專利名稱：與利什曼原蟲屬寄生蟲毒性相關(guān)的基因的制作方法
與利什曼原蟲屬寄生蟲毒性相關(guān)的基因本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?2813849.X、申請(qǐng)日為2002年6月17日、發(fā) 明名稱為"與利什曼原蟲屬寄生蟲毒性相關(guān)的基因"的發(fā)明專利申請(qǐng) 的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及抗利什曼病領(lǐng)域。本發(fā)明起于從碩大利什曼原蟲 (Leishmania major)的野生分離林中鑒定到一種基因，該基因編碼 的蛋白命名為L(zhǎng)mPDI，該蛋白具有兩個(gè)與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 潛在活性位點(diǎn)(Cys-Gly-His-Cys )序列相同的區(qū)域。LmPDI蛋白主 要在該寄生蟲毒性最強(qiáng)的分離林內(nèi)表達(dá)。首先，該蛋白可以成為一個(gè) 新的治療靶標(biāo)來(lái)發(fā)展抗利什曼病藥物，其次，該蛋白還可以作為一個(gè) 新的元素成為旨在保護(hù)人類及動(dòng)物宿主抗擊利什曼病的免疫原性制劑 以及可能地疫苗制劑的組成部分。影響上百萬(wàn)個(gè)體的利什曼病是一組異質(zhì)性疾病，這些疾病都是由 于宿主感染了利什曼原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲所致。這種感染的臨床表 現(xiàn)特征呈現(xiàn)高度多態(tài)性，包括無(wú)癥狀的感染，單純或復(fù)發(fā)性皮膚感染 形式(cutaneous form )，擴(kuò)散性或無(wú)變應(yīng)性皮膚感染形式，粘膜與皮 膚感染形式以及內(nèi)臟感染形式，如果不進(jìn)行特定的治療，該感染是致 命的。通常，根據(jù)該病的地理分布，利什曼病的每個(gè)種類或亞類都具 有特定的臨床表現(xiàn)，但是，這并不是絕對(duì)的規(guī)則。另外，在同樣的地 理區(qū)域，相同的寄生蟲物種可能引起不同嚴(yán)重程度的臨床表現(xiàn)。該感 染臨床表現(xiàn)的這種多樣性至少部分是由于寄生蟲毒性的多樣性引起 的。此寄生蟲在其生活周期中，在兩個(gè)階段之間交替有鞭毛的前鞭 毛體階段以及無(wú)鞭毛體(amastigote)階段，前者可在昆蟲栽體的消化道 內(nèi)觀察到，后者則存在于宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)。很難使用抗利什曼病藥 物，相當(dāng)重要的原因是這些藥物的毒性以及寄生蟲形成的日益頻繁的抗性(Lira， Sundar et al, 1999)。另外，近來(lái)開發(fā)的測(cè)試疫苗目前并 沒(méi)有顯現(xiàn)出預(yù)期的效力(Sharifi, FeKri et al, 1998; Khalil， El Hassan et al， 2000 )。未能找到控制利什曼病的方法的一部分原因是該寄生蟲傳播周期 的復(fù)雜性以及目前對(duì)于此寄生蟲生物知識(shí)的缺乏。在近十年中，已經(jīng) 鑒定了幾種在寄生蟲的傳染性及生物學(xué)中起重要作用的分子。對(duì)于表 面糖綴合體，特別是脂磷聚糖(LPG)的修飾與碩大利什曼原蟲和杜氏 利什曼原蟲(L. donovani)傳染性和毒性的改變有關(guān)(Beverley和 Turco, 1998); Desjardins和Descoteaux, 1998; Sacks, Modi et al, 2000; Spath， Epstein et al， 2000),而這似乎并不適用于墨西哥利什曼原蟲(L. mexicana ) (IIg 2000; Hg， Demar et al， 2001 )。與LPG的生物合成相 關(guān)的分子:磷酸甘露糖異構(gòu)酶(Garami and IIg， 2001), LPGl(Sacks， Modi et al， 2000; Spath, Epstein et al， 2000)， LPG2(Descoteaux, Luo et al， 1995)以及半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(De and Roy， 1999 )也與利什曼原蟲 毒性相關(guān)。最近還描述了一些其它的毒性因子。其中包括半胱氨酸蛋 白酶家族(Mottram， Brooks etal， 1998)，促分裂原活化蛋白(MAP)-激酶(Wiese， 1998 )， A2基因(Zhang和Matlashewski, 1997 )， 表 面糖蛋白gp63 ( Chakrabarty， Mukherjee et al， 1996 )， 動(dòng)質(zhì)體 (kinetoplastid )膜蛋白(KMP )國(guó)ll( Mukhopadhyay， Sen et al， 1998 )， 過(guò)氧化物歧化酶(Paramchuk， Ismail et al， 1997 )， trypanothione還原 酶(Dumas, Ouellette et al， 1997 )， 以及熱休克蛋白(HSP )家族的 某些成員(Hubel，Krobitschetal， 1997)。表征毒性因子可能對(duì)發(fā)展新的抗該病的藥物或疫苗具有重要意義。優(yōu)先篩選出與寄生蟲毒性相關(guān)的蛋白可以避免在危險(xiǎn)性較低的林 系中抗性的不必要出現(xiàn)，這種抗性隨后是可能傳給其它林系的。另夕卜， 導(dǎo)致對(duì)藥物產(chǎn)生抗性的目標(biāo)毒性蛋白的突變?cè)谀菚r(shí)也可以引起寄生蟲 毒性的降低或消除，從而具備一定的治療效果。在過(guò)去的幾十年間，使用了很多方法來(lái)研究利什曼原蟲寄生蟲的 毒性因子。這些方法均基于遺傳學(xué)研究，例如突變寄生蟲的互補(bǔ)(Ryan，Garraway et al， 1993; Descoteaux, Luo et al, 1995; Desjardins和 Descoteaux, 1997; Wiese， 1998 ),基因失效才支術(shù)的應(yīng)用(Titus， Gueiros-Filho et al， 1995; Mottram， Souza et al， 1996; Dumas， Ouellette et al， 1997; Hubel， Krobitsch et al， 1997; Mottram， Brooks et al， 1998 )，或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)進(jìn)行的對(duì)寄生蟲藥物抗性基因的分析(Cotrim， Garrity et al， 1999; Perez-Victoria, Perez-Victoria et al， 2001)。這些研 究鑒定了此寄生蟲生物學(xué)中幾種重要的基因，目前這些基因正在被確 i人為新藥物的乾(Selzer， Chen et al， 1997; McKerrow， Engel et al， 1999 )，或者作為靶用于開發(fā)及使用毒性減弱的突變體作為活疫苗 (Titus， Gueiros-Filho et al， 1995; Streit， Recker et al， 2001 )。必須指 出，到目前為止，幾乎所有已進(jìn)行的關(guān)于利什曼寄生蟲毒性的研究要 么是在經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后喪失了毒性的實(shí)驗(yàn)室克隆基礎(chǔ)上進(jìn)行的，要么 是在那些通過(guò)突變?cè)囼?yàn)、基因失效或基因過(guò)表達(dá)而被遺傳操作了的寄 生蟲基礎(chǔ)上進(jìn)行的。這樣，那些涉及在該條件下被鑒定基因的毒性的 結(jié)論很可能與傳播區(qū)域內(nèi)寄生蟲的天然致病性并不切實(shí)相關(guān)。為了研究寄生蟲毒性的分子基礎(chǔ)，避免與使用實(shí)驗(yàn)室林系相關(guān)聯(lián) 的方法學(xué)偏差，本發(fā)明人首先分離得到了具有不同毒性水平的碩大利 什曼原蟲(L)野生林。碩大利什曼原蟲(L. major)是人畜共患的皮 膚利什曼病(ZCL)的起因，在從毛里塔尼亞到蒙古的綿延廣闊區(qū)域 內(nèi)，該病在人類中流行。本發(fā)明人鑒定了從人類ZCL損傷處得到的碩 大利什曼原蟲分離抹，這些碩大利什曼原蟲分離林都是在同樣的傳播 季節(jié)得到的，它們對(duì)BALB/c敏感小鼠實(shí)驗(yàn)感染模型的致病性各不相 同(實(shí)施例l)。這種實(shí)驗(yàn)致病力的差異與體外生長(zhǎng)的差異相關(guān)，這反 映出這些野生型分離抹在生物學(xué)方面的差異。隨后使用"差異顯示"技術(shù)(Liang和Pardee, 1992; Liang， Bauer et al， 1995)，鑒定在完全不同的分離林之間差異表達(dá)的那些基因，所 述分離林通過(guò)它們?cè)贐ALB/c小鼠中的實(shí)驗(yàn)致病力而區(qū)分(兩個(gè)高毒 性的分離林以及兩個(gè)低毒性的分離株)。該技術(shù)可以在事先不了解基因 的序列的情況下，研究以不同水平表達(dá)的這些基因。然后鑒定出了三個(gè)在兩個(gè)毒性最強(qiáng)的分離林內(nèi)被優(yōu)先表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄物通過(guò)篩選碩大利什曼原蟲cDNA文庫(kù)得以完全表征。對(duì)該序列的分析 表明其與真核生物的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI， Erp60和 Erp72)具有同源性。根據(jù)下述理由命名這個(gè)新蛋白為L(zhǎng)mPDI:如同 PDI家族的其它成員，(i) LmPDI具有兩個(gè)CGHC活性區(qū)域，(ii) 該蛋白的N-末端區(qū)域含有一個(gè)潛在的信號(hào)序列，而C-末端區(qū)域含有一 個(gè)潛在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號(hào)(EEDL ); (iii )它能夠自身組織成寡聚結(jié)構(gòu)；(iv)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組蛋白能夠體外表達(dá)活性的PDI。另夕卜， 除上面提及的保守區(qū)域之外，在LmPDI和上述的其它PDI之間幾乎 沒(méi)有相似之處。實(shí)際上，PDI家族包括許多高度趨異的分子，其與分 泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白的成熟有關(guān)(Noiva 1999; Frand， Cuozzo et al， 2000 )。 PDI為多功能蛋白，其與表達(dá)的調(diào)控，保持，修復(fù)的復(fù)雜機(jī)制 相關(guān)；該蛋白能夠促進(jìn)構(gòu)象的改變從而保證只有正確折疊的蛋白質(zhì)才 能離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。除了酶的作用之外(還原和異構(gòu))，最近還發(fā)現(xiàn)PDI 具有其它的功能，包括陪伴分子活性，肽結(jié)合及細(xì)胞粘附(Ferrari 和Soling, 1999 )。重要的是，強(qiáng)調(diào)LmPDI主要在那些毒性最強(qiáng)的分 離林內(nèi)表達(dá)(實(shí)施例2)。總之，這些結(jié)果暗示LmPDI在利什曼原 蟲寄生蟲的天然毒性方面具有重要的作用，因此可以作為化學(xué)治療或 疫苗接種的新靶標(biāo)。另外，最近關(guān)于細(xì)菌PDI等價(jià)物(稱為DsbA， 二硫鍵)作用的 數(shù)據(jù)(Martin, 1995; Ostermeier， De Suiter et al， 1996 )提示了該蛋白 可能在不同微生物的致病性中的作用(Yu和Kroll， 1999 )。 DsbA基因 的失活能夠強(qiáng)烈地影響弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)的存活及毒 性(Yu， 1998; Yu， Edwards-Jones et al， 2000 )。 