專利名稱：胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法、判斷裝置及其使用試劑盒。

背景技術(shù)：
近年來，在臨床診斷領(lǐng)域，基因檢查迅速普及。作為基因檢查的一例，有癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷。癌細胞脫離原發(fā)灶經(jīng)血管和淋巴管轉(zhuǎn)移到全身。在癌癥手術(shù)中，需要盡可能將病灶切除干凈，因此，要求正確地查出轉(zhuǎn)移，并根據(jù)轉(zhuǎn)移的程度采取適當處置。為此，術(shù)中的癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移的診斷顯得尤為重要。作為癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一種診斷方法，即以在正常細胞中不表達或表達量很低、在癌細胞中大量表達的蛋白質(zhì)的核酸為靶核酸進行檢測。隨著近年來基因分析技術(shù)的發(fā)展，通過擴增、檢測從生物體切除的淋巴結(jié)組織中所含靶核酸即可有效地進行癌癥診斷。
為了用這種基因檢查的方法檢查癌向特定組織的轉(zhuǎn)移，現(xiàn)在越來越多的人熱衷于進行使用LAMP法(loop-mediated isothermalamplification method)和聚合酶鏈反應(PCR法，polymerase chainreaction)等檢查癌基因的研究。這種基因檢查可以通過檢測組織和細胞等所含癌標志物(比如在癌細胞特異表達的蛋白質(zhì)的mRNA等)進行。
眾所周知，癌標志物(以下也單稱為標志)之一角蛋白19(CK19)作為診斷乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標志非常有用。CK19是一種公認的在正常淋巴結(jié)的表達量和在轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的乳腺癌細胞上的表達量具有有意義之差的分子。
胃癌在中國、日本和韓國等亞洲和南美患者較多。據(jù)2003年癌癥死亡人數(shù)統(tǒng)計，胃癌在日本，在男性中僅次于肺癌居第二位，在女性中僅次于大腸癌位居第二位。而且，癌癥自覺癥狀很少，早期發(fā)現(xiàn)很困難，進展轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)等的情況很多。
過去，人們使用角蛋白20和癌胚抗原作為判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標志。但關(guān)于胃癌基因檢查的報告很少，判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的更先進的方法有待開發(fā)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決前述問題，目的是提供一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法、判斷裝置及其試劑盒。
本發(fā)明提供一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法，包括 定量步驟，定量用疑有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA； 判斷步驟，根據(jù)所得所述mRNA的定量結(jié)果判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
所述判斷步驟包括根據(jù)mRNA的定量值判斷所述淋巴結(jié)組織中的轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移度的步驟。
所述轉(zhuǎn)移度為轉(zhuǎn)移灶大小。
所述轉(zhuǎn)移度為轉(zhuǎn)移灶的癌細胞數(shù)。
在所述定量步驟用核酸擴增法定量所述角蛋白19的mRNA。
所述核酸擴增法為定量RT-PCR或定量RT-LAMP。
所述判斷步驟包括比較所述mRNA定量值和預定的閾值，當定量值低于閾值時，判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，當定量值超過閾值時，判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性。
所述mRNA定量值是所述檢測試樣中的所述角蛋白19mRNA的絕對量。
本發(fā)明還提供一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷裝置，包括 定量系統(tǒng)，定量用疑有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA； 判斷系統(tǒng)，根據(jù)所得mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
所述裝置，還具備根據(jù)所得mRNA定量值，判斷所述淋巴結(jié)組織中轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移度的第二判斷系統(tǒng)。
本發(fā)明進一步提供一種用于判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑盒，其包括，用來制備檢測試樣的淋巴結(jié)組織前處理液、含能檢出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于實施核酸擴增法的酶的酶溶液。
所述試劑盒的所述前處理液為含有二甲亞砜的緩沖液。
所述試劑盒的所述酶溶液含有RNA依賴型DNA聚合酶和DNA依賴型DNA聚合酶。
本發(fā)明可以提供一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法、判斷裝置及其所用試劑盒。以此可以進行有效的胃癌基因檢查。通過本發(fā)明還可以判斷有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中的轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移度。判斷轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移度可以提供決定是否要手術(shù)的指標或決定手術(shù)方式的指標。



[圖1]為本發(fā)明一實施方式的判斷裝置的整體結(jié)構(gòu)斜視圖。
[圖2]為圖1所示判斷裝置的作為定量系統(tǒng)的核酸擴增測定裝置整體結(jié)構(gòu)的斜視圖。
[圖3]為圖2的核酸擴增測定裝置的平面略圖。
[圖4]為本發(fā)明一實施方式的判斷裝置中作為判斷系統(tǒng)的個人電腦CPU的轉(zhuǎn)移判斷流程。
[圖5]為實施例1算出的胃癌淋巴結(jié)組織中CK19mRNA未標準化的拷貝數(shù)顯示圖。
[圖6]為實施例2算出的胃癌淋巴結(jié)組織中CK19mRNA的標準化值的顯示圖。
