專利名稱：糖化方法
糖化方法對序列表的引用本發(fā)明包含計算機可讀形式的序列表。通過引用將計算機可讀形式并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)啤酒用麥芽汁和用于產(chǎn)生啤酒的改進的糖化方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代的糖化方法中，當酶中的糖化麥芽量較低或允許使用所有輔助谷物 (adjunct grist)時，經(jīng)常將酶作為補充劑而加入。也在用高含量酶進行充分修飾的麥芽 的糖化中使用酶，以增加提取回收率以及可發(fā)酵糖的量。因此公知應(yīng)用脫支酶，例如，異 淀粉酶或支鏈淀粉酶，以增加可發(fā)酵糖的得率?？梢栽谟糜诋a(chǎn)生低熱量啤酒的方法中應(yīng) 用脫支酶。這種方法為 Willow 等(MBAATechnical Quarterly，1977，14 :105)、美國專利 No. 4，528，198,4, 666，718 和 4，318，927 和 GB 2056484 和 GB 2069527 的主題。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過使用某種支鏈淀粉酶，可以使用更少 量的酶蛋白而實現(xiàn)糖化。因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生啤酒用麥芽汁的方法，其中包括由谷物形 成醪，并將所述醪與支鏈淀粉酶(E. C. 3. 2. 1.41)接觸，其中所述支鏈淀粉酶具有氨基酸， 所述氨基酸序列a)與SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列至少50%相同，或b)由在低嚴緊條 件下與下述雜交的核酸序列編碼i)編碼SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列的核酸序列的互 補鏈，或ii) (i)的至少100個核苷酸的亞序列。在第二方面，本發(fā)明提供根據(jù)由第一方面的方法產(chǎn)生的麥芽汁。在第三方面，本發(fā)明提供由第一方面的方法產(chǎn)生的濃縮的和/或干燥的麥芽汁。在第四方面，本發(fā)明提供由第二和第三方面的麥芽汁產(chǎn)生的啤酒。在第五方面，本發(fā)明提供適用于第一方面的方法中的組合物，所述組合物包括支 鏈淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)、葡糖淀粉酶和可選的α _淀粉酶，其中支鏈淀粉酶具有氨基酸 序列，所述氨基酸序列a)與SEQ ID NO :4中所示的氨基酸序列至少50%相同，或b)由在 低嚴緊條件下與下述雜交的核酸序列編碼i)編碼SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列的核酸 序列的互補鏈，或ii) (i)的至少100個核苷酸的亞序列。發(fā)明詳述釀造方法在本領(lǐng)域中公知，并且通常包括發(fā)麥芽(malting)、糖化(mashing)和發(fā) 酵的步驟。糖化是將來自碎大麥麥芽和固體輔料的淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵和不可發(fā)酵的糖，從 而產(chǎn)生具有理想組成的麥芽汁的方法。傳統(tǒng)的糖化包括將碎大麥麥芽和輔料與水在設(shè)定溫 度和以設(shè)定體積混合，以使在發(fā)麥芽工藝中開始的生物化學(xué)變化繼續(xù)進行。糖化方法在各 種溫度進行一段時期，以活化負責(zé)降解蛋白質(zhì)和糖的內(nèi)源酶。至今為止，糖化中帶來的最重 要的變化是將淀粉分子轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖。在傳統(tǒng)的糖化方法中負責(zé)淀粉轉(zhuǎn)化的主要的酶是 α_和淀粉酶。α-淀粉酶通過將淀粉分子分解成很多可受到β-淀粉酶攻擊的更短
3的鏈而非?？焖俚剡€原不可溶和可溶的淀粉。產(chǎn)生的二糖是麥芽糖。除了在糖化過程中形 成的麥芽糖之外，還產(chǎn)生短的支鏈葡萄糖寡聚物。短的支鏈葡萄糖寡聚物是不可發(fā)酵的糖， 能夠使成品啤酒味道更好，并增加熱量。在糖化后，當所有淀粉都已經(jīng)分解時，需要從固體(酒糟)分離液體提取物(麥 芽汁)。麥芽汁的分離和過濾很重要，因為固體包含大量的蛋白質(zhì)，基本未修飾的(poorly modified)淀粉，含脂肪材料，硅酸鹽和多酚(丹寧)。在從酒糟分離麥芽汁后，可以用釀造 酵母發(fā)酵酒糟以產(chǎn)生啤酒。關(guān)于常規(guī)釀造方法的詳細信息可以在Research and Teaching Institute ofBrewing, Berlin (VLB)的 Wolfgang Kunze 的"Technology Brewing andMalting" , 1999 年第二版修訂版，ISBN 3-921690-39-0中找到。在糖化過程中形成的短的支鏈葡萄糖寡聚物可以通過加入外源酶(除了麥 芽之外加入的酶)而進一步水解。脫支酶如支鏈淀粉酶(pullulanase)和異淀粉酶 (isoamylase)水解這些寡聚物中的支鏈α _1_6糖苷鍵，從而釋放葡萄糖或麥芽糖和直鏈 寡聚物，其受到內(nèi)源酶(源自麥芽)和/或外源酶，例如，α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡糖淀 粉酶的作用。本發(fā)明提供適于產(chǎn)生不可發(fā)酵糖含量低的麥芽汁的新方法。該方法使用特定選擇 的支鏈淀粉酶活性。