專利名稱：：對(duì)2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(pcv2)感染高度容許的均質(zhì)細(xì)胞系的產(chǎn)生的制作方法對(duì)2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(PCV2)感.染高度容許的均質(zhì)細(xì)胞系的產(chǎn)生
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)生2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(PCV2)。更具體地，本發(fā)明涉及對(duì)PCV2感染高度易感的連續(xù)細(xì)胞系以及利用所述細(xì)胞系產(chǎn)生PCV2的方法。豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(PCV)是小的無包膜環(huán)狀單鏈DNA病毒，其屬于環(huán)狀構(gòu)象病毒科。Murphy,FA.，F(xiàn)auquet,CM.，Bishop,DHL.,Ghabrial，SA"Jarvis，AW.,Martelli,GP.;Mayo,MA.，Summers,MD.Virustaxonomy.SixthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.NewYork,N.Y:Springer-Verlag;1995.pp.166-168。其最開始被鑒定并描述為豬腎細(xì)胞系的污染物。Tischer,L，Gelderblom,H.,Vettermann，W"Koch，M.A.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA.Nature.1982:295:64-66。最近，PCV與豬的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)相聯(lián)系，該疾病首先在以下文獻(xiàn)中涉及WesternCanada.Ellis,丄，Hassard，L.，Clark，E.,Harding,J.，Allan,G"Willson，P.,Strokappe,J.,Martin,K.，McNeilly，F(xiàn).,Meehan,F.,Todd,D.,Haines,D.Isolationofcircovirusfromlesionsofpigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome.Can.Vet.J.，1998;39:44-51;Harding,J.C.S.:Clark,E.G.Recognizinganddiagnosingpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS).SwineHealthProd.1997;5:201—203;JueLiu，IsabelleChen,andJimmyKwang,J.Virol2005:7P(13);8262-74。PWMS作為一種主要的疾病出現(xiàn)，其對(duì)全球的豬工業(yè)經(jīng)濟(jì)造成極大威脅。其首次出現(xiàn)于加拿大之后，PMWS目前已經(jīng)播散到美國、歐洲和亞洲。該綜合征主要影響6-14周的幼仔。在患病豬中呈緩慢漸進(jìn)性進(jìn)展，死亡率高。見http:〃www.aphis.usda.ciov/vs/ceah/cei/taf/emerqin。cliseasenoticefiles/pmws0301htm。PMWS高度可變?；疾∝i顯示慢性消耗，呼吸窘迫，腹瀉，動(dòng)作失調(diào)，麻痹，皮膚蒼白以及藍(lán)耳的表現(xiàn)。豬通常會(huì)顯示生長速度減慢，以及有時(shí)會(huì)出現(xiàn)黃疸。PMWS的診斷基于患病豬的年齡，典型的消耗表現(xiàn)以及尸檢病變。顯微鏡和免疫組織化學(xué)組織檢測(cè)顯示獨(dú)特的肺和淋巴樣組織病變，其中存在PCV2。Id.抗細(xì)菌藥物通常對(duì)于PWMS無效并且目前沒有可用的疫苗。癥狀的預(yù)防基于生物安全防護(hù)和良好的畜牧習(xí)慣。PCV2已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與其他疾病相關(guān)，包括豬皮炎腎病綜合征("PDNS"),先天性震顫(CT-AIl)，繁殖疾病，產(chǎn)前心肌炎(prenatalmyocarditis)和增生性壞死性肺炎。利用PCV抗原的疫苗已經(jīng)顯示了在預(yù)防PMWS中的初步成功。Fenaux，M.,etal.，Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVIinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs.丄Virol，2004.75(12):p.6297-303;Blanchard，P.etal"Protectioncontrelamaladied'amaigrissementduporcelet(MAP)parvaccinsaADNetproteinesrecombinantes.JourneesdelaRecherchePorcineenFrance,2004.36:p.345-352;Blanchard,P.