[圖7]為實施例3算出的胃癌淋巴結(jié)組織中CK19mRNA的拷貝數(shù)顯示圖。
[圖8]為CK19mRNA定量值與轉(zhuǎn)移灶大小的關(guān)系圖。
[圖9]為CK19mRNA定量值與癌細胞數(shù)的關(guān)系圖。
[圖10]為CK19mRNA定量值與轉(zhuǎn)移灶大小的關(guān)系圖。
[圖11]為CK19mRNA定量值與癌細胞數(shù)的關(guān)系圖。
[符號說明] 1 癌轉(zhuǎn)移判斷裝置 101核酸擴增測定裝置 51 反應部 52 濁度檢測器 102電腦 102c 顯示器 102d CPU
具體實施例方式 在本發(fā)明第一實施方式中，轉(zhuǎn)移度只要是胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中能夠反映轉(zhuǎn)移程度或轉(zhuǎn)移灶狀態(tài)的東西均可，無特別限定。轉(zhuǎn)移度比如可以表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶大小或轉(zhuǎn)移灶中癌細胞數(shù)量。
淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)大小分為微轉(zhuǎn)移(小轉(zhuǎn)移)和大轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移灶長徑小于2mm時，稱為微轉(zhuǎn)移(Micro metastasis)。轉(zhuǎn)移灶長徑大于2mm時，稱為大轉(zhuǎn)移(Macro metastasis)。小于0.2mm的轉(zhuǎn)移灶稱為游離癌細胞(Isolated Tumor CellITC)。一般一診斷為大轉(zhuǎn)移，就要求摘除轉(zhuǎn)移灶。微轉(zhuǎn)移處于無法判斷轉(zhuǎn)移灶是否再增大的狀態(tài)。本發(fā)明的一實施方式能夠設定閾值，作為可識別微轉(zhuǎn)移和大轉(zhuǎn)移的數(shù)值。也可以根據(jù)轉(zhuǎn)移灶的大小設定多個閾值。
在本發(fā)明一實施方式中，作為所用標本可以例舉出含從胃癌患者身上采集的淋巴結(jié)組織的試樣。更具體地說，可以例舉出以生檢為目的采集的胃癌附近的淋巴結(jié)組織。
作為檢測試樣，只要可以定量標本中角蛋白19的mRNA即可，并無特別限定。比如混合標本與前處理液，對前處理液中的標本進行化學和/或物理處理，讓含在標本中的細胞中的mRNA移動(增溶)到溶液中，獲得mRNA?？梢砸源巳芤簽闄z測試樣。
作為前處理液只要是可溶解標本中所含細胞中的mRNA即可，無特別限定。比如可以緩沖液為前處理液。為了控制RNA的分解，最好緩沖劑為酸性。具體而言，pH的理想范圍為2.5～5.0，最好為3.0～4.0。為了使pH保持在這一范圍，可以使用公認的緩沖劑。作為緩沖劑具體名稱，可以列舉出甘氨酸-鹽酸緩沖劑等。緩沖劑的濃度只要能夠讓緩沖劑pH保持在上述范圍內(nèi)即可，無特別限定。
前處理液里最好含有表面活性劑。用表面活性劑破損細胞膜和核膜。通過這種破損，細胞中的核酸更易移到溶液中。對表面活性劑的種類沒有特別限制，只要有這種作用即可，不過最好為非離子型表面活性劑，以聚氧乙烯類非離子型表面活性劑為好。
特別以如下通式所示聚氧乙烯類非離子型表面活性劑最為合適 R1-R2-(CH2CH2O)n-H (在此，R1是碳原子數(shù)10～22的烷基、鏈烯基、炔基、異辛基；R2是-O-或-(C6H4)-O-；n為8～120的整數(shù))。比如可以使用聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蔻醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯異辛苯酚醚等。其中具體地說以Brij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)為宜。前處理液中的表面活性劑濃度0.1～6％(v/v)為宜，1～5％(v/v)更好。
用后述核酸擴幅法定量mRNA時，該前處理液最好添加二甲亞砜(DMSO)。淋巴結(jié)中有時含有阻礙核酸擴幅中的酶反應的物質(zhì)(阻礙物質(zhì))，通過DMSO的作用可以有效地減少阻礙物質(zhì)的影響。DMSO還有抑制核擴增酶的活性降低的作用。作為前處理液中的DMSO濃度，以1～50％(v/v)為宜，5～30％(v/v)更好，最好是10～25％(v/v)。
通過使用上述前處理液，不必使用市場出售的提純試劑盒等進行普遍進行的核酸抽取和提純，就能夠便捷地制備出檢測試樣。
上述標本與前處理液的混合比例沒有特別限定，但對于1mg標本可以使用0.0001～0.005mL的前處理液。關(guān)于上述混合過程沒有特別限定，比如可以在室溫下進行標本與前處理液充分混合的時間。
在混合標本與前處理液中，最好在前處理液中破碎標本。作為破碎的方法，可以列舉出用均質(zhì)器均質(zhì)化、凍結(jié)融化等。作為均質(zhì)器，可使用在該領(lǐng)域中常用的東西，比如韋林氏攪切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器、杜恩斯均化器、弗氏壓碎器(French press)和超聲波破碎機等。破碎條件根據(jù)使用方法和裝置適當設定即可。
用上述方法破碎的破碎液通過離心分離、過濾器過濾、柱層析等一般使用的提純方法進行初提純，即可制備出檢測試樣。根據(jù)檢測試樣的狀態(tài)，也可用核酸提取法等方法進行再提純。
在本發(fā)明的一實施方式中，定量檢測試樣中的角蛋白19的mRNA可以用諸如核酸擴增法和DNA芯片等眾所周知的方法。特別推薦使用核酸擴增法。
作為用于定量角蛋白19的mRNA的DNA芯片，可以使用固定了能與角蛋白19的cDNA雜交的多核甙酸及/或其片段的基質(zhì)。使用DNA芯片檢測RNA可以使用眾所周知的常用方法。比如可以如下進行先利用與存在于檢測試樣中的mRNA3’端的polyA序列結(jié)合的引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應。進行逆轉(zhuǎn)錄反應時，比如使用以Cy3和Cy5等熒光物質(zhì)標記的核甙酸合成經(jīng)熒光標記的cDNA。讓該cDNA與上述固定了多核甙酸的基質(zhì)接觸，則此多核甙酸和被標記的cDNA形成雙鏈。接著，測定cDNA的熒光即可定量角蛋白19的mRNA。
作為可用于定量角蛋白19的mRNA的核酸擴增法可以使用在核酸擴增反應前含逆轉(zhuǎn)錄反應的核酸擴增法、比如RT-PCR(ReverseTranscription PCR)法和RT-LAMP(Reverse Transcription LAMP關(guān)于LAMP法參照美國專利6410278號公報)法等眾所周知的核酸擴增法。更具體地說，可以制備含有上述檢測試樣、能夠檢出角蛋白19的引物和實施核酸擴增法用酶的反應液，用所得反應液進行核酸擴增，測定擴增后的cDNA。
在本發(fā)明的一實施方式中，引物也可作為引物液、作為一種試劑提供。引物溶液只要含有用以檢測角蛋白19的引物即可，并無特別限定。作為引物溶液，以引物在溶液中穩(wěn)定、易保存的為宜。
