專利名稱：用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包膜載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的安全、高效載體。具體地， 本發(fā)明涉及通過使用病毒或滅活的病毒，尤其滅活的HVJ(仙臺病毒)所制備 的基因轉(zhuǎn)移載體。而且，本發(fā)明所述基因轉(zhuǎn)移載體還可用于基因治療和大 規(guī)模(high throughput)篩查。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已開發(fā)了多種旨在用于基因治療的病毒性和非病毒性(合成的)基因 轉(zhuǎn)移方法(Mulligan，科學(xué)，260， 926-932 (1993)和Ledley,人類基因治療， 第6巻，1129-1144(1995))。 一般而言，病毒方法比非病毒方法能更有效地 將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。但病毒載體由于同時(shí)引入了親代病毒的基本基因元 件，以及病毒基因的滲漏表達(dá)，免疫原性，和對宿主基因組結(jié)構(gòu)的修飾， 使得它存在安全性方面的考慮。非病毒載體一般具有較少的細(xì)胞毒活性和 較小的免疫原性。但大多數(shù)非病毒方法的基因轉(zhuǎn)移效率(尤其在體內(nèi))低于某 些病毒載體。
因此，病毒載體和非病毒載體都既有限制又有優(yōu)點(diǎn)。因此必須開發(fā)體 內(nèi)應(yīng)用的高效、低毒性基因轉(zhuǎn)移載體，以便彌補(bǔ)其中一類載體系統(tǒng)的限制 又具有另 一 類系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。
另一方面，HVJ具有較高免疫原性，且已知可誘導(dǎo)CTL，特別是當(dāng)產(chǎn) 生大量NP蛋白時(shí)(Cole，G.A.等，免疫學(xué)雜志158， 4301-4309(1997))。也有 人擔(dān)心宿主的蛋白質(zhì)合成可能被抑制。
HVJ還有一個(gè)問題,當(dāng)使病毒融合蛋白經(jīng)離心或柱操作而純化以便在脂 質(zhì)膜上重建時(shí)，所產(chǎn)生的顆?？赡苡捎谥亟ǘゲ《镜钠渌鞍?主要是M蛋白),從而使要求融合活性的Fl與HN蛋白間的比率不能維持在與野生 型病毒相同的水平,導(dǎo)致較低融合活性。此外,由于融合蛋白在重建時(shí)插入脂 質(zhì)膜的方向不必與在野生型中 一樣，故可提呈某些未知抗原。
另有人報(bào)道了 一種通過添加新的分子而實(shí)施重建的方法(Uchida, T.等， 細(xì)胞生物學(xué)雜志80， 10-20, 1979)。但該方法存在失去原有病毒功能的高度 危險(xiǎn)，因?yàn)楹铣深w粒的膜組分本質(zhì)上不同于天然病毒顆粒的膜組分。
涉及將基因或蛋白包入脂質(zhì)體并將其與滅活的HVJ融合而產(chǎn)生融合顆 粒(如在傳統(tǒng)HVJ-脂質(zhì)體中 一樣)的方法已能將非侵襲性或非毒性基因轉(zhuǎn)移 至培養(yǎng)的細(xì)胞或體內(nèi)組織中。該項(xiàng)技術(shù)在世界各地頻繁用于動(dòng)物試驗(yàn)中 (Dzau, V. J.等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，93, 11421-11425 (1996)和Kaneda, Y. 等，今日分子醫(yī)學(xué)，5, 298-303(1999))。但已有人發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)技術(shù)的缺陷例 如，由于須制備兩種不同載體，即病毒和脂質(zhì)體，該方法可能比較復(fù)雜； 由于與脂質(zhì)體融合而致使平均直徑比病毒顆粒大1.3倍的那些顆粒，它們的
融合活性為病毒的10%或更低。此外，就某些組織而言，基于傳統(tǒng)HVJ的載體可能不能獲得任何基因 轉(zhuǎn)移，或如果可以，效率也極低。這表明，根據(jù)傳統(tǒng)方法可用于基因治療 的組織很有限。
有需要開發(fā)一種用于人類基因治療的病毒性載體，其可安全、高效、 并簡單地制備，還能將基因轉(zhuǎn)移至廣泛多種體內(nèi)組織中。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是開發(fā)一種安全、高效、且簡單的基于病毒 的基因轉(zhuǎn)移載體，其可應(yīng)用于廣泛多種培養(yǎng)細(xì)胞或體內(nèi)組織，它克服了傳 統(tǒng)重建型HVJ載體方法或HVJ-脂質(zhì)體方法的缺點(diǎn)。
發(fā)明公開
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種安全、高效的利用滅活病毒的基因 轉(zhuǎn)移載體。滅活病毒(其中病毒的基因組已被滅活)不能復(fù)制病毒蛋白，因此
