患者。提供下列實(shí)施例是用于說明目的，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下文和本文其他處公開的每篇出版物或其他參考文獻(xiàn)均在此完整引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1下列實(shí)施例描述將ZnT8(亦稱Slc30a8)首次鑒定為新的糖尿病自身抗原。本發(fā)明人利用人U133和小鼠MOE430Affymetrics芯片(實(shí)際上覆蓋了完整基因組)以及Panchip5.0(報(bào)告小鼠胰腺中的基因轉(zhuǎn)錄物)進(jìn)行寡核苷酸微陣列實(shí)驗(yàn)。從正常小鼠、糖尿病模型(NOD和ob/ob)及IAPP基因和Ngn3缺陷小鼠的分離的胰島，以及小鼠胰腺胂瘤細(xì)胞系(aTCl-6胰高血糖素瘤，(3TC3和Min6胰島素瘤和mPAC導(dǎo)管瘤系)獲得^據(jù)。分析所述凄t據(jù)，高亮顯示具有小島細(xì)胞型特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，以及它們在胰腺a-和P-細(xì)胞之間的分布。使用基于基因本體論(GO)注釋的進(jìn)一步分析來產(chǎn)生人和小鼠候選自身抗原的基因列表。在IO個(gè)得分最高的候選物中，5個(gè)是已知的糖尿病自身抗原，促使本發(fā)明人對(duì)高得分轉(zhuǎn)錄物(對(duì)應(yīng)于ZnT8)中的一種作為新發(fā)病的T1D人類受試者中體液自身免疫性的靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證原則(proof-of-principle)實(shí)驗(yàn)。開發(fā)的針對(duì)該候選物的血清學(xué)分析在20%的糖尿病受試者中檢測到免疫反應(yīng)性，而在對(duì)照中沒有檢測到(<2.5%)?，F(xiàn)在的計(jì)劃利用體液和細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性的分析尋求檢查所述列表中的這種和其他基因候選物。具體來說，覆蓋幾乎所有編碼的小鼠mRNAs范圍(轉(zhuǎn)錄組)的基因微陣列的出現(xiàn)使得能夠鑒定在胰島中表達(dá)的基因亞組。大量公開的研究已經(jīng)記載了在胰島組織、特異性小島細(xì)胞類型和胰島來源的細(xì)胞系中表達(dá)的基因(67)(Shalev，2002)(68)。此外，研究報(bào)告了胰島對(duì)生理和病理生理處理(諸如在體外用葡萄糖或炎性細(xì)胞因子刺激)的應(yīng)答，及載有突變基因(影響胰功能或發(fā)育)的小鼠的胰島的應(yīng)答。令人遺憾地，目前該數(shù)據(jù)的大部分不能從中央庫公共數(shù)據(jù)庫獲得，或在各種微陣列平臺(tái)上，使得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化非常困難。本發(fā)明人利用人U133和小鼠MOE430寡核苷酸芯片(實(shí)質(zhì)上報(bào)告了每個(gè)物種的全部轉(zhuǎn)錄物)進(jìn)行了超過50次微陣列實(shí)驗(yàn)。這包括來自正常小鼠、糖尿病模型(NOD和ob/ob)及IAPP基因和Ngn3缺陷小鼠的數(shù)據(jù)。后者完全缺失胰腺內(nèi)分泌腺細(xì)胞，因此在不同妊娠時(shí)間點(diǎn)的分析允許鑒定在整個(gè)發(fā)育期間相對(duì)于外分泌和導(dǎo)管組織在內(nèi)分泌腺細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物(69)。已經(jīng)將這些數(shù)據(jù)與來自45個(gè)組織類型(Novartis數(shù)據(jù)集和Unigene表達(dá)模式)的較大非胰腺組織庫的陣列數(shù)據(jù)和dbEST序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。小鼠胰腺腫瘤細(xì)胞系(ocTCl-6胰高血糖素瘤，PTC3和Min6胰島素瘤和mPAC導(dǎo)管瘤系)的分析進(jìn)一步允許產(chǎn)生預(yù)示分?jǐn)?shù)，以選擇有可能顯示小島細(xì)胞型特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，以及它們在cc-和(3-細(xì)胞之間的分布。這些細(xì)胞系表達(dá)與腫瘤細(xì)胞表型有關(guān)的基因，因此還對(duì)來自表達(dá)自身抗原Phogrin(與EGFP相連，受大鼠胰島素2啟動(dòng)子的控制)的轉(zhuǎn)基因小鼠的分離胰腺p細(xì)胞進(jìn)行分析。表2列出一些基因，對(duì)于這些基因通過ANOVA分析確定轉(zhuǎn)錄物，首先是在任意胚胎學(xué)年齡的Ngn3野生型和敲除小鼠(胰腺內(nèi)分泌腺和前體)中差別表達(dá)，其次是存在于成年小鼠胰島。然后基于在ocTC和|3TC細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)將所述列表進(jìn)行劃分。所述方法成功地預(yù)測了參與胰島發(fā)育的大多數(shù)已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控組分的小島細(xì)胞特異性，諸如Ipfl,Arx，Pax4,Pax6,Brn4,NeuroD及數(shù)個(gè)a和(3細(xì)胞基因的已知細(xì)胞類型特異性。已知的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄物諸如PTPRN(IA-2)、激素原轉(zhuǎn)化酶(Pcskl，Pcsk2,Cpe)和granins(Chga,ChgbScg2，Sgnel)屬于常見的aTC和PTC轉(zhuǎn)錄物的庫。根據(jù)預(yù)測，與other胰島內(nèi)分泌腺細(xì)胞有關(guān)的基因不表達(dá)(Ppy,Pyy和ghrelin)。在已知基因中存在一些意外，例如WilliamsBeuren綜合征染色體區(qū)域14基因作為顯示|3細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄物出現(xiàn)。該轉(zhuǎn)錄因子是糖酵解和葡萄糖異生作用酶的重要調(diào)節(jié)因子，與肝起源的2型糖尿病形式有關(guān)(70)。它通常被認(rèn)為分布廣泛。利用原位雜交分析追蹤(數(shù)據(jù)未胞)，在成年胰腺中，轉(zhuǎn)錄物限于胰島，其分布符合P細(xì)胞的特異性。表2.檢查基因轉(zhuǎn)錄物(在Ngn3ko胰腺中e12.5、e15.5或e18.5被去除)在內(nèi)分泌腺細(xì)胞系aTC和P丁C和成年胰島中的表達(dá)。胰島內(nèi)分泌腺細(xì)胞的組分用下劃線表示；已知的自身抗原用黑體字突出顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表2還顯示已知T1D自身抗原的分布，用黑體字突出顯示。這種相對(duì)簡單的生物信息學(xué)分析顯示，胰島素1和2，IGRP(G6Pc-rs),IAPP和IA-2(PTPRN)位于它們的預(yù)期細(xì)胞位置，但GAD65不是這種情況。但是大部分研究者包括本發(fā)明人未在小鼠胰島中檢測到后者，盡管它在人胰島中是高豐度的(71)。上述分析強(qiáng)調(diào)了以下事實(shí)，許多自身抗原顯示細(xì)胞類型特異性。但是其自身不足以確定候選物，因此改進(jìn)所述生物信息學(xué)方法以考慮大量被認(rèn)為是自身抗原候選物屬性的特征，同時(shí)根據(jù)存在/缺席呼叫(present/absentcall)不排除候選物。模型基本上考慮了下列特征1.自身抗原顯示對(duì)耙細(xì)胞的特異性，盡管這不必是絕對(duì)的。2.大多數(shù)自身抗原在靶細(xì)胞中以中等到高水平表達(dá)。3.T1D自身抗原看起來與調(diào)節(jié)分泌途徑的元件物理相關(guān)。4.細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫的許多靶標(biāo)看起來是膜結(jié)合型的。5.大部分還在胸腺的外周抗原表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)。6.數(shù)個(gè)顯示選擇性剪接的組織特異性模式。特征1_4可以是基于微陣列數(shù)據(jù)集的交集和組成基因的注釋進(jìn)行評(píng)價(jià)。人們認(rèn)為有可能基于這類數(shù)據(jù)推算出"自身抗原指數(shù)，，，盡管重點(diǎn)放于對(duì)抗原性有貢獻(xiàn)的具體結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)特征正在確定，就像與細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答相比對(duì)體液介導(dǎo)的應(yīng)答的相對(duì)貢獻(xiàn)一樣。為解決這個(gè)問題，本發(fā)明人編譯了2組基因，一組針對(duì)小鼠，一組針對(duì)人，基于對(duì)內(nèi)分泌胰腺表達(dá)的豐度和特異性(表3);小鼠數(shù)據(jù)源自表2中的數(shù)據(jù)，關(guān)于表達(dá)數(shù)據(jù)的人類數(shù)據(jù)源自79個(gè)人類組織的NovartisGeneAtlas(72)。在GeneSpring和GeneSpeed中進(jìn)行分析，后者是由JanJensen及其同事在科羅拉多丹佛的BarbaraDavisCenter開發(fā)的蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫。表3A:小鼠P細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物選擇308個(gè)轉(zhuǎn)錄物，依據(jù)是它們不存在于缺失Ngn3的小鼠胰腺，存在于成年胰島，及它們存在于P-TC細(xì)胞系。在UnigeneEST表達(dá)數(shù)據(jù)庫中查詢這些基因中的每一種，以確定每種基因在38個(gè)不同小鼠組織包括胰腺(但不包括胰島)中轉(zhuǎn)錄的頻率。列表顯示每百萬EST克隆頻率，以及與所有組織中的總數(shù)相比在胰腺中注明的轉(zhuǎn)錄物百分比(特異性)。豐度和特異性的結(jié)果用于分選數(shù)據(jù)。編碼已知糖尿病自身抗原的轉(zhuǎn)錄物被突出顯示。B:人轉(zhuǎn)錄物最初查詢代表71個(gè)不同人組織的Novartis定制寡核苷酸陣列，以確定胰島數(shù)據(jù)集中的哪種基因顯示與所有其他組織的中值顯著不同的信號(hào)(ANOVA截?cái)?lt;0.0002)。篩選出這些轉(zhuǎn)錄物的子集(顯示比所有組織的中值高5倍的信號(hào))，以去除顯示低信號(hào)強(qiáng)度(<200)的轉(zhuǎn)錄物，并且相對(duì)于胰島所述子集在胰腺中的表達(dá)水平更高。然后將符合這些標(biāo)準(zhǔn)的140個(gè)基因用于查詢UnigeneEST表達(dá)數(shù)據(jù)庫，以確定每種基因在52個(gè)不同人組織包括胰腺中的轉(zhuǎn)錄頻率。列表顯示胰腺的每百萬EST克隆頻率(豐度)，以及相對(duì)于所有組織來說，胰腺中轉(zhuǎn)錄物的百分比(特異性)。數(shù)據(jù)按Abu*Spec指數(shù)分類。編碼已知糖尿病自身抗原的轉(zhuǎn)錄物被突出顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在所述兩種情況下，已知的糖尿病自身抗原在所述列表中出現(xiàn)靠前，甚至次要的體液自身免疫靶標(biāo)諸如ICA69和GAD67也屬于最前面的100個(gè)候選物。兩種列表上的轉(zhuǎn)錄物顯著重疊，它們的相對(duì)豐度和組織特異性相似，除了GAD65夕卜，與人相比時(shí)，它在小鼠中表達(dá)很少。位于最前面100個(gè)中的許多蛋白是分泌顆粒蛋白或與分泌途徑有關(guān)的膜蛋白，這通過檢查SWISSPROT，Prosite和EPCONdb數(shù)據(jù)庫的基因本體論(GO)功能得到確定。為了解決這些基因列表是否能夠真正預(yù)測自身抗原耙標(biāo)的問題，本發(fā)明人開發(fā)了針對(duì)Slc30a8(現(xiàn)被稱為ZnT8)的免測沉淀分析，Slc30a8是一種跨膜陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在小鼠和人類基因列表中表現(xiàn)靠前，是具有中等豐度但高組織特異性的轉(zhuǎn)錄物。