在本發(fā)明一實施方式中，用于實施核酸擴增法的酶也可以作為酶溶液、作為一種試劑提供。作為酶只要可以實施核酸擴增法即可，并無特別限定。作為酶溶液比如可以使用分別單獨調(diào)制RNA依賴型DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)和DNA依賴型DNA聚合酶(以下也稱為DNA聚合酶)制備的酶溶液或既含有逆轉(zhuǎn)錄酶又含有DNA聚合酶的酶溶液。從反應液調(diào)制的簡便性來看，尤以既含有逆轉(zhuǎn)錄酶又含有DNA聚合酶的酶溶液為宜。
逆轉(zhuǎn)錄反應和核酸擴增反應可以按照引物的序列等適當改變條件。逆轉(zhuǎn)錄反應和核酸擴增反應的條件可以使用比如Sambrook，J.etal.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York上記述的條件。
作為用于檢測角蛋白19的引物，如有可擴增角蛋白19的mRNA或cDNA的多核甙酸。其序列無特別限定，具體而言，可以舉出下列序列號所示的引物。另外，序列號1和2所示引物為適于RT-PCR的引物對，序列號5～10所示引物為適于RT-LAMP的引物對。
[RT-PCR的引物] 序列號15′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′ 序列號25′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′ [RT-LAMP的引物] 序列號5 5′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′ 序列號6 5′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′ 序列號75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′ 序列號85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′ 序列號95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′ 序列號105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′ 上述引物也可以用在該技術(shù)領(lǐng)域常用的技術(shù)進行修飾。上述引物的標記可以用放射活性元素或無放射活性分子進行。所用放射活性同位素可以列舉出32P、33P、35S、3H或125I。無放射活性物質(zhì)可以從生物素、抗生朊、鏈霉親和素或諸如地谷新配質(zhì)那樣的配體、半抗原、色素和諸如放射線發(fā)光性、化學發(fā)光性、生物發(fā)光性、熒光或磷光性試劑那樣的發(fā)光性試劑中選擇。
有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶和DNA聚合酶可以使用在該技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的東西。作為具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶如有AMV(Avian MyeloblastosisVirus)逆轉(zhuǎn)錄酶和M-MLV(Molony Murine Leudemia Virus)逆轉(zhuǎn)錄酶等。作為DNA聚合酶可以使用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶等。
通過測定上述核酸擴增生成的核酸擴增生物即可定量角蛋白19的mRNA。此時，推薦采用定量RT-PCR(Quantitative ReverseTranscription-PCR)和定量RT-LAMP(Quantitative ReverseTranscription-LAMP)等。采用這些方法，隨著核酸(cDNA)的擴增，反應液的光學狀態(tài)(濁度、吸光度、熒光強度等)會發(fā)生變化，因此，實時測定之，即可定量角蛋白19的mRNA。
作為RT-PCR的具體例子可以使用眾所周知的方法，比如Taqman(注冊商標)法和SYBR Green法(嵌合熒光法)預先在核酸擴增反應前的反應液中添加SYBR Green，實時測定擴增反應中隨著cDNA的擴增而增強的熒光強度。角蛋白19的mRNA定量值可以根據(jù)反應液的熒光強度達到一定值時所需要的循環(huán)數(shù)計算出來。
使用RT-LAMP時，隨著cDNA的擴增，作為副產(chǎn)品生成大量焦磷酸鎂。此焦磷酸鎂為非溶性，反應液會隨焦磷酸鎂的增加而變濁。因此，通過實時對反應液的濁度(或吸光度)進行光學測定即可定量角蛋白19的mRNA。另外，在RT-LAMP法中也可使用上述SYBRGreen法。角蛋白19的mRNA定量值可以根據(jù)反應液的濁度、吸光度、熒光強度等達到一定值所需時間(檢測時間)計算出來。
在本發(fā)明一實施方式中，作為判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的步驟，只要是可以根據(jù)上述檢測試樣中的角蛋白19mRNA的定量值絕對或相對地判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移即可，并無特別限定，但應該將角蛋白19的mRNA定量值與閾值相比較。
角蛋白19的mRNA定量值可以不管有無標準化處理，用于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷步驟，但是，最好不進行標準化處理，以角蛋白19的mRNA絕對量作為定量值使用。
在此，所謂標準化指將定量上述角蛋白19的mRNA所獲得的定量值換算為與含從胃癌患者身上采集的淋巴結(jié)組織的試樣即標本數(shù)量相應的值。更具體地說就是指用標本量或反映該量的信息、推薦用內(nèi)部標準、最好用管家基因的mRNA量或反映該量的信息除以定量上述角蛋白19的mRNA所獲得的定量值。
所謂管家基因指一般認為在大多數(shù)組織和細胞中都有一定量表達的基因。作為管家基因，可以舉出β-肌動朊、GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、β2微球蛋白和HPRT1(次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1)等基因。所謂反映管家基因的mRNA量的信息指用與角蛋白19同樣的方法定量管家基因時所得信息。
在本發(fā)明一實施方式中，標本的管家基因的mRNA測定值也可以作為判斷核酸擴增反應是否正確進行的質(zhì)控品使用，而不用于標準化。管家基因在幾乎各種細胞中均有表達，因此，如果檢測出管家基因的mRNA，就可認為癌標志物的核酸擴增反應也適當進行。另一方面，若沒有檢測出管家基因的mRNA，則可考慮由于酶失活等原因使核酸擴增反應沒有正確進行的可能性。
在本發(fā)明一實施方式中，所謂角蛋白19mRNA的絕對量指用于定量mRNA的檢測試樣中的角蛋白19mRNA的絕對量或反映該絕對量的信息。求絕對量時不進行上述標準化。用上述這種絕對量作為定量值，直接與預先設定的閾值進行比較，即可比經(jīng)標準化步驟更正確地判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