定義在本公開的內(nèi)容中，使用了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的多個術(shù)語。但是，幾個 術(shù)語使用了特定的含義，含義如下所限定。如本文所使用的，將術(shù)語“谷物(grist) ”理解為含有淀粉或糖的材料，其是啤酒生 產(chǎn)的基礎(chǔ)，例如，大麥麥芽和輔料。通常，谷物不包含任何添加的水。將術(shù)語“麥芽”理解為任何發(fā)芽的谷類谷粒(malted cereal grain)，特別是大麥。將術(shù)語“輔料”理解為谷物中不是大麥麥芽的部分。輔料可包括任何富含淀粉的植 物材料，如，未發(fā)芽的谷物，如大麥、稻、玉米、小麥、黑麥、高粱和易于發(fā)酵的糖和/或糖漿。將術(shù)語“醪(mash) ”理解為包含淀粉的漿料，該漿料包含浸于水中的谷物。將術(shù)語“麥芽汁”理解為糖化過程中提取谷物后的未發(fā)酵的液體流出物(liquor run-off)ο將術(shù)語“酒糟”理解為提取谷物和分離麥芽汁后殘余的浙干的(drained)固體。將術(shù)語“啤酒”在本文中理解為發(fā)酵后的麥芽汁，S卩，從大麥麥芽，任選的輔料和啤 酒花釀造的含酒精飲料(alcoholic beverage)。術(shù)語“同源序列”用于表征如下序列，其具有與已知序列至少70%，優(yōu)選至少 75%，或者至少80%，或者至少85%，或90%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%，至少99%或者甚至至少100%相同的氨基酸序列。用于同源性確定的氨基酸序列的 相關(guān)部分是成熟多肽，即，不含信號肽。術(shù)語“同源序列”也用于表征在低嚴緊性，中嚴緊性， 中/高嚴緊性，高嚴緊性，或甚至非常高嚴緊性與已知序列雜交的DNA序列。用于確定在低、 中或高嚴緊性核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間雜交的合適的實驗條件包括將包含 DNA片段或RNA的濾膜預(yù)浸以在5x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，1989)中雜交10 分鐘，并在 5x SSC，5x Denhardt 溶液(Sambrook 等，1989)，0. 5% SDS 和 100 微克/ml 變性
4超聲處理鮭精DNA的溶液中將濾膜預(yù)雜交(Sambrook等，1989)，然后在包含濃度為IOng/ ml 的隨機引發(fā)的(Feinberg 和 Vogelstein，1983，Anal. Biochem. 132 :6_13)、用 32P_dCTP 標記的(比活性> lxl09cpm/微克)探針的相同溶液中在約45°C雜交12小時。然后將濾 膜在2xSSC，0. 5% SDS中，在約55°C (低嚴緊性)，更優(yōu)選約60°C (中嚴緊性)，更優(yōu)選約 65 0C (中/高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選約70°C (高嚴緊性)，和甚至更優(yōu)選約75°C (非常高嚴 緊性)洗滌兩次共30分鐘。使用χ射線片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。將本公開中關(guān)于多肽或DNA序列所使用并涉及的術(shù)語“同一性”理解為兩個序列 之間的同一性程度，表示第一個序列與第二個序列之間的差別(derivation)。同一性可以 通過本領(lǐng)域已知的計算機程序適當確定，如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8,August 1994,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S. B.和Wunsch，C.D.，(1970),Journal of MolecularBiology,48,443-453) 0對于多肽序列比較，使用下述設(shè)定缺口產(chǎn)生罰分 (GAPcreation penalty)為 3. O 和缺口延伸罰分(GAP extension penalty)為 0.1。本發(fā) 明的氨基酸序列和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之間的同一性程度如下計算兩個序 列比對中完全匹配的數(shù)目，除以“發(fā)明序列”的長度或“外源序列”的長度中最短者。結(jié)果 表示為百分比同一性。麥芽汁生產(chǎn)按照第一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生啤酒用麥芽汁的方法，包括由谷物形成醪，并 將所述醪與支鏈淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)接觸，其中所述支鏈淀粉酶具有如下氨基酸序列， 所述氨基酸序列a)與SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列至少50%，至少60%，至少70%， 至少75%，至少80%，或至少85%，或90%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98% 或甚至至少99%相同或b)由核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴緊性，中嚴緊性，中/高嚴 緊性，高嚴緊性，或甚至非常高嚴緊性條件下與下述雜交i)編碼SEQ ID NO :4中所示氨基 酸序列的核酸序列的互補鏈，或ii) (i)的至少100個核苷酸，至少200個核苷酸，至少300 個核苷酸，至少500個核苷酸，至少1000個核苷酸，或甚至至少1500個核苷酸的亞序列。