利用克隆序列的體外翻譯及人類血清(來自接受胰島素療法之前44例新發(fā)病受試者及40歲和HLA配對(duì)對(duì)照)，開發(fā)出一種放射免疫沉淀分析法(圖1)。具體來說，從人胰島cDNA擴(kuò)增Slc30A8，并將其克隆入pCDNA3定向拓樸載體，驗(yàn)證序列，在利用5pCi35S甲硫氨酸的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物體外翻譯反應(yīng)中用作模板(0.5pg)。將人血清樣品(5pl)與20,000dpm翻譯產(chǎn)物在50pl包含0.1。/。NP40的Tris緩沖鹽溶液中4。C溫育過夜。將固定的ProteinA添加到每種溫育液中，利用過濾分離免疫球蛋白結(jié)合的放射性并通過閃爍計(jì)數(shù)測定。T1D血清樣品中的9個(gè)顯示顯著高于對(duì)照血清觀察到的結(jié)合水平(Mann68Whitney非參數(shù)雙尾檢驗(yàn))，高達(dá)所述分析中存在的放射性配體的50%。自身抗體在早期發(fā)病(<8歲)和年齡更大的患者(>8歲)中都存在。在9例陽性患者中，6例經(jīng)檢測還對(duì)胰島素自身抗體顯示陽性，5例對(duì)GAD顯示陽性，6例對(duì)IA-2顯示陽性。Slc30a8看起來是獨(dú)立的疾病標(biāo)記物。診斷血清學(xué)分析及用于細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性的分析的進(jìn)一步發(fā)展需要產(chǎn)生至少功能上純的、折疊成天然構(gòu)象并不含促有絲分裂雜質(zhì)的抗原。這不是一個(gè)小問題，尤其是對(duì)于跨膜蛋白像Slc30a8和IGRP來說，它們在過表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞是傾向于有毒性的。就IGRP來說，本發(fā)明人先前就能夠表達(dá)天然形式的高水平抗原，通過利用受調(diào)控的金屬硫蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞。已經(jīng)利用IGRP反應(yīng)性的T細(xì)胞雜交瘤克隆檢測了這種細(xì)胞的粗制膜組分(CMF)，所述雜交瘤克隆通過將IGRP免疫NOD小鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞與BWZ36淋巴瘤系(在IL-2啟動(dòng)子的控制下穩(wěn)定表達(dá)LacZ)融合產(chǎn)生(73)。例如，在圖2A顯示的數(shù)字化圖象中，S2細(xì)胞用mIGRPV5His構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并用0.5mMCu誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞膜組分(CMF)用抗V5抗體進(jìn)行印跡。用TX-100有效提取蛋白，將其與金屬螯合物親和層析柱結(jié)合，并在非變性條件下用咪唑洗脫。圖2B是顯示對(duì)IGRP-CMFT細(xì)胞雜交瘤(克隆l-76-54)進(jìn)行應(yīng)答分析的圖示。將T細(xì)胞雜交瘤(2x105細(xì)胞/孔)與作為APCs的輻射NOD脾細(xì)胞(lxl06細(xì)胞/孔)和抗原(IGRP-CMF或S2-CMF，10pg蛋白/孔)溫育過夜。對(duì)P半乳糖苷酶活性進(jìn)行分光光度法分析。圖2A-3B顯示，IGRP生成受金屬硫蛋白啟動(dòng)子的緊密調(diào)節(jié)(圖2A),粗制膜組分可以被哺乳動(dòng)物APCs加工以誘導(dǎo)來自IGRP反應(yīng)性T細(xì)胞雜交瘤克隆的IGRP特異性應(yīng)答(圖2B),利用氯-酚紅-P-半乳糖苷作為底物測定。推定抗原的昆蟲細(xì)胞表達(dá)與T細(xì)胞增殖或雜交瘤活化分析的組合提供了一種通用但有效的標(biāo)準(zhǔn)操作方案集合，它們應(yīng)當(dāng)適應(yīng)各種蛋白，包括可溶性和膜組分及需要糖基化和其他翻"^后修飾的蛋白。實(shí)施例2下列實(shí)施例描述了鑒定體液和細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫的其他靶標(biāo)的分析，通過進(jìn)一步評(píng)價(jià)表3中潛在候選物的候選名單(參見實(shí)施例1)。最初，對(duì)于不熟悉的候選物和只用ESTs表示的分子，獲得全長克隆，對(duì)人和小鼠胰腺組織進(jìn)行原位雜交分析以驗(yàn)證它們在P細(xì)胞中的表達(dá)。^人類愛試,^遽i^&清夢為V,/,這凝逸我^。這些分析最好在人類受試者中進(jìn)行，由于免疫應(yīng)答基因的遺傳多樣性和復(fù)雜性，它們很可能顯示更寬的自身免疫應(yīng)答譜。還可以利用半自動(dòng)化方法采用96孔模式以每個(gè)樣品低成本每天篩選大量樣品。BarbaraDavisCenter已經(jīng)保存了數(shù)以萬計(jì)的樣品，根據(jù)HLA單倍型、對(duì)與T1D有關(guān)的分子(胰島素，GAD65,IA2,phogrin)的自身反應(yīng)性、與乳糜瀉有關(guān)的分子(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶IgA)的自身反應(yīng)性及與多內(nèi)分泌腺疾病有關(guān)的分子包括影響腎上腺皮質(zhì)(21[3-羥化酶Addisons(74))和曱狀腺(TSH受體("))的自身反應(yīng)性進(jìn)行充分注釋和分析。可以獲得來自新發(fā)病患者的超過20,000份血清，以及數(shù)量較少的來自未患有T1D的同卵雙生的樣品和獲自糖尿病患者一級(jí)親屬的系列樣品，跨越的疾病階段從抗體陰性，到單個(gè)和多個(gè)抗體陽性，和疾病發(fā)病。首先開發(fā)出兩種分別基于放射免疫沉淀和時(shí)間分辨熒光檢測(TRF)方法的分析法。這兩種分析法均需要克隆和表達(dá)候選抗原，本發(fā)明人采用一種通用方法，其起始于逆轉(zhuǎn)錄的mRNA或經(jīng)驗(yàn)證的MGC質(zhì)粒(其作為PCR模板，利用被設(shè)計(jì)成能將序列插入InvitrogenGATEWAY進(jìn)入載體的引物)?；谶M(jìn)入載體，所述序列通過單步重組就可被指向體外翻譯，細(xì)菌重組蛋白的產(chǎn)生，腺病毒或桿狀病毒生成。對(duì)于放射性沉淀分析，在利用網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和5|na35S曱硫氨酸的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)(TNT試劑盒；Promega)中，將克隆的受CMV啟動(dòng)子控制的cDNA用作模板(0.5pg)。將96孔板中的血清樣品(5^il)與20,000dpm翻譯產(chǎn)物在50h1包含0.1。/。NP40的Tris緩沖鹽溶液中4。C溫育過夜。然后將固定的ProteinA添加到每種溫育液中以捕獲免疫球蛋白結(jié)合的放射性，然后利用過濾回收并通過閃爍計(jì)數(shù)測定放射性。在每次分析中運(yùn)行陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化。為了進(jìn)行TRF分析，根據(jù)情況cDNA在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中被表達(dá)為組氨酸標(biāo)記的構(gòu)建體，并通過金屬螯合物層析純化。96孔板用純化的蛋白(l-10pg/ml)包被，封閉，然后與血清在50nl包含0.1%NP40的Tris緩沖鹽溶液中4。C溫育過夜。利用與銪偶聯(lián)的d、鼠抗人IgG(DELFIA)和酸性pH下的時(shí)間分辨熒光測量法(Victor2多通道計(jì)數(shù)器)確定與板結(jié)合的免疫球蛋白。在這兩種類型的分析中，利用抗體與重組抗原的預(yù)吸附作為對(duì)照以檢測特異性并排除異嗜性抗體假象。就膜結(jié)合的抗原而言，可能證明必需利用結(jié)構(gòu)域特異性構(gòu)建體而不是全長分子進(jìn)行，但這可以通過設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異性結(jié)構(gòu)域的引物及按如上所述的相同方法克隆來實(shí)現(xiàn)。最初目標(biāo)是篩選190份新發(fā)病T1D血清和190份配對(duì)對(duì)照的庫，確定每種分析的特異性和靈敏性，利用受試者工作曲線分析來確定可接受的截?cái)嗪蚆annWhitney非參數(shù)檢驗(yàn)來確定統(tǒng)計(jì)顯著性(Prism軟件；GraphpadInc.)。通過進(jìn)一步優(yōu)化分析步驟以最小化背景并最大化信號(hào)/噪音來追蹤糖尿病血清的陽性結(jié)果。真正的陰性結(jié)果(低背景和信號(hào)/噪音為l)之后可進(jìn)一步改進(jìn)所述分析，例如在體外翻譯分析中引入胰腺微粒體。利用無疏水性結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體，不同的阻斷劑，不同的免疫球蛋白捕獲方法及將試驗(yàn)血清與重組抗原預(yù)吸附的樣品對(duì)比，通過降低分析中噪音的共同努力，具有低疾病特異性的分析有時(shí)可以被改進(jìn)。指向故障排除的努力的程度將明顯取決于問題的本質(zhì)和疾病特異性的自身反應(yīng)性是否是可疑的這一指示。對(duì)有希望的分析法進(jìn)行追蹤，通過將其應(yīng)用于其他可用的臨床樣品以回答以下問題在自然病史中自身反應(yīng)性何時(shí)存在，自身反應(yīng)性與其他自身抗原的重疊，以及是否存在與患者的年齡或HLA狀況的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室和BarbaraDavisCenter的大量出版物用做所述研究的模板(76;77)。4//Z^-Z)i3、-/)i^和-ZX7S掙差西VvE*謬逸#對(duì)候逸戎#的紐應(yīng)介孚本發(fā)明人先前的數(shù)據(jù)顯示，810.]\4背景下見八-008+I-AI3"。小鼠可以引發(fā)針對(duì)phogrin表位肽2和7的CD4+T細(xì)胞回憶應(yīng)答，并且相同的肽被人類新發(fā)病患者(其中許多具有DR4/DQ8單倍型)中的外周T細(xì)胞作為靶標(biāo)(78)。這些先前的研究支持以下預(yù)測，人HLA-DQ8對(duì)小鼠I-Ag7具有類似的結(jié)合特異性，而且所述-DQ8分子在小鼠或人共刺激和輔助分子的環(huán)境下可以呈遞抗原。它們確認(rèn)了小鼠轉(zhuǎn)基因模型作為鑒定與人類疾病有關(guān)的表位的方法的應(yīng)用，即使當(dāng)HLA轉(zhuǎn)基因不是在嚴(yán)格地糖尿病易感的背景下攜帶。為了評(píng)價(jià)任何候選抗原(在1A型糖尿病人中可以被MHC易感基因座呈遞)的T細(xì)胞表位的完整譜，利用轉(zhuǎn)基因HLA-DQ8、-DR3(DRB"0301)和-DR4(DRB1*0401)小鼠作為代表已知的糖尿病易感基因座和HLA-DR2(DRBP1502)作為與糖尿病無關(guān)的"保護(hù)性"II型分子的對(duì)照，對(duì)用人重組蛋白免疫后的T細(xì)胞回憶應(yīng)答進(jìn)行分析。動(dòng)物產(chǎn)生HLA-DR和-DQ轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)個(gè)品系來評(píng)價(jià)這些分子在塑造疾病(諸如T1D、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎和全身性紅斑狼瘡)中免疫應(yīng)答的作用(79;80)。本發(fā)明人/人Dr.ChellaDavid(DepartmentofImmunology,MayoClinic,Rochester,MN)處獲得HLA-DQ8+I-Apo/o,-DR2,-DIG和-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠，并在我們的中心建立這些小鼠的群落。最近從Dr.GretaSonderstrup，StanfordUniversity獲得具有人CD4的第二HLA-DR4系，其數(shù)量目前正在擴(kuò)增。