DsbA還參與霍亂弧菌(Vibrio cholerae )腸毒素的產(chǎn)生(Peek和Taylor, 1992; Yu， Webb et al，1992 )。 DsbA對(duì)致病性大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)物種的 致病性也十分重要在尿道致病性物種中，DsbA可催化菌毛蛋白的特 定陪伴分子蛋白形成二硫橋鍵(Zhang和Donnenberg， 1996 )。在致腸 病物種中，仍需要DsbA來(lái)穩(wěn)定及形成菌毛(Hultgren， Abraham et al，1993; Wang， Bjes et al， 2000 )。本申請(qǐng)第一個(gè)說(shuō)明了 PDI作為毒性因子在原生動(dòng)物寄生蟲中起重 要作用。LmPDI通過(guò)輔助其他因子的構(gòu)象改變和穩(wěn)定來(lái)發(fā)揮作用，這 些因子對(duì)利什曼原蟲寄生蟲的生物學(xué)及致病性是必要的。鑒定這樣的 因子對(duì)于從生物學(xué)角度更好地了解這種寄生蟲極為有利，而且對(duì)于發(fā) 展抗利什曼病的新型治療手段或疫苗也很有益處。這樣，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及與利什曼原蟲(Leishmania )毒 性相關(guān)的蛋白，其含有至少一個(gè)與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI) 蛋白的潛在活性位點(diǎn)(Cys-Gly-His-Cys)相同的位點(diǎn)。該蛋白優(yōu)選由 該寄生蟲本身編碼。特別地，本發(fā)明涉及碩大利什曼原蟲的LmPDI蛋白，其具有SEQ IDNO:2的序列，并涉及任何與LmPDI具有至少40%同一性，優(yōu)選 至少80%同一性的LmPDI功能性變體。在這里，我們將"LmPDI功能性變體"定義為在利用LmPDI 基因已被失活的碩大利什曼原蟲林所進(jìn)行的感染性試驗(yàn)中，能夠彌補(bǔ) LmPDI的蛋白。本文所述術(shù)語(yǔ)"感染性試驗(yàn)"指任何能夠評(píng)價(jià)通常與 毒性有關(guān)的寄生蟲生長(zhǎng)相關(guān)生物學(xué)特性的試驗(yàn)。尤其可以列舉下述三 種類型的試驗(yàn) 寄生蟲前鞭毛體形式在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，通過(guò)例如 實(shí)施例5第2點(diǎn)所述類型的技術(shù)測(cè)試； 感染體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞的能力，使用例如實(shí)施例6以及 Kebai'er等，2001所述技術(shù)測(cè)試；.通過(guò)感染敏感小鼠(例如BALB/c)，測(cè)試誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠利什曼病 的能力。該技術(shù)在例如實(shí)施例5第3點(diǎn)以及Kebai'er等人，2001年的 文獻(xiàn)中均有詳細(xì)描述。使用CLUSTAL W版本1.8軟件(Thompson J D， Higgins D G和 Gibson T J )或BOXSHADE版本3.21軟件(Hoffman K和Baron M ) 評(píng)價(jià)與LmPDI的同一性百分比，與幾個(gè)物種的PDI家族蛋白比較后， 得到LmPDI的同一性百分比在27%-36%之間(實(shí)施例2 )。第二方面，本發(fā)明涉及重組多肽，其含有至少一個(gè)具有上述定義的蛋白的IO個(gè)以上氨基酸的片段，并且如果與另一個(gè)多肽片段適當(dāng)?shù)厝诤系脑?，那么?dāng)對(duì)動(dòng)物施用該重組多肽時(shí)，所述重組多肽就能夠引發(fā)針對(duì)LmPDI表位的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還涉及如下重組多肽，其含 有至少一個(gè)具有上述定義的蛋白的IO個(gè)以上氨基酸的片段，并且如果 與另一個(gè)多肽片段適當(dāng)?shù)厝诤系脑挘敲丛撝亟M多肽就能夠被抗 LmPDI蛋白的抗體識(shí)別。在本文中，術(shù)語(yǔ)"多肽，，應(yīng)以其廣義理解，即，包括具有至少10 個(gè)(當(dāng)規(guī)定時(shí)可以更多)氨基酸的序列，其可以含有或不含有糖基化 部分或糖脂，而且不考慮其一級(jí)，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。上述本發(fā)明的重 組多肽中存在的LmPDI片段長(zhǎng)度可以多于15， 20, 30， 50或100個(gè) 氨基酸，或者更多。重組的或從被感染細(xì)胞純化得到的LmPDI以及本發(fā)明的多肽可 用于免疫人類或動(dòng)物宿主，以保護(hù)其遠(yuǎn)離利什曼病，或者產(chǎn)生并回收 抗LmPDI的抗體，如實(shí)施例2所述。本發(fā)明的一個(gè)特定重組多肽為L(zhǎng)mPDI-(His) 6蛋白，其具有SEQ IDNO:3的序列，如實(shí)施例2所述。本發(fā)明重組多肽的另一實(shí)例為L(zhǎng)mPDI片段與載體多肽形成的融 合蛋白，所述LmPDI片段含有至少一個(gè)LmPDI表位，而所述栽體多 肽有助于該LmPDI片段呈遞給免疫系統(tǒng)。它可以是全長(zhǎng)或部分 LmPDI與e-內(nèi)酰胺酶片段、或破傷風(fēng)或白喉變性毒素、或任何其它 來(lái)自病原性微生物(特別是寄生蟲、細(xì)菌或病毒起源的)的多肽形成 的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及編碼上述蛋白或多肽的核酸序列。優(yōu)選的 核酸序列包含編碼具SEQ ID NO: 1序列的LmPDI的序列或該序列的 片段，所述片段具有30或更多個(gè)核苷酸，優(yōu)選具有100個(gè)以上核苷酸， 并且其編碼的多肽含有至少一個(gè)LmPDI特征性表位。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列的核酸載體。例如，可以是質(zhì) 粒，粘粒，噬菌體或病毒。優(yōu)選本發(fā)明的栽體能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白或多肽。本發(fā)明的載體尤其能夠在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)LmPDI。本發(fā)明還涉及含有上述栽體的培養(yǎng)細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是細(xì)菌， 酵母，昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或任何其它類型細(xì)胞。該細(xì)胞可用于 表達(dá)并可能地生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或多肽，或者用于生產(chǎn)其后能夠在其 它的培養(yǎng)細(xì)胞類型中或體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明蛋白或多肽的載體。純粹為非 限制性地舉例說(shuō)明該細(xì)胞，可以例舉CHO、 VERO、 BHK21細(xì)胞和 昆蟲細(xì)胞作為能夠在本發(fā)明中體外使用的細(xì)胞類型。同樣地，BCG和 鼠傷寒沙門氏菌可以作為體內(nèi)使用的細(xì)胞例子。最后，重要的是注意 為疫苗接種目的向個(gè)體施用編碼上述多肽或蛋白的病毒載體，例如痘 苗病毒或DNA也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的一種特定細(xì)胞為細(xì)菌菌林LmPDI-XLn于2001年1月 31日保藏在國(guó)立微生物保藏中心[CNCM，保藏號(hào)為1-2621。該菌林 來(lái)自 XLl-blue MRF'細(xì)菌菌林，基因型為A (mrcA)183 △ (mcrCB國(guó)hsdSMR-mrr)173endAl s叩E44 thi國(guó)l recAl gyrA96 relAl lac[F， proABlacIqZ AM15 TnlO(Tetr)]，被質(zhì)粒pBK-CMV-LmPDI 轉(zhuǎn)化。該質(zhì)粒相應(yīng)于Stratagene(La Jolla， CA)出售的質(zhì)粒pBK-CMV, 在其EcoRI和Xho I限制性位點(diǎn)之間加入了來(lái)自LmPDI的cDNA。本發(fā)明還涉及能夠在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1的核酸序列特 異性雜交的核酸探針，該探針使得可以測(cè)定生物樣品中是否存在編碼 LmPDI的毒性基因。本文中，我們將"嚴(yán)格雜交條件"定義為這樣的條件在大約65 "C,在例如6XSSC， 0.5%SDS， 5X Denhanrdt， s溶液以及100ng/ml 變性的非特異性DNA的溶液中或者任何具有同等離子強(qiáng)度的溶液中 雜交，并且在65r，在例如具有至多0.2XSSC和0，l。/oSDS的溶液或 者任何具有同等離子強(qiáng)度的溶液中進(jìn)行洗滌步驟之后，兩個(gè)DNA分 子能夠特異性雜交的條件。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)待雜交序 列的長(zhǎng)度，其GC核苷酸含量以及任何其它參數(shù)，依照如Sambrook 等，2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition,Laboratory Press, Cold Spring Harbor， New York )描述的方案，改變 這個(gè)條件的嚴(yán)格性。在上述定義以及在本文中，術(shù)語(yǔ)"特異性"應(yīng)該以其在實(shí)驗(yàn)室中 通常所用的最廣泛含義進(jìn)行理解。這樣，如果在復(fù)雜混合物中，分子 A對(duì)于分子B的親合性顯著地高于分子A對(duì)混合物中其它分子的親合 性，以致通過(guò)分子A可以將分子B檢測(cè)出來(lái)，那么分子A即特異性地 識(shí)別分子B。本文所用的嚴(yán)格條件是這樣的條件，在此條件下能夠在從LmPDI cDNA合成的放射性標(biāo)記探針存在下，檢測(cè)出源自不同利什曼原蟲物 種的各種PDI，而不能檢測(cè)出源自宿主或其它微生物的PDI。例如，能夠在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: l序列特異性雜交的本 發(fā)明探針可以是這樣的當(dāng)使用所述標(biāo)記探針對(duì)來(lái)自感染了表達(dá) LmPDI的碩大利什曼原蟲林的細(xì)胞的DNA樣品進(jìn)行Southern印跡 時(shí)，印跡上會(huì)具有至少一條明顯不同的條帶，其密度高于其它條帶(非 特異性的)，而在同樣條件下，對(duì)來(lái)自未感染碩大利什曼原蟲的細(xì)胞的 DNA樣品進(jìn)行Southern印跡時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)這樣的條帶。另一方面，本發(fā)明涉及核苷酸引物，其允許從利什曼原蟲感染細(xì) 胞中特異性地?cái)U(kuò)增SEQ ID NO: 1的至少部分序列，這樣就使得可以 檢測(cè)生物樣品中是否存在編碼LmPDI的毒性基因。如果以未感染利 什曼原蟲的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)沒(méi)有導(dǎo)致任何序列被明顯擴(kuò)增，而 以含有SEQ ID NO: 1核苷酸序列的樣品進(jìn)行同樣的反應(yīng)卻導(dǎo)致所述 序列的至少一個(gè)片段被擴(kuò)增，那么該擴(kuò)增就稱為"特異性的"。