在 一個優(yōu)選實施方案中，支鏈淀粉酶具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID N0:3的氨基 酸序列相差不多于100個氨基酸，優(yōu)選不多于80個氨基酸，更優(yōu)選不多于50個氨基酸，更 優(yōu)選不多于30個氨基酸，甚至更優(yōu)選不多于20個氨基酸，和最優(yōu)選不多于10個氨基酸。第一方面的谷物包括包含淀粉的發(fā)芽谷物和/或輔料。谷物可以優(yōu)選包 括0% -100%，優(yōu)選20% -100%，優(yōu)選30% -100%，更優(yōu)選40% -100%，甚至更優(yōu)選 50 % -100 %，更優(yōu)選60 % -100 %，如80 % -100 %或甚至最優(yōu)選90 % -100 %的輔料，未發(fā)芽 谷物和/或未發(fā)芽大麥。在一個具體實施方案中，輔料由100%未發(fā)芽大麥組成。此外，谷 物優(yōu)選包含0 % -100 %，優(yōu)選20 % -100 %，優(yōu)選30 % -100 %，更優(yōu)選40 % -100 %，甚至更 優(yōu)選50 % -100 %，更優(yōu)選60 % -100 %，或最優(yōu)選70 % -100 %，或甚至最優(yōu)選90 % -100 % 發(fā)芽谷物和/或未發(fā)芽大麥。在一個具體實施方案中，谷物包含約50 %發(fā)芽谷物，例如，發(fā) 芽大麥，和約50%輔料，例如未發(fā)芽谷物，如未發(fā)芽大麥。第一方面的方法中使用的發(fā)芽谷物包括任何發(fā)芽的谷物，并且優(yōu)選為選自發(fā)芽的 大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻的發(fā)芽谷物，并且最優(yōu)選發(fā)芽大麥。第一方面的方法中使用的輔料可以獲得自塊莖、根、莖、葉、豆類、谷類和/或完整的谷粒。輔料可以包含生和/或精制淀粉和/或含糖材料，其源自植物，如小麥、黑麥、燕麥、 玉米、稻、買羅高粱(milo)、黍、高粱、馬鈴薯、甘薯、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、 西米(sago)、香蕉、糖甜菜和/或甘蔗。優(yōu)選地，輔料包含未發(fā)芽谷物，例如，選自下列的未 發(fā)芽谷物大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻，并且最優(yōu)選未發(fā)芽大麥。在本發(fā)明的糖化 方法之前、過程中或之后，可以向大麥麥芽醪中加入包含可易于發(fā)酵的碳水化合物如糖或 糖漿的輔料，但是優(yōu)選在糖化方法之后加入。根據(jù)本發(fā)明，支鏈淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)酶活性由外源提供并存在于醪中?？梢?在形成醪之前、過程中或之后向醪成分例如水和/或谷物中加入支鏈淀粉酶。在特別優(yōu)選 的實施方案中，α “淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)和/或葡糖淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 3)與支鏈淀粉 酶一起加入，并存在于醪中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，向醪中加入其它酶，所述酶選自下組異淀粉酶、蛋 白酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、非汀(Phytin)和酯酶。在糖化方法中，從谷物提取的淀粉逐漸水解成可發(fā)酵的糖和較小的糊精。優(yōu)選地， 在提取麥芽汁之前，醪對碘測試是淀粉陰性。糖化方法的溫度通常在控制下逐步增加，其中每步中一種酶的作用勝過其它酶， 最終降解蛋白質(zhì)、細胞壁和淀粉。糖化溫度曲線通常在本領(lǐng)域中已知。在本發(fā)明中，糖化 方法中的糖化(淀粉降解)步驟優(yōu)選在60°C -66°c，更優(yōu)選在61°C -65°c，甚至更優(yōu)選在 620C _64°C，和最優(yōu)選在63°C _64°C進行。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，糖化溫度是 64 "C。從醪獲得麥芽汁通常包括濾去(strain)酒糟中的麥芽汁，所述酒糟即形成谷物 的部分的不溶性谷粒和谷殼材料?？蓪崴ㄟ^酒糟以從谷物中沖洗或淋洗(sparge)出 任何殘余的提取物。在本發(fā)明的方法中應(yīng)用熱穩(wěn)定纖維素酶導(dǎo)致葡聚糖水平有效下降 以促進麥芽汁過濾，從而確保循環(huán)時間減少和高的提取回收率。優(yōu)選地，提取回收率為至少 80 %，優(yōu)選至少81%，更優(yōu)選至少82 %，甚至更優(yōu)選至少83 %，如至少84 %，至少85 %，至少 86 %，至少87 %，至少88 %，至少89 %，至少90 %，和最優(yōu)選至少91%。在從第一方面的任何上述實施方案的谷物酒糟分離麥芽汁后，可以按原樣使用麥 芽汁或?qū)⑵涿撍蕴峁饪s和/或干燥的麥芽汁。濃縮和/或干燥的麥芽汁可以用作釀酒 提取物，麥芽提取物調(diào)味劑(flavoring)，用于不含酒精的麥芽飲料、麥芽醋、早餐谷物，用 于糖果等。