比較安全并具有低細(xì)胞毒性和低抗原性。通過將基因包入病毒包膜載體這 種利用滅活病毒的基因轉(zhuǎn)移載體，可制備一種安全、高效、且簡單的用于 培養(yǎng)細(xì)胞或體內(nèi)組織的基因轉(zhuǎn)移載體。
在本發(fā)明另 一方面中，提供一種能將基因轉(zhuǎn)移至很多種體內(nèi)組織中的 病毒包膜載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所用病毒是HVJ?？衫帽景l(fā)明之病毒包膜載體獲得體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的組織的實(shí)例有，但不限于肝臟、骨胳肌、
子宮、腦、眼、頸動(dòng)脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎臟、脾臟、癌組織、
神經(jīng)、B淋巴細(xì)胞、以及呼吸道組織。
在本發(fā)明另 一方面中，提供簡單實(shí)現(xiàn)(realizing)向懸浮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移 的方法。利用本發(fā)明病毒包膜載體向懸浮細(xì)胞實(shí)施基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)選方法實(shí) 例包括，在有硫酸魚精蛋白的條件下使懸浮細(xì)胞與病毒包膜載體混合，并 使混合物離心的基因轉(zhuǎn)移方法。
在本發(fā)明另一方面中，通過利用本發(fā)明的能在短時(shí)間內(nèi)包容大量基因 的基因轉(zhuǎn)移載體實(shí)現(xiàn)向培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)組織中高效且快速的基因轉(zhuǎn)移。因 此，在本發(fā)明另一方面中，利用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移載體建立對基因組的高流 通量、快速質(zhì)量分析系統(tǒng)。
在本發(fā)明另 一方面中，基因轉(zhuǎn)移載體可長期以冷凍狀態(tài)貯存于-20。C 。 例如，可將該基因轉(zhuǎn)移載體以冷凍狀態(tài)密封、貯存、并運(yùn)輸。
本發(fā)明另 一方面提供一種基因轉(zhuǎn)移載體，其對優(yōu)選70 %或更多的細(xì)胞， 更優(yōu)選80%或更多的細(xì)胞，還更優(yōu)選對90%或更多的細(xì)胞，最優(yōu)選對95 %或更多的細(xì)胞具有體外基因轉(zhuǎn)移活性。
本發(fā)明一個(gè)特定方面提供一種基因轉(zhuǎn)移載體，當(dāng)滅活病毒制備成功的2 個(gè)月后，產(chǎn)生病毒包膜載體作為基因轉(zhuǎn)移載體時(shí)，可維持基因轉(zhuǎn)移活性的 60%或更多，優(yōu)選70%或更多，更優(yōu)選80%或更多，最優(yōu)選90%或更多。
本發(fā)明另一方面提供一種基因轉(zhuǎn)移載體，當(dāng)體內(nèi)局部給與時(shí)，其對優(yōu) 選30 %或更多的組織中細(xì)胞，更優(yōu)選40 %或更多的組織中細(xì)胞，還更優(yōu)選 50%或更多的組織中細(xì)胞，最優(yōu)選60%或更多的組織中細(xì)胞具有基因轉(zhuǎn)移 活性。
本發(fā)明的一方面提供一種含有滅活病毒的包膜的基因轉(zhuǎn)移載體。 本發(fā)明的一方面中，用于制備基因轉(zhuǎn)移載體的病毒可以是野生型病毒 或重組型病毒。
本發(fā)明又一方面中，所用病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、披膜病 毒牙牛(Togaviridae)、 冠訝犬病毒牙牛(Coronaviridae)、 黃病毒牙牛(Flaviridae)、 副粘 病毒科(Paramyxoviridae)、 正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、 布尼亞病毒科 (Bunyaviridae)、彈^犬病毒3牛(Rhabdoviridae)、痘病毒牙牛(Poxviridae)、皰滲病 毒科(Herpesviridae)、桿狀病毒科(Baculoviridae)、以及嗜肝DNA病毒科(Hepdnaviridae)。本發(fā)明一個(gè)具體方面中，所用病毒為HVJ。在本發(fā)明另一 方面中，用Hasan， M.K.等(普通病毒學(xué)雜志,78， 2813- 2820 (1997))或 Yonemitsu， Y.等(自然生物技術(shù)學(xué)(Nature Biotechnology) 18, 970-973 (2000))
所述重組仙臺病毒制備基因轉(zhuǎn)移載體。
本發(fā)明另一方面提供能向動(dòng)物體內(nèi)組織實(shí)施基因轉(zhuǎn)移的基因轉(zhuǎn)移載體。