過去通過組織診斷判斷癌轉(zhuǎn)移的方法是先制作組織切片，經(jīng)染色等處理后進行鏡檢。但是，鏡檢方式的組織診斷只能檢查組織的一部分，一旦在不含癌細胞的部位切片的話，有可能漏過癌細胞。而通過分子檢查判斷癌轉(zhuǎn)移能夠使用從生物體采集的所有組織標本(或制作切片剩余的組織標本)，因此，與僅憑部分截面檢查的組織診斷不同，漏診的可能較小。
在本發(fā)明一實施方式中，閾值可以設定為低于已確認有胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性標本所含mRNA的定量值、高于已確認無胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陰性標本所含mRNA的定量值。最好預測數(shù)個陽性標本的mRNA定量值和數(shù)個陰性標本的mRNA定量值，將能以最高概率識別陽性標本和陰性標本的值設定為閾值。具體而言，當用定量RT-PCR法定量角蛋白質(zhì)19的mRNA時，閾值設為8～690個拷貝數(shù)為宜，用定量RT-LAMP法定量角蛋白質(zhì)19的mRNA時，閾值設為10～270個拷貝數(shù)為宜。
本發(fā)明判斷方法的判斷步驟是根據(jù)角蛋白19的mRNA定量值判斷上述胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的。比較角蛋白19的mRNA定量值與閾值，mRNA定量值比閾值高時可以斷定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽性，比閾值低時則斷定為陰性。通過取得這種判斷結(jié)果即可作為手術(shù)方式、切除范圍和術(shù)后治療方針等的決定指標。
mRNA定量值根據(jù)癌轉(zhuǎn)移度高低，與轉(zhuǎn)移灶大小和轉(zhuǎn)移灶所含癌細胞數(shù)量有關(guān)。因此，如上所述，根據(jù)mRNA定量值可以對淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)移灶進行定量測定和階段性測定。進行階段性測定時，將mRNA定量值與預設的數(shù)個閾值作比較。此時，最好至少有一個閾值(第一閾值)設定為可識別癌陰性和癌陽性。這些閾值根據(jù)癌和腫瘤標志物種類適當設定。即使在定量測定轉(zhuǎn)移灶時，也最好先用此第一閾值識別陰性和陽性，再對轉(zhuǎn)移陽性的病灶進行癌病灶定量測定。
在本發(fā)明一實施方式中，第一閾值可以設定為低于已確認有癌細胞存在的淋巴結(jié)(陽性標本)所含mRNA的定量值、高于已確認無癌細胞存在的淋巴結(jié)(陰性標本)所含mRNA的定量值。最好預先測定數(shù)個陽性標本的mRNA定量值和數(shù)個陰性標本的mRNA的定量值，以能夠概率最高地區(qū)分陽性標本和陰性標本的值作為閾值。
如要取得上述階段性信息，則除第一閥值外還使用第二閾值。比如預先設定上述第一閾值和可識別弱陽性和強陽性的第二閾值。當mRNA的定量值低于第一閾值時，可判斷實際上不存在癌病灶(即癌陰性)。當mRNA的定量值高于第一閾值、低于第二閾值時，可判斷存在較小癌病灶(癌弱陽性)。當mRNA的定量值高于第二閾值時，可判斷存在較大癌病灶(癌強陽性)。
淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移按大小分為微轉(zhuǎn)移(Micro metastasis)和大轉(zhuǎn)移(Macro metastasis)。轉(zhuǎn)移灶長邊不足2mm時稱為微轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移灶長邊超過2mm時稱為大轉(zhuǎn)移。不到0.2mm的轉(zhuǎn)移灶稱為游離癌細胞(Isolated Tumor CellITC)。一般診斷為大轉(zhuǎn)移，則需要摘除轉(zhuǎn)移灶。微轉(zhuǎn)移則被認為處于無法判斷轉(zhuǎn)移灶是否會再變大的狀態(tài)。在本發(fā)明一實施方式中，上述第二閾值可以設定為能識別微轉(zhuǎn)移灶和大轉(zhuǎn)移灶的值。除第二閾值以外，還可以根據(jù)轉(zhuǎn)移灶大小設定數(shù)個閾值。
測定角蛋白19的mRNA的表達量可以測定淋巴結(jié)中癌細胞數(shù)和癌病灶的尺寸(面積、體積或質(zhì)量等)。即，淋巴結(jié)中的角蛋白19的mRNA表達量可以作為決定胃癌患者摘除淋巴結(jié)的范圍的指標。比如，如果檢查的淋巴結(jié)沒有大轉(zhuǎn)移灶，則不必進一步擴大摘除范圍。如果檢查的淋巴結(jié)中有大轉(zhuǎn)移灶，則有必要摘除更大范圍的淋巴結(jié)?，F(xiàn)在的病理診斷能夠切實檢出的2mm大轉(zhuǎn)移灶的，從道理上說，淋巴結(jié)直徑均為4mm以下。再大的淋巴結(jié)就有可能漏檢轉(zhuǎn)移灶。病理診斷與本發(fā)明的方法并用的話就可以降低漏檢轉(zhuǎn)移灶的可能性。
本發(fā)明的另一個實施方式胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷裝置包括定量系統(tǒng)，定量用從胃癌患者身上采集的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19的mRNA；判斷系統(tǒng)，根據(jù)上述mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明一實施方式中，對定量系統(tǒng)沒有特別限定，只要能夠從胃癌患者身上采集淋巴結(jié)組織制備檢測試樣，定量其中的角蛋白19mRNA即可。作為定量系統(tǒng)推薦能定量經(jīng)LAMP法和PCR法擴增的核酸的核酸擴增測定裝置。該核酸擴增測定裝置具有測定單元，用引物和核酸擴增酶擴增檢測試樣中的角蛋白19mRNA，測定所得核酸擴增產(chǎn)物。
在本發(fā)明一實施方式中，對判斷系統(tǒng)無特別限定，只要能夠根據(jù)上述定量系統(tǒng)定量的角蛋白19的mRNA定量值絕對或相對地判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移即可。作為判斷系統(tǒng)以通過比較定量值和預設的閾值來判斷癌轉(zhuǎn)移的為宜。定量值尤以檢測試樣中的上述角蛋白19mRNA的絕對量為宜。此裝置也可具備顯示所得判斷結(jié)果的顯示器。
在本發(fā)明一實施方式中，裝置還具有判斷轉(zhuǎn)移灶在淋巴結(jié)組織中的轉(zhuǎn)移度的判斷系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移度判斷系統(tǒng)可以與判斷癌轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移判斷系統(tǒng)分設，也可以是將二者功能集于一身的一個裝置。
胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷裝置的一實施方式如圖1～3所示。圖1為本發(fā)明一實施方式的判斷裝置的整體結(jié)構(gòu)斜視圖。圖2為圖1所示作為定量系統(tǒng)的核酸擴增測定裝置的整體結(jié)構(gòu)斜視圖。圖3為圖2所示核酸擴增測定裝置的平面略圖。