利用I-APo/oI-Eao/o背景的基因組構(gòu)建體制備HLA-DQ8(DQA"0301/DQBP0302)小鼠，因此產(chǎn)生HLA-DQ8作為唯一的II型分子?；蚪M-DR2(DRBP1502)及-DR4(DRB1承0401)和國DR3(DRB"0301)的cDNA構(gòu)建體與小鼠I-Ea或人DRa轉(zhuǎn)基因配對(duì)。通過對(duì)取自尾部的DNA進(jìn)行PCR，將所有的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物根據(jù)MHC表達(dá)進(jìn)行基因分型，對(duì)PBMCs和脾細(xì)胞進(jìn)行FACS分析以確定人轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平并監(jiān)測小鼠MHC基因產(chǎn)物的表達(dá)?？乖蔬f細(xì)胞(APCs):輻射過的(20-35Gy)同基因小鼠脾細(xì)胞或源自骨髓的DCs被用于CD4+細(xì)胞的體外刺激，通過在蛋白抗原(l-100iag/ml)或肽(0.1-10pg/ml)存在的條件下共溫育。使用時(shí)，在用25號(hào)注射器針頭灌洗后，從8-12周齡雄性小鼠的脛骨和股骨的骨髓制備DCs。碎片和大的細(xì)胞聚集物通過過濾(70inm網(wǎng)目)去除，紅細(xì)胞用NH4C1裂解，將細(xì)胞重懸于RPMI1640(包含10%熱滅活的無內(nèi)毒素FBS)，并添加抗生素、丙酮酸鹽(lmM)、|3-巰基乙醇(50|^]^)和10ng/mlGM-CSF。在第2天和第4天通過用新鮮培養(yǎng)基替換去除未粘附的細(xì)胞，第6天回收粘附不牢的細(xì)胞(主要是含有一些污染的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的未成熟DCs)。在這個(gè)時(shí)候細(xì)胞將與重組抗原以及0.1pg/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)接觸24-48小時(shí)，以誘導(dǎo)II型MHC分子的"成熟，，和上調(diào)。T細(xì)胞系和雜交瘤利用我們先前已經(jīng)使用過的策略(78)從轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生T細(xì)胞系和克隆，所述策略依賴于免疫(在尾巴基部皮下注射溶于50plCFA的5-100嗎重組抗原)以誘導(dǎo)抗原特異性應(yīng)答。在免疫后8-10天從腹股溝和主動(dòng)脈周淋巴結(jié)收集T細(xì)胞，檢測針對(duì)抗原的CD4+回憶應(yīng)答，其優(yōu)選的在選擇性載體系統(tǒng)(即用S2細(xì)胞的His標(biāo)記抗原免疫；用細(xì)菌GST雜合物回憶)中產(chǎn)生。隨后使用抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞雜交瘤。T細(xì)胞將要經(jīng)受單輪體外刺激，然后聚乙二醇介導(dǎo)其與BWZ36胸腺瘤(其在IL-2啟動(dòng)子的NFAT元件控制下穩(wěn)定表達(dá)LacZ)融合(73)。HAT抗性系將在RPMI/FBS中繁殖，利用有限稀釋克隆，并通過將1x105個(gè)雜交瘤細(xì)胞與1x106個(gè)同基因脾細(xì)胞在RPMI/FBS和抗原中共培養(yǎng)進(jìn)行分析。在16-24小時(shí)后，誘導(dǎo)的(3半乳糖香酶利用可溶性比色底物氯-酚紅-P-半乳糖苷進(jìn)行測量(參見圖1)，或在單獨(dú)的固定雜交瘤細(xì)胞中利用X-Gal。為了證明MHC限制性，還利用選擇性APCs分析雜交瘤，所述APCs包括具有相同遺傳背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞，和一組EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴樣干細(xì)胞系(該細(xì)胞系是我們從T1D和對(duì)照器官供體建立的)；參見(78)。為了確認(rèn)克隆形成能力和評(píng)價(jià)克隆多樣性，通過反向PCR測序從總RNA制備的克隆cDNA，確定TCR使用(81)。本發(fā)明人現(xiàn)有的經(jīng)驗(yàn)(研究HLA-DQ8+和DR4+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中對(duì)phogrin細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞應(yīng)答)表明，推論的針對(duì)其他抗原的免疫原性、應(yīng)答應(yīng)當(dāng)在這些動(dòng)物中獲得，并且它們可能是提供消息的。按照呈遞相關(guān)肽的能力，I-Ag7和-DQ8是功能高度相似的，盡管載有這些分子的APCs不會(huì)越界呈遞給限于同源分子的T細(xì)胞。因?yàn)楦哂H和力類型轉(zhuǎn)換抗體的產(chǎn)生是T依賴性的步驟，可以預(yù)料從用抗原(先前在如上所述的實(shí)驗(yàn)中顯示引發(fā)自身抗體)免疫的動(dòng)物中將檢測到回憶應(yīng)答。但是，轉(zhuǎn)換不必是真實(shí)的；不顯示體液免疫的抗原仍然可以是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的靶標(biāo)。在本研究中HLA-DR2轉(zhuǎn)基因被歸入II型分子，其與糖尿病易感性無關(guān)，可以連接到與疾病無關(guān)的不同表位。本發(fā)明人先前的經(jīng)驗(yàn)表明，利用雜交瘤而不是T細(xì)胞克隆更可能獲得更高的TCRs多樣性，因此我們開始的焦點(diǎn)是制備這種試劑。與NOD小鼠不同，人類糖尿病受試者表達(dá)多種MHCII型分子，未來研究的一個(gè)可能領(lǐng)域就是在二倍轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中研究各種糖尿病易感性或保護(hù)性等位基因。例如，HLA-DR3/-DQ8動(dòng)物，患有更嚴(yán)重的胰島炎(但不是糖尿病)，并且與親本動(dòng)物相比，顯示對(duì)GAD65增強(qiáng)的自發(fā)應(yīng)答(82;83)。不受理論約束，本發(fā)明人相信它們還可能顯示對(duì)候選自身抗原增加的應(yīng)答性。類似地，可以檢查共表達(dá)HLA-DR3和-DR4或HLA-DR2和-DQ8的效果。實(shí)施例3下列實(shí)施例描述了另外的與鑒定ZnT8作為糖尿病自身免疫性的新標(biāo)記物和靶標(biāo)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。編碼ZnT8的cDNA可以作為糖尿病自身免疫標(biāo)記物的觀點(diǎn)來源于基因敲除小鼠(Ngn3缺失)的微陣列數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析及與其他組織中組織表達(dá)模式的比較(實(shí)施例1)。最初，所述標(biāo)記物被注釋為對(duì)應(yīng)于RikenESTC820002P14的UnigeneMm.208831,然后認(rèn)識(shí)到其對(duì)應(yīng)于ZnT8。本發(fā)明人制備了全長ZnT8，并進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，在放射免疫沉淀分析中利用新發(fā)病的糖尿病血清檢測了該蛋白。原始數(shù)據(jù)表明10%的患者顯示反應(yīng)性，指示ZnT8可以作為用于I型糖尿病診斷分析的新自身抗原。然后本發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了ZnT8的C端片段，其最終對(duì)應(yīng)于全長分子的大約102個(gè)氨基酸。在分析法中對(duì)該片段的檢測概述如下。利用ZnT8片段檢測來自144例新發(fā)病T1D患者(年齡1到55歲；平均年齡11.9歲)的血清，在放射免疫沉淀分析中45°/。是血清陽性的，與此相對(duì)，在年齡和HLA配對(duì)對(duì)照組中血清陽性<1%。按照年齡分層顯示，在年齡更大的個(gè)體中抗體顯示傾向于更高，在12-15歲的糖尿病發(fā)病組中達(dá)到70%的頂點(diǎn)。該年齡模式類似于其他糖尿病自身抗原(GAD65和IA2)的模式，但比胰島素抗體出現(xiàn)更晚。對(duì)所述新抗原的自身反應(yīng)性顯示與IAA、GAD和IA2的自身反應(yīng)性水平無關(guān)，因此其被認(rèn)為是一種獨(dú)立的標(biāo)記物。分析來自9例個(gè)體的樣品，所述個(gè)體從<1歲追蹤到臨床糖尿病的發(fā)病。這些來自于BarbaraDavisCenter進(jìn)行的同胞隊(duì)列的DAISY研究。在前驅(qū)糖尿病的過程中這些個(gè)體中的8例是血清陽性的。在前驅(qū)糖尿病的過程中自身反應(yīng)性傾向于出現(xiàn)更晚，通常接著出現(xiàn)GAD和胰島素自身抗體。一些情況下發(fā)病時(shí)間出現(xiàn)在IA2自身反應(yīng)性之前或之后。在1個(gè)所述受試者中，抗ZnT8是發(fā)病前檢測到的唯一抗體，強(qiáng)調(diào)了發(fā)現(xiàn)這種新自身抗原的重要性。檢測了8例新發(fā)病的個(gè)體，所述個(gè)體對(duì)胰島素GAD或IA2抗體是陰性的。在該組中，經(jīng)檢測2例對(duì)新抗原陽性，這再一次增強(qiáng)了以下觀點(diǎn)其具有不依賴現(xiàn)有標(biāo)記物的預(yù)測價(jià)值。更具體地，參照圖5，該圖顯示ZnT8C端探針的標(biāo)準(zhǔn)分析。曲線描述了在7個(gè)分離實(shí)驗(yàn)中一式兩份分析的稀釋系列的平均值±SD。實(shí)驗(yàn)在3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行，并使用不同的體外翻譯反應(yīng)。將體外翻譯的35S標(biāo)記探針(20000cpm)與溶于50nlPBSpH7.4(包含0.15。/。Tween20、1%BSA和0.01%疊氮鈉)的5)al血清溫育過夜，然后添加20nl50%(按體積計(jì)算)ProteinA瓊脂糖珠子懸液。45分鐘后，通過過濾回收珠子，清洗4次，然后干燥，添加30iid閃爍劑，進(jìn)行液體閃爍計(jì)數(shù)。對(duì)ZnT8ORF和N端4果針進(jìn)行比4交分析。陽性樣品9例新發(fā)病糖尿病血清的庫在合并的對(duì)照血清中二倍稀釋；對(duì)照樣品來自糖尿病同胞的9例年齡、性別和HLA匹配的樣品的庫；非特異性結(jié)合無血清添力口。圖6顯示利的不同ZnT8構(gòu)建體的盲DASP研究的結(jié)果。將體外翻譯的35S標(biāo)記構(gòu)建體(20000cpm)與溶于50^1PBSpH7.4(包含0.15%Tween20、1%BSA和0.01%疊氮鈉)的5pl血清溫育過夜，然后添加20pl50%(按體積計(jì)算)ProteinA瓊脂糖珠子懸液。45分鐘后，通過過濾回收珠子，清洗4次，然后干燥，添加30nl閃爍劑，進(jìn)行液體閃爍計(jì)數(shù)。免疫沉淀放射性可以表示為相對(duì)于從合并血清制備的標(biāo)準(zhǔn)品和16例個(gè)體對(duì)照血清組的分?jǐn)?shù)，如下所示抗原性指數(shù)—cpm試驗(yàn)品-平均cpm對(duì)照)/(cpm標(biāo)準(zhǔn)品-平均對(duì)照)。所有分析都重復(fù)3次。DASP提供100個(gè)參考樣品作為對(duì)照和50個(gè)匹配的新發(fā)病糖尿病樣品。分析截?cái)啾欢x為對(duì)應(yīng)于平均對(duì)照+4SD的指數(shù)，對(duì)于ORF、N端和C端分析分別是0.1543、0.1555和0.0129。在譯碼時(shí)，這對(duì)應(yīng)于98%、998%和99。/(>。據(jù)此8%、4%和60%的糖尿病樣品檢測為陽性。如圖6所述，大量對(duì)照血清在ORF和N端分析中始終檢測為陽性。該分析靈敏性更低，相對(duì)于C端分析顯示降低的信號(hào):噪音比。盡管糖尿病和對(duì)照樣品之間的差異在所有分析中都是顯著的(P0.0001MannWhitney秩和檢驗(yàn))，但最有效的分析是利用C端構(gòu)建體(C4探針SEQID:24)。C端分析更好的性能可能與探針(不存在跨膜結(jié)構(gòu)域)更好的溶解性和/或其他隱含表位的暴露有關(guān)。