在制備本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移載體的方法中，不必滅活病毒。因此，本發(fā)明 一個(gè)方面中，可在不進(jìn)行滅活病毒的步驟的前提下，利用含以下步驟的方 法制備基因轉(zhuǎn)移載體
1) 使病毒與外源基因混合，和
2) 凍融該混合物，或進(jìn)一步使該混合物與一種表面活性劑混合。 本發(fā)明另一方面提供用于基因轉(zhuǎn)移的滅活型病毒包膜載體的制備方
法，該方法包括以下步驟 滅活病毒，
使該滅活的病毒與外源基因混合，和 凍融該混合物。
本發(fā)明又一方面提供用于基因轉(zhuǎn)移的滅活型病毒包膜載體的制備方 法，該方法包括以下步驟 滅活病毒，和
使該滅活的病毒與外源基因在有表面活性劑存在的情況下混合。 在本發(fā)明另一方面中，所用表面活性劑選自辛基葡糖苷、Triton-X100、 CHAPS和NP-復(fù)
本發(fā)明一個(gè)具體方面提供制備滅活型病毒包膜載體的方法，該方法還 包括在外源基因與滅活病毒的包膜混合之前，向外源基因中添加硫酸魚精 蛋白的步驟。
本發(fā)明另 一方面提供將基因?qū)敕蛛x的動(dòng)物組織中的方法，該方法包 括以下步驟
制備含所需基因的基因轉(zhuǎn)移載體，和 通過基因轉(zhuǎn)移載體將基因?qū)雱?dòng)物組織。
本發(fā)明另 一 方面提供將外源基因?qū)霊腋〖?xì)胞的方法，該方法包括以 下步驟使懸浮細(xì)胞與基因轉(zhuǎn)移載體在有硫酸魚精蛋白存在的情況下混合，和 離心該混合物。
本發(fā)明還有一方面提供含本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移載體的用于基因治療的藥用 組合物。
更具體地，本發(fā)明涉及
1. 含有病毒包膜的基因轉(zhuǎn)移載體。
2. 項(xiàng)l的基因轉(zhuǎn)移載體，所述病毒衍生自野生型病毒或重組病毒。
3. 項(xiàng)1或2的基因轉(zhuǎn)移載體，所述病毒衍生自屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、披 膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病 毒科、彈狀病毒科、痘病毒科、皰滲病毒科、桿狀病毒科和嗜肝DNA病毒 科的病毒。
4. 項(xiàng)3的基因轉(zhuǎn)移載體，所述病毒是HVJ。
5. 項(xiàng)1-4之一的基因轉(zhuǎn)移載體，其利用含以下步驟的方法來制備將 所述病毒與一種外源基因混合；和將該混合液冷凍和解凍2次或更多次。
6. 項(xiàng)1-4之一的基因轉(zhuǎn)移載體，其利用以下方法來制備，所述方法包 括將該病毒與一種外源基因在有表面活性劑存在時(shí)進(jìn)行混合的步驟。
7. 項(xiàng)5或6的基因轉(zhuǎn)移載體，所述方法還包括滅活所述病毒的步驟。
8. 項(xiàng)7的基因轉(zhuǎn)移載體，其中所述表面活性劑選自辛基葡糖苷、 Triton-X100、 CHAPS和NP-40。
9. 項(xiàng)8的基因轉(zhuǎn)移載體，其中所述表面活性劑是辛基葡糖苷。
10. 項(xiàng)l-9之一的基因轉(zhuǎn)移載體，其中所述方法還包括將硫酸魚精蛋白 添加至所述外源基因的步驟。
11. 項(xiàng)l-10之一的基因轉(zhuǎn)移載體，其用于將基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)組織中。
12. 項(xiàng)11的基因轉(zhuǎn)移載體，其中所述組織選自肝臟、骨骼肌、子宮、 腦、目艮、頸動(dòng)脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎臟、脾臟、癌組織、神經(jīng)、B 淋巴細(xì)胞、以及呼吸系統(tǒng)的組織。
13. 用于基因治療的藥用組合物，其包含項(xiàng)l-12之一的基因轉(zhuǎn)移載體。
14. 用于篩選基因文庫的試劑盒，其包含項(xiàng)l-12之一的基因轉(zhuǎn)移載體。
15. 制備基因轉(zhuǎn)移載體的方法，所述載體包含用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包 膜，所述方法包括以下步驟將所述病毒與外源基因混合；和將該混合液 冷凍和解凍2次或更多次。16. 制備基因轉(zhuǎn)移載體的方法，所述載體括包含用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包
膜，所述方法包括以下步驟將所述病毒與一種外源基因在有表面活性劑 存在的情況下混合。
17. 項(xiàng)15或16的方法，進(jìn)一步包括滅活所述病毒的步驟。
18. 將基因?qū)敕蛛x的動(dòng)物組織中的方法，該方法包括以下步驟 制備如項(xiàng)l-12之一的基因轉(zhuǎn)移載體，該載體含有所需的外源基因；和 通過該基因轉(zhuǎn)移載體將基因?qū)敕蛛x的動(dòng)物組織。