本發(fā)明某實施方式的判斷裝置如圖1所示，由核酸擴增測定裝置101和與該核酸擴增測定裝置連接能進行有線或無線通信、作為判斷系統(tǒng)的電腦(PC)102組成。
核酸擴增測定裝置101如圖2所示，包括分裝器件10、上樣單元20、吸嘴安裝單元30、吸嘴廢棄單元40、由5個反應檢測塊50a構(gòu)成的反應檢測單元50和用于向X方向和Y方向移動分裝器件10的移送器60。
分裝器件10如圖2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移動的旋臂11和與旋臂11相對可各自獨立向Z方向(垂直方向)移動的一對(二支)注射器12。
如圖2和圖3所示，上樣單元20從裝置前側(cè)開始依次有10個試樣管插孔21a～21j、一個酶試劑容器孔21k和一個引物試劑容器孔211。10個試樣管插孔21a～21j分5行2列排列。試樣管插孔21c和21d、試樣管插孔21e和21f、試樣管插孔21g和21h、試樣管插孔21i和21j分別從裝置里面向外依次置于上樣位置1、上樣位置2、上樣位置3和上樣位置4。
本實施方式中，正面左側(cè)的試樣管插孔21c、21e、21g和21i用于插裝有對預先切除的生物組織(淋巴結(jié))進行處理(勻質(zhì)化、過濾等)制作的溶解提取液(檢測試樣)的試樣管22，正面右側(cè)的試樣管插孔21d、21f、21h和21j插裝有上述試樣稀釋到10倍的稀釋試樣的試樣管23。
試樣管插孔21a用于放置裝陽性質(zhì)控品的容器24，該陽性質(zhì)控品用于確認應該擴增的核酸正常擴增；而試樣管插孔21b用于放置裝有陰性質(zhì)控品的容器25，該陰性質(zhì)控品用于確認不該擴增的核酸正常未擴增。
酶試劑容器插孔21k和引物試劑容器插孔211分別放置裝有用于擴增角蛋白19mRNA相應的cDNA(以下也簡稱為CK19)的核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19引物試劑的引物試劑容器27。
反應檢測單元50的各反應檢測塊50a如圖2和圖3所示，由反應部51、二個濁度檢測器52和閉合器件53(參照圖2)構(gòu)成。設置于各反應檢測塊50a的反應部51如圖3所示，有二個用于放置檢測池54的檢測池孔51a。各反應檢測塊50a從裝置里側(cè)向外依次排列于池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。
濁度檢測器52由置于反應部51一側(cè)基板55a上的由有465nm波長的蘭色發(fā)光二極管組成的發(fā)光二極管光源52a和配置于反應部51另一側(cè)基板55b上的光電二極管集光器52b構(gòu)成。各反應檢測塊50a分別配置了由一個發(fā)光二極管光源52a和一個光電二極管集光器52b組成一組的濁度檢測器52各二組。
檢測池54有裝試樣的二個池54a和蓋二個池54a的二個蓋54b。
移送器60如圖2所示，有向Y方向移送分裝器件10的直行向?qū)?1和球型螺桿62、驅(qū)動球型螺桿62的步進電動機63、向X方向移送分裝器件10的直行向?qū)?4和球型螺桿65、驅(qū)動球型螺桿65的步進電動機66。向X方向和Y方向移送分裝器件10是靠步進電動機63和步進電動機66分別轉(zhuǎn)動球型螺桿62和65實現(xiàn)的。
電腦102如圖1所示包括輸入設備鍵盤102a和鼠標102b、由監(jiān)視器組成的顯示器102c以及分析試樣測定結(jié)果的CPU102d。
下面參照圖1～圖3就本實施方式的判斷裝置1的運行過程進行說明。本實施方式的裝置如上所述，用RT-LAMP法對胃癌手術(shù)切除的淋巴結(jié)組織中的角蛋白19mRNA進行擴增，測定隨著擴增產(chǎn)生的焦磷酸鎂形成的白色沉淀物引起的渾濁度變化，以此定量角蛋白19的mRNA，將定量值與閾值比較，判斷癌細胞向該淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移的情況。下面就這種裝置進行說明。
預先對切除組織進行處理(如勻質(zhì)化、過濾等)，將由此制備的溶解抽取液(以下稱試樣)裝入試樣管22，將該試樣管22插入試樣管插孔21c～21j(參照圖2及圖3)。將裝有陽性質(zhì)控品的容器24和裝有陰性質(zhì)控品的容器25分別插入試樣管插孔21a和21b(參照圖3)。在酶試劑容器孔21k和引物試劑容器孔211分別放入裝有CK19擴增用核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19擴增用引物試劑的引物試劑容器27(參照圖3)。吸嘴安裝單元30設置2個各自收納36個一次性吸移管吸嘴31的托盤32。
核酸擴增測定裝置101一啟動，首先，分裝器件10的旋臂11被圖2所示移送器60從初始位置移到吸嘴安裝單元30后，分裝器件10的二個注射器12在吸嘴安裝單元30向下移動。于是，二個注射器12的頂端插入二個吸移管吸嘴31的上部開口處，從而自動裝上吸移管吸嘴31。當二個注射器12向上移動之后，分裝器件10的旋臂11向X方向移動，移向裝有引物試劑的引物試劑容器27的上方。位于引物試劑容器27上方的一個注射器12向下移動，吸移引物試劑后向上移動。分裝器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使另一個注射器12同樣位于引物試劑容器27的上方。然后另一個注射器12向下移動，同樣從引物試劑容器27吸移引物試劑后向上移動。如此，引物試劑容器27內(nèi)的CK19引物試劑被安裝在注射器12上的二個吸移管吸嘴31吸移。
引物試劑吸移后，二個注射器12都移到上面，分裝器件10的旋臂11被移送器60移向位于最里面(正對裝置的里側(cè))池位1的反應檢測塊50a上方。在最里面的反應檢測塊50a，二個注射器12向下移動，使裝在二個注射器12的二個吸移管吸嘴31分別插入檢測池54的二個池54a中，再用注射器12將CK19的引物試劑分別注入二個池54a中。引物試劑分裝后，注射器12向上移動。
二個注射器12分裝引物試劑后，向上移動，分裝器件10的旋臂11被移送器60向X方向移動，移到吸嘴廢棄單元40的上方。在吸嘴廢棄單元40的上方，吸移管吸嘴31被丟棄。具體而言，二個注射器12向下移動，使吸移管吸嘴31插入吸嘴廢棄單元40的二個吸嘴廢棄孔40a(參照圖3)。在此狀態(tài)下，分裝器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然后向上移動二個注射器12，吸移管吸嘴31上部的緣卡在槽40b下面，受到向下的力，從而吸移管吸嘴31自動脫離二個注射器12的嘴部，這樣，吸移管吸嘴31就被丟棄在吸嘴廢棄單元40。
接下來，以同樣的動作酶試劑從酶試劑容器26分注到上述池54a，再以同樣的動作將試樣從試樣管22和試樣管23分注到上述池54a。
引物試劑、酶試劑和試樣向上述池54a的吸移動作完成后，檢測池54的蓋54b閉合。當此閉合動作完成后，將檢測池54內(nèi)的液溫從約20℃加熱到約65℃，通過RT-LAMP反應對CK19mRNA相應的cDNA進行擴增。隨擴增生成的焦磷酸鎂形成白色沉淀物，用比濁法檢測該白色沉淀物。具體而言，用圖3所示發(fā)光二極管光源52a和光電二極管集光器52b檢測(監(jiān)測)擴增反應過程中檢測池54內(nèi)的濁度，進行濁度檢測。