圖7所示實(shí)驗(yàn)證明ZnT8檢測患者的自身抗體，所述患者對(duì)ICA和金標(biāo)準(zhǔn)生化抗體是陰性的。用于檢測糖尿病自身抗體的初始金標(biāo)準(zhǔn)品是ICA(胰島細(xì)胞質(zhì)抗體)，一種復(fù)雜、耗時(shí)和相對(duì)主觀的分析，需要將血型O人類受試者的組織學(xué)胰腺切片與血清接觸，然后與焚光標(biāo)記的二抗溫育，由經(jīng)過訓(xùn)練的觀察者進(jìn)行顯微鏡鑒定。它還沒有完全被3種生化抗體分析(胰島素GAD和IA2)取代，因?yàn)榇嬖贗CA+ve但生化抗體陰性的個(gè)體。因此對(duì)于包括超過60000例受試者的大規(guī)模糖尿病預(yù)防試驗(yàn)1，ICA被用作確定T1D患者高風(fēng)險(xiǎn)一級(jí)親屬群體中自身免疫性的方法。對(duì)30例新發(fā)病患者(他們是ICA陽性，但胰島素、GAD和IA2陰性)血清的分析顯示，24%對(duì)ZnT8C端探針有反應(yīng)，表明ZnT8可能是ICA分析中檢測到的抗體的組分。更值得注意的是發(fā)現(xiàn)對(duì)ICA以及胰島素、insulin,GAD和IA2陰性的個(gè)體樣品中30例(20.3%)對(duì)ZnT8抗體檢測為陽性。這表明C端探針檢測到的表位可能隱含于ORF分子，該結(jié)論得到后續(xù)研究的證75實(shí)。存在以下可能性，對(duì)ZnT8的反應(yīng)性可能不是泛泛的與自身免疫性有關(guān)，而是特異性的與糖尿病有關(guān)。一系列24份個(gè)體(對(duì)抗DNA抗體4企測為陽性)樣品在ZnT8自身抗體分析中是陰性的。圖8A-C顯示在新發(fā)病群體中就Ins(圖8A)、GAD(圖8B)和IA2(圖8C)中的每一種而言自身抗體與ZnT8的關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)中，自身抗體與ZnT8C端探針之間的關(guān)系與3種金標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)來源于BDC采集的175例新發(fā)病的患者。結(jié)果顯示為采用對(duì)數(shù)尺度的抗原指數(shù)，以顯示數(shù)據(jù)的全部范圍及其重疊。圖9A-9D顯示相對(duì)于年齡來說，疾病發(fā)病時(shí)自身抗體的表達(dá)(圖9A=ZnT8;圖9B=GAD;圖9C=胰島素；圖9D=IA2)。具體來說，該實(shí)驗(yàn)顯示發(fā)病時(shí)ZnT8血清陽性在年長受試者中更高，而胰島素自身反應(yīng)性降低。數(shù)據(jù)來源于237例受試者，他們糖尿病發(fā)病的年齡在9個(gè)月到18歲之間。數(shù)據(jù)按l年間隔分類，得到與年齡有關(guān)的頻率模式。ZnT8C端反應(yīng)性隨著發(fā)病年齡增加，而胰島素反應(yīng)性顯示預(yù)期的降低，如公開的研究中所述。GAD反應(yīng)性也傾向于增加，盡管不是那么顯著。檢測年長受試者中自身反應(yīng)性的標(biāo)記物彌補(bǔ)了年長個(gè)體中胰島素作為標(biāo)記物的低效應(yīng)用。發(fā)病后不能使用胰島素，因?yàn)閷a(chǎn)生針對(duì)外源胰島素(用于治療疾病)的抗體。該實(shí)驗(yàn)證明ZnT8抗體能夠提供良好指標(biāo)以檢測老年糖尿病(LADA或1.5型糖尿病)的潛在自身免疫性，所述糖尿病在年長受試者中經(jīng)常被誤診為2型糖尿病并被不當(dāng)治療。在美國可能存在與1型患者同樣多的LADA患者。圖10A和10B顯示研究ZnT8自身抗體作為T1D預(yù)測標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在一組43例個(gè)體(他們從9個(gè)月大追蹤到糖尿病)的樣品中回顧分析針對(duì)ZnT8的自身抗體及針對(duì)胰島素、GAD65和IA2的3種金標(biāo)準(zhǔn)抗體。來自9例個(gè)體的一系列結(jié)果在此顯示作為實(shí)例。抗體反應(yīng)性表示為cpm,用先證者(proband)減去對(duì)照除以對(duì)照應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)偏差。分析中截?cái)嘤苫疑珔^(qū)域定義，其等于3SD或大約1%概率(陽性分析將偶然產(chǎn)生)。圖IOA組顯示的患者不產(chǎn)生針對(duì)胰島素的自身抗體，但在1.5歲對(duì)IA2和GAD檢測為陽性。IA2抗體被短暫表達(dá)，但在4歲時(shí)恢復(fù)。期間發(fā)展出高并且持續(xù)的對(duì)ZnT8的反應(yīng)性。此后IA2抗體恢復(fù)，5年后個(gè)體患有臨床糖尿病。圖10B顯示的患者不產(chǎn)生針對(duì)胰島素、IA2或GAD65的自身抗體，但在2歲時(shí)(臨床疾病前18個(gè)月)顯示ZnT8Abs。圖ll是顯示發(fā)病時(shí)糖尿病自身抗體狀況的圖表。ZnT8自身抗體的測量為3種金標(biāo)準(zhǔn)自身抗原IA2、胰島素和GAD65提供額外的預(yù)測功效。已公開的研究顯示檢測到的抗體數(shù)量而不是抗體滴度是疾病的最有效預(yù)測因素。盡管如此，一些人患有T1D而從不顯示針對(duì)3種金標(biāo)準(zhǔn)抗體IA2、GAD65和胰島素的抗體。這表明可能存在遺漏的反應(yīng)性，該結(jié)論還得到自身抗原免疫組化分析(其比INS、GAD和IA2Abs的組合測量檢測更多的患者)的證實(shí)。但是ICA分析是耗時(shí)和主觀的。對(duì)于只顯示金標(biāo)準(zhǔn)抗體之一的個(gè)體來i兌，5年內(nèi)的患病相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)較低，但2種或更多種抗體表明預(yù)后不良，將提示治療介入(如果可用的話)。圖11的上部顯示對(duì)患糖尿病個(gè)體進(jìn)行臨床診斷時(shí)的抗體狀況。結(jié)果來自于對(duì)50例新發(fā)病糖尿病受試者及100例年齡配對(duì)對(duì)照(由糖尿病自身抗原標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃(DiabetesAutoantigenStandardizationProgram)提供)和先前部分所示數(shù)據(jù)的盲研究。在添加了ZnT8自身反應(yīng)性的分析后，抗體陰性的個(gè)體數(shù)量從14%顯著降低到8%,另外12%被指定為更高的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，在被列為抗體陰性的7例個(gè)體中，43。/。實(shí)際上具有針對(duì)ZnT8的抗體。在"低風(fēng)險(xiǎn)"1Ab組的7例個(gè)體中，再一次，3例(43%)對(duì)ZnT8抗體檢測為陽性，使他們處于更高的風(fēng)險(xiǎn)類型。對(duì)于金標(biāo)準(zhǔn)3，胰島素自身抗體很難檢測，并且在實(shí)驗(yàn)室之間分析的重現(xiàn)性很差。如果放棄胰島素分析并用ZnT8分析取代將有以下優(yōu)點(diǎn)0Ab患者的數(shù)目仍將從14減少到8%,將會(huì)有類似數(shù)量的雙陽性和三陽性患者。將需要進(jìn)行縱向系列實(shí)驗(yàn)以證明存在額外的診斷效力，但可以合理推斷ZnT8/GAD/IA2將是優(yōu)于INS/GAD/IA2的組合。此外，有可能避免使用1251標(biāo)記的配體，并進(jìn)行抗胰島素分析所需的抗原預(yù)吸附。圖11的部分記載了抗體如何在不同類型的患者之間分布。在該組中ZnT8C端抗體經(jīng)常作為唯一的抗體出現(xiàn)，再次與GAD類似，證明其預(yù)測的價(jià)值。在挑選的個(gè)體種群(ICA陽性，但對(duì)3種金標(biāo)準(zhǔn)品是陰性的)中，25%是ZnT8C端陽性的。圖12A和12B顯示ZnT8抗體分析的受試者工作特性。數(shù)據(jù)來源于BarbaraDavisCenter(Denver,Colorado)的新發(fā)病患者的組合，樣品集由DASP提供。該組合覆蓋發(fā)病時(shí)年齡從1.5歲到59歲的個(gè)體。從對(duì)應(yīng)的16例對(duì)照血清組的3SD限制性確定截?cái)?。通過在每種情況下比較對(duì)照和糖尿病組產(chǎn)生ROC曲線。圖12A顯示免測沉淀指數(shù)，圖12B顯示每種分析的靈敏性和特異性之間的關(guān)系。圖13顯示與ZnT80RF、C端和N端探針的抗體反應(yīng)性之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)來源于BarbaraDavisCenter的新發(fā)病患者的組合，樣品集由DASP提供，共227例個(gè)體。最前面的50例C端陽性患者包括了大多數(shù)對(duì)ZnT8ORF和ZnT8N端探針的反應(yīng)性檢測為陽性的個(gè)體。在對(duì)N端探針和ORF的反應(yīng)性之間存在顯著的相關(guān)性，但在ORF和C端探針之間不存在。這表明參與N端反應(yīng)性的表位是被ORF探針檢測到的那些表位的亞群，但C端檢測到其他患者，是比ORF翻譯產(chǎn)物更好的自身反應(yīng)指示物。這可能是因?yàn)榭缒^(qū)錯(cuò)誤折疊并扭曲了正常C端的折疊，導(dǎo)致ORF探針未能正確折疊。C端可以包括其他表位，其中一些可以是隱含的，除非其從完整的分子釋放。圖14A和14B的實(shí)驗(yàn)研究了ZnT8的N端和C端是否會(huì)相互作用產(chǎn)生新的表位(這取決于所述兩種結(jié)構(gòu)域)或N端序列是否可以掩蓋C端表位。該實(shí)驗(yàn)利用糖尿病血清的2個(gè)庫進(jìn)行，所述糖尿病血清對(duì)C端探針具有強(qiáng)應(yīng)答，但N端反應(yīng)性是較低(圖14A)或較高的(圖14B)。利用所述兩種混合物，很明顯對(duì)N端和C端的反應(yīng)性是獨(dú)立的，并且探針混合時(shí)免疫沉淀的放射性等于單獨(dú)探針的總和。該實(shí)驗(yàn)的其他變化包括Zn離子的添加或內(nèi)源Zn的螯合，它們作為可能的因素參與這些結(jié)構(gòu)域的相互作用。來自上文這些的結(jié)果是沒有差別的，表明N端和C端相互作用不影響免疫反應(yīng)性。參照圖15A-15C，這些圖顯示目的在于定位ZnT8C端自身抗體表位的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖15A顯示小鼠Slc30A8(頂部；顯示的是SEQIDNO:4的267-367位)、人Slc30A8(中間;顯示的是SEQIDNO:2的268-369位)和小鼠Slc30A3(底部；序列是SEQIDNO:25)比對(duì)的序列。因?yàn)樾∈骃lc30A8和Slc30A3不被大多數(shù)T1D血清識(shí)別，該數(shù)據(jù)表明變異殘基很可能對(duì)預(yù)測人Slc30A8序列中的表位非常關(guān)鍵。本發(fā)明人假設(shè)最后的11個(gè)氨基酸(PDCLFCEDPCD;SEQIDNO:2的359-369位)因此可能是抗原表位；但是缺失該區(qū)域的探針(BstNl消化，圖15B;參照顯示限制性酶切位點(diǎn)的序列是SEQIDNO:2的336-369位)與野生型C端一樣有效的被9例糖尿病血清的庫免疫沉淀(圖15B)。削減另6個(gè)氨基酸減弱了自身抗體結(jié)合，削減12個(gè)氨基酸消除了抗體結(jié)合，表明該區(qū)域是特別重要的。這些探針的序列提供于本文的表1。如圖15C所示，在帶電殘基(K340、H345和E352)處對(duì)C端探針進(jìn)行點(diǎn)突變，所述帶電殘基可能有助于抗原性，并對(duì)絲氨酸353進(jìn)行點(diǎn)突變，絲氨酸353是推定的酪蛋白激酶及可能的翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)用相同的糖尿病血清庫檢測時(shí)，很明顯這些殘基中的每一種都有助于免疫反應(yīng)性，在3個(gè)帶電殘基都被改變的突變體中(AAA)被被證明是累加的。這些探針的序列提供于本文的表1。利用覆蓋該區(qū)域的重疊20mer合成肽作為潛在的阻斷劑進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。它們阻斷結(jié)合的能力最多是中等的(降低<33%)，表明自身抗體表位實(shí)際上可能是構(gòu)象型的，而不是簡單的線性序列。