19. 將外源基因?qū)霊腋〖?xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述懸 浮細(xì)胞與項(xiàng)1-12之一的基因轉(zhuǎn)移載體在有硫酸魚精蛋白存在的情況下混 合；和離心該混合液。


圖l顯示，多次凍融HVJ包膜載體并轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞后，外源基因(螢 光素酶基因)表達(dá)水平(安光素酶活性)的測量結(jié)果。
圖2顯示，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后，螢光素酶活性的測量結(jié)果，確保 使用相同數(shù)量的病毒來制備添加至培養(yǎng)的細(xì)胞中的HVJ包膜載體。
圖3顯示，當(dāng)HVJ包膜載體中使用各種量的外源基因(螢光素酶表達(dá)載 體)時(shí)，螢光素酶活性的測量結(jié)果。
圖4顯示，當(dāng)使用各類緩沖液制備HVJ包膜載體時(shí)，螢光素酶活性的 測量結(jié)果。
圖5顯示用傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移載體、滅活型HVJ-脂質(zhì)體以及本發(fā)明的方法 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的結(jié)果比較。
圖6圖示利用表面活性劑的情況下，制備滅活的HVJ包膜載體的方法。 圖7示用表面活性劑制備的HVJ包膜載體中所含蛋白的SDS-PAGE模式。
圖8是HVJ包膜載體的顯微電鏡負(fù)染圖，其顯示(l)未處理的HVJ; (2) 不含DNA但接受了辛基葡糖苷處理的HVJ;和(3)含DNA并接受了辛基葡 糖苷處理的HVJ。
圖9A-9C顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶活性 取自辛基葡糖苷的不同濃度；辛基葡糖苷對HVJ的不同處理時(shí)間；是否進(jìn) 行超聲(聲)處理；以及所用載體的不同大小，如圖所示。圖IOA和IOB顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶 活性取自硫酸魚精蛋白(PS)的如圖所示不同濃度和不同轉(zhuǎn)染時(shí)間。
圖IIA和IIB顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶 活性取自圖示的不同DNA量(實(shí)驗(yàn)中所用量)，以及不同貯存溫度。
圖12顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶活性取自 用各種HAU滴度的HVJ制備HVJ包膜載體并將其用于基因轉(zhuǎn)移的情況， 如圖所示。
圖13A顯示如圖所示的不同UV輻射量下，以螢光素酶活性水平表示 的基因轉(zhuǎn)移效力。
圖13B顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶活性取 自圖中所示的不同(3-丙醇酸內(nèi)酯(BPL)濃度。
圖14顯示對人的舌上扁平上皮癌(SAS)的以螢光素酶活性水平表示的 基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶活性取自圖中硫酸魚精蛋白的不同濃度和轉(zhuǎn)染保溫 的不同時(shí)間。
圖15顯示對人的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)的以螢光素酶活性水平表示 的基因轉(zhuǎn)移效力，所述酶活性取自圖中硫酸魚精蛋白的不同濃度和轉(zhuǎn)染保 溫的不同時(shí)間。
圖16A顯示對小鼠肝臟的以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力， 所述酶活性通過利用本發(fā)明的HVJ包膜載體或HVJ-AVE(人工病毒包膜)月旨
質(zhì)體獲得。
圖16B顯示對小鼠子宮的以螢光素酶活性水平表示的基因轉(zhuǎn)移效力， 所述酶活性通過利用本發(fā)明的HVJ包膜載體或HVJ-AVE(人工病毒包膜)月旨
質(zhì)體獲得。
圖16C顯示用本發(fā)明的HVJ包膜載體向小鼠子宮實(shí)施pEB-CMV-LacZ 基因轉(zhuǎn)移后，對子宮組織的LacZ染色結(jié)果。通過LacZ染色可見，LacZ基 因的表達(dá)主要在子宮內(nèi)膜的腺上皮中。
圖16D顯示，將含有pEGFP-l(10，000 HAU)的HVJ包膜載體經(jīng)小腦延 髓池或經(jīng)頸動(dòng)脈給藥至SD大鼠(雄性，體重300-400g)的結(jié)果。給藥的3-4 天后，處死大鼠，制備活組織切片(live section),在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
①經(jīng)小腦延髓池給藥