在一個優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵麥芽汁以產(chǎn)生酒精飲料，優(yōu)選啤酒，例如，愛兒啤酒 (ale)、烈性愛兒啤酒(strong ale)、苦味酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒 (porter)、陳貯啤酒(lager)、出口 型啤酒(export beer)、麥芽酒(maltliquor)、大麥酒、 低麥芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、 低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。麥芽汁的發(fā)酵可包括向麥芽 汁中投入(Pitch with)酵母漿料，該漿料包含新鮮酵母(即先前未用于本發(fā)明的酵母)或 者所述酵母可以是回收的酵母。應(yīng)用的酵母可以是適于啤酒釀造的任何酵母，特別是選自 酵母屬菌種(Saccharomyces spp.)的酵母，如釀酒酵母和葡萄汁酵母(S. uvarum)，其包括 這些生物體的天然或人工產(chǎn)生的變體。用于產(chǎn)生啤酒的麥芽汁的發(fā)酵方法為本領(lǐng)域的技術(shù) 人員所熟知的。
本發(fā)明的方法可包括向發(fā)酵麥芽汁中加入二氧化硅水凝膠(silicahydrogel)，以 增加啤酒的膠質(zhì)穩(wěn)定性(colloidal stability)。這些方法還可以包括向發(fā)酵的麥芽汁中 加入硅藻土(kieselguhr)并過濾以使啤酒鮮亮(bright)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供由第二或第三方面的麥芽汁產(chǎn)生的啤酒，如通過將 麥芽汁發(fā)酵產(chǎn)生啤酒而產(chǎn)生的啤酒。啤酒可以是任何類型啤酒，例如，愛兒啤酒、烈性愛兒 啤酒、烈性黑啤酒、缽爾透黑啤酒、陳貯啤酒、苦味酒、出口型啤酒、麥芽酒、低麥芽啤酒、高 醇啤酒、低醇啤酒、低熱量啤酒或清淡啤酒。酶待應(yīng)用于本發(fā)明中的外源酶應(yīng)該根據(jù)它們在本發(fā)明方法中的處理溫度以及它們 在醪中的PH條件下保持充分活性的能力來進行選擇，并應(yīng)以有效量加入。酶可以源自任何 來源，優(yōu)選來自植物或藻類，更優(yōu)選來自微生物，如來自細菌或真菌。支鏈淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 41)在本發(fā)明的方法和/或組合物中使用的優(yōu)選的支鏈淀粉酶是具有如下氨基酸序 列的直鏈淀粉酶，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :4中所示的序列至少50%，如至少55%， 如至少60%，如至少65%，如至少66%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少 85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少95%， 如至少98%或者甚至100%相同；特別是當使用下述設(shè)置用Needle程序比對時矩陣為 BL0SUM62，缺口起始罰分10. 0，缺口延伸罰分0. 5，無缺口同一性矩陣。最優(yōu)選地，支鏈淀粉酶源自嗜酸普魯蘭芽孢桿菌(Bacillusacidopullulyticus)。 支鏈淀粉酶可具有由 Kelly 等，1994(FEMS Microbiol. Letters 115 97-106) (SEQ ID NO 6)公開的氨基酸序列或同源序列。異淀粉酶(E.C. 3. 2. L 68)本發(fā)明的方法和/或組合物中使用的另一種酶可以是可替換的脫支酶，如異淀粉 酶(E. C. 3. 2. 1. 68)。異淀粉酶水解支鏈淀粉(amylopectin)和β -極限糊精中的α -1， 6-D-糖苷分支鍵，并且能通過異淀粉酶不能攻擊支鏈淀粉和通過對α -限糊精的有限作用 而區(qū)別于支鏈淀粉酶。異淀粉酶可以本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的有效量加入。異淀粉酶可以 單獨加入或與支鏈淀粉酶一起加入。α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)本發(fā)明的方法和/或組合物中使用的特定α-淀粉酶可以是芽孢桿菌 屬(Bacillus) α-淀粉酶。公知的芽孢桿菌屬α -淀粉酶包括源自地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和嗜熱脂肪芽孢 桿菌(B. stearothermophiIus)的菌株的α -淀粉酶。在本發(fā)明的上下文中，期望的芽孢 桿菌屬α-淀粉酶是WO 99/19467第3頁第18行至第6頁第27行中所定義的α-淀 粉酶。優(yōu)選的α-淀粉酶具有氨基酸序列，其與WO 99/19467中SEQ IDN0:4(本文公開 為SEQ ID NO 7)具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%， 至少98%，或者特別是至少99%。最優(yōu)選的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶是SEQ ID NO :9或包括 WO 99/43794中公開的其變體。期望的變體和雜合體在WO 96/23874、WO 97/41213和WO 99/19467中描述。特別期望的是來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)，其 具有W099/19467中SEQ ID NO :3所公開的氨基酸序列(本文公開為SEQ ID Ν0:10)，其具