進(jìn)一步的方法是產(chǎn)生Slc30A8和Slc30A3的嵌合分子，其保留C端區(qū)域的一般構(gòu)象但允許關(guān)鍵序列被替換以干擾二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些嵌合分子還將用于繪制針對(duì)蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。圖16顯示對(duì)于自身反應(yīng)性非常重要的ZnT8C端的殘基，并顯示動(dòng)物物種間指定表位的保守性。截短型和突變型突變體(如上文表l)表明，核心序列SLTIQMES(SEQIDNO:2的346-353位)是針對(duì)人Slc30A8的自身抗體反應(yīng)性的關(guān)鍵，并且單個(gè)殘基E352和S353對(duì)抗體結(jié)合做出重要的貢獻(xiàn)。全部序列在不同脊推動(dòng)物物種的Slc30A8高度保守，但在最接近的哺乳動(dòng)物同系物Slc30A2和Slc30A3保守性要低一些。糖尿病自身抗體^^測不到表達(dá)為C端片段的后一蛋白。有趣地是，從關(guān)系更遠(yuǎn)的細(xì)菌物種的陽離子外排(cationefflux)蛋白(其他CzcD)和兩種無關(guān)蛋白(大腸桿菌的偶聯(lián)轉(zhuǎn)移蛋白和人REEP3)中觀察到同源序列。這提出了以下可能性，分子模擬可能在對(duì)人類鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的自身反應(yīng)性發(fā)展中起作用，或可能有助于抗原表位擴(kuò)展及免疫應(yīng)答的旁觀活化?？傊?，ZnT8是1型糖尿病前獨(dú)立的自身免疫性血清學(xué)標(biāo)記物，其被預(yù)本文描述的分析形式允許每天篩選直至500份樣品，并且能夠輕易地自動(dòng)化以增加其能力。人類受試者具有針對(duì)ZnT8的自身抗體的事實(shí)表明，自體反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答是可能性非常高的。這反過來表明，可以按照上文的詳細(xì)描述開發(fā)其他的診斷分析，以及治療和預(yù)防I型糖尿病的新的治療方法，亦如上文詳細(xì)所述。實(shí)施例4下列實(shí)施例描述了另外的利用缺失突變體和小鼠/人嵌合體對(duì)ZnT8的自身抗體表位作圖。在該實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果在圖17中顯示，對(duì)包括C端自身抗體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域的邊界作圖，利用一系列ZnT8肽(其中NH2或COOH端被截短)，或通過制備人和小鼠ZnT8序列的嵌合體，后者在標(biāo)準(zhǔn)分析中是沒有免疫反應(yīng)的。按比例顯示重疊程度，缺失程度顯示為缺失氨基酸的數(shù)目(缺失圖)或氨基酸位置號(hào)，其中融合蛋白是接合在一起的，前面有單字母代碼的氨基酸(嵌合體圖)。通過MODELLER,利用大腸桿菌Yiip陽離子外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生人ZnT8C端的3維模型(圖18)。用亮灰色突出顯示的殘基在人和小鼠序列之間變化，用中灰色突出顯示的殘基被指定為較弱的抗原候選物，基于NH2和COOH缺失構(gòu)建體的免疫分析。人ZnT8325位的多態(tài)性殘基在空填模型(spacefillmodel)中顯示為暗灰色殘基(該圖中所有位置都是根據(jù)SEQIDNO:2)。白種人種群中ZnT8的主要人多態(tài)性變體(Trp325和Arg325)遠(yuǎn)離所述結(jié)構(gòu)的細(xì)胞質(zhì)極處的膜，很大程度上被人和小鼠之間保守的殘基包圍。Arg側(cè)鏈伸展到溶劑中，而Trp吲哚環(huán)折回到分子，所以有可能產(chǎn)生非常不同的表面而不扭曲總的折疊。Gln325變體，盡管在幾何位置上接近Arg側(cè)鏈，被預(yù)測導(dǎo)致結(jié)構(gòu)沿著Ser353轉(zhuǎn)動(dòng)。第二a螺旋部分(aa328-341)的變異殘基簇(其拓樸結(jié)構(gòu)基本上不受多態(tài)性的影響)被假定為表位(同等的被載有多態(tài)性變體的探針識(shí)別)的良好候選物。在這點(diǎn)上Arg332、Glu333、Arg336和Arg340的相鄰和溶劑顯露都是值得關(guān)注的。至于圖19,顯示T1D自身抗體靶向區(qū)域中ZnT8殘基的保守性。在大約5%的患者中N端是抗體的靶標(biāo)，而達(dá)到80%的T1D受試者顯示針對(duì)C端的抗體。制備含C端起始和結(jié)尾的構(gòu)建體，以繪制C端表位的邊界?；疑幱皡^(qū)域是大部分自身反應(yīng)性集中的區(qū)域。比較小鼠、人和蟾蜍的Znt8序列，顯示大部分表位區(qū)域是保守的，除了氨基酸322-341之外(參照SEQIDNO:2)。該區(qū)域包括人的主要多態(tài)性變體(325R或325W),這在其他物種中沒有發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例5下列實(shí)施例描述了與涉及ZnT8基因和蛋白的多態(tài)性的本發(fā)明實(shí)施方案有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。小鼠ZnT8C端與人ZnT8的不同之處在于104個(gè)氨基酸中的18個(gè)，其不與新發(fā)病的糖尿病血清反應(yīng)。產(chǎn)生基于小鼠序列的構(gòu)建體，其中變異氨基酸被單獨(dú)或多次替換為它們的人類對(duì)應(yīng)物。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖21A-21C。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是利用人血清測定的2-7次應(yīng)答的平均值，所述血清已被實(shí)現(xiàn)分類為限于人Arg325(CR)或Trp325(CW)多態(tài)性變體，或與Arg325、Trp325或Gln325(CQ)變體以相同程度反應(yīng)。氨基酸編號(hào)參照人類序列位置(SEQIDNO:2)。結(jié)果顯示，氨基酸325向其人類對(duì)應(yīng)物的改變恢復(fù)了與CR-和CW-限制性血清的結(jié)合，但只與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合。沒有單氨基酸改變能恢復(fù)CQ應(yīng)答血清的反應(yīng)性。但是，氨基酸332、333、336的組合取代以及在小鼠序列的aa340包括氨基酸缺失恢復(fù)了反應(yīng)性。這被325位包括Arg進(jìn)一步增強(qiáng)。圖22A-22D顯示小鼠ZnT8的多位點(diǎn)突變概括了人ZnT8反應(yīng)性。在該實(shí)驗(yàn)中，圖22A顯示小鼠序列的單個(gè)點(diǎn)突變，盡管仍能夠檢測大量人Arg反應(yīng)性的抗體應(yīng)答，但對(duì)大多數(shù)血清沒有反應(yīng)。但是，基于人和小鼠結(jié)構(gòu)差異的4殘基的進(jìn)一步突變(REKK突變體)立刻使小鼠序列幾乎與人Arg325天然結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性一樣(圖22B)。大多數(shù)hTrp反應(yīng)性血清觀察不到相同的探針(圖22D)。相同血清只與mTrp探針微弱反應(yīng)(圖22C)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，如圖23A-23D所示，利用mQ>R325、mQ>W325、hR325、hW325和hQ325探針分析來自171例新發(fā)病T1D受試者的ZnT8，相對(duì)于兔抗C端抗體(BUN-E)計(jì)算數(shù)據(jù)。32例個(gè)體顯示hArg325限制性抗體結(jié)合，其中19例顯示對(duì)mArg325探針的應(yīng)答。13例顯示hTrp325限制性抗體結(jié)合，其中10例顯示對(duì)mArg325探針的應(yīng)答。在沒有人類對(duì)應(yīng)物的情況下沒有觀察到與mArg325或mTrp325的結(jié)合。Arg325限制人和小鼠之間相關(guān)的應(yīng)答，在對(duì)hQ325探針表示的結(jié)合校正后具有類似的大小。當(dāng)對(duì)hTrp325限制性應(yīng)答作圖時(shí)，甚至在對(duì)hQ325結(jié)合校正后，mTrp325探針的結(jié)合具有較低的強(qiáng)度。這些數(shù)據(jù)表明，325位的氨基酸是自身抗體表位特異性的決定簇，就Arg變體來說，小鼠點(diǎn)突變體類似于天然的人構(gòu)象。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，利用氨基酸325的變體測定出新發(fā)病T1D患者中的ZnT8自身抗體應(yīng)答?；贏rg、Trp和Gln變體ZnT8325的突變C端探針被用于測定300例新發(fā)病患者中的體液免疫應(yīng)答。圖24D顯示基于針對(duì)單個(gè)探針或探針組合的應(yīng)答區(qū)分的應(yīng)答的水平和頻率。圖24C顯示對(duì)普通Arg81和Trp變體應(yīng)答之間的關(guān)系，基于只對(duì)Trp(垂直的)和Arg(水平的)應(yīng)答的95%截?cái)鄬⑵浞譃?個(gè)區(qū)，對(duì)角線代表針對(duì)分析中兩種探針j叚定15%CV的等同應(yīng)答±3SD的邊界。圖24A和24B在檢查針對(duì)Gln探針及Arg和Trp探針的應(yīng)答之間的關(guān)系時(shí)使用相同分層。圖25顯示ZnT8自身抗體特異性與氨基酸325處密碼子的患者基因型(SNPrsl3266634)之間的關(guān)系。新診斷的T1D受試者用TaqMan探針進(jìn)行基因分型，并利用氨基酸325處摻入Gln(Q)、Arg(R)或Trp(W)的人ZnT8C端構(gòu)建體進(jìn)行血清分析。將分析截?cái)嘣O(shè)定成指數(shù)為0.02。在R或W之間的信號(hào)超過Q探針信號(hào)的情況下，假定相應(yīng)測量值的CV是15%，被指定為具有雙反應(yīng)陽性，如果指數(shù)相差〉3SD。從該數(shù)據(jù)可以得出大量重要的結(jié)論1)對(duì)Gln探針(hCQ)的反應(yīng)性相對(duì)不受基因型影響，而在具有C等位基因(Arg編碼)的個(gè)體中Arg反應(yīng)性(hCR)更顯著，在具有T等位基因(Trp編碼)的個(gè)體中Trp活性更顯著。2)300例個(gè)體中只有一個(gè)顯示與hCQ探針反應(yīng)，但不與hCW或hCR反應(yīng)。該個(gè)體在氨基酸325處可能編碼Gln殘基(核苷酸測序分析)。對(duì)Arg(僅僅Arg)顯示限制性應(yīng)答的個(gè)體都具有編碼C等位基因。對(duì)Trp(僅僅Trp)顯示限制性應(yīng)答的個(gè)體都具有編碼T等位基因。對(duì)于顯示超過hCQ反應(yīng)性的hCR和hCW反應(yīng)性的個(gè)體來說相同情況是基本上成立的。這些數(shù)據(jù)概述于圖26,其顯示基因型與對(duì)hCR和hCW探針的反應(yīng)性之間的相關(guān)性。更具體的，圖26概述了以下主要發(fā)現(xiàn)，限于Arg325表位的反應(yīng)性與C等位基因尤其是CC基因型密切相關(guān)，相反，限于Trp325表位的抗體反應(yīng)性與T等位基因尤其是TT基因型相關(guān)。圖27顯示與糖尿病發(fā)病年齡有關(guān)的Slc30A8基因型。在基因型與T1D被診斷的年齡之間不存在明顯的相關(guān)性。但是，需要總結(jié)更多的樣品，例如，具有TT基因型的個(gè)體在6歲前很少患病，盡管趨勢仍然存在，對(duì)于介入來說結(jié)論是重要的。與對(duì)照受試者文獻(xiàn)中報(bào)道的相比，本發(fā)明人的糖尿病群體中的基因型存在一些改變。本發(fā)明人觀察到56.8%CC,35.1。/。CT和8.1%TT(n=285)。歐洲群體中報(bào)道的基因型頻率是52.3%CC、44.1%CT和3.6%TT(n=168)P=0.05Fisher精確檢驗(yàn)。但74.4%C和25.6%T的等位基因頻率在兩個(gè)群體中是相同的?；蛐偷姆植寂cHardyWienberg分布(55.33。/。