經(jīng)證實(shí)基因已導(dǎo)入腦表面。另一方面又證實(shí)沒有向腦的深部進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。還證實(shí)，沒有向脈絡(luò)叢中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。 ②，③經(jīng)頸動(dòng)脈給藥
在左側(cè)(即給藥處)證實(shí)有顯著高表達(dá)。在腦內(nèi)表面部分、基底核部、以 及另一腦的腦表面均證實(shí)有表達(dá)。在另一腦的腦表面的表達(dá)^^皮認(rèn)為已通過
側(cè)流(collateral)傳(flow)向另 一側(cè)。
圖16E顯示pCMV-NK4對VEGF-誘導(dǎo)型血管生成的劑量依賴性抑制作 用，所述載體能表達(dá)一種HGF突變體，該突變體可抑制HGF的功能。
圖16F顯示通過向氣管注射HVJ包膜載體而實(shí)施的基因轉(zhuǎn)移的結(jié)果。
圖17A和17B顯示將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞后，第二天在焚光顯微鏡下觀 察到的細(xì)胞熒光結(jié)果。保溫IO分鐘后獲得約10%的寡核苷酸導(dǎo)入效力(圖 HB)，而保溫60分鐘后寡核芬酸已導(dǎo)入80%或更多的細(xì)胞中(圖HA)。
圖18顯示在人的白血病細(xì)胞系CCRF-CEM， NALM-6，和K-562中的 導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 ，
當(dāng)使用脂質(zhì)體或存在脂質(zhì)體試劑(Gibco BRL的Lipofectamine、 lipofectin 等)時(shí)，這些細(xì)胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)顯示極低的導(dǎo)入效力。
加入600-1 ，000 n g/ml硫酸魚精蛋白，于20。C以10,000 rpm或15,000 rpm 離心IO分鐘，即可獲得高螢光素酶活性。未觀察到與HVJ包膜載體相關(guān)的 顯著細(xì)胞毒活性。硫酸魚精蛋白的離心和添加是基因轉(zhuǎn)移所必需的。
圖19顯示癌組織的基因轉(zhuǎn)移結(jié)果。在癌組織的腫瘤實(shí)體中觀察到基因 表達(dá)。尤其，用500 Mg/ml硫酸魚精蛋白獲得了較高的基因轉(zhuǎn)移活性。另一 方面，在較低硫酸魚精蛋白濃度下未檢測到基因表達(dá)。
圖20顯示用皰滲病毒包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的結(jié)果。盡管總螢光 素酶活性低，但已確定，用Triton-X10處理5分鐘可獲得具有最高導(dǎo)入效 力的載體。 一種未利用硫酸魚精蛋白的制備方法具有高導(dǎo)入效力。所有樣 品經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察均未見任何細(xì)胞毒性。
圖21顯示用貯存于-80。C的皰滲病毒包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的結(jié) 果。用添加了 10%血清的培養(yǎng)基所獲導(dǎo)入效力高于用無血清培養(yǎng)基所獲。 用200m1載體溶液(估計(jì)量2.8x 107病毒顆粒/孔)所獲基因轉(zhuǎn)移活性高于 用100 m 1載體溶液(估計(jì)量1.4 x 107病毒顆粒/孔)所獲。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式(定義)
本文中"基因轉(zhuǎn)移"指將天然、合成、或重組的所需基因或基因片段(體 外或體內(nèi))導(dǎo)入靶細(xì)胞，其導(dǎo)入方式可使所導(dǎo)入的基因維持其功能。本發(fā)明
將被導(dǎo)入的基因或基因片段包括DNA、 RNA、或任何核酸(DNA或RNA的 具有特定序列的合成類似物)。本說明書中，術(shù)語"基因轉(zhuǎn)移"、和"轉(zhuǎn)染" 可互換使用。
本文中"基因轉(zhuǎn)移載體"、"基因載體"或"病毒包膜載體"指通過在 病毒包膜中包含外源基因而獲得的載體。用于制備基因轉(zhuǎn)移載體的病毒可 以是野生型病毒或重組型病毒。
本發(fā)明的一個(gè)方面中，所用病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、披膜病毒科、冠 訝犬病毒-4"、黃病毒牙+、副粘病毒-牛、正粘病毒牙牛、布尼亞病毒牙牛、彈^l犬病 毒科、痘病毒科、皰滲病毒科、桿狀病毒科、以及嗜肝DNA病毒科。本發(fā) 明一個(gè)具體方面中，所用病毒為HVJ。
本文中"基因轉(zhuǎn)移活性"指載體的"基因轉(zhuǎn)移"活性，其可利用所導(dǎo) 入的基因的功能(如果是表達(dá)載體，則是所編碼蛋白的表達(dá)和/或該蛋白的活