試樣的濁度數(shù)據(jù)從核酸擴增測定裝置101實時傳送到電腦102。電腦102的CPU102d將試樣濁度與預設閾值進行比較，從而判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在此，還可同時判斷向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病灶大小。
在此，參照圖4就電腦102的CPU102d的處理過程進行說明。首先，在步驟S1，CPU102d從核酸擴增測定裝置101接收濁度數(shù)據(jù)。然后在步驟S2，CPU102d比較該濁度數(shù)據(jù)和預設閾值，以此判斷癌轉(zhuǎn)移為陽性還是陰性。在步驟S3，CPU102d將步驟S2判斷的結(jié)果傳送至顯示器102c。
[實施例] 本實施例就通過定量從胃癌患者采集的淋巴結(jié)組織中的CK19mRNA來判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法進行說明。
實施例1(用定量RT-PCR法判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移> (1)檢測試樣的制備 用組織學上認為有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(陽性淋巴結(jié))10個和組織學上診斷為沒有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(陰性淋巴結(jié))10個如下制備檢測試樣。
在各淋巴結(jié)(約50～600mg/個)中添加4mL含DMSO、pH3.4的處理液(含200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產(chǎn))和20％DMSO(和光純藥制))，用攪拌機勻質(zhì)化。將所得勻質(zhì)液以10,000×g、室溫下離心分離1分鐘，用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN公司制，產(chǎn)品號74014)從200μL上清中提取、純化RNA，得檢測試樣。
(2)定量CK19的mRNA 對如上從陽性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)制備的檢測試樣，采用實時PCR裝置(ABI PRISM(注冊商標)7000型熒光定量PCR儀，應用生物系統(tǒng)公司)用以下引物進行實時RT-PCR反應，定量CK19的mRNA。
實時RT-PCR使用RT-PCR試劑盒-Quanti Tect SYBR Green RT-PCR試劑盒(QIAGEN公司制，產(chǎn)品號204245)按照使用說明書進行，反應液的組成和反應條件如下 用于檢測CK19的引物 上游引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列號1) 下游引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列號2) 反應液 RNase free H2O 11.1μL 2×mastermix12.50μL 100μM上游引物(最終濃度500nM) 0.075μL 100μM下游引物(最終濃度500nM) 0.075μL QuantiTect RTmix0.25μL 檢測試樣1.00μL 合計25.00μL 反應條件 50℃、30分鐘 95℃、15分鐘 PCR以下工序重復40周期； 95℃、15秒 53℃、30秒 72℃、30秒。
求反應液熒光強度超過閾值(Threshold上述實時PCR儀配備的SDS軟件自動設定的值)時的PCR周期數(shù)，根據(jù)此PCR周期數(shù)算出mRNA拷貝數(shù)。結(jié)果如圖5所示。從圖5的結(jié)果得知，通過將閾值設定為每個檢測試樣350個拷貝數(shù)，即可對胃癌轉(zhuǎn)移得出與組織診斷的結(jié)果一致的判斷。
實施例2 測定上述檢測試樣中β-肌動朊的mRNA的量作為管家基因。測定方法同實施例1中對CK19的mRNA的測定。用于PCR的引物如下 用于檢測β-肌動朊的引物 上游引物5′-CCACACTGTGCCCATCTACG-3′(序列號3) 下游引物5′-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3′(序列號4) 用在此所得β-肌動朊mRNA的拷貝數(shù)除以實施例1所得CK19的mRNA拷貝數(shù)(進行標準化)，結(jié)果如圖6所示。從圖6的結(jié)果可以看出，用作為管家基因的β-肌動朊mRNA的拷貝數(shù)除以CK19的mRNA拷貝數(shù)，進行標準化，也可判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
從實施例1和2的結(jié)果可以看出，根據(jù)定量RT-PCR法定量CK19mRNA所得定量值可以判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。并得知，定量值以CK19mRNA的絕對量更能明確區(qū)分陽性標本和陰性標本。
實施例3(用定量RT-LAMP法診斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移> (1)檢測試樣的制備 用組織學上診斷為有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(陽性淋巴結(jié))7個和組織學上診斷為沒有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(陰性淋巴結(jié))8個，如下制備檢測試樣。
在各淋巴結(jié)(約50～600mg/個)中添加4mL含DMSO、pH3.4的處理液(含200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產(chǎn))和20％DMSO(和光純藥制))，用攪拌機勻質(zhì)化。將所得勻質(zhì)液以10,000×g、室溫下離心分離1分鐘，在20μL上清液中添加180μL處理液，得200μL檢測試樣。
(2)反應液的制備 混合以下各成份，制備13.97μL的反應液。
750mM TRIS緩沖液(pH8.0)1.00μl 10×Thermopol緩沖液(新英格蘭bioLaboratorie公司生產(chǎn))2.50μl 10mM dNTPs 2.00μl 100mM MgSO40.75μl 100mM 二硫蘇糖醇 1.25μl 2％ Tergitol(Sigma Aldrich Japan公司制)2.50μl H2O3.97μl (3)酶試劑的制備 混合以下成份制備3.04μL的酶試劑。
10U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(普洛麥格公司制)0.14μl 8U/μl Bst DNA聚合酶(新英格蘭bioLaboratorie公司制) 2.27μl RNase inhibitor(普洛麥格公司制)0.63μl (4)引物的制備 混合以下成份制備6.00μL的引物溶液。