CC、38.11%CT和6.56。/。TT)不是顯著不同。如果觀察雜合子對(duì)純合TT，差異將更加顯著(P=0.026)，可能表明存在更多的TT基因型和更少的雜合子。種群研究沒有報(bào)告染色體8(Slc30A8所在區(qū)域)上T1D相關(guān)基因的存在。盡管如此基因組范圍的SNP分析顯示Slc30A8T等位基因與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)需要分析大約8000例受試者以檢測到顯示大約1.2的比值比和P<0.05。組合的免疫和基因數(shù)據(jù)的有趣特征是觀察到，Arg限制性抗體在CC純合組中的發(fā)生率高于雜合子，同樣，Tip限制性抗體在TT純合組中高于雜合子。這可能部分由于基因劑量作用，更多的抗原表達(dá)伴隨更高的自身反應(yīng)性。在圖28A-B中，相對(duì)于使用的探針和Slc30A8基因型顯示自身抗體反應(yīng)性的水平。CC基因型由169個(gè)樣品代表，CT由108個(gè)樣品代表，TT由23個(gè)樣品代表。ZnT8hCGln探針據(jù)預(yù)測只反映與REKK表位結(jié)合的抗體，而hCArg探針與該表位及以Arg325殘基為中心的表位都結(jié)合。hCTrp探針報(bào)告REKK結(jié)合及以Arg325為中心的表位。hCArg反應(yīng)性的平均水平和發(fā)生率按預(yù)期方向受基因型的影響，即增加的反應(yīng)性與C等位基因頻率(Arg325編碼)有關(guān)(圖28A)。同樣地，hCTrp反應(yīng)性的平均水平和發(fā)生率隨T等位基因頻率(Trp325編碼)增加(圖28A)。hCGln反應(yīng)性傾向于隨C等位基因增加，盡管對(duì)于發(fā)生率或水平來說不是顯著的(圖28A)。與其他生化自身抗體IAA、GADA和IA2A的反應(yīng)性不受Slc30A8基因型的影響(圖28B)。圖29顯示概括ZnT8A分析當(dāng)前發(fā)展?fàn)顩r的實(shí)驗(yàn)。對(duì)一系列盲樣品(blindedsamples)進(jìn)行分析，所述樣品由疾病控制中心(CDC)的糖尿病自身抗原計(jì)劃(DASP)提供，由50例新發(fā)病的糖尿病患者和99例對(duì)照組成。利用體外翻譯的35S曱硫氨酸放射標(biāo)記的探針(基于小鼠(m)或人(h)ZnT8序列)，采用基本的放射免疫沉淀形式進(jìn)行分析。所有探針都包括ZnT8的C端104aa(C),其在人氨基酸325位具有Gln(Q)(SEQIDNO:50)、Arg(R)(SEQIDNO:49)或Trp(W)(SEQIDNO:51)。此外，通過以下方式產(chǎn)生抗體利用3個(gè)甘氨酸殘基的接頭序列將ZnT8的N端74aa(N)與C端融合，例如hNCW,或產(chǎn)生C端二聚體，其具有通過柔性接頭臂(SEQIDNO:52)與hCR構(gòu)建體連接的hCW構(gòu)建體，以產(chǎn)生hCWR構(gòu)建體(SEQIDNO:60)。接頭臂源自免疫球蛋白重鏈序列，其已知在其序列的恒定區(qū)和可變區(qū)之間提供柔性連接。接頭(序列PSTPPGSSGGG;SEQIDNO:52)能夠允許單個(gè)抗體分子以更高的親和力結(jié)合，因?yàn)樗梢栽?個(gè)位點(diǎn)與探針連接?？蛇x擇地，探針可以同時(shí)結(jié)合2個(gè)抗體分子，包括不同表位特異性的免疫球蛋白。從完全相同的樣品獲得的結(jié)果顯示本領(lǐng)域的眾多當(dāng)前狀況和糖尿病自身反應(yīng)性的特征，即1)與人類對(duì)應(yīng)物(hCQ)(SEQIDNO:50)相比，人T1D自身抗體對(duì)天然小鼠序列(SEQIDNO:40)的反應(yīng)性較低(mCQ相對(duì)于hCQ}。2)在氨基酸324處(SEQIDNO:41)(相當(dāng)于人aa325)用Arg殘基取代Gln殘基(SEQIDNO:49)的單個(gè)點(diǎn)突變增加抗體與小鼠ZnT8的結(jié)合(mCQ相對(duì)于mCR的數(shù)據(jù)〉。3)對(duì)載有325位單氨基酸改變的人探針的差別反應(yīng)性{發(fā)病時(shí)自身抗體的發(fā)生率一貫遵循h(huán)CR>hCW>hCQ的順序)。這是因?yàn)閔CR(SEQIDNO:49)和hCW(SEQIDNO:51)探針具有以氨基酸325位為中心的其他表位，并且因?yàn)樵诒景l(fā)明人的群體(主要是白種人)中針對(duì)Arg變體的抗體的出現(xiàn)頻率高于針對(duì)Trp變體的抗體。4)N端與C端W(SEQIDNO:62)或R(SEQIDNO:63)變體的融合引入以下可能性在反應(yīng)性更高的C端表位中摻入被5-8%T1D群體識(shí)別的N端表位。但是因?yàn)楸尘暗脑?，采用這種方式測量到的抗體總發(fā)生率實(shí)際上低于單獨(dú)的C端探針，因此分析中的截?cái)喔?。?duì)分子的進(jìn)一步改造將糾正這點(diǎn)。5)將CW和CR結(jié)構(gòu)域融合入一個(gè)分子(SEQIDNO:60)產(chǎn)生一種纟罙針，其檢測與CR、CW和CQ探針有反應(yīng)的個(gè)體的自身反應(yīng)性。此外，信號(hào)在糖尿病受試者中更高，沒有背景的任何損失，產(chǎn)生一種性能比3種不同分析法的組合更優(yōu)越的分析法?？梢韵胂裉结樀倪M(jìn)一步多聚化甚至可以進(jìn)一步提高檢測水平。78%的檢出率與任意其他糖尿病生化自身抗體標(biāo)記物相比同樣高或更高。圖30顯示針對(duì)組合N端、C端、腔環(huán)、細(xì)胞溶質(zhì)環(huán)和多態(tài)性殘基的不同ZnT8構(gòu)建體的自身反應(yīng)性。hCTrpminusTM(SEQIDNO:67)是包括3個(gè)胞外(腔)和2個(gè)細(xì)胞溶質(zhì)環(huán)(連接6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域)的構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)成能捕獲存在于這些環(huán)中的任意表位。它檢測額外4%的新發(fā)病患者。hCArgN包括N和C端，但按照相反的順序(SEQIDNO:66)。利用該探針測量到的抗體水平與單獨(dú)利用hCArg測量到的抗體水平有關(guān)，但也捕捉到一些額外的患者，尤其是那些顯示低水平反應(yīng)性的患者。該數(shù)據(jù)還顯示，除了對(duì)包括氨基酸325的表位反應(yīng)相同或?qū)ζ洳灰蕾嚨幕颊咭酝猓?25位交換Arg為Trp的多態(tài)性鑒定了眾多限于只對(duì)hCArg或hCTrp的抗體應(yīng)答的患者。實(shí)施例6下列實(shí)施例提供涉及ZnT8作為新靶標(biāo)和I型糖尿病標(biāo)記物的其他數(shù)據(jù)。圖31A-F顯示研究結(jié)果，其中在23個(gè)新發(fā)病T1D受試者的組中隨時(shí)間將針對(duì)ZnT8的自身抗體與C肽(正餐后2小時(shí))和其他自身抗體進(jìn)行比較。該分析的主要結(jié)果是，針對(duì)ZnT8的自身抗體在發(fā)病后降低，其動(dòng)力學(xué)類似于P細(xì)胞群的損失，反映為C肽應(yīng)答的減弱。該數(shù)據(jù)導(dǎo)致本發(fā)明人最初懷疑在圖31A-31C的分子中存在遺傳變異，可以觀察到對(duì)C端構(gòu)建體的應(yīng)答有時(shí)與N-C融合構(gòu)建體相同(圖31A)或完全不同(圖31B-C)。當(dāng)重新測序這些探針時(shí)，顯示C端是Arg325形式(SEQIDNO:49)，N-C是分子的Trp325形式(SEQIDNO:64)。通過利用用于克隆的2個(gè)不同胰島來源或從雜合個(gè)體克隆產(chǎn)物來引入多態(tài)性變體。反應(yīng)性的年平均減退對(duì)于C端是26土130/。，N/C是28±9%，C-pep是32±14%，IA2是22±11(±SDn=15)。相反GADA增加42±191%,可能因?yàn)榇嬖谠摽乖牧硪唤M織來源。圖32顯示發(fā)病后5-10年的ZnT8A和C-肽水平。對(duì)先前研究(描述于上文的實(shí)施例)直至IO年的追蹤顯示，在個(gè)體中抗體一直減退，而那些最初高水平的抗體更持久。到5+年的時(shí)候大約60%的樣品中存在血清轉(zhuǎn)化，在所有情況下水平平均降低90%。具有低Ab水平(<0.4)的樣品傾向于更快的血清轉(zhuǎn)化。具有高水平抗體的一些樣品具有殘余的P細(xì)胞群，由陽性隨機(jī)C肽指示。在本文先前實(shí)施例中已經(jīng)描述了對(duì)胰島素、GAD和IA2之外的ZnT8自身抗體的測量。在這些實(shí)施例中，本發(fā)明人只測量了hCR反應(yīng)性，其已經(jīng)排除Trp325反應(yīng)性。圖33A進(jìn)一步顯示^r出率變化的原則(黑色為檢出ZnT8;白色未檢出)。圖33B顯示增加ZnT8抗體測量的不同效果。實(shí)施例7下列實(shí)施例描述自身抗體預(yù)吸附實(shí)驗(yàn)，顯示利用重組蛋白來區(qū)別不同的ZnT8表位。利用載體諸如pGEX(產(chǎn)生谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，可以在谷胱甘肽瓊脂糖上純化)或pQE系列(產(chǎn)生蛋白的N或C端具有多聚組氨酸標(biāo)記的蛋白，可以通過金屬螯合物層析純化)已產(chǎn)生大量重組ZnT8分子。但是，這些被證明產(chǎn)生不溶性的包涵體，其很難被純化，而且不能正確折疊重新產(chǎn)生自身抗原表位。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種解決方案，利用整合His標(biāo)簽(用于金屬螯合物親和純化)和蛋白融合伴倡(一種細(xì)菌伴侶蛋白，確保正確折疊)的載體(pET43.1載體，Novagen,EMDBiosciences)。蛋白在BL-21(DE3)細(xì)菌(Novagen)中表達(dá)。產(chǎn)生基于SEQIDNO:49(Arg325變體)、SEQIDNO:50(Gln325變體)和SEQIDNO:51(Trp325變體)的NUShZnT8C端蛋白，并在Nichalate柱上純化，將20樣i克樣品與T1D血清在室溫下溫育2小時(shí)，然后添加35SMet標(biāo)記的hCArg、hCTrp和hCGln探針并進(jìn)行常規(guī)放射免疫沉淀分析。在圖2C所示的實(shí)驗(yàn)中，選擇3種血清，它們已知限于Arg325(血清#541827命名為hCArg),Trp325(血清#533855命名為hCTrp)，及與所有hC端構(gòu)建體共有的表位(不依賴325位的氨基酸)反應(yīng)(血清弁BT命名為hCGln)。結(jié)果顯示血清的顯著特異性，它們限于由325位多態(tài)性確定的表位。結(jié)果還顯示，325無限制性的血清不能區(qū)別Trp和Arg構(gòu)建體。實(shí)際上，這提供了一種確定血清對(duì)Arg325、Trp325和非限制性表位(當(dāng)這些存在于相同樣品中時(shí))的相對(duì)反應(yīng)性的更好方式。目前，利用單一的外部泛反應(yīng)性C端標(biāo)準(zhǔn)品(BUN-E)的3種放射性分析用于標(biāo)定應(yīng)答，然后將數(shù)字彼此相減。利用本文描述的可用重組蛋白，使用相關(guān)的探針并測定信號(hào)被不同重組蛋白壓制的程度，可以確定反應(yīng)性的水平。因此，基于ZnT8的融合蛋白(諸如本文描述的hCNUS融合蛋白)的可用性(顯示預(yù)期的表位特異性)，是產(chǎn)生基于非同位素方法的固相自身抗體分析中的重要步驟。實(shí)施例8下列實(shí)施例描述編碼hZnT8的腺病毒載體的產(chǎn)生，及其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明人還制備了用于表達(dá)全長hZnT8的腺病毒載體。在MOI為100時(shí)用對(duì)照腺病毒(AdLacZ)或Ad-hZnT8-V5-His()轉(zhuǎn)導(dǎo)Cos7細(xì)胞。48小時(shí)后，收集細(xì)胞，通過SDS-PAGE和利用多克隆兔抗hZnT8的免疫印跡檢測表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。按照制造商的說明書在體外(RTS100小麥胚CECF試劑盒，Roche)翻譯p-葡糖醛酸酶(GUS)或hZnT8-V5-His。通過western印跡分析lpl(2%)混合物。