性等)作為指標(biāo)來檢測。
本文中"滅活的"用于指基因組已被滅活的病毒。滅活病毒具有復(fù)制 缺陷。優(yōu)選，滅活可通過UV處理或用烷基化試劑處理來獲得。
本文中"外源基因"指包含在基因轉(zhuǎn)移載體中的任何核酸序列，但該 核酸序列并非病毒來源。本發(fā)明的一個(gè)方面中，將外源基因可搡作連接至 使被基因轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入的基因能表達(dá)的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列(如轉(zhuǎn)錄所必需的啟動(dòng) 子、增強(qiáng)子、終止子、polyA加尾信號，以及翻譯所必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、 起始密碼子、終止信號等)。本發(fā)明另一方面中，外源基因不包括用于該外 源基因表達(dá)的任何調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明還一方面中，外源基因?yàn)楣押塑账峄?i秀S烏(;decoy:)核酸。
包含在基因轉(zhuǎn)移載體中的外源基因主要是DNA或RNA核酸分子，但 所導(dǎo)入的核酸分子可包括核酸類似物分子?；蜣D(zhuǎn)移載體中所含分子種類 可以是一種，也可以是多種不同基因分子。
本文中"基因文庫，，指含有自然界分離的或人工合成的核酸序列的核 酸文庫。核酸序列的自然來源包括真核生物、原核生物、或病毒的基因組 序列或cDNA序列，但不限于此。通過向自然界分離的序列中加入任意序列(如信號或標(biāo)記)而獲得的文庫也包括在本發(fā)明的基因文庫中。在一個(gè)實(shí)施 方案中，基因文庫包含諸如導(dǎo)致其中所含核酸序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的啟動(dòng)子 等序列。
本文中，"HVJ"和"仙臺病毒"可互換使用。
本文中，"HAU，，指可凝集雞紅細(xì)胞的0.5 %的病毒活性水平。一個(gè)HAU 相當(dāng)于約24，000，000個(gè)病毒顆粒(Okada， Y.等，Biken Journal 4, 209 - 213, 1961)。
(基因治療)
治療性核酸構(gòu)建物可利用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體而局部或全身性給 藥。當(dāng)這類核酸構(gòu)建物包括蛋白的編碼序列時(shí)，該蛋白的表達(dá)可利用內(nèi)源 性哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子或外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)。編碼序列的表達(dá)可以是組成型的或 可以調(diào)節(jié)。
當(dāng)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體被作為基因治療的組合物使用時(shí)，本發(fā)明載 體的給與，可通過將載體的PBS(磷酸鹽緩沖液)、鹽水等懸浮液直接注射至 局部位點(diǎn)(如癌組織內(nèi)部、肝內(nèi)、肌肉內(nèi)和腦內(nèi))，或經(jīng)由其脈管(如動(dòng)脈內(nèi)、 靜脈內(nèi)或門靜脈內(nèi))給與。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基因轉(zhuǎn)移載體通常是將單位注射劑型(溶液、懸浮 液、或乳液)的基因轉(zhuǎn)移載體與可藥用載體(即在所用劑量和濃度下對受體無 毒性且能與制劑中其它成分相容的物質(zhì))混合而配制成。例如，制劑優(yōu)選不 包括氧化劑以及已知對基因轉(zhuǎn)移載體有害的其它化合物。
可藥用載體最好包含少量添加劑如增強(qiáng)滲透性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。
這些物質(zhì)在所用劑量和濃度下對受體無毒性，且包括緩沖液如磷酸鹽、檸 檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸、及其它有機(jī)酸或它們的鹽；抗氧化劑如抗壞血 酸；小分子多肽(約不到IO個(gè)殘基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)(如血清 清蛋白、明膠、或免疫球蛋白)；親水性聚合物(如聚乙烯吡硌烷酮)；氨基 酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸)；單糖、二糖、及其它碳水化 合物(包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精)；螯合劑(如EDTA); 糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；反離子(如鈉)；和/或非離子表面活性劑(如聚 山梨酯(polysorbate)或聚羥亞烴(polyxamer)),或PEG 。