7有突變I181*+G182*+N193F。芽孢桿菌屬α -淀粉酶可以以1. 0-1000NU/kg DS,優(yōu)選2. 0_500NU/kg DS,優(yōu)選 10-200NU/kg DS 的量加入。本發(fā)明的方法使用的另一種特定的α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉 酶。例如，源自曲霉屬(Aspergillus)內(nèi)菌種的α -淀粉酶，并且優(yōu)選來自黑曲霉 (Aspergillusniger)的菌株。特別期望的是與WO 2002/038787中SEQ ID NO :1所示的氨基 酸序列(本文公開為SEQ ID NO: 11)顯示高同一性，即至少50%，至少55%，至少60%，至 少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %或者甚至至少90 %同一性的真菌α -淀 粉酶。真菌 α -淀粉酶可以以 l-1000AFAU/kg DS，優(yōu)選2_500AFAU/kg DS，優(yōu)選20-100AFAU/ kg DS的量加入。葡糖淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 3)本發(fā)明的方法和/或組合物中使用的另一種特定的酶可以是源自微生物或植物 的葡糖淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 3)。優(yōu)選的是真菌或細菌來源的選自下組中一種或多種的葡 糖淀粉酶曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J. 3 (5) :1097-1102)，或它們的變體，如W092/00381和WO 00/04136中所公開的；泡盛曲 霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(W084/02921)、米曲霉(A. oryzae) (Agric. Biol. Chem.，1991， 55(4) :941-949)，或其變體或片段。其它期望的葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是源自 埃默森踝節(jié)菌(Talaromyces emersonii) (W0 99/28448)、Talaromycesleycettanus (美 國專利號Re. 32，153)、杜邦踝節(jié)菌(Talaromyces duponti)和嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces 讓吐!11叩1^1118)(美國專利號4，587，215)的葡糖淀粉酶。優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括源自米曲 霉的葡糖淀粉酶，如與W000/04136中的SEQ IDNO 2中所示的氨基酸序列具有至少90%， 至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特別是至少99%或者甚至至少 90%同一性的葡糖淀粉酶。其它優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括源自埃默森踝節(jié)菌的葡糖淀粉酶， 如與埃默森踝節(jié)菌的氨基酸序列(W0 99/28448)具有至少90%，至少92%，至少95%，至少 96 %，至少97 %，至少98 %，或特別是至少99 %，或者甚至至少90 %同一性的葡糖淀粉酶。期望的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬(Clostridium)的葡糖淀粉酶， 特別是熱解淀粉梭菌(C. thermoamylolyticum) (EP 135，138)和熱硫化氫梭菌 (C. thermohydrosulfuricum)(TO 86/01831)。還期望的是商業(yè)產(chǎn)品AMG 200L ；AMG 300L ； SAN SUPER 禾Π AMGtmE (來自 Novozymes) ；0PTIDEX 300 (來自 Genencor Int.) ；AMIGASE 禾Π AMIGASE PLUS (來自 DSM) ；G-ZYME G900(來自 EnzymeBio-Systems) ；G-ZYME G990ZR (黑曲霉葡糖淀粉酶和低 蛋白酶含量)?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的有效量加入葡糖淀粉酶。蛋白酶合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋 白酶，即，通過在低于PH 7的酸性條件下水解蛋白質(zhì)的能力表征的蛋白酶。蛋白酶負責(zé)在醪中將全長的高分子量蛋白降解成低分子量蛋白。低分子量蛋白對 于酵母的營養(yǎng)是必需的，而高分子量蛋白保證泡沫穩(wěn)定性。因此技術(shù)人員熟知蛋白酶應(yīng)該 以平衡量加入，同時為酵母提供緩慢(amble)游離氨基酸并且保留足夠的高分子量蛋白以使泡沫穩(wěn)定化?？梢砸?. l-1000AU/kg DS，優(yōu)選l-100AU/kg DS并且最優(yōu)選5_25AU/kg DS 的量加入蛋白酶。纖維素酶(E.C. 3. 2. 1. 4)纖維素酶可以是微生物來源的，如源自絲狀真菌(例如，曲霉屬、木霉屬 (Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium))的菌株。纖維素酶的具體實 例包括從特異腐質(zhì)霉(H. insolens)可獲得的內(nèi)切葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶I)，其還由WO 91/17244中