如果有必要，上述的探針和引物可以被標(biāo)記和/或置于診斷試劑盒 內(nèi)，而這也是本發(fā)明的一個(gè)部分。如果能夠在利什曼原蟲感染過(guò)程中 確定LmPDI基因的存在以及可能地該基因的表達(dá)水平，例如確定使 用LmPDI抑制劑進(jìn)行的治療的寄生蟲性和/或機(jī)會(huì)致病性負(fù)栽 (parastic and/or opportunistic charge )， 可食fe是有利的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠特異性識(shí)別LmPDI的純化 抗體?？梢允菃慰寺』蚨嗫寺〉娜丝贵w，人源化抗體或動(dòng)物抗體。所述抗體可以使用實(shí)驗(yàn)部分所述的方法，在LmPDI親和性柱上進(jìn)行純 化。所述特異性的LmPDI抗體可以有很多應(yīng)用?？捎闷錂z測(cè)生物樣品中LmPDI的存在，例如以診斷利什曼病和/ 或確定使用LmPDI抑制劑治療利什曼病的可能性。這樣，本發(fā)明還涉及體外診斷引發(fā)利什曼病的寄生蟲感染的方法。 該方法可使用本發(fā)明的多肽或蛋白，或抗該蛋白的抗體進(jìn)行，或者使 用上述的探針進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)特定診斷方法包括以下步驟 將至少一個(gè)本發(fā)明的抗體與來(lái)自對(duì)象的生物樣品在能夠使所 述抗體和生物樣品中所含抗原性蛋白形成免疫復(fù)合物的條件下相接 觸，其中所述對(duì)象局部感染了引發(fā)利什曼病的寄生蟲； 檢測(cè)所述復(fù)合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法檢測(cè)復(fù)合物(酶促反應(yīng)， 熒光轉(zhuǎn)移等)。本發(fā)明的抗體可以以與上述探針或引物相同的方法被包含在診斷 試劑盒中。用于執(zhí)行上述方法的診斷試劑盒也是本發(fā)明的一部分。 以例舉的方式，所述試劑盒可以包含 至少一個(gè)本發(fā)明的抗體； 適于使被分析樣品中所含抗原性蛋白與所述抗體形成免疫復(fù) 合物的介質(zhì)； 使得能夠檢測(cè)到如此形成的復(fù)合物的試劑； 如果適當(dāng)?shù)脑?，?duì)照樣品?；蛘?，本發(fā)明的抗體可以構(gòu)成藥物的組成部分，所述藥物旨在用 于預(yù)防，減輕或治療特定利什曼病。本發(fā)明另 一 方面涉及含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核 酸序列和/或栽體和/或細(xì)胞的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物能 夠體外刺激單核的細(xì)胞的增殖，所述單核的細(xì)胞來(lái)自與利什曼原蟲寄 生蟲接觸過(guò)的個(gè)體。優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物能夠體外刺激來(lái)自與碩大利什曼原蟲接觸過(guò)的個(gè)體的單核的細(xì)胞增殖。在本發(fā)明免疫原性組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物具 有藥物學(xué)上可接受的用于人或動(dòng)物宿主給藥的制劑。本發(fā)明人已證明，LmPDI能夠在體外誘導(dǎo)來(lái)自與碩大利什曼原蟲 接觸過(guò)的個(gè)體的單核的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且這些細(xì)胞因子的表達(dá) 鐠與在Thl型免疫反應(yīng)中所觀察到的一致(實(shí)施例3 )。如上所述的免 疫原性組合物，由于當(dāng)其被施用給人或動(dòng)物宿主時(shí)能夠誘導(dǎo)Thl型免 疫反應(yīng)，因此構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核酸序列 和/或載體和/或細(xì)胞的疫苗組合物，所述疫苗組合物旨在保護(hù)人類或動(dòng) 物宿主免于利什曼病。優(yōu)選地，將本發(fā)明的疫苗組合物以藥學(xué)上可接 受用于人或動(dòng)物宿主給藥的方式配制。所述疫苗組合物可以是液體形式，皮下或肌肉內(nèi)注射到患者體內(nèi)， 或者可以是口服疫苗的形式，香骨劑形式，或者與本發(fā)明核苷酸序列 結(jié)合的顆粒形式，例如將DNA吸附到顆粒表面。后一種形式使得疫 苗可以使用基因槍來(lái)施用。應(yīng)當(dāng)注意本文所述的疫苗組合物劑型僅僅 為說(shuō)明性地例舉，而非限制其范圍。本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗組合物還可以含有一個(gè)或多 個(gè)與利什曼原蟲異源的抗原，和/或一個(gè)或多個(gè)編碼所述抗原的核酸序 列。因此本發(fā)明的組合物可以引發(fā)針對(duì)幾種不同病原體的免疫反應(yīng)， 如果適當(dāng)?shù)脑?，還可制成多元疫苗(polyvaccine )。接種方法以及活性劑的劑量必須與所用疫苗的類型以及待施用的 哺乳動(dòng)物相適應(yīng)?？估猜x的疫苗接種方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其包括給 人類或動(dòng)物宿主施用含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核酸序 列和/或栽體和/或細(xì)胞的組合物。確定利什曼原蟲毒性中LmPDI所起的作用還使得能夠啟動(dòng)新的 策略來(lái)鑒定活性分子，所述分子可用于抑制此寄生蟲的生長(zhǎng)。已經(jīng)顯 示能夠抑制PDI的分子一一例如桿菌肽或氯汞基苯磺酸(pCMBS )——可以抑制利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(實(shí)施例4)。因此， 本發(fā)明還涉及可以抑制碩大利什曼原蟲生長(zhǎng)的分子的篩選方法，包括 評(píng)價(jià)所述分子對(duì)LmPDI活性的抑制能力的步驟。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu) 酶通常具有多種活性，特別是氧化還原、異構(gòu)酶以及陪伴分子活性。 本發(fā)明的篩選方法可以涉及對(duì)LmPDI任何功能的抑制。在本發(fā)明的一個(gè)特定篩選方法中，對(duì)分子抑制LmPDI活性的能 力的評(píng)價(jià)步驟是在用于使變性的RNaseA ( scrambled RNase A )再活 化的試驗(yàn)中進(jìn)行的，包括下述步驟 在允許變性RNase A再活化的條件下，在LmPDI存在下，孵 育此變性RNaseA; 加入受試分子，在與允許變性RNase A被LmPDI再活化的條 件相同的條件下，孵育此RNaseA; 將存在受試分子和不存在受試分子時(shí)所獲得的結(jié)果相比較，當(dāng) 存在受試分子時(shí)RNase A再活化的差錯(cuò)說(shuō)明所述分子具有LmPDI抑 制活性。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何其它的PDI活性試驗(yàn)，特別 是按照Lyles和Gilbert(1991)所描述的原始方案改進(jìn)的試驗(yàn)。本發(fā)明的篩選方法還可以包括用于抑制碩大利什曼原蟲在液體培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)的試驗(yàn)，以及如果合適的話，用于抑制碩大利什曼原蟲在 利什曼病實(shí)驗(yàn)鼠模型中生長(zhǎng)的試驗(yàn)。這種方法的實(shí)例在實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施 例5中描述。按如上定義的方法所篩選出來(lái)的活性分子具有抑制或調(diào)節(jié)碩大利 什曼原蟲生長(zhǎng)的特點(diǎn)。實(shí)施例4所示的用桿菌肽獲得的結(jié)果表明PDI抑制劑能夠抑制 利什曼原蟲的生長(zhǎng)。因此， 一種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 抑制劑在制備預(yù)防、減輕或治療利什曼原蟲感染的藥物組合物中的應(yīng) 用也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明可以使用的具有抗PDI活性的化合物 有例如抗PDI或抗LmPDI抗體，桿菌肽，桿菌肽鋅，5，5，-聯(lián)硫基雙 (2-硝基苯甲酸)(5，5'誦dithiobis (2-iiitrobenzoic) acid， DTNB ),對(duì)氯汞基苯碌酸(pCMBS )或tocinoic acid。根據(jù)上述應(yīng)用制備的組合物優(yōu)選局部地，口服地或通過(guò)腸胃外途 徑施用給人或動(dòng)物宿主。本發(fā)明的一個(gè)特定方面涉及桿菌肽或桿菌肽鋅作為引發(fā)利什曼病 的寄生蟲的生長(zhǎng)抑制劑、或作為抗利什曼原蟲感染的活性劑的應(yīng)用，很顯然，用于治療利什曼原蟲感染的、含有一種或多種蛋白質(zhì)二 硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑的藥物組合物是本發(fā)明的一部分。這樣的 組合物可特別地含有桿菌肽或桿菌肽鋅。該組合物可制備成局部施用 的制劑，例如霜狀，軟骨劑，香骨劑或噴霧劑，該例舉為非限制性的。 本發(fā)明人已證明，將這樣的組合物以香骨劑對(duì)BALB/c小鼠的寄生蟲 感染部位局部給藥后，能夠緩解疾病的發(fā)展(實(shí)施例9和圖14)。本發(fā)明還涉及治療利什曼原蟲感染的藥物組合物，其含有至少一 種針對(duì)LmPDI的特異性抗體和/或任何能夠抑制PDI活性的分子。這 樣的組合物優(yōu)選適于局部，口服或腸道外方式給藥。治療利什曼病的方法也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，所述方法包 括對(duì)人或動(dòng)物患病個(gè)體施用PDI或LmPDI抑制劑，不論該抑制劑是 抗體或任何其它類型的分子。下文的實(shí)施例及附圖描述了本發(fā)明所進(jìn)行的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，其目的 為提供所需的實(shí)驗(yàn)支持，而不是限制本發(fā)明的范圍。這些實(shí)施例和附 圖還以非限制性的方式說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案以及重要性的某些方 面。