檢測到hZnT8蛋白的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例9下列實(shí)施例顯示ZnT8在各種細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)定位。INS-1細(xì)胞是源自胰腺(3細(xì)胞的|3細(xì)胞系，提供P細(xì)胞的良好細(xì)月包培養(yǎng)模型。用于上述分析的抗體由稱為BUN-E的重組融合蛋白激發(fā)，用于鑒定Slc30A8基因編碼的ZnT8的胞內(nèi)定位?？贵w突出顯示大小約為0.2-0.5微米的胞內(nèi)點(diǎn)狀細(xì)胞器(數(shù)據(jù)未顯示)。這些以與胰島素類似的模式分布于細(xì)胞，從而標(biāo)記胰島素顆粒，先前的研究已將ZnT8定位于此處。本發(fā)明人在該實(shí)施例中描述的免疫組織化學(xué)研究(數(shù)據(jù)未顯示)表明，ZnT8不是完全位于顆粒中，但與transGolgi網(wǎng)絡(luò)標(biāo)記物TGN38顯示部分重疊。它不與早期內(nèi)體標(biāo)記物EEA1或循環(huán)內(nèi)體(由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體標(biāo)記)定位，但與成熟溶酶體的標(biāo)記物L(fēng)AMP1基本重疊?？偟恼f來，這些數(shù)據(jù)與先前的報(bào)道(ZnT8僅僅是分泌顆粒蛋白)(Chimientietal.,上文)不同。實(shí)施例10下列實(shí)施例顯示人胎兒胰腺的實(shí)時(shí)PCR，表明ZnT8具有高的胰島特異性，不同于該基因家族的相關(guān)成員(ZnTl-7和ZnT9)。按照指定年齡獲得人胎兒的胰腺，提取mRNA，然后將其用于測定發(fā)育期間(9和23周妊娠)和成年胰島中的表達(dá)水平。在第9周，胰腺主要由未分化的間充組織組成。到第23周，大體解剖(grossanatomy)類似于成年的，顯示ZnTl(Slc30Al)尤其是ZnT8(Slc30A8)的表達(dá)實(shí)質(zhì)上增加，參見圖34。分離的胰島具有更少的ZnTl,因?yàn)槠渲饕抻谕夥置诮M織。實(shí)施例11下列實(shí)例證明，新確診的T1D患者顯示針對(duì)ZnT8合成肽的外周T細(xì)胞應(yīng)答。該實(shí)驗(yàn)顯示來自新近的糖尿病受試者的PBMCs產(chǎn)生hZnT8依賴性IFN-Y。從4例新近的糖尿病受試者分離PBMCs，并用2個(gè)連續(xù)hZnT8肽(l0嗎/ml)的庫培養(yǎng)48小時(shí)，所述2個(gè)連續(xù)hZnT8肽跨越完整的人ZnT8序列，具有20mer肽，重疊7個(gè)氨基酸。洗滌后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包被抗IFN-y單克隆的ELISPOT板，再培養(yǎng)17小時(shí)。在洗滌去除細(xì)胞和培養(yǎng)基后，利用第二位點(diǎn)生物素化的抗IFN-g單克隆，GABA,和沉淀銀溶液檢測分泌的細(xì)胞因子。利用Bioreader4000ProX(BIOSYS)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。對(duì)照受試者不對(duì)任何肽產(chǎn)生顯著的信號(hào)(SI>3),但對(duì)于破傷風(fēng)類毒素/白喉毒素陽性對(duì)照顯示SI-22。所有被測的患者，但不是對(duì)照，對(duì)至少3種肽產(chǎn)生顯著的IFN-y應(yīng)答(SI>3)，而受試者N03對(duì)肽庫中的12種產(chǎn)生應(yīng)答。在個(gè)體之間幾乎沒有》見察到相關(guān)性，只有庫17(E5+F5)被所有受試者識(shí)別。參考文獻(xiàn)1.WucherpfennigKW，EisenbarthGS:Type1diabetes.淑/顯畫/2:767-768，20012.YoonJW，JunHS:Cellularandmolecularpathogenicmechanismsofinsulin-dependentdiabetesmellitus./IwK/^"t/Sd928:200-211,20013.RosmalenJG，vanEwijkW,LeenenPJ:T-celleducationinautoimmunediabetes:teachersandstudents.7>ewi^/續(xù)畫/23:40-46,20024.RossiniAA:Autoimmunediabetesandthecircleoftolerance.Aa6e^y53:267-275,20045.KukrejaA>CostG,MarkerJ，ZhangC,SunZ,Lin-SuK，TenS，SanzM,ExleyM，WilsonB，PorcelliS，MaclarenN:Multipleimmuno-regulatorydefectsintype-1diabetes,JC//"/m^s7109:131-140，20026.ArifS，TreeTI,AstillTP,TrembleJM,BishopAJ，DayanCM,RoepBO,Peakm肌M:AutoreactiveTcellresponsesshowproinflammatorypolarizationindiabetesbutaregulatoryphenotypeinhealth.JC//w/m^W113:451-463，20047.RedondoMJ，YuL>HawaM,MackenzieT，PykeDA，EisenbarthGS，LeslieRD:HeterogeneityoftypeIdiabetes:analysisofmonozygotictwinsinGreatBritainandtheUnitedStates.DZaZ)"o/og/a44:354-362，20018.AtkinsonMA,LeiterEH:TheNODmousemodeloftype1diabetes:asgoodasitgets7Va/她c/5:601-604，19999.AndreI，GonzalezA，WangB，KatzJ，BenoistC,MathisD:Checkpointsintheprogressionofautoimmunedisease:lessonsfromdiabetesmodels./Voc/to/爿cad^/S^93:2260-2263，199610.KassemSA，ArielI,ThorntonPS,ScheimbergI，GlaserB:Beta-cellproliferationandapoptosisinthedevelopingnormalhumanpancreasandinhyperinsulinismofinfancy.D/fltoes49:1325-1333，200011.RosmalenJG，LeenenPJ,PelegriC,DrexhageHA,Homo-DelarcheF:Isletabnormalitiesinthepathogenesisofautoimmunediabetes.7Ve/tis五wc/omwo/A/"aZ)13:209-214,200212.ZieglerAG,SchmidS，HuberD，HummelM,BonifacioE:Earlyinfantfeedingandriskofdevelopingtype1diabetes-associatedautoantibodies.Tamfl290:1721-1728，200313.NorrisJM，BarrigaK，KlingensmithG,HoffmanM,EisenbarthGS,ErlichHA，RewersM:Timingofinitialcerealexposureininfancyandriskofisletautoimmunity.Jo/na290:1713-1720,200314.HyotyH，TaylorKW:Theroleofvirusesinhumandiabetes.45:1353-1361,200215.LargerE，BecourtC，BachJF，BoitardC:PancreaticisletbetacellsdriveTcell-immuneresponsesinthenonobesediabeticmousemodel.J^xpMed181:1635-1642，199516.BakerFJ,LeeM，ChienYH,DavisMM:Restrictedislet-cellreactiveTcellrepertoireofearlypancreaticisletinfiltratesinNODmice./VocA^/^cad&/t/S力99:9374-9379，200217.YangY,CharltonB,ShimadaA，DalCantoR，F(xiàn)athmanCG:MonoclonalTcellsidentifiedinearlyNODisletin衡ates.,顯畫'(y4:189-194,199618.TianJ，GregoriS,AdoriniL,KaufmanDL:Thefrequencyofhighavidi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利要求25的嵌合蛋白，其中一個(gè)片段包括在325位的精氨酸，第二片段包括在325位的色氨酸。27.ZnT8的片段或同系物，包括被抗ZnT8抗體選擇性結(jié)合的至少一個(gè)ZnT8表位。28.權(quán)利要求27的ZnT8的片段或同系物，其中所述抗ZnT8抗體是獲自個(gè)體的抗體。29.權(quán)利要求27的ZnT8的片段或同系物，其中所述個(gè)體患有或被懷疑患有I型糖尿病。30.ZnT8的片段或同系物，包括被ZnT8特異性T細(xì)胞受體特異性識(shí)別的至少一個(gè)ZnT8表位。31.權(quán)利要求30的ZnT8的片段或同系物，其中所述個(gè)體患有或被懷疑患有I型糖尿病。32.權(quán)利要求1-31中任意一項(xiàng)的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白與至少一個(gè)靶向基團(tuán)復(fù)合，以將該片段或嵌合蛋白靶向到組織或機(jī)體的細(xì)胞或部位。33.權(quán)利要求32的片段或同系物，其中所述靶向基團(tuán)靶向于T細(xì)胞。34.權(quán)利要求32的片段或同系物，其中所述靶向基團(tuán)靶向于ZnT8特異性的自體反應(yīng)T細(xì)胞。35.權(quán)利要求1-31中任意一項(xiàng)的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白與毒素復(fù)合，所述毒素在T細(xì)胞或B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或另外對(duì)T細(xì)胞或B細(xì)胞是有毒的。36.權(quán)利要求1-31中任意一項(xiàng)的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白與可檢測的標(biāo)記物連接。37.ZnT8的同系物，包括與天然存在的ZnT8蛋白具有低于99%的同一性，并且與SEQIDNO:2具有至少90%同一性的蛋白。38.權(quán)利要求37的同系物，其中所述蛋白與SEQIDNO:2具有至少95%的同一性。39.權(quán)利要求37或權(quán)利要求38的同系物，其中所述蛋白包括SEQIDNO:2的位置325，并且325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。40.—種包括ZnT8或其變體或片段的疫苗，其中所述疫苗引發(fā)抑制或消除個(gè)體中ZnT8特異性自體反應(yīng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。41.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，它們選擇性結(jié)合ZnT8或其片段或變體，并抑制或降低個(gè)體中ZnT8特異性自身免疫應(yīng)答。42.權(quán)利要求41的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。43.—種診斷易患或正患有自身免疫病的個(gè)體的方法，包括;險(xiǎn)測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與陰性對(duì)照相比，如果檢測到個(gè)體中抗體的增加表明個(gè)體易患或正患有自身免疫病。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。45.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。