圖14的氨基酸序列定義，和WO 91/17243中所述43kD特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶。本發(fā)明的方法中使用的特定纖維素酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶，如內(nèi)切-1，4_β-葡 聚糖酶。特別期望的是WO 2003/062409中SEQ ID NO :2中所示的β -葡聚糖酶(本 文公開為SEQ ID Ν0:14)和同源序列。可以使用的商業(yè)上可獲得的纖維素酶制劑包括
CELLUCLAST 、CELLUZYME 、CEREFLO 和 ULTRAFLO (可從
Novozymes A/S 獲得)，LAMINEX 和SPEZYME CP (可從 Genencor Int.獲得)和 ROHAMENT 7069K 可從R6hm，Germany 獲得)。可以以1. 0-10000BGU/kg DS,優(yōu)選 10_5000BGU/kg DS,優(yōu)選 50-1000B⑶/kg DS 和 最優(yōu)選100-500B⑶/kg DS的量加入β -葡聚糖酶。材料與方法酶支鏈淀粉酶1，其源自嗜酸普魯蘭芽孢桿菌，并具有SEQ ID NO :1中所示序列。支 鏈淀粉酶1可由Novozymes作為Promozyme 400L獲得。支鏈淀粉酶2，其源自Bacillus deramificans (美國專利No. 5，736，375)，并具有 SEQ ID NO 2中所示序列。支鏈淀粉酶2可由Novozymes作為Promozyme D2獲得。支鏈淀粉酶3，其源自嗜酸普魯蘭芽孢桿菌，并具有SEQ ID NO :4中所示序列。酸性真菌α-淀粉酶，其源自黑曲霉，并具有SEQ ID NO=Il中所示序列。葡糖淀粉酶G1，其源自黑曲霉(boel等，見上文)。方法α -淀粉酶活性(NU)使用馬鈴薯淀粉作為底物可以確定α-淀粉酶活性。這種方法基于改性的 (modified)馬鈴薯淀粉通過酶的分解，并通過將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合來跟蹤 此反應(yīng)。起初，形成藍黑色(blackish blue color)，但是在淀粉分解過程中，藍色越來越 淺，并逐漸變成紅褐色(reddish-brown)，將其與有色玻璃標準相比較。一千Novo α -淀粉酶單位(KNU)等于1000NU。一個KNU定義為在標準條件下(即， 370C +/-O. 05 ；0. 0003Μ Ca2+ ；禾PpH 5. 6)降解5. 26g淀粉干物質(zhì)(Merck Amylum solubile) 的酶量。酸性α -淀粉酶活性(AFAU)酸性α -淀粉酶活性可以以AFAU (酸性真菌α -淀粉酶單位)測定，其相對于酶 標準物確定。IFAU定義為在下述標準條件下每小時降解5. 260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。酸性α-淀粉酶是內(nèi)切-α-淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶， Ε. C. 3. 2. 1. 1)，催化淀粉分子內(nèi)部區(qū)域中的α -1，4-糖苷鍵，形成不同鏈長的糊精和寡糖。碘與淀粉形成的藍色的強度與淀粉濃度成正比。使用反向比色法，測定在特定分析條件下 淀粉濃度的減少作為淀粉酶活性。
α-淀粉酶標準條件/反應(yīng)條件底物可溶淀粉，大約0. 17g/L緩沖液檸檬酸鹽(citate)，大約0. 03M碘(I2)0. 03g/LCaCl2 1. 85mMpH: 2.50 士 0· 05溫育溫度40°C反應(yīng)時間23秒波長590nm酶濃度0·025AFAU/mL酶的作用范圍0.01-0. 04AFAU/mL葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在37°C和pH 4. 3每分鐘水解1微摩爾麥芽糖 的酶量。使用來自Boehringer Mannheim，124036 的 Glucose GOD-Perid 試劑盒，通過根 據(jù)(AEL-SM-0131，可應(yīng)要求從Novozymes獲得)修正的方法以AGU/ml確定活性。標準品 AMG-標準品，批號7-1195，195AGU/ml。將375 μ L底物(50mM乙酸鈉，pH 4. 3中的麥芽 糖)在37°C溫育5分鐘。加入稀釋于乙酸鈉中的25 μ L酶。10分鐘后，通過加入IOOyL 0. 25Μ NaOH而停止反應(yīng)。將20 μ L轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板并加入200 μ LGOD-Perid溶液 (124036，Boehringer Mannheim)。30分鐘后，在室溫測定650nm處的吸光度，并由AMG-標 準品，AGU/ml計算活性。分析方法(AEL-SM-0131)的詳細描述可以應(yīng)要求從Novozymes獲 得。支鏈淀粉酶活性(PUN)一個支鏈淀粉酶單位(PUN)定義為在pH 5的檸檬酸鹽緩沖液中，在50°C能從支鏈 淀粉底物每分鐘形成1微摩爾葡萄糖的酶量。支鏈淀粉酶樣品和底物(紅色支鏈淀粉)一起溫育。內(nèi)切支鏈淀粉酶水解紅色支 鏈淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，釋放紅色底物降解產(chǎn)物。使用乙醇將未降解的底物沉淀。在 510nm用分光光度法測定釋放顏色的量，其與樣品中的內(nèi)切-支鏈淀粉酶活性成比例。將樣 品的顏色形成與支鏈淀粉酶活性已知的樣品產(chǎn)生的顏色形成相比較。支鏈淀粉酶是支鏈淀粉6-葡聚糖-水解酶，酶分類號為E. C. 3. 2. 1. 41。反應(yīng)條件溫度50°C 士2°CpH5.0淀粉+碘λ = 590nm藍/ 紫