圖l顯示對(duì)兩個(gè)毒性最強(qiáng)的分離林(94和67， V)和兩個(gè)毒性最 弱的分離林(32和07， v )內(nèi)碩大利什曼原蟲基因表達(dá)的差異顯示(DD ) 分析。圖1A顯示放射自顯影后測(cè)序凝膠的一部分，顯示使用隨機(jī)十聚 體引物以及寡聚dT引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。差異表達(dá)的CDNA由箭頭 標(biāo)出。pl4cDNA由星號(hào)標(biāo)出。圖IB顯示Northern印跡分析DD技術(shù)所鑒定出的基因在毒性最 強(qiáng)的分離林(94和67， V)和毒性最弱的分離林(32和07， v)內(nèi)的 表達(dá)。從處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的不同分離林前鞭毛體提取得到的mRNA與 放射性標(biāo)記的探針p14進(jìn)行了雜交。放射自顯影后，印跡先去雜交 (de-hybridized)再與碩大利什曼原蟲a-微管蛋白(oc -tub)基因的特異 性探針重雜交。圖2顯示LmPDI cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )及推導(dǎo) 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。以小寫字母表示的核苷酸代表非翻 譯域。18nt的前導(dǎo)序列(SL)以下劃線標(biāo)出，而用于多腺苷酸化信號(hào) 的潛在序列以方框標(biāo)出。肽信號(hào)的潛在序列以黑體標(biāo)出。LmPDI潛在 的活性位點(diǎn)以雙下劃線標(biāo)出，而使其停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能序列則以虛 線標(biāo)出。圖3顯示布氏錐蟲(Trypanosoma brucei) ( T. brucei， GenBank 登錄號(hào)P12865 ) ， Hypocrea jecorina(H. Jecorina， 074568)， Caemorhabditis elegans(C. elegans, 017908) ， Chlamydomonas reinhardtii(C. reinhard, 048949)，黃果錄(Drosophila melanogaster) (D. melano， P54399), Cryptosporidium parvum(C. parvum, Q27553)和人 類(H. sapiens, P072237 )的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶與LmPDI氛基酸序 列進(jìn)行的比對(duì)(alignment)。黑色方框內(nèi)的字母表示相同的氨基酸， 灰色方框表示類似氨基酸。導(dǎo)入了 "空位(gap)"來(lái)獲得比對(duì)序列之 間的最大相似性，并以短劃線標(biāo)出。使用兩套軟件程序進(jìn)行序列比對(duì) CLUSTAL W版本1.8; Thompson, J D， Higgins， D G和 Gibson, T J; BOXSHADE版本3.21; Hoffman, K和Baron, M。圖4顯示對(duì)重組LmPDI在再活化變性RNase( scrambled RNase ) 中所起作用的分析結(jié)果。25X:下，在含有4.5mM(cCMP)， lmM谷胱 甘肽GSH，0.2mM谷胱甘肽二石充化物(GSSH )，2mM EDTA和lOOmM Tris-HCL， pH 8的緩沖液中，在牛血清白蛋白(BSA ) (l.化M )的存在下，或在牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白(1.4fiM)的存在下，或在 重組LmPDI (1.4pM )的存在下，孵育變性的RNase A ( 8pm ) 30分 鐘，其中牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶作為 陽(yáng)性對(duì)照。在30分鐘內(nèi)，每5分鐘測(cè)定296nm下的RNaseA活性， 以此確定RNase A的再活化(Lyles和Gilbert, 1991 )。圖5A顯示對(duì)碩大利什曼原蟲基因中LmPDI基因拷貝數(shù)目的 Southern印跡分析結(jié)果。將8嗎分離自碩大利什曼原蟲94的基因組 DNA用下述限制性酶消化Aval, EcoRV，HindIII， Pstl， EcoRI， Xhol， NcoI，SacI， Sphl。標(biāo)有星號(hào)的酶在LmPDI cDNA上可酶切一次。圖5B顯示對(duì)不同利什曼原蟲物種中的LmPDI基因的Southern 印跡分析結(jié)果。將8pg分離自碩大利什曼原蟲(94)，嗜皮性嬰兒利什 曼原蟲(L. infantum MC ),嗜內(nèi)臟性嬰兒利什曼原蟲(L. infantum Vise);杜氏利什曼原蟲的基因組DNA用Pstl酶切。在這些試驗(yàn)中基 因組DNA與代表LmPDI整個(gè)eDNA序列的探針雜交。圖6顯示用不同抗LmPDI抗體制品對(duì)碩大利什曼原蟲中天然 LmPDI進(jìn)行的免疫檢測(cè)。將20pg前鞭毛體GLC 94的總蛋白在 Laemmli緩沖液(第1道)中或在0.5m DTT存在下(第2道)以及 在0.05ng產(chǎn)生自大腸桿菌并已純化的LmPDI ( rLmPDI)存在下(第 3道)進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并使用抗-LmPDI免疫 血清(第1道)或親合柱純化的抗-LmPDI抗體(第2、 3道)進(jìn)行顯 示。圖7顯示兩種毒性最強(qiáng)(94， 67, V)和兩種毒性最弱分離林(32， 7， v)前鞭毛體中LmPDI表達(dá)的Western印跡分析結(jié)果。將20嗎 來(lái)自不同分離抹的穩(wěn)定生長(zhǎng)期總前鞭毛體蛋白進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到 硝化纖維素膜上，在抗-LmPDI多克隆抗體的存在下孵育該膜。箭頭 (〉)指示由抗LmPDI的免疫血清所識(shí)別的3種蛋白。圖8顯示與LmPDI ( 5ng/ml)孵育后，來(lái)自在突尼斯人獸互傳性 皮膚利什曼病區(qū)域生活的個(gè)體的單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況。收集淋巴單 核細(xì)胞，用RPMI-PS/Glu培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)行3次離心(30ml—次，然后10ml兩次)以洗滌，之后計(jì)數(shù)并在存在或不存在5ng/ml LmPDI 的條件下以106細(xì)胞/ml的濃度孵育。培養(yǎng)5天后，加入氚標(biāo)記的胸苷， 評(píng)估對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用。結(jié)果以CPM表示。圖9顯示使用桿菌肽在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的寄生蟲(L. major) 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)的結(jié)果。其是針對(duì)在0， lmM, 1.5mM或2mM桿菌肽 存在下碩大利什曼原蟲前鞭毛體繪制的96小時(shí)生長(zhǎng)曲線。圖10顯示桿菌肽(BAC)，桿菌肽鋅(BACZn),對(duì)氯汞基苯甲 酸(pCMBA)以及tocinoic acid ( TOC )對(duì)重組LmPDI體外活性的 影響。使用不同濃度的抑制劑(0-2mM)跟蹤PDI抑制劑對(duì)LmPDI 體外再活化變性RNase A的能力的影響。使用無(wú)抑制劑時(shí)的LmPDI 作為陽(yáng)性對(duì)照(T)。圖ll顯示桿菌肽(BAC)(圖llA)，桿菌肽鋅(BACZn)(圖11B )， 5，5'-聯(lián)疏基雙(2-硝基苯曱酸)(DTNMB)(圖IIC)以及對(duì)氯汞基苯 甲酸(pCMBA)(圖11D)對(duì)利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中的體外生長(zhǎng) 的影響。使用不同濃度的抑制劑(0-5mM)跟蹤PDI抑制劑對(duì)寄生蟲 的體外增殖的影響。使用未經(jīng)抑制劑處理的寄生蟲作為這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照(T)。圖12顯示桿菌肽和桿菌肽鋅對(duì)于rLmPDI活性的抑制作用。體 外測(cè)定桿菌肽(BAC )和桿菌肽鋅(BACZn)對(duì)于rLmPDI活性的作用。 利用不同的BAC和BACZn抑制劑濃度(0-2mM)進(jìn)行試驗(yàn)，以此分 析其對(duì)rLmPDI體外再活化變性RNase A的能力的影響。未經(jīng)抑制劑 處理的rLmPDI活性作為陽(yáng)性對(duì)照。圖13顯示桿菌肽鋅對(duì)GCL94前鞭毛體增殖的抑制作用。體外測(cè) 定桿菌肽鋅(BACZn)對(duì)于GCL94前鞭毛體增殖的作用。使用不同抑制 劑濃度進(jìn)行試驗(yàn)，以此分析其對(duì)寄生蟲體外擴(kuò)增能力的影響。在不含 抑制劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的寄生蟲作為對(duì)照(C)。圖14顯示桿菌肽鋅對(duì)敏感BALB/c小鼠體內(nèi)疾病發(fā)展的影響，所 述小鼠已被GCL94分離林前鞭毛體所感染。用1(^個(gè)GCL94分離林 前鞭毛體感染敏感BALB/c小鼠的爪墊，并使用桿菌肽處理或不處理。該處理在感染后9周停止(箭頭表示處理終止)。每條曲線顯示單個(gè)小 鼠在大小上的變化。實(shí)施例下述實(shí)施例所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是使用以下材料及方法獲得的 寄生蟲和培養(yǎng)條件研究中所用的碩大利什曼原蟲(L major)分離林來(lái)自人ZCL病 變傷口，該傷口是在實(shí)施例1所述研究中獲得的。26"C下，使用NNN 培養(yǎng)基(以瓊脂糖和兔血為基礎(chǔ)制備的固體培養(yǎng)基)培養(yǎng)寄生蟲，逐 步轉(zhuǎn)移到含有2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100jLig/ml鏈霉素 和10%滅活胎牛血清的RPMI( SIGMA， St Louis， MO )(完全培養(yǎng)基) 上。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前鞭毛體在恒定體積的完全培養(yǎng)基中調(diào)整到106 寄生蟲/ml濃度，26n孵育。4-6天后達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，寄生蟲密度為 3xl0:8xl(^個(gè)寄生蟲。使用這些穩(wěn)定生長(zhǎng)期的前鞭毛體進(jìn)行RNA和 蛋白的提取。RNA提取及差異顯示使用"TRIZOL"試劑(Gibco-BRL)提取總RNA。根據(jù)制造商說(shuō) 明書，使用"poly A+RNA分離試劑盒"(Amersham-Pharmacia )，通 過(guò)寡聚dT/纖維素柱子純化poly A+ RNA。在含有l(wèi)pM寡聚(dT )uMN 引物(其中M-A或C或G， N-A或C或G或T(Genset) )， IX第一 鏈緩沖液(Gibco畫BRL)， 5nM dNTP(Amersham誦Pharmacia)， 10U RNAsin (Promega)以及200U逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL )的20|xl逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)中4吏用200ng mRNA。37"C孵育1小時(shí)后，95C孵育5分鐘以終止反應(yīng)。使用12個(gè)寡聚 dT和10個(gè)隨機(jī)十聚體的組合，通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA。 PCR反應(yīng)溶液 體積為20pl，含有2nl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，0.2nM5，引物，1(iM3'引物， 2jiMdNTP, 10|iCia35SATP, lXTaqDNA多聚酶反應(yīng)緩沖液和1U Taq聚合酶(Amersham-Pharmacia )。該反應(yīng)物在Perkin-Elmer 9600 熱循環(huán)儀上孵育40個(gè)循環(huán)94" 30秒，40'C 60秒以及72tl 30秒，再72t: 6分鐘一個(gè)循環(huán)。用6。/。丙烯酰胺測(cè)序凝膠分析PCR產(chǎn)物。 在Whatmann 3MM濾紙上真空干燥該凝膠，并放射自顯影。從凝膠 中切下差異表達(dá)的cDNA，洗脫，并在同樣的寡聚核苷酸存在下在上 述條件下再次PCR擴(kuò)增。使用平末端PCR克隆試劑盒(Amersham Pharmacia )，根據(jù)廠商說(shuō)明書，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMOSblue栽體中。 4吏用Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)測(cè)定克隆片段的 序列，并使用ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行分析。 