，etal"Protectionofswineagainstporcinemultisystemicwastingsyndrome(PMWS)byporcinecircovirustype2(PCV2)proteins.Vaccine,2003.21:p.4565-4575;Pogranichniy,R.etal.EfficacyofinactivatedPCV2vaccinesforpreventingPMWSinCDCDpigs,AmericanAssociationofSwineVeterinarians.2004.DesMoines，Iowa。但是，目前沒有可用的有效疫苗。PMWS以及其他PCV2病毒感染相關(guān)疾病的疫苗、診斷劑和治療的開發(fā)需要有效且可靠的大量制造所述病毒的手段。PCV2病毒母液常規(guī)地通過在豬腎細(xì)胞系PK15上培養(yǎng)所述病毒來產(chǎn)生。從PK15細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的病毒效價(jià)表達(dá)為50。/。組織培養(yǎng)感染劑量("TCID50")每毫升，通常為104-105并且不超過105。感染的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫熒光染色顯示僅僅大約40%的細(xì)胞群對(duì)PCV2感染易感。需要對(duì)PCV2感染高度容許并可靠地在延長的時(shí)間中以高效價(jià)產(chǎn)生病毒的連續(xù)細(xì)胞系。4附圖簡(jiǎn)述圖1顯示免疫熒光測(cè)定的結(jié)果，顯示感染后3天被PCV2感染的非克隆的和克隆的PK15細(xì)胞單層的感染百分比。A,B，C和D分別代表模擬感染的PK15單層(陰性對(duì)照)，感染的PK15單層，低容許和高容許(克隆C1)亞克隆的單層。圖2顯示37°C吸附1小時(shí)后，PCV2附著于PK15細(xì)胞系低和高容許細(xì)胞克隆的表面膜。圖3顯示PK15和克隆Cl細(xì)胞群在48小時(shí)中的生長曲線。圖4顯示在親代PK15和克隆的Cl細(xì)胞系在4代中產(chǎn)生的PCV2病毒。圖5顯示親代PK15和克隆的Cl細(xì)胞系中PCV2病毒基因組合成。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了對(duì)PCV2感染高度容許的連續(xù)細(xì)胞系。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對(duì)PCV2感染高度容許的基本均質(zhì)的細(xì)胞系的方法，其包括(l)培養(yǎng)含有對(duì)PCV2感染具有不同易感性的細(xì)胞的均質(zhì)細(xì)胞群；(2)稀釋所述細(xì)胞培養(yǎng)物并將稀釋的細(xì)胞的等份試樣置于分離的容器內(nèi)使得每個(gè)容器含有大約一個(gè)細(xì)胞;(3)將PCV2加入每個(gè)容器；(4)培養(yǎng)所述細(xì)胞并鑒定含有對(duì)PCV2感染易感的細(xì)胞的容器；和(5)培養(yǎng)并維持來自這種細(xì)胞的細(xì)胞系。具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了名為PK15-C1的連續(xù)細(xì)胞系。其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生PCV2的方法，所述方法通過在本發(fā)明的細(xì)胞系中在適合細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)病毒并回收所述細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒來進(jìn)行。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了PK15豬腎細(xì)胞系中的細(xì)胞群體對(duì)于PCV2感染的容許性而言是異質(zhì)的。發(fā)現(xiàn)所述的細(xì)胞系含有對(duì)病毒感染具有低和高容許性的細(xì)胞。PCV2-感染的PK15產(chǎn)生的相對(duì)低病毒效價(jià)是由于細(xì)胞系的異質(zhì)性。本發(fā)明的均質(zhì)細(xì)胞系可通過克隆單個(gè)細(xì)胞并鑒定對(duì)PCV2感染高度易感的所得培養(yǎng)物來產(chǎn)生。雖然PK15細(xì)胞系是用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選細(xì)胞系，其他對(duì)PCV2感染易感的細(xì)胞系也可用于產(chǎn)生產(chǎn)生均質(zhì)病毒的細(xì)胞系。，均質(zhì)細(xì)胞群的培養(yǎng)物首先稀釋成包含單個(gè)細(xì)胞的等份試樣。所述單細(xì)胞等分試樣置于獨(dú)立的容器中，諸如微量滴定板的孔中，并懸浮在含有細(xì)胞復(fù)制所需營養(yǎng)成分、生長因子和緩沖液的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。它們隨后在誘導(dǎo)細(xì)胞生長的溫度和大氣條件下保溫。細(xì)胞生長之后，例如生長到連續(xù)單層之后，將感染量的病毒加入每個(gè)等分試樣并培養(yǎng)細(xì)胞直到達(dá)到適宜的病毒產(chǎn)生階段。測(cè)定每個(gè)等分試樣的病毒效價(jià)，例如通過免疫熒光測(cè)試，所述的測(cè)定根據(jù)以下方案感染后(pi)72小時(shí)感染的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，與PCV2ORF-l抗體以及隨后與抗豚鼠異硫氰酸熒光素(FITC)保溫，每次在37'C保溫1小時(shí)，每個(gè)步驟之間用磷酸緩沖鹽水洗滌細(xì)胞一次。