含基因轉(zhuǎn)移載體的藥用組合物通常以水溶液形式保存在單劑型或多劑 型的容器，如密封的安瓿瓶或小瓶中。本發(fā)明還提供一種藥劑包裝或試劑盒，其包括一或多個(gè)容器，其中裝 載本發(fā)明藥用組合物的一或多種成分。此外，本發(fā)明的多肽可與其它治療 性化合物一起使用。
含有本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移載體的藥用組合物可根據(jù)醫(yī)療實(shí)踐進(jìn)行配制和用 量，應(yīng)考慮患者個(gè)人的臨床狀況(如需預(yù)防或治療的狀況)、含基因轉(zhuǎn)移載體 的組合物的運(yùn)送位點(diǎn)、耙組織、給藥方法、給藥時(shí)間表、以及本領(lǐng)域纟支術(shù) 人員已知的其它因素。因此，本說明書中描述的基因轉(zhuǎn)移載體的"有效量，， 或適當(dāng)劑量可根據(jù)上述考慮而定。
例如，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體給藥至小鼠時(shí)，每只小鼠可給與相當(dāng)
于20-20,000 HAU、優(yōu)選60-60,000 HAU、更優(yōu)選200-2,000 HAU的基因載 體。所給與的基因載體中外源基因的含量為0.1-100昭，優(yōu)選0.3-30昭，更 優(yōu)選l-10iig/小鼠。
如果將本發(fā)明的基因載體給藥至人，每人可給與相當(dāng)于400-400,000 HAU、優(yōu)選1,200-120,000 HAU、更優(yōu)選4,000-40,000 HAU的基因載體。所 給與的基因載體中外源基因的含量為2-2，000嗎，優(yōu)選6-600嗎，更優(yōu)選 20-200嗎/人。
以下實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，并非限制。
實(shí)施例
1.基因轉(zhuǎn)移載體的利用凍融法的制備，以及其應(yīng)用 (實(shí)施例1:利用凍融法制備HVJ包膜載體)
用螢光素酶基因作為外源基因。將重組HVJ病毒凍融多次后，將該基 因?qū)肱囵B(yǎng)的細(xì)胞中。
將500|il TE、 750嗎螢光素酶表達(dá)載體pcOriPLuc (Saeki和Kaneda等， 人類基因治療，11， 471-479 (2000))與各種濃度的HVJ病毒混合。將HVJ 病毒的濃度調(diào)整至10、 25、 50、或100 HAU/pl。將該溶液分為12等份， 每份均保存在4。C，用干冰冷凍然后解凍；如此重復(fù)最多達(dá)30次。將已凍 融了指定次數(shù)的溶液加入BHK-21細(xì)胞中(24孔板，4乂104細(xì)胞/板，0.5 ml DMEM, 10%FCS)。使細(xì)胞與5%(:02在37。C反應(yīng)20分鐘后，纟田胞用PBS 洗滌，然后再加入0.5 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)。
除去培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入500|il 1 x細(xì)胞培養(yǎng)物裂解試劑(Promega)以裂解細(xì)胞，將該溶液置于微量離心管中，離心。用Promega螢光素酶分 析系統(tǒng)和Lumat LB9501發(fā)光儀(Luminophotometer)測定20jil所得上清的螢 光素酶活性。每種溶液測三次，取平均值。
結(jié)果見圖1。螢光素酶活性隨著重組HVJ病毒凍融次數(shù)的增加而增加。 凍融20次時(shí)的安光素酶表達(dá)10倍或更多倍于凍融三次的觀察結(jié)果。這些 結(jié)果證實(shí)，在本實(shí)施例所用條件下，重組HVJ病毒的凍融次數(shù)優(yōu)選為5次 以上，更優(yōu)選約15-約20次。
(實(shí)施例2:經(jīng)凍融制備的HVJ包膜載體的基因轉(zhuǎn)移效力)
將類似于實(shí)施例1所用的重組HVJ病毒凍融30次后，在確保將相同量 病毒加入到宿主細(xì)胞的前提下，檢查向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的效力。
結(jié)果見圖2。圖2中，在X軸的500 HAU處，具有10 HAU/pl病毒濃 度的溶液的加入量為5(^1,而100 HAU/pl溶液的加入量為5(il。如圖2所 示，具有100HAU/V1病毒濃度的溶液的基因表達(dá)效力與具有10-50 HAU/pl 病毒濃度的溶液相比減少約50%。該結(jié)果表明，在本實(shí)施例的條件下，重 組病毒的濃度優(yōu)選為10-50 HAU4d。