Nothern印跡分析將200ng從處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的4抹碩大利什曼原蟲分離林前鞭毛 體所提取的mRNA變性，在1.2。/。瓊脂糖/2.2M甲醛凝膠上進(jìn)行分離， 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到"Hybond N+" ( Amersham-Pharmacia )膜上。然后80 r加熱2小時(shí)固定該核酸。使用Megaprime DNA標(biāo)記體系試劑盒 (Amersham-Pharmada )，用[oc 32PIdCTP標(biāo)記差異表達(dá)的cDNA片 段和a-微管蛋白。65。C下，在lXDenhardt， s/6X SSC/0.1% SDS/0.1 mg . ml"鮭魚精子溶液中，進(jìn)行雜交過(guò)夜。65C下，用含有0.1X SSC/0.1% SDS的溶液清洗該膜，并放射自顯影。構(gòu)建cDNA文庫(kù)以及對(duì)LmPDI cDNA的表征根據(jù)廠商說(shuō)明書(Stratagene )，在ZAPII載體中，利用5jig來(lái)自 毒性最強(qiáng)林(GCL94)前鞭毛體的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用 Megaprime DNA標(biāo)記體系試劑盒(Amersham-Pharmacia )， 用oc 32P]dCTP標(biāo)記p14探針，用該探針篩選6 x 1()6噬斑(lysis plaques)。 回收目的噬斑，并再次篩選，以此從污染克隆中分離出陽(yáng)性克隆。然 后對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。Southern印跡分析用圖5所示的限制性酶消化10網(wǎng)提取自毒性最強(qiáng)林GLC94前鞭 毛體的基因組DNA，并在0.6%的瓊脂糖凝膠上分析，然后轉(zhuǎn)移到 HybondN+ (Amersham-Pharmacia)膜上。在[a 32PdCTP放射性標(biāo) 記的、且與LmPDI的整個(gè)cDNA克隆相對(duì)應(yīng)的探針存在下，孵育該 膜。然后用含有0.1X SSC/0.1% SDS的溶液清洗該膜，并放射自顯影。重組蛋白LmPDI在大腸桿菌BL21細(xì)菌內(nèi)的表達(dá)及純化 將去除了信號(hào)肽編碼序列、相應(yīng)于LmPDI cDNA開放閱讀框的序 列(1371bp)克隆到細(xì)菌表達(dá)栽體pET-22b ( Novagen )中。在LB 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒(pET-22b-LmPDI)的大腸桿菌BL21細(xì) 菌，再用lmM異丙基-l-硫代-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)處理4小時(shí) 謙導(dǎo)重組蛋白的合成。在鎳(Ni2+)柱上(Amersham-Pharmacia )通 過(guò)親合層析純化重組蛋白LmPDI-(His)6 ( SEQ ID NO: 3)。通過(guò) SDS-PAGE證實(shí)制得的蛋白的純度。制備抗LmPDI多克隆抗體以及免疫印跡分析天然蛋白的表達(dá) 通過(guò)肌內(nèi)注射500jig純化重組蛋白LmPDI在弗式不完全佐劑 (IFA， Sigma)中的乳化液(v/v)以免疫兔子。再給兔子另外注射兩次 500ng重組蛋白。第一次是在最初注射后15天進(jìn)行的肌內(nèi)注射，而笫 二次是在30天后進(jìn)行的皮內(nèi)注射。最后一次注射后，釆取兔血10天，收集血清保存在-80t:。 ioox:下，將來(lái)自前鞭毛體的蛋白裂解物在Laemmli 1X緩沖液中變性10分鐘，加載在12%的SDS丙烯酰胺凝膠 上，并電轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上(Millipore)。室溫下將該膜孵育在飽 和PBS/0.1o/。Tween20/3。/。脫脂奶溶液中1小時(shí)，然后在4"C,用含有 1/1000稀釋的抗LmPDI抗體的相同溶液孵育過(guò)夜。在 PBS/0.1%Tween20中清洗3次后，室溫下，在偶聯(lián)了過(guò)氧化物酶的兔 抗-IgG 二抗(Amersham-Pharmacia，稀釋到1/1000)存在下賻育該 膜1小時(shí)，之后在PBS/0.1%Tween20中清洗3次。使用"ECL系統(tǒng)" 試劑盒(Amersham-Pharmacia)，根據(jù)廠商說(shuō)明書，通過(guò)檢測(cè)過(guò)氧化 物酶的活性來(lái)測(cè)定蛋白抗體復(fù)合物。 制備變性的RNaseA將20mg純化的核糖核酸酶(RNase A )于室溫下置于pH 8.6且 含有0.15M DTT， 6M胍-HCl以及0.1M Tris-HCl的緩沖液中18小時(shí)， 使其變性，再通過(guò)0.01MHC1平衡的SephadexG-25柱進(jìn)行純化。在 275nm下，使用9200M"cm1的消光系數(shù)測(cè)定變性RNase A(scrambled RNaseA)級(jí)分的濃度。-80^0下將此級(jí)分保存兩周。重組LmPDI蛋白對(duì)RNase A的再活化作用25C下，在含有4.5mMcCMP， lmM谷胱甘肽GSH， 0.2mM谷 胱甘肽二石克化物GSSH， 2mMEDTA和100mMTris-HCl， pH8的緩 沖液中，在牛血清白蛋白(BSA) (1.—M)的存在下，或在牛蛋白質(zhì) 二石危鍵異構(gòu)酶蛋白(1.4pM)的存在下，或在重組LmPDI (1.4liM) 的存在下，孵育變性的RNaseA (8pm) 30分鐘，其中牛血清白蛋白 作為陰性對(duì)照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。如文獻(xiàn) (Lyles and Gilbert, 1991)所述，每5分鐘測(cè)定296nm下的RNase A 活性，以此確定RNaseA的再活化。實(shí)施例1:篩選具有不同毒性水平的碩大利什曼原蟲分離林本研究所用的碩大利什曼原蟲分離抹來(lái)自人ZCL病變傷口 ，該傷 口獲自1994-1995年在突尼斯南部E1 Guettar進(jìn)行的前瞻性研究期間 (Louzir, Melby et al， 1998 )。根據(jù)其在敏感型BALB/c小鼠感染試驗(yàn) 中的致病力，從19個(gè)分離抹中進(jìn)行挑選來(lái)自不同分離林的2乂106無(wú) 鞭毛體被注射到BALB/c小鼠后爪墊中，并在9周內(nèi)每周觀察傷口的 進(jìn)展。感染后5周，測(cè)定由寄生蟲抗原體外激活的淋巴結(jié)(lymphatic ganglia)單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IFN- y量。這些試驗(yàn)首先顯示了不同碩大利什曼原蟲分離林所誘導(dǎo)的疾病的 進(jìn)展有巨大差異，其次說(shuō)明了使用單個(gè)分離林能夠產(chǎn)生重現(xiàn)性結(jié)果。感染后5周，毒性最強(qiáng)的林體外誘導(dǎo)產(chǎn)生了最大量的IL-4和最低 水平的IFN-Y 。在BALB/c敏感型小鼠的感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校么T大利什曼原蟲感 染的臨床表現(xiàn)根據(jù)分離林的不同而有所變化，而用其中單個(gè)的分離林 感染則可以得到重現(xiàn)性結(jié)果，根據(jù)這些觀察結(jié)果，本發(fā)明人建立了這 樣的假說(shuō)當(dāng)比較毒性最強(qiáng)和最弱的分離林時(shí)，與毒性相關(guān)的那些基 因可能會(huì)被差異表達(dá)。已經(jīng)由其它作者描述過(guò)的與寄生蟲的毒性相關(guān) 的一組基因，包括LPG1， LPG2, KMP-ll， Cpc， Cpb， HsplOO, Gene B和gp63，其表達(dá)情況已通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和定量基因擴(kuò)增技術(shù) 進(jìn)行了初步分析。在對(duì)BALB/c小鼠表現(xiàn)出不同致病力的碩大利什曼原蟲分離林之間，該分析并沒(méi)有顯示出任何差異(Kebaier， Louzir et al， 2001 )。兩抹誘導(dǎo)重度損傷且快速發(fā)展的分離林MHOM/TN/94/GLC94 和MHOM/TN/94/GLC67 (分別為GLC94和GLC67 )代表毒性最強(qiáng) 的分離林，而兩林i秀導(dǎo)輕度試驗(yàn)癥狀的分離林MHOM/TN/94/GLC07 和MHOM/TN/94/GLC32 (分別為GLC07和GLC32 )代表毒性較弱 的分離林，它們被選擇出來(lái)，以繼續(xù)研究在不同林內(nèi)具有潛在不同表 達(dá)水平的毒性基因。實(shí)施例2:差異顯示技術(shù)鑒定碩大利什曼原蟲的新蛋白質(zhì)二疏鍵 異構(gòu)酶LmPDI，其參與天然寄生蟲毒性1-鑒定那些在碩大利什曼原蟲強(qiáng)毒性分離抹和弱毒性分離株內(nèi)差 異表達(dá)的基因首先，從兩林強(qiáng)毒性分離抹(GLC94和GLC67)和兩林弱毒性 分離林(GLC32和GLC07)的前鞭毛體純化mRNA，然后使用 Oligo(dT)nMN引物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中M-A或C或G， N=A 或C或G或T。該差異顯示試驗(yàn)過(guò)程中所用的引物為使用與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用相同的Oligo-dT引物以及10個(gè)隨機(jī)引物， 按科學(xué)文獻(xiàn)(Liang和Pardee, 1992; Liang, Bauer et al 1995; Heard, Lewis etal， 1996 )所述的，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)?？傮w而言，產(chǎn)生并分析了 60種引物組合。使用不同引物組合所產(chǎn) 生的擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分析，結(jié)果顯示來(lái)自碩大利什 曼原蟲不同分離林(強(qiáng)毒性和弱毒性)的基因約95。/。表達(dá)相同mRNA 并且表達(dá)水平相同。僅25個(gè)信使RNA在強(qiáng)毒性和弱毒性分離林之間 似乎差異表達(dá)(圖1A)。先從丙烯酰胺凝膠中分離出差異表達(dá)的cDNA， 然后使用與第一次PCR所用相同的引物組合再次擴(kuò)增，最后克隆到 pMOS載體中。對(duì)不同克隆測(cè)序后鑒定了其中一些。使用差異表達(dá)的14個(gè)片段作為探針，通過(guò)Northern印跡分析碩 大利什曼原蟲不同分離林的mRNA，結(jié)果顯示在14個(gè)分離林中，有3個(gè)克隆在強(qiáng)毒性和弱毒性分離林之間表現(xiàn)出差異表達(dá)。其中 一個(gè)克隆p14已經(jīng)用Northern印跡進(jìn)行鑒定。相應(yīng)于克隆p14的探針與約2.2kb 大小的轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交，與兩個(gè)弱毒性分離林相比，該轉(zhuǎn)錄物在 兩個(gè)強(qiáng)毒性分離株內(nèi)優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖1B)。這證實(shí)了由差異顯示技術(shù)獲 得的結(jié)果?？寺l4全長(zhǎng)被測(cè)序，該克隆為339bp。該片段核苷酸序 列與數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank和EMBL )內(nèi)的各序列之間比較后，未發(fā)現(xiàn)顯 著同源的序列。