80pmol/μl上游內(nèi)引物 1.00μl (序列號55′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′) 80pmol/μl下游內(nèi)引物 1.00μl (序列號65′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′) 5pmol/μl上游外引物1.00μl (序列號75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′) 5pmol/μl下游外引物1.00μl (序列號85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′) 60pmol/μl loop上游引物1.00μl (序列號95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′) 60pmol/μl loop下游引物1.00μl (序列號105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′) (5)RT-LAMP反應液的制備 制備由上述反應液、酶試劑和引物試劑構(gòu)成的RT-LAMP反應液。RT-LAMP反應液是以CK19mRNA為鑄模，用RT-LAMP法擴增cDNA的反應液。
(6)定量CK19的mRNA 將上述檢測試樣2μl添加到23μl RT-LAMP反應液，用實時濁度測定裝置(Teramecs公司制LA-200)進行核酸擴增的同時，實時測定作為核酸擴增副產(chǎn)品生成的非溶性焦磷酸鎂所造成的白濁。
測定從用RT-LAMP法擴增各檢測試樣中所含mRNA相應的cDNA到濁度達到0.1所需的時間(檢測時間)，根據(jù)此值，計算出CK19mRNA絕對量。結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，閾值設定為每個檢測試樣140拷貝數(shù)，即可使對胃癌轉(zhuǎn)移的判斷與組織診斷結(jié)果一致。
從實施例3的結(jié)果得知，定量RT-LAMP法也可以從CK19的mRNA定量值判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
從以上結(jié)果看，顯然根據(jù)角蛋白19的mRNA定量值可以得出有關(guān)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的正確判斷結(jié)果。本發(fā)明的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法不論用何種mRNA定量法、特別是何種核酸擴增法，均可有效判斷。
實施例4(定量RT-PCR法測定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶大小) 對從9名胃癌患者采集的11個淋巴結(jié)測定癌細胞數(shù)和CK19mRNA表達量。
(1)測定轉(zhuǎn)移灶大小并對癌細胞計數(shù) 從有胃癌(非充實低分化腺癌)轉(zhuǎn)移的11個淋巴結(jié)切出厚約10μm的切片，放在載玻片上。對該切片用抗CK19抗體和Envision試劑盒(均為DAKO公司產(chǎn)品)進行免疫組織化學染色。再用GS-710Calibrated Densitometer(Bio-Rad公司制)檢測該切片的癌細胞轉(zhuǎn)移灶大小(mm2)。用WinROOF(三谷商事株式會社)對癌細胞計數(shù)(細胞數(shù)/片)。
(2)定量CK19的mRNA 在上述(1)制作的切片鄰近處切取切片(厚約10μm)，用RNeasyMini試劑盒(QIAGEN公司制)提取RNA，制備RNA試樣。用此RNA試樣配制以下成份的反應液，通過TaqMan法計算出CK19mRNA的拷貝數(shù)(拷貝數(shù)/片)。TaqMan法的測定用TaqMan一步法RT-PCR混合試劑盒(TaqMan One-step RT-PCR Master Mix)和PRISM7700實時熒光PCR儀(Prism 7700 Realtime PCR system)(均為ABI(應用生物系統(tǒng)公司)產(chǎn)品)按照所附使用說明書進行。
反應液 RNase free H2O10.205μL TaqMan 2x Universal PCR混合試劑盒 12.5μL 40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix 0.63μL 100μM上游引物0.075μL 100μM下游引物0.075μL 9.7pmol/μL(終濃度200nm)TaqMan探針0.515μL 檢測試樣 1μL 合計 25.00μL 檢測CK19mRNA的引物序列和TaqMan探針的序列如下 上游引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列號1) 下游引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列號2) TaqMan探針5′-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3′ (序列號11) 此TaqMan探針5′端有6-羧基熒光素(FAM)，3′端有6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。
反應條件 48℃、30分鐘 95℃、10分鐘 PCR以下工序重復40周期； 95℃、15秒 60℃、1分。
圖8顯示了mRNA的定量值(拷貝數(shù)/片)與胃癌轉(zhuǎn)移灶大小的關(guān)系。圖9顯示了定量值與癌細胞數(shù)的關(guān)系。從圖8和圖9可以確認，mRNA的定量值與轉(zhuǎn)移灶大小和癌細胞數(shù)有關(guān)。因此，可以確認，定量淋巴結(jié)的CK19mRNA可以預測轉(zhuǎn)移灶的大小。
實施例5(用定量RT-LAMP法測定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大小) 對從9名胃癌患者采集的11個淋巴結(jié)測定癌細胞數(shù)和CK19mRNA表達量。
(1)測定轉(zhuǎn)移灶大小并對癌細胞計數(shù) 按照實施例4(1)所述方法，從有胃癌(非充分低分化腺癌)轉(zhuǎn)移的11個淋巴結(jié)制作厚10μm的切片，進行免疫組織化學染色。然后，按實施例4(1)所述方法測定這些切片的癌細胞轉(zhuǎn)移灶大小(mm2)。再按實施例4(1)所述方法對癌細胞數(shù)(細胞數(shù)/片)計數(shù)。
(2)定量CK19的mRNA 在上述(1)切取的切片鄰近處切取切片(厚約10μm)，用RNeasyMini試劑盒(QIAGEN公司制)提取RNA，制備RNA試樣。然后按實施例3所述方法制備反應液，實施RT-LAMP。
圖10顯示了mRNA的定量值(拷貝數(shù)/片)與胃癌轉(zhuǎn)移灶大小的關(guān)系。圖11顯示了定量值與癌細胞數(shù)的關(guān)系。從圖10和圖11可以確認，mRNA的定量值與轉(zhuǎn)移灶大小和癌細胞數(shù)有關(guān)。因此，可以確認，定量淋巴結(jié)的CK19mRNA可以預測轉(zhuǎn)移灶大小。