—糊精+寡糖
40°C, pH 2. 5 t = 23秒脫色
底物濃度酶濃度反應(yīng)時間波長
0. 67%紅色支鏈淀粉 0.04-0. 13PUN/mL 30分鐘試劑/底物氯化鉀溶液0. 5M紅色支鏈淀粉底物2%。供應(yīng)商為Megazyme，Australia檸檬酸鹽緩沖液0. 05M pH 5. 0包括25mM半胱氨酸的檸檬酸鹽緩沖液0. 05M pH 5. 0乙醇 99. 8%將904PUN/g的支鏈淀粉酶標準品制備物在檸檬酸鹽緩沖液0.05M中稀釋成 0. 05-0. 20PUN/ml的標準品稀釋液系列。空白檸檬酸鹽緩沖液0.05M將酶樣品在檸檬酸鹽緩沖液0. 05M中稀釋至活性為0. 06-0. 20PUN/ml，并與標準 品稀釋液系列比較。實施例1在這個實施例中，分析不同的支鏈淀粉酶以降低麥芽汁中不可發(fā)酵糖(糊精/ DP4/4+)的量的能力。使用如下糖化溫度曲線將100%充分修飾的麥芽糖化，所述糖化溫度曲線包括 460C 26分鐘，然后以1°C /分鐘增加至64°C，之后使溫度保持恒定。在98、128和158分鐘 收集樣品。在0分鐘加入酶。分別以1000AGU/kg DS和250AFAU/kg DS向所有處理中加入葡 糖淀粉酶和α-淀粉酶。根據(jù)表1加入支鏈淀粉酶。將樣品煮沸10分鐘并過濾(孔徑0. 20微米)。通過HPLC分析樣品，并計算不可 發(fā)酵糖(DP4/4+)的百分比。
11
使用表1中的數(shù)據(jù)，通過回歸，計算與支鏈淀粉酶3的2. 74mg酶蛋白/kg相同效 果所需的支鏈淀粉酶1和支鏈淀粉酶2的酶劑量(見表2)。 由這些結(jié)果可以看出，支鏈淀粉酶3是最有效的酶。因此，減少不可發(fā)酵糖(糊精 /DP4/4+)的量需要的支鏈淀粉酶3酶蛋白更少，由此增加了麥芽汁的發(fā)酵(attenuation)。實施例2在本實施例中分析不同支鏈淀粉酶的pH曲線和溫度曲線。用下述條件根據(jù)相對酶活分析而進行PH和溫度曲線的研究。分析方法原理通過支鏈淀粉酶水解支鏈淀粉中的α -1，6-糖苷鍵，并且由修改的 Somogyi-Nelson方法檢測增加的還原糖量。在本實驗中，以相對活性評價活性，其中活性最強的樣品指定為100%。檢測條件 如下緩沖液檸檬酸鹽0. 1M+0. 2M磷酸鹽(在pH曲線中調(diào)節(jié)，在溫度曲線中為pH 5)底物0.2%支鏈淀粉 Sigma (p-4516)溫度在pH曲線中為60°C，在溫度曲線中調(diào)節(jié)反應(yīng)時間30分鐘
12
根據(jù)Nelson，1944，J. Biol. Chem. 153 :375_380 和 Somogyi，1945，J. Biol. Chem. 160 :61_68中描述的原理檢測由支鏈淀粉酶釋放的還原糖。簡言之，通過以對應(yīng)于樣 品體積的體積(例如，2ml的樣品加2ml)加入Somogyi氏銅(cobber)試劑而終止水解反 應(yīng)。將樣品煮沸20分鐘，并在顏色反應(yīng)前冷卻。通過加入對應(yīng)于樣品1/2體積的Nelson 試劑(例如，樣品+Somogyi銅試劑共4ml時加入2ml)而進行反應(yīng)。樣品混合2分鐘，然后 加入與Nelson試劑等量的水。在暗處溫育樣品30分鐘，并在分光光度計中在540nm測量?？梢匀缦轮苽湓噭㏒omogyi 銅試劑在1000ml H2O 中溶解 70. 2g Na2HP04x2H20 和 80. Og KNAC4H406x4H20 (kaliumsodium tartrat (酒石酸鉀鈉))(稍稍加熱)。再加入 60g NaOH ； 16. 0gCuS04x5H20 和 360. Og Na2SO4 并加水至2000ml。用NaOH調(diào)pH至10. 8Nelson 試齊[J:在1200ml H2O 中溶解 100. Og (NH4) 6Mo7024x7H20。小心加入 84. 0mlH2S04。此外，在 IOOml H2O中溶解12. OOg Na2HAS04x7H20(砷酸氫二鈉)，并將此溶液緩慢加入第一種溶液中 并加水至2000ml。下面的表3和4中給出了三種支鏈淀粉酶的pH和溫度曲線。
這些結(jié)果表明，與其它兩種支鏈淀粉酶比較，支鏈淀粉酶3在高溫時具有寬的PH 曲線和活性。這些性質(zhì)使支鏈淀粉酶3成為釀酒(糖化條件)中非常穩(wěn)健的酶，特別是對 于糖化溫度為62°C -65°C時。實施例3用支鏈淀粉酶1和3 (SEQ ID NO 1和4)進行浸出糖化(infusion mashing)測 試。以100%大麥為底物(谷物)制備6個糖化樣品。將大麥(DS%:86. 73)磨碎，并且對于每個樣品，將50. Og樣品(總DS 43. 34g)與 50 °C的200g自來水和3. OmllM H3PO4混合。 所有樣品均加入無支鏈淀粉酶的相同的酶混合物。然后根據(jù)下表向樣品1-6加入支鏈淀粉酶酶劑量活性/g 然后在運行下述程序的自動化糖化設(shè)備中測試樣品。
糖化后，所有樣品均加入自來水至總共300g并過濾。然后將過濾的樣品煮沸10分鐘并用去離子水1 1稀釋。將50ml子樣品離心并進行標準密度分析，計算RDF% (發(fā)
酵的真實水平)。結(jié)果作為RDF%和以％表示的麥芽汁糖(DP2和DP4+)給出。