這可能是由于pl4克隆對(duì)應(yīng)著信使RNA的非翻譯3' 末端區(qū)域所致。2-克隆并分析p14全長(zhǎng)cDNA序列為分離得到相應(yīng)于pl4克隆的全長(zhǎng)cDNA序列，使用339bp片段 來(lái)篩選GLC94分離抹前鞭毛體的cDNA文庫(kù)。從^f皮分析的6X105f 組克隆中分離得到2個(gè)陽(yáng)性克隆。圖2顯示最長(zhǎng)克隆的核苷酸序列， 其為2094bp( SEQ ID NO: 1)。該克隆具有編碼477個(gè)氨基酸(aa )多 肽的開放閱讀框，所述多肽的理論分子量為52.4kDa，等電點(diǎn)為5.22。 該蛋白的N末端相應(yīng)于向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)送所需的潛在信號(hào)肽，20aa長(zhǎng)度。 非翻譯的5，區(qū)域含有一個(gè)利什曼原蟲特有的剪切前導(dǎo)序列，而非翻譯 的3'區(qū)域含有多聚A尾巴，其前邊即為潛在的聚腺苷酸化位點(diǎn)(圖2),該分離克隆的多肽序列與幾種物種的蛋白質(zhì)二石危鍵異構(gòu)酶家族蛋 白(PDI和Erp)具有27-36%的同一性(圖3)。另外，該蛋白在47-52 和381-386位殘基處含有兩個(gè)與PDI、 Erp和石危氧還蛋白家族蛋白的 潛在活性位點(diǎn)(Cys-GIy-His-Cys，或CGHC)相同的區(qū)域。C末端區(qū) 域在474-477位殘基處顯示出潛在的KDEL(EEDL)型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信 號(hào)，這說(shuō)明，如同PDI和Erp—樣，該蛋白可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。 這樣，P14就是一種來(lái)自碩大利什曼原蟲蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的 蛋白。其被命名為L(zhǎng)mPDI (圖2和3 )。為確定LmPDI是否具有大多數(shù)已描述的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶顯 示出的氧化還原酶巰基-二硫化物活性(oxido-reductase thiodisulfide activity),我們研究了重組蛋白LmPDI使變性RNase A復(fù)性的能力。 在大腸桿菌中合成重組LmPDI,然后純化，并用于再活化RNase A的體外試驗(yàn)。獲得的結(jié)果顯示LmPDI能夠恢復(fù)RNaseA活性，其再 活化作用的方式類似于牛PDI的，試驗(yàn)使用牛PDI作為對(duì)照(圖4)。為鑒定編碼LmPDI的基因的拷貝數(shù)目，本發(fā)明人使用"P標(biāo)記的 LmPDI cDNA片段作為探針，進(jìn)行了 Southern印跡類型的雜交。所 獲的結(jié)果基本上顯示出單一的帶，除了在LmPDI cDNA內(nèi)部帶有切割 位點(diǎn)的那些酶(圖5A)。因此，編碼LmPDI的基因很可能在碩大利 什曼原蟲基因組內(nèi)以單拷貝存在。另外，在受試的各種利什曼原蟲物 種(嗜皮性嬰兒利什曼原蟲(L. infantum MC )，嗜內(nèi)臟性(viscerotropic) 嬰兒利什曼原蟲(L. infantum Vise)和杜氏利什曼原蟲)中，LmPDI 基因似乎是保守的(圖5B)。3-LmPDI表達(dá)的免疫印跡分析為表征天然蛋白的表達(dá)，用大腸桿菌內(nèi)合成再通過(guò)親合層析純化 的重組LmPDI蛋白免疫兔子。通過(guò)免疫印跡，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所獲 的抗LmPDI多克隆抗體極有效地識(shí)別GLC94穩(wěn)定生長(zhǎng)期前鞭毛體裂 解物中預(yù)期大小(55kDa)的蛋白(圖6)。另外，還檢測(cè)到另兩種蛋 白。第一種蛋白分子量為105kDa，相應(yīng)于LmPDI的約2倍，第二種 蛋白的分子量為35kDa。為證實(shí)105kDa蛋白是否對(duì)應(yīng)于LmPDI二聚 體，在高濃度DTT(0.5mM)存在下，分析變性的GLC94前鞭毛體裂解 物。該條件下，抗LmPDI抗體未能檢測(cè)到105kDa蛋白。這些結(jié)果i兌 明LmPDI被組裝成寡聚物。35kDa蛋白似乎是污染物。事實(shí)上，親 合柱(Sepharose 4B-LmPDI )上純化的抗LmPDI抗體不再識(shí)別35kDa 蛋白(圖6)。為了比較毒性最強(qiáng)和毒性最弱的分離抹內(nèi)LmPDI的表達(dá)水平， 提取穩(wěn)定生長(zhǎng)期的前鞭毛體蛋白并定量。在12。/。聚丙烯酰胺-SDS凝 膠上分析5pg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用抗LmPDI抗體 進(jìn)行的Western印跡顯示LmPDI ( 55kDa )及其二聚體(105kDa) 在毒性最強(qiáng)的分離林內(nèi)表達(dá)更強(qiáng)烈(圖7)。相反，35kDa的污染蛋白 在各個(gè)受試株內(nèi)以同等方式表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明LmPDI的表達(dá)水平 和被研究分離林的致病力之間存在相關(guān)性。實(shí)施例3: LmPDI誘導(dǎo)有活動(dòng)性損傷或ZCL前驅(qū)癥狀的個(gè)體的 單核細(xì)胞體外增殖由于碩大利什曼原蟲LmPDI在寄生蟲感染階段會(huì)高度表達(dá)，因 此可以作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶標(biāo)。為證實(shí)該假說(shuō)是否中肯，通過(guò)獲自 有活動(dòng)性損傷或ZCL前驅(qū)癥狀的個(gè)體的單核細(xì)胞的增殖試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià) LmPDI誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。該研究通過(guò)37名El Guettar(突尼斯南部)居民進(jìn)行，針對(duì)這些個(gè) 體獲得了相對(duì)于寄生蟲全部抗原的細(xì)胞增殖試驗(yàn)(SLA, —種能夠顯 示與寄生蟲事前有接觸的試驗(yàn))結(jié)果。按下述將這些個(gè)體分組l組8名SLA試驗(yàn)陰性的個(gè)體；2組29名SLA試驗(yàn)陽(yáng)性的個(gè)體。通過(guò)Ficoll/Hypaque梯度離心(Pharmacia, Uppsala, Sweden )， 從外周血中分離出含有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的單核的細(xì)胞。結(jié)果(圖8)顯示對(duì)于免疫的個(gè)體有顯著增殖。將單核的細(xì)胞與同濃度的LmPDI孵育48小時(shí)，誘導(dǎo)PBMC培養(yǎng) 物上清液內(nèi)的細(xì)胞因子(IFN-P， IL-4)，使用人抗IL-4和抗IFN-P 單克隆抗體(Pharmingen, San Diego, CA )進(jìn)行ELISA檢測(cè)以評(píng)價(jià)這 些細(xì)胞因子。結(jié)果來(lái)自個(gè)體的小樣品。它們清楚地顯示在LmPDI刺激過(guò)的細(xì) 胞上清液中，不存在IL-4而存在顯著量的IFN-P。該結(jié)果顯示基本上是Thl型反應(yīng)，說(shuō)明LmPDI能夠作為抗利什 曼病的疫苗備選物質(zhì)。實(shí)施例4: PDI抑制劑的存在可以抑制液體培養(yǎng)基中碩大利什曼 原蟲的生長(zhǎng)桿菌肽是一種已知的PDI抑制劑。使用桿菌肽進(jìn)行的試驗(yàn)表明 終濃度為2mM的桿菌肽完全抑制了碩大利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基內(nèi) 的生長(zhǎng)(圖9)。這些試驗(yàn)在下述試驗(yàn)條件下進(jìn)行a)制備變性的RNaseA將20mg純化的核糖核酸酶(RNase A )于室溫下置于pH 8.6的 含有0.15M DTT， 6M胍-HC1以及0.1M Tris-HCl的緩沖液中18小時(shí)， 使其還原變性，再通過(guò)0.01M HC1平衡的Sephadex G-25柱進(jìn)行純化。 在275nm下，使用9200M"cnT1的消光系數(shù)測(cè)定變性RNase A級(jí)分的 濃度b -80匸下將這些級(jí)分保存兩周。b) 重組LmPDI蛋白對(duì)RNaseA的再活化作用25C下，在含有4.5mMcCMP， lmM谷胱甘肽GSH， 0.2mM谷 胱甘肽二硫化物GSSH, 2mM EDTA和lOOmM Tris-HCl, pH 8的緩 沖液中，在牛血清白蛋白(BSA) (1.4|uM)的存在下，或在牛蛋白質(zhì) 二石克鍵異構(gòu)酶(1.4^M)的存在下，或在重組LmPDI (1.4pM)的存 在下，孵育變性的RNase A ( 8pM ) 30分鐘，其中牛血清白蛋白作 為陰性對(duì)照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶作為陽(yáng)性對(duì)照。如文獻(xiàn)(Lyles and Gilbert, 1991)所述，每5分鐘測(cè)定296nm下的RNase A活性30 分鐘，以此確定RNaseA的再活化。c) 體外測(cè)試不同PDI抑制劑對(duì)于重組LmPDI的巰基-二硫化物氧 化還原酶活性的抑制作用對(duì)重組LmPDI進(jìn)行的巰基-二硫化物氧化還原酶活性 (thio-disulfide oxido-reductase activity)抑制試驗(yàn)的試驗(yàn)條件與"重組 LmPDI蛋白對(duì)RNase A的再活化作用"段所述的條件完全一致，除了 反應(yīng)在O.OlmM， O.lmM， 0.5mM，和2mM下述PDI抑制劑存在下 進(jìn)行 桿菌肽 桿菌肽鋅 對(duì)氯汞基苯甲酸(pCMBA)tocinoic acidd) 抑制寄生蟲(碩大利什曼原蟲)在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 為測(cè)定桿菌肽(BAC),桿菌肽鋅(BACZn)，對(duì)氟汞基苯甲酸(pCMBA )， 5，5'-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB )對(duì)利什曼原蟲 在液體培養(yǎng)基內(nèi)的體外生長(zhǎng)的影響，上述抑制劑以不同的濃度，即0mM， 0.05mM， O.lmM, 0.2mM, 0.5mM, lmM， 1.5mM， 2mM, 2.5mM，和5mM，加入到含有5%胎牛血清和2xl06/ml指數(shù)生長(zhǎng)期寄 生蟲的RPMI中。26X:孵育該寄生蟲，并在96小時(shí)內(nèi)，每24小時(shí)進(jìn) 行計(jì)數(shù)。在Mallassez單元(cell)上計(jì)數(shù)寄生蟲。實(shí)施例5:就其抑制碩大利什曼原蟲生長(zhǎng)的能力評(píng)價(jià)LmPDI抑制分子對(duì)于LmPDI在利什曼原蟲毒性中所起作用的評(píng)價(jià)可以開發(fā)出新 的策略來(lái)鑒定在利什曼病治療過(guò)程中有效的分子。桿菌肽之外的已知 具有抗PDI活性的分子可能能夠抑制該寄生蟲的生長(zhǎng)。在此提出了一 種評(píng)價(jià)分子抗利什曼原蟲的潛在有效性的方案實(shí)例?？煞秩齻€(gè)步驟評(píng)價(jià)已知分子的抗PDI活性或那些將要被新鑒定的 分子。第一個(gè)步驟中，體外測(cè)試該分子對(duì)大腸桿菌中合成的重組 LmPDI蛋白的作用。然后進(jìn)行抑制寄生蟲在液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)的試 驗(yàn)，最后利用利什曼原蟲的試驗(yàn)鼠模型試驗(yàn)這些分子。l-評(píng)價(jià)對(duì)重組LmPDI的抑制作用分析LmPDI的PDI活性的技術(shù)在實(shí)施例2和上面的材料和方法 部分已詳細(xì)描述。可使用同樣的技術(shù)，通過(guò)向反應(yīng)液中加入不同濃度 的潛在抑制劑來(lái)評(píng)價(jià)某個(gè)已知或待鑒定的PDI抑制劑的能力(使用 LmPDI分子模型)。將結(jié)果表示為相對(duì)于僅僅緩沖液的抑制作用百分 比。只保留那些具有明顯的且劑量依賴性的LmPDI抑制活性的分子。為了確定文獻(xiàn)中所述的各種PDI抑制劑是否能夠抑制LmPDI的 巰基-二硫化物氧化還原酶活性，以不同的濃度體外試驗(yàn)這些抑制劑阻 斷LmPDI的該酶活性的能力，所述LmPDI由大腸桿菌合成并已被純 化。抑制劑為 桿菌肽*桿菌肽鋅 對(duì)氯汞基苯甲酸(pCMBA )tocinoic acid結(jié)果如圖10所示，該結(jié)果表明O.OlmM pCMBA和2mM桿菌肽或桿菌肽鋅的存在就會(huì)完全抑制LmPDI的活性。與此相反，在所 采用的濃度下(該濃度能夠完全抑制人類PDI的活性)，tocinoic acid 似乎對(duì)于LmPDI的活性并沒(méi)有太大作用。