染色結(jié)果在奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生高病毒效價(jià)的能力進(jìn)行評(píng)分。高病毒產(chǎn)生細(xì)胞系隨后有利地再克隆并選出高度容許細(xì)胞。本發(fā)明產(chǎn)生的優(yōu)選的細(xì)胞系來自細(xì)胞系PK15(ATCCCCL-33)并稱為克隆C1。在本發(fā)明中優(yōu)選稱為PK15-C1。本發(fā)明的結(jié)果顯示克隆的C1細(xì)胞群比PK15細(xì)胞對(duì)PCV2感染更易感。因此，PK15-C1與親本PK15細(xì)胞系相比是更有效產(chǎn)生高PCV2病毒產(chǎn)量的細(xì)胞系。PK15-C1己經(jīng)在美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)PTA-8244。本發(fā)明還通過以下實(shí)施例說明，其目的并非限制本發(fā)明。實(shí)施例1產(chǎn)生PK15-C1PK15親本細(xì)胞系維持在Eagle's極限必需培養(yǎng)基(MEM)中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充有5。/。胎牛血清(FBS),2.2g/L碳酸氫鈉，2mML-谷氨酸，1.0mM〗丙酮酸鈉和抗生素。PK15細(xì)胞的克隆通過有限稀釋法進(jìn)行。細(xì)胞用胰蛋白酶消化，以平均濃度1細(xì)胞/孔在MEM/20%FBS/60%調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中稀釋，并分配在96孔組織培養(yǎng)板中。立即篩選所述的板的單個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記，在37°(^和5%C02大氣下保溫該板。鑒定來自最初的孔的細(xì)胞單層之后，對(duì)這些亞克隆進(jìn)行另一輪進(jìn)一步的克隆。PK15親本和克隆的細(xì)胞群通過免疫熒光測(cè)定(IFA)篩選高和低容許細(xì)胞。所述細(xì)胞在96孔板中接種到70%匯合并在接種后6小時(shí)用PCV2感染，效價(jià)為大約105TCID50/ml。將葡糖胺(300mM)加入感染24小時(shí)內(nèi)的感染細(xì)胞中，所述細(xì)胞維持在MEM/5%FBS中、37。C/5。/。C02下。該實(shí)驗(yàn)中所用陽性和陰性對(duì)照分別為105TCID5。/ml的PCV2病毒上清(s/n)和MEM/5%FBS。所述細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，IFA在感染后(pi)72小時(shí)進(jìn)行。IFA結(jié)果顯示與PK15親代細(xì)胞中的40%PCV2感染以及保持低容許性的細(xì)胞克隆中的低于20%感染相比，在高容許克隆Cl細(xì)胞中出現(xiàn)最高的90%PCV2感染(圖1)。此外，進(jìn)行病毒附著測(cè)定來觀察PCV2與每個(gè)細(xì)胞克隆的細(xì)胞表面膜的親和力。每個(gè)細(xì)胞克隆接種于細(xì)胞培養(yǎng)玻片上并如上所述保溫過夜以獲得70%匯合。將107TCID50/ml的PCV2加入細(xì)胞在37。C吸附1小時(shí)并用4%多聚甲酸固定。IFA如上所述繼續(xù)進(jìn)行，但是利用PCV2ORF-2抗體作為一級(jí)抗體。最后的洗滌之后，染色的細(xì)胞用熒光包埋介質(zhì)包埋并在ZeissMeta倒置共聚焦顯微鏡下觀察。共聚焦顯微鏡下的結(jié)果顯示在37°C吸附1小時(shí)之后PCV2附著于克隆的和非克隆的PK15細(xì)胞的細(xì)胞表面膜，如圖2所示。A，B,C和D分別代表摸擬感染的PK15單層(陰性對(duì)照)，感染的低容許、高容許(克隆Cl)亞克隆單層以及感染的PK15單層。1)FITC熒光染色圖像。2)光相(lightphase)和綠色熒光圖像的重合。熒光的擴(kuò)散和強(qiáng)度，表示PCV2附著于細(xì)胞表面膜，在高容許性細(xì)胞克隆C1上最強(qiáng)，然后是未克隆的PK15細(xì)胞和低容許細(xì)胞克隆。這些結(jié)果提示克隆C.l對(duì)PCV2感染最易感，由此被選擇用于PCV2病毒的增殖。實(shí)施例2PK15-C1的表征PK15親代細(xì)胞和克隆Cl細(xì)胞通過它們以小時(shí)為單位的平均代長表征。大約lxl()S個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，在MEM/10%FBS中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，經(jīng)DNA提取并在接種后0,4,8，16,24，32和48小時(shí)定量。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA定量數(shù)據(jù)，PK15親代和克隆Cl細(xì)胞群的平均代長分別為12.1和14.6小時(shí)。結(jié)果顯示于圖3，表1提示PK15親代細(xì)胞比克隆Cl細(xì)胞倍增得更快。然后，在PK15親代和克隆C1細(xì)胞的病毒產(chǎn)物之間比較培養(yǎng)物上清中釋放的病毒的效價(jià)。所述細(xì)胞在150cm^且織培養(yǎng)瓶中接種到70%匯合，并在接種后6小時(shí)用PCV2(l(^TCID50/ml)感染。感染的培養(yǎng)物用D-葡糖胺并如前所述維持在培養(yǎng)基中。最后，病毒感染的培養(yǎng)物在感染后4天(DPI)凍干3次，細(xì)胞碎片在3500rpm、4°C沉淀5分鐘，獲得包含PCV2病毒的上清。