46.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。47.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。48.—種診斷易患或正患有自身免疫病的個(gè)體的方法，包括檢測個(gè)體試樣中ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，其中與陰性對(duì)照相比，如果^r測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增加表明個(gè)體易患或正患有自身免疫病。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。50.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。51.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。52.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。53.權(quán)利要求43-52中任意一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)所述個(gè)體易患或正患有自身免疫病時(shí)，所述方法還包括給該個(gè)體施用治療劑，所述治療劑靶向于該個(gè)體中包括325位氨基酸的ZnT8表位。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述治療劑是該個(gè)體中ZnT8的蛋白、肽或激動(dòng)劑，它們使該個(gè)體的免疫應(yīng)答耐受ZnT8蛋白。55.權(quán)利要求53的方法，其中所述治療劑刺激抗ZnT8蛋白的免疫應(yīng)答。56.權(quán)利要求43-55中任意一項(xiàng)的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病。57.—種監(jiān)測個(gè)體的I型糖尿病自身免疫從最初的良性自身反應(yīng)性到破壞性胰島炎的進(jìn)展的方法，包括檢測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與相同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體的增加表明該個(gè)體正向破壞性胰島炎發(fā)展。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。59.權(quán)利要求57的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。60.權(quán)利要求57的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。61.權(quán)利要求57的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。62.—種監(jiān)測個(gè)體的I型糖尿病自身免疫從最初的良性自身反應(yīng)性到破壞性胰島炎的進(jìn)展的方法，包括檢測個(gè)體試樣中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答，其中與相同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，；險(xiǎn)測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增加表明該個(gè)體正向破壞性胰島炎發(fā)展。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。64.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。65.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。66.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。67.—種監(jiān)測用于預(yù)防I型糖尿病、延緩I型糖尿病發(fā)病或改善前驅(qū)糖尿病個(gè)體的自身免疫的治療效果的方法，包括檢測個(gè)體試樣中選擇性結(jié)合ZnT8的抗體，其中與相同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體水平降低或基本上相同表明所述治療是有效的，其中與同個(gè)體中抗體的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中抗體增加表明所述治療是無效的。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。69.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。70.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。71.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法包括檢測選擇性結(jié)合人ZnT8的抗體，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。72.—種監(jiān)測用于預(yù)防I型糖尿病、延緩I型糖尿病發(fā)病或改善前驅(qū)糖尿病個(gè)體的自身免疫的治療效果的方法，包括^r測個(gè)體試樣中ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，其中與相同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，是有效的，其中與同個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的先前測量值相比，檢測到個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答增加表明所述治療是無效的。73.權(quán)利要求72的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。74.權(quán)利要求72的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。75.權(quán)利要求72的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。76.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法包括檢測對(duì)包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。77.權(quán)利要求43-47、53-61或67-71中任意一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括使用選自以下組的分析法放射免疫沉淀分析，ELISA,時(shí)間分辨熒光分析和化學(xué)發(fā)光分析。78.權(quán)利要求43-47、53-61或67-71中任意一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括使用竟?fàn)幮凿B分析。79.權(quán)利要求48-56、62-66或72-76中任意一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括使用選自以下組的分析法T細(xì)胞增殖分析，利用可溶性MHC四聚體進(jìn)行的結(jié)合分析，利用可溶性T細(xì)胞受體進(jìn)行的結(jié)合分析，和ELISPOT分析。80.權(quán)利要求43-79中任意一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括使用ZnT8或其片段或變體。81.用于進(jìn)行權(quán)利要求43-47、53-61或67-71中任意一項(xiàng)方法的分析試劑盒，包括a)ZnT8蛋白或其變體或片段；b)用于檢測選擇性結(jié)合ZnT8的抗體的試劑。82.用于進(jìn)行權(quán)利要求48-56、62-66或72-76中任意一項(xiàng)方法的分析試劑盒，包括a)ZnT8蛋白或其同系物或片段；b)用于檢測ZnT8特異性T細(xì)胞應(yīng)答的試劑。83.—種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫的方法，包括給需要其的個(gè)體施用引發(fā)ZnT8特異性免疫應(yīng)答的藥劑，所述ZnT8特異性免疫應(yīng)答保護(hù)患者被自身免疫病靶向的細(xì)胞或組織。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述藥劑保護(hù)胰島的|3細(xì)胞。85.—種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫的方法，包括給需要其的個(gè)體施用藥劑，所述藥劑靶向于個(gè)體的ZnT8特異性T細(xì)胞，并誘導(dǎo)ZnT8特異性T細(xì)胞的壞死或凋亡。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述藥劑誘導(dǎo)ZnT8特異性T細(xì)胞的壞死或凋亡。87.—種預(yù)防自身免疫病、延緩自身免疫病發(fā)病或改善患有自身免疫病的個(gè)體的自身免疫的方法，包括給需要其的個(gè)體施用藥劑，所述藥劑誘導(dǎo)個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞的耐受性。88.權(quán)利要求87的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述藥劑誘導(dǎo)個(gè)體中ZnT8特異性T細(xì)胞的耐受性。89.權(quán)利要求83-88中任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是ZnT8、其同系物、其片段或其合成模擬物。90.權(quán)利要求89的方法，其中所述藥劑是權(quán)利要求1-38中任意一項(xiàng)的片段或嵌合蛋白、同系物或其片段。91.權(quán)利要求83-88中任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是個(gè)體中與天然的自身抗體竟?fàn)幗Y(jié)合該個(gè)體的ZnT8的抗體。92.權(quán)利要求83-91中任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑對(duì)包括325位精氨酸的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。93.權(quán)利要求83-91中任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑對(duì)包括325位色氨酸的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。94.權(quán)利要求83-91中任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑對(duì)包括325位谷氨酰胺的人ZnT8的多態(tài)性變體具有特異性。95.ZnT8、其變體、其片段、其合成模擬物或結(jié)合所述ZnT8的抗體、其同系物或其片段在基本上如本文所述的診斷、預(yù)后或治療方法中的用途。全文摘要本發(fā)明描述了在I型自身免疫性糖尿病(T1D)、其他自身免疫病及其他糖尿病相關(guān)疾病和病癥中鑒定ZnT8作為自身抗原靶標(biāo)。本發(fā)明還描述了基于該發(fā)現(xiàn)的各種治療、診斷和預(yù)后工具及方法。本發(fā)明公開了鑒定出ZnT8的遺傳變異在疾病過程的起始和自身免疫性向臨床糖尿病的進(jìn)展中起著重要作用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101646781SQ200780051859公開日2010年2月10日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者珍妮特·M·溫茨勞,簡·詹森,約翰·C·赫頓,霍華德·戴維森申請人:科羅拉多大學(xué)董事會(huì)