2-抑制寄生蟲(碩大利什曼原蟲)在液體培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。將試驗(yàn) 分子溶解在溶劑中，溶劑的適合性取決于其物理化學(xué)性質(zhì)(在水溶液 或有機(jī)溶劑中的溶解度)。所有試驗(yàn)中使用單獨(dú)溶劑作為對(duì)照。例如， 試驗(yàn)可以利用碩大利什曼原蟲GLC94分離林進(jìn)行。培養(yǎng)基的組分已 在上面給出(實(shí)施例2及材料和方法)。26'C孵育培養(yǎng)物，并定期重新 接種以使寄生蟲維持在穩(wěn)定生長(zhǎng)期。在某些試驗(yàn)中使用了無(wú)鞭毛體樣 階段的寄生蟲。這種情況下，離心穩(wěn)定生長(zhǎng)期的寄生蟲(前鞭毛體)， 將培養(yǎng)基替換為pH5.0且補(bǔ)充了胎牛血清(FCS)的Schneider Drosophila培養(yǎng)基。然后在35C, 5%<:02下孵育培養(yǎng)物。
碩大利什曼原蟲前鞭毛體生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn)是采用指數(shù)生長(zhǎng)期的寄 生蟲進(jìn)行的，將其初始濃度調(diào)整為106寄生蟲/1111完全培養(yǎng)基，在存在 或不存在各種濃度受試分子的條件下，在96孔培養(yǎng)板上以100nl/孔的 量孵育。26"C, 5% C02下孵育寄生蟲，并在96小時(shí)內(nèi)每24小時(shí)計(jì) 數(shù)。在Mallassez單元上進(jìn)行寄生蟲計(jì)數(shù)?；蛘呤褂醚?xì)胞計(jì)數(shù)器。 所有的測(cè)定均一式三份。以抑制濃度來(lái)確定分子的抑制能力，所述濃 度為與對(duì)照相比能夠?qū)⒓?xì)胞分裂降低50%的濃度(IC50 )。
使用Almar Blue作為生存/生長(zhǎng)指示劑，通過(guò)熒光測(cè)定試驗(yàn)評(píng)價(jià) 無(wú)鞭毛體生存力的降低。
為測(cè)定在(l-)段中所述的PDI抑制劑對(duì)寄生蟲體外生長(zhǎng)的抑制 能力，對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)。向含有2xl(^指數(shù)生長(zhǎng)期的寄生蟲/ml的RPMI 中加入不同量的抑制劑。26X:下孵育寄生蟲，并在96小時(shí)內(nèi)每M小 時(shí)計(jì)數(shù)。在Mallassez單元上進(jìn)行寄生蟲計(jì)數(shù)。所獲結(jié)果如圖11所示， 該結(jié)果顯示濃度分別為5mM， 2mM和0.5mM的桿菌肽、桿菌肽鋅 和PCMBA完全抑制了利什曼原蟲的生長(zhǎng)。與此相反，在所采用的濃 度下(該濃度能夠完全抑制人類PDI的活性)，5，5，-聯(lián)硫基雙(2-硝基 苯曱酸)(DTNB)似乎對(duì)于利什曼原蟲的生長(zhǎng)并沒(méi)有太大作用。3-測(cè)定預(yù)先選擇的抑制劑在碩大利什曼原蟲感染敏感型BALB/c 小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械男Я?。該體內(nèi)試驗(yàn)取決于受試分子的毒性和理化特 性?？梢杂?06穩(wěn)定生長(zhǎng)期的碩大利什曼原蟲前鞭毛體感染BALB/c 小鼠，并注射(50nl體積)到右后爪墊內(nèi)。使用游標(biāo)卡尺每周測(cè)量傷 口的直徑。
總的說(shuō)來(lái)，根據(jù)情況，可以使用三種治療方案
對(duì)于易擴(kuò)散且低毒或無(wú)毒的疏水分子，可使用不同的方案，以 不同的濃度，腹膜內(nèi)注射該產(chǎn)品。注射的頻率視該分子的生物利用率 和半衰期而定。所有試驗(yàn)中，該方案均在注射后9周末尾結(jié)束。
對(duì)于水溶性的且相對(duì)具有毒性的分子，可在傷口內(nèi)部通過(guò)至少 4次對(duì)硬化區(qū)的注射(通?？蓪⒒钚詣┝砍?0)來(lái)完成注射。
對(duì)于脂溶性分子，對(duì)試驗(yàn)傷口每周施用香骨劑進(jìn)行測(cè)試。
總之，不論受試產(chǎn)品的注射方式如何，可以進(jìn)行兩種類型的方案
注射寄生蟲后隨即開始的方案；
注射寄生蟲后4-5周才開始的方案，在該起始時(shí)間點(diǎn)上，損傷 已經(jīng)建立。
所有試驗(yàn)中，在方案結(jié)束后，處死小鼠并在注射位點(diǎn)以及引流損 傷的結(jié)中估計(jì)寄生蟲負(fù)荷。
實(shí)施例6:利什曼原蟲體外感染鼠巨噬細(xì)胞
從雌性BALB/c小鼠股骨或脛骨內(nèi)抽出骨髓并從中分離鼠骨髄巨 噬細(xì)胞(MBMM )。在多孔板上以1.5x103細(xì)胞/孔的量在500nl完全培 養(yǎng)基中培養(yǎng)MBMM。為刺激MBMM的生長(zhǎng)和成熟，向培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充 20%的L-929成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其作為巨噬細(xì)胞集落刺激因 子(MCSF)的來(lái)源。37n， 5。/oC02下培養(yǎng)6天后，去除培養(yǎng)基，清 洗MBMM，加入含有10%胎牛血清但不含L-929成纖維細(xì)胞條件培 養(yǎng)基的新鮮RPMI。通過(guò)差速離心法，從未潰爛的損傷中純化出傷口 內(nèi)的無(wú)鞭毛體，并使用錐蟲藍(lán)病毒染色計(jì)數(shù)。使用這些寄生蟲，以4 個(gè)寄生蟲/巨嗟細(xì)胞的終比例感染MBMM。加入寄生蟲后2小時(shí)，用 PBS洗滌巨噬細(xì)胞5次，以去除未被吞噬的無(wú)鞭毛體。然后在37匸，95%空氣和5% C02下孵育該培養(yǎng)物。在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn) 30min，及2， 24和72小時(shí)。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用PBS洗滌各孔，去除 覆蓋物，室溫下用乙醇固定被感染的巨噬細(xì)胞1小時(shí)。然后清洗該板 之后用Giemsa染色以追蹤感染。
在每孔中央計(jì)數(shù)被感染的巨噬細(xì)胞，在孔中央細(xì)胞分散良好，可 以容易地計(jì)數(shù)寄生蟲。在板的這種水平，寄生蟲/巨噬細(xì)胞的比例可以 高于4。
實(shí)施例7:通過(guò)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抑制劑抑制重組LmPDI的酶
活性
已有文獻(xiàn)描述了幾種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑(Ryser et al， 1994， Orlandi 1997， Mouetal， 1998)。其中，桿菌肽和桿菌肽鋅 是由枯草桿菌(Bacillus subtilis )和地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis )產(chǎn)生的多肽抗生素復(fù)合物。桿菌肽A是商業(yè)桿菌肽的主 要化合物，其為至少9種桿菌肽的混合物。該抗生素能夠抑制許多革 蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，還能夠抑制許多蛋白酶的活性，所述蛋 白酶如PDI,谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，木瓜蛋白酶以及神經(jīng)肽酶。這些蛋白 酶的大多數(shù)都在其活性位點(diǎn)具有半胱氨酸殘基。
第一步，本發(fā)明人檢驗(yàn)這些抑制劑的作用以驗(yàn)證它們體外改變重 組LmPDI (rLmPDI)酶活性的可能能力。
使用上述變性RNase技術(shù)(Lyles和Gilbert, 1991 )來(lái)說(shuō)明LmPDI 的活性。將20mgRNaseA(Amersham-Pharmacia)于室溫下置于pH 8.6的含有0.15M 二硫蘇糖醇，6M胍HC1以及0.1M Tris-HCl的緩沖 液中18小時(shí)，4吏其變性。再通過(guò)0.01M HC1平衡的Sephadex G-25 柱進(jìn)行純化，并在275nm下用分光光度法定量。
在基于谷胱甘肽的還原緩沖液中，PDI可以催化變性RNase復(fù)性 (Gilbert, 1998 )。以2，-3'-環(huán)胞苷單磷酸(cCMP )為底物，分光光度 法測(cè)定RNase活性的恢復(fù)。將8pM變性RNase，單獨(dú)或在1.4pM牛 血清白蛋白(BSA )或1.4|iM rLmPDI的存在下，與含有4.5mM cCMP， lmM還原型谷胱甘肽(GSH), 200 pM氧化型谷胱甘肽(GSSG ),2mM EDTA和lOOmM Tris-HCl, pH8的緩沖液混合。室溫下反應(yīng)30 分鐘。通過(guò)在反應(yīng)的半小時(shí)內(nèi)每5分鐘測(cè)定一次296nm下的吸光度來(lái) 記錄由RNase復(fù)性導(dǎo)致的cCMP水解。
在不同濃度桿菌肽(BAC 0.01mM-2mM)和桿菌肽鋅(BACZn, 0.01mM-2mM)的存在下，測(cè)定重組LmPDI ( rLmPDI)的活性。結(jié) 果如圖12所示。
這些結(jié)果顯示，桿菌肽和桿菌肽鋅具有類似的效果。在這兩種產(chǎn) 品存在下，O.lmM時(shí)觀察到了 50%抑制，在0.5mM下為700/。， 2mM 下為100%。抑制rLmPDI的這些濃度與文獻(xiàn)中描述的作為其它物種 PDI的抑制劑時(shí)的濃度相當(dāng)。
實(shí)施例8:在桿菌肽鋅存在下碩大利什曼原蟲前鞭毛體的體外生 長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)
本發(fā)明人隨后測(cè)試了桿菌肽鋅對(duì)碩大利什曼原蟲前鞭毛體的體外 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響。該研究中僅試驗(yàn)了桿菌肽鋅，首先是由于它對(duì) rLmPDI酶活性的抑制鐠與桿菌肽的相同，其次是由于桿菌肽與桿菌 肽鋅相比更加穩(wěn)定且毒性更低。
為此，在凝結(jié)的兔血清為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)GLC94分離林前 鞭毛體2天。然后將寄生蟲(2xl(^寄生蟲/ml)轉(zhuǎn)移到含有濃度為1， 1.5， 2.5mM的桿菌肽鋅BACZn的完全培養(yǎng)基中。將在不含有抑制劑 的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的前鞭毛體作為對(duì)照。通過(guò)在48， 72和96小時(shí) 計(jì)數(shù)寄生蟲來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果如圖13所示。