PCV2病毒在PK15親代和克隆C1細(xì)胞系中連續(xù)傳代，收獲并保存在-80。C直到利用Cl克隆通過IFA測(cè)定感染力。IFA結(jié)果顯示與從親代PK15細(xì)胞系產(chǎn)生的較低效價(jià)105TCID5Q/mL相比，Cl細(xì)胞克隆在5次連續(xù)傳代之后產(chǎn)生最大的病毒效價(jià)1()8TCID50/mL(圖4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>親代PK15和Cl細(xì)胞克隆中PCV2的DNA復(fù)制速度也利用實(shí)時(shí)PCR法評(píng)估。感染后4天(DPI)收獲200微升的每種PCV2感染的PK15和Cl細(xì)胞裂解物，利用QiaAmpDNAMini試劑盒(QIAGEN，Inc.,Valencia,CaliforniaUSA)進(jìn)行DNA提取。純年的DNA隨后在200微升無菌蒸餾水中洗脫。實(shí)時(shí)PCR利用RocheLightCyclersystem(RocheAppliedScience,Indianapolis,IndianaUSA)進(jìn)行。1微升每種DNA提取物用作PCR模板，并使用PCV2特異性引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增(正向引物5'cacctggttgtggtaaaagc3',反向引物5'ggtctgattgctggtaatcg3')。含有PCV2基因組插入物的PBluescript質(zhì)粒(Stratagene，LaJolla，CaliforniaUSA)用作標(biāo)準(zhǔn)參照。實(shí)時(shí)PCR定量顯示lmLPK15和Cl細(xì)胞裂解物中PCV2的基因組DNA拷貝數(shù)分別為107和IO，圖5)。盡管本發(fā)明通過舉例說明，應(yīng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行變化而不偏離本發(fā)明的精神和權(quán)利要求限定的范圍。權(quán)利要求1.連續(xù)產(chǎn)生2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(“PCV2”)的方法，包括用所述病毒感染豬腎細(xì)胞系PK15-C1，在適合細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞系；以及回收所述細(xì)胞系產(chǎn)生的所述病毒。2.產(chǎn)生基本均質(zhì)的對(duì)2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒("PCV2")感染高度容許的細(xì)胞系的方法，包括(l)培養(yǎng)含有對(duì)PCV2感染具有不同易感性的細(xì)胞的均質(zhì)細(xì)胞群;(2)稀釋所述細(xì)胞培養(yǎng)物并將稀釋的細(xì)胞的等份試樣置于分離的容器內(nèi)使得每個(gè)容器含有大約一個(gè)細(xì)胞；(3)將PCV2加入每個(gè)容器;(4)培養(yǎng)所述細(xì)胞并鑒定含有對(duì)PCV2感染易感的細(xì)胞的容器；和(5)培養(yǎng)并維持來自這種細(xì)胞的細(xì)胞系。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述均質(zhì)細(xì)胞群是PK15細(xì)胞群。4.權(quán)利要求2的方法，其中步驟2-5重復(fù)至少一次。5.連續(xù)產(chǎn)生2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒("PCV2")的方法，包括用PCV2感染權(quán)利要求2，3或4的方法產(chǎn)生的細(xì)胞系，在適合細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，以及回收所述細(xì)胞系產(chǎn)生的所述病毒。6.權(quán)利要求2，3或4的方法產(chǎn)生的連續(xù)產(chǎn)生2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒("PCV2")的細(xì)胞系。7.細(xì)胞系PK15-C1，其于2007年3月20日以PTA-8244保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)2型豬環(huán)狀構(gòu)象病毒(“PCV2”)感染高度容許的連續(xù)細(xì)胞系。PCV2是豬的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(“PMWS”)的致病因子。PMWS作為主要的疾病出現(xiàn)，對(duì)全球的養(yǎng)豬工業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生極大威脅。本發(fā)明的高容許細(xì)胞系提供重組且可靠的PCV2來源以用于開發(fā)PMWS的疫苗，治療和診斷劑。文檔編號(hào)C12R1/93GK101688185SQ200780053724公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2007年5月11日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者A·L·H·凌,H-S·康,J·L·S·基申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司