序列表
<110>希森美康
<120>胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cagatcgaag gcctgaagga20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cttggcccct cagcgtact 19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ccacactgtg cccatctacg20
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aggatcttca tgaggtagtc agtcag
<400>4
aggatcttca tgaggtagtc agtcag 26
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a
<400>5
ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a41
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g
<400>6
gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g41
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>tggtaccaga agcagggg
<400>7
tggtaccaga agcagggg 51
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>gttgatgtcg gcctccacg
<400>8
gttgatgtcg gcctccacg 19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>agaatcttgt cccgcagg
<400>9
agaatcttgt cccgcagg 18
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cgtctggctg cagatga
<400>10
cgtctggctg cagatga 17
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>設計的用作TaqMan探針的核苷酸序列
<400>11
cctcaataac acatacaact caaaa2權(quán)利要求
1. 一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法，包括
定量步驟，定量用疑有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA；
判斷步驟，根據(jù)所得所述mRNA的定量結(jié)果判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述判斷步驟包括根據(jù)mRNA的定量值判斷所述淋巴結(jié)組織中的轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移度的步驟。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)移度為轉(zhuǎn)移灶大小。
4. 權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)移度為轉(zhuǎn)移灶的癌細胞數(shù)。
5. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于在所述定量步驟用核酸擴增法定量所述角蛋白19的mRNA。
6. 權(quán)利要求5所述方法，其特征在于所述核酸擴增法為定量RT-PCR或定量RT-LAMP。
7. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述判斷步驟包括比較所述mRNA定量值和預定的閾值，當定量值低于閾值時，判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，當定量值超過閾值時，判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性。
8. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述mRNA定量值是所述檢測試樣中的所述角蛋白19mRNA的絕對量。
9. 一種胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷裝置，包括
定量系統(tǒng)，定量用疑有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA；
判斷系統(tǒng)，根據(jù)所得mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
10. 權(quán)利要求9所述裝置，還具備根據(jù)所得mRNA定量值，判斷所述淋巴結(jié)組織中轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移度的第二判斷系統(tǒng)。
11. 一種用于判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑盒，其包括，用來制備檢測試樣的淋巴結(jié)組織前處理液、含能檢出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于實施核酸擴增法的酶的酶溶液。
12. 權(quán)利要求11所述試劑盒，其特征在于所述前處理液為含有二甲亞砜的緩沖液。
13. 權(quán)利要求11或12所述試劑盒，其特征在于所述酶溶液含有RNA依賴型DNA聚合酶和DNA依賴型DNA聚合酶。
全文摘要
發(fā)明提供胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷方法、判斷裝置及其試劑盒。通過包括以下步驟的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷方法、基于該方法的判斷裝置及該方法所用試劑盒解決上述課題定量步驟，定量用疑有胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA；判斷步驟，根據(jù)所得上述mRNA的定量結(jié)果判斷胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
文檔編號C12M1/34GK101260428SQ20081000044
公開日2008年9月10日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月15日
發(fā)明者高田英基, 檜山佳代, 中林一樹, 大友泰裕 申請人:希森美康株式會社