這些結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)桿菌肽鋅濃度為1.5mM時(shí)，寄生蟲的生長(zhǎng)被部 分抑制，而當(dāng)濃度為2mM和5mM時(shí)則被完全抑制，而濃度在lmM 時(shí)不起作用。因此，非常重要的是注意到，該分子能夠阻斷培養(yǎng)的碩 大利什曼原蟲寄生蟲的增殖。
實(shí)施例9:桿菌肽鋅存在下對(duì)BALB/c小鼠中碩大利什曼原蟲前 鞭毛體生長(zhǎng)的抑制作用
桿菌肽鋅已經(jīng)成為一種治療手段，桿菌肽鋅的可獲得性允許測(cè)試 其對(duì)BALB/c小鼠的碩大利什曼原蟲感染進(jìn)展的影響。用GLC94分離林處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的前鞭毛體(106前鞭毛體爪)感染小鼠后爪爪墊， 并用基于5mM或25mM BACZn (制備在凡士林中)的香骨處理。注 射寄生蟲后48小時(shí)開始施用藥骨，每天一次， 一周5天。以同樣的方 式感染小鼠并用凡士林處理作為對(duì)照。每周測(cè)量傷口的大小。結(jié)果如 圖14所示。
盡管是初步研究，但這些結(jié)果仍顯示當(dāng)以香骨劑形式在注射部 位局部使用桿菌肽鋅時(shí)，其能夠緩解BALB/c小鼠的疾病進(jìn)程。應(yīng)該 強(qiáng)調(diào)在處理組小鼠中，用5mM桿菌肽處理的3只小鼠中，有2只 出現(xiàn)損傷減輕，而用25mM桿菌肽處理的4只小鼠中，有2只出現(xiàn)損 傷減輕。由于BALB/c小鼠不能完全滅除寄生蟲，預(yù)期在終止治療后 會(huì)出現(xiàn)臨床疾病復(fù)發(fā)，即使是用于人類的治療方法(銻酸葡胺和 paramomycin)對(duì)于BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的疾病也幾乎無(wú)效，在 BALB/c小鼠中從未觀察到寄生蟲的完全消失。
因此，我們認(rèn)為L(zhǎng)mPDI可以作為抵抗利什曼原蟲的化學(xué)療法的 潛在靶標(biāo)，而且桿菌肽似乎對(duì)碩大利什曼原蟲具有潛在效力。
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1. 與利什曼原蟲(Leishmania)毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)，其包含至少一個(gè)與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI)蛋白質(zhì)的潛在活性位點(diǎn)相同的位點(diǎn)(Cys-Gly-His-Cys)。
2. 與利什曼原蟲毒力相關(guān)的利什曼原蟲蛋白質(zhì)，其包含至少一個(gè)與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI)蛋白質(zhì)的潛在活性位點(diǎn)相同的位點(diǎn)(Cys-Gly-His國(guó)Cys )。
3. 權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其特征在于它是碩大利什曼原蟲(Leishmania major )的LmPDI蛋白，具有SEQ ID NO: 2的序列，或者是與LmPDI具有至少40%同一性，優(yōu)選至少80%同一性的任何 LmPDI功能性變體。
4. 重組多肽，其含有至少一個(gè)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述蛋白的多于10個(gè)氨基酸的片段，當(dāng)對(duì)人或動(dòng)物宿主施用該重組多肽時(shí)，所述重組多肽能夠引發(fā)針對(duì)LmPDI的表位的免疫反應(yīng)。
5. 權(quán)利要求4的重組多肽，其特征在于，它是具有SEQIDNO: 3序列的LmPDI-(His )6蛋白。
6. 含有與另一多肽片段融合的權(quán)利要求4的重組多肽的融合蛋白，當(dāng)對(duì)人或動(dòng)物宿主施用該融合蛋白時(shí)，所述融合蛋白能夠引發(fā)針對(duì)LmPDI的表位的免疫反應(yīng)。
7. 編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸序列。
8. 權(quán)利要求7的核酸序列，其特征在于，其含有相應(yīng)于SEQ ID NO: 1第241-1674位核苷酸的編碼序列，或者所述序列的大小為100個(gè)或更多個(gè)核苷酸的片段。
9. 核酸載體，其特征在于其含有權(quán)利要求7或8的核酸序列。
10. 權(quán)利要求9的載體，其特征在于其為質(zhì)粒，粘粒，噬菌體或病毒。
11. 含有權(quán)利要求9或10的載體的培養(yǎng)細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求11的細(xì)胞，其特征在于其為細(xì)菌菌株LmPDI-XLu于2001年1月31日保藏在國(guó)立微生物保藏中心[CNCM， the National Collection of Microorganism Cultures]，保藏號(hào)為1-2621。
13. 在高嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO: 2核酸序列特異性雜交 的核酸探針在確定生物樣品中編碼LmPDI的毒力基因存在與否中的應(yīng)用。
14. 核苷酸引物，其特征在于其允許從利什曼原蟲感染細(xì)胞特異 性地?cái)U(kuò)增SEQ ID NO: 1序列的至少部分序列，由此允許確定生物樣 品中是否存在編碼LmPDI的毒力基因。
15. 純化的抗體，其特異性地識(shí)別LmPDI。
16. 免疫原性組合物，其含有權(quán)利要求l、 2、 3或6的蛋白質(zhì)和/ 或權(quán)利要求4或5的重組多肽，和/或權(quán)利要求7或8的核酸序列，和 /或權(quán)利要求9或10的栽體，和/或權(quán)利要求11的細(xì)胞，所述免疫原性 組合物能夠在體外刺激單核的細(xì)胞的增殖，所述單核的細(xì)胞來(lái)源于與 利什曼原蟲寄生蟲接觸過(guò)的個(gè)體。
17. 權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其能夠在體外刺激單核的細(xì) 胞增殖，所述單核的細(xì)胞來(lái)源于與碩大利什曼原蟲接觸過(guò)的個(gè)體。
18. 權(quán)利要求16或17的免疫原性組合物，其為對(duì)人類或動(dòng)物宿 主施用的藥學(xué)上可接受的制劑。
19. 權(quán)利要求16至18的免疫原性組合物，當(dāng)施用給人類或動(dòng)物 宿主時(shí)，其能夠誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答。
20. 免疫接種組合物，含有權(quán)利要求1， 2, 3或6的蛋白質(zhì)和/ 或權(quán)利要求4或5的重組多肽，和/或權(quán)利要求7或8的核酸序列，和 /或權(quán)利要求9或10的栽體，和/或權(quán)利要求11的細(xì)胞，所述免疫接種 組合物旨在保護(hù)人類或動(dòng)物宿主免患利什曼病。
21. 權(quán)利要求20的免疫接種組合物，其為對(duì)人類或動(dòng)物宿主施用 的藥學(xué)上可接受的制劑。
22. 權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)的免疫原性和/或疫苗組合物，還含有 利什曼原蟲的外源抗原和/或編碼利什曼原蟲外源抗原的核酸序列。
23. 能夠抑制碩大利什曼原蟲生長(zhǎng)的分子的篩選方法，包括評(píng)價(jià)所述分子抑制LmPDI活性的能力的步驟。
24. 權(quán)利要求23的篩選方法，其中，評(píng)價(jià)所述分子抑制LmPDI 活性的能力的步驟是在再活化變性RNaseA的試驗(yàn)中進(jìn)行的，所述試 驗(yàn)包括以下步驟 在允許變性RNaseA再活化的條件下，在LmPDI存在下，賻育 變性的RNase A; 加入受試分子，在與允許變性RNase A被LmPDI再活化的條件 相同的條件下，孵育變性的RNaseA;.將存在受試分子和不存在受試分子時(shí)所獲得的結(jié)果相比較，當(dāng) 存在受試分子時(shí)RNase A再活化的差錯(cuò)說(shuō)明所述分子具有抑制 LmPDI的活性。
25. 權(quán)利要求23或24的篩選方法，進(jìn)一步包括抑制碩大利什曼 原蟲在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的試驗(yàn)，如果合適的話，還包括抑制碩大利 什曼原蟲在利什曼病試驗(yàn)鼠模型中生長(zhǎng)的試驗(yàn)。
26. —種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑在制備旨在 用于預(yù)防、緩解或治療利什曼原蟲感染的藥物組合物中的應(yīng)用。
27. 權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中PDI抑制劑為抗PDI或抗LmPDI 的抗體，桿菌肽，桿菌肽鋅，5，5'-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)， 對(duì)氯汞基苯碌酸(pCMBS )或tocinoic acid。
28. 權(quán)利要求26或27的應(yīng)用，用于制備對(duì)人或動(dòng)物宿主進(jìn)行局 部、口服或腸胃外給藥的組合物。
29. 桿菌肽或桿菌肽鋅作為引起利什曼病的寄生蟲生長(zhǎng)的抑制劑 的應(yīng)用，或者作為抗利什曼病感染的活性劑的應(yīng)用。
30. 用于治療利什曼病感染的藥物組合物，其含有權(quán)利要求15 的抗體。
31. 權(quán)利要求30的組合物，其適于局部、口服或腸胃外給藥。
32. 用于治療利什曼原蟲感染的藥物組合物，其含有一種或多種 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑。
33. 權(quán)利要求32的藥物組合物，其含有桿菌肽或桿菌肽鋅。
34. —種體外診斷可引發(fā)利什曼病的寄生蟲感染的方法，其特征 在于其包括 將至少一種權(quán)利要求15的抗體與患者的生物樣品在允許所述抗 體和生物樣品中所含抗原性蛋白形成免疫復(fù)合物的條件下相接觸，其 中所述患者部分地感染了引發(fā)利什曼病的寄生蟲；.檢測(cè)所述復(fù)合物。
35. 用于實(shí)施權(quán)利要求34的方法的診斷試劑盒，其特征在于其含有 至少一種權(quán)利要求15的抗體； 適于形成與所述抗體的免疫復(fù)合物的介質(zhì)； 允許檢測(cè)所形成的任何復(fù)合物的試劑； .如果適當(dāng)?shù)脑挘瑢?duì)照樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗利什曼病領(lǐng)域。本發(fā)明從野生型碩大利什曼原蟲分離株中分離出了被稱為L(zhǎng)mPDI的蛋白編碼基因，該蛋白具有兩個(gè)與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)蛋白潛在活性位點(diǎn)序列(Cys-Gly-His-Cys)相同的區(qū)域。LmPDI蛋白主要在毒性最強(qiáng)的寄生蟲分離株內(nèi)表達(dá)。該蛋白可用于制備抗利什曼病藥物，可用于制備免疫原性組合物以及疫苗制劑，使人和動(dòng)物宿主免受利什曼原蟲感染。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101274960SQ200810001348
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2002年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月18日
發(fā)明者H·羅茲爾, K·德拉吉, M·喬尼克, 阿喬爾 Y·本 申請(qǐng)人:突尼斯巴斯德研究所;巴斯德研究所