結(jié)果表明，對于獲得高％1^^，支鏈淀粉酶3明顯優(yōu)于支鏈淀粉酶1，并且支鏈淀粉 酶3能夠產(chǎn)生甚至優(yōu)于支鏈淀粉酶1的麥芽糖水平(DP2水平)。實施例4用支鏈淀粉酶3(SEQ ID NO 4)進行浸出糖化測試，以評價支鏈淀粉酶3的麥芽糖 產(chǎn)生性質(zhì)。以100%大麥為底物(谷物)制備6個糖化樣品。將大麥(DS%:86. 73)磨碎，并且對于每個樣品，將50. Og樣品(總DS 43. 34g)與 50°C的200g自來水和5% Na2SO3和IM H3PO4混合。所有樣品均加入無支鏈淀粉酶的相同的酶混合物。然后根據(jù)下表向樣品1-6加入支鏈淀粉酶3 然后運行下述程序在自動化糖化設(shè)備中測試樣品。 糖化后，向所有樣品中加入自來水至總量為300g并過濾。然后將已過濾的樣品煮 沸10分鐘，并用去離子水1 1稀釋。將50ml子樣品離心并進行分析。結(jié)果如下 結(jié)果表明麥芽糖濃度隨著支鏈淀粉酶3的劑量增加而增加，并且麥芽糖％的增加 之后發(fā)酵(RDF% )增加。糊精部分(HPLC分析DP4/4+)在同時降低。只有大麥淀粉酶能在這個反應(yīng)中產(chǎn)生麥芽糖，并且支鏈淀粉酶3可以促進大 麥的淀粉酶的作用。
葡萄糖濃度低，且不受支鏈淀粉酶3作用的影響，這是發(fā)酵產(chǎn)生的麥芽汁時的一 個優(yōu)勢。通過大麥淀粉酶，并且通過麥芽汁的發(fā)酵(RDF%)增加，支鏈淀粉酶3幫助降 解糊精，并促進麥芽糖的形成。
權(quán)利要求
用于產(chǎn)生啤酒用麥芽汁(Brewer’s wort)的方法，其中包括從谷物形成醪，和將所述醪與支鏈淀粉酶接觸，其中所述支鏈淀粉酶具有下述氨基酸序列a)與SEQ ID NO4中所示氨基酸序列至少86％相同；或b)由核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴緊條件下與下述雜交i)編碼SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的核酸序列的互補鏈；或ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述支鏈淀粉酶源自嗜酸普魯蘭芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其進一步包括將所述醪與葡糖淀粉酶和/或α_淀粉 酶接觸。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉 (Aspergillus niger)或埃默森躁節(jié)菌(Talaromyces emersonii)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包括將所述醪與選自下組的酶接觸 纖維素酶、異淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述谷物包括發(fā)芽和/或未發(fā)芽的谷粒。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中未發(fā)芽的谷粒和/或發(fā)芽的谷粒選自下 列大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中發(fā)芽的谷粒包括選自發(fā)芽的大麥、小麥、黑 麥、高粱、黍、玉米和稻的發(fā)芽谷粒。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述麥芽汁是濃縮的和/或干燥的。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其還包括發(fā)酵麥芽汁以獲得酒精飲料。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述酒精飲料是啤酒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述啤酒是愛兒啤酒、烈性愛兒啤酒、苦味酒、烈性 黑啤酒、缽爾透黑啤酒、陳貯啤酒、出口型啤酒、麥芽酒、大麥酒、低麥芽啤酒、高醇啤酒、低 醇啤酒、低熱量啤酒或清淡啤酒。
13.由根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法產(chǎn)生的麥芽汁。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的濃縮的和/或干燥的麥芽汁。
15.由根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的麥芽汁產(chǎn)生的啤酒。
16.適用于根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法中的組合物，所述組合物包括支鏈淀粉 酶、葡糖淀粉酶和任選的α -淀粉酶，其中所述支鏈淀粉酶具有如下的氨基酸序列，所述氨 基酸序列a)與SEQID NO 4中所示氨基酸序列至少50%相同；或b)由在低嚴緊條件下與下述雜交的核酸序列編碼i)編碼SEQID NO 4中所示氨基酸序列的核酸序列的互補鏈或ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉或埃默 森踝節(jié)菌。
全文摘要
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生啤酒用麥芽汁的方法，其中包括從谷物形成醪，和將所述醪與支鏈淀粉酶接觸。
文檔編號C12N9/44GK101918525SQ200780101920
公開日2010年12月15日 申請日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者尼爾斯·埃爾維格, 珀·L·喬爾根森, 邁克爾·托馬斯 申請人:諾維信公司;諾維信股份有限公司