此外，將重組HVJ病毒凍融29次后，第30次實(shí)施冷凍，然后將該HVJ 病毒溶液以此冷凍狀態(tài)保存一周，然后凍融，加至細(xì)胞中。結(jié)果，在冷凍 狀態(tài)下保存了 一周的重組HVJ病毒也顯示與經(jīng)受了連續(xù)30次凍融的病毒相 同的螢光素酶基因表達(dá)水平。
(實(shí)施例3:測定用安光素酶表達(dá)基因進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移效力)
利用不同量的營光素酶表達(dá)載體制備HVJ包膜載體，檢查向宿主細(xì)胞 的基因轉(zhuǎn)移效力。
HVJ病毒的量為50 HAU/|il TE。安光素酶表達(dá)載體pcOriPLus的量為 0.05， 0.1， 0.25, 0.5， 1.0， 1.5, 2.0, 3.0,或5.5 ^ig/^il TE。凍融20次，將所述溶 液的終體積調(diào)整至ioow，然后用如實(shí)施例1所述相同的方法測定螢光素酶活性。
結(jié)果見圖3。以表達(dá)載體pcOriPLuc(約9.5kb)為外源基因，隨著它的添 加，其表達(dá)量以劑量依賴的方式增加，直至添加量達(dá)1.5(ig;隨后，表達(dá)量 幾乎不再有變化。該結(jié)果證實(shí)，在本實(shí)施例的條件下，優(yōu)選用1.5ng/pl或更 多的外源基因DNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。
(實(shí)施例4:緩沖液類型對基因轉(zhuǎn)移效力的影響)用不同類型的緩沖液制備HVJ包膜載體，檢查向宿主細(xì)胞實(shí)施基因轉(zhuǎn) 移的效力。
HVJ病毒的量為50 HAU/pl緩沖液。螢光素酶表達(dá)載體pcOriPLuc的 量為15嗎/Vl。所用緩沖液為TE、PBS、或BSS(137mMNaCl， 5.4mMKCl， 10 mM Tris-HCl， pH7.5)、或向這些緩沖液中添加蔗糖至終濃度為0 mM， 20 mM, 40mM,或60mM。凍融20次，將所述溶液的終體積調(diào)整至100^1，然后用 如實(shí)施例1所述相同的方法測定螢光素酶活性。
結(jié)果見圖4，其證實(shí)，在本實(shí)施例的條件下，優(yōu)選只使用TE作為制備 重組HVJ病毒的緩沖液。
(實(shí)施例5: AVE(人工病毒包膜)型載體和本發(fā)明之HVJ包膜栽體的比
較)
利用滅活的HVJ脂質(zhì)體(具有最佳基因轉(zhuǎn)移效力的AVE型(Saeki，Y.等， 人類基因治療，8， 2133-2141 (1997)))這種傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行的基因轉(zhuǎn) 移，與本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行比較。
HVJ脂質(zhì)體或HVJ病毒的量為50 HAU/pl TE，營光素酶表達(dá)載體 pcOriPLuc的量為1.5^ig/|il。重組HVJ病毒的凍融次數(shù)為2次或15次。其 它條件與實(shí)施例1中的相同，不同的是用人胚腎細(xì)胞系HEK293作為宿主 細(xì)胞。
結(jié)果見圖5。其證實(shí)，本發(fā)明中將HVJ包膜載體重復(fù)凍融15次的方法 比用HVJ脂質(zhì)體進(jìn)行的傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移方法的基因轉(zhuǎn)移效力高很多。 (實(shí)施例6:合成寡核苷酸的導(dǎo)入效力)
將已用FITC(異硫氰酸焚光素)標(biāo)記的合成寡核苷酸(20bp)以1 mg/ml的 濃度與滅活的HVJ病毒混合。將該溶液凍融20次后，使之與BHK-21細(xì)胞 反應(yīng)20分鐘。17小時(shí)后觀察焚光信號。結(jié)果，幾乎在100%的細(xì)胞的細(xì)胞 核中觀察到焚光信號。該結(jié)果表明，本發(fā)明的方法也可有效用于將合成的 核酸導(dǎo)入細(xì)胞。
(實(shí)施例7: GFP基因的導(dǎo)入效力)
將GFP(綠色熒光蛋白)基因與滅活的HVJ病毒的混合溶液凍融20次 后，將2ng-5jul該混合液注射至大鼠大腦。結(jié)果在注射部位觀察到熒光信 號。此外，將利用了 GFP基因的HVJ包膜載體凍存3個(gè)月，然后注射至大 鼠大腦。同樣，在注射部位觀察到因GFP基因表達(dá)而產(chǎn)生的熒光信號。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的方法確實(shí)能實(shí)現(xiàn)基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。此外，還
證實(shí)HVJ包膜載體的冷凍保存是可能的。
2.基因轉(zhuǎn)移載體的利用表面活性劑的制備，以及其應(yīng)用 (實(shí)施例8:利用表面活性劑制備滅活的HVJ包膜栽體)
利用表面活性劑制備滅活的HVJ包膜載體的方法圖示于圖6。 (1: HVJ的培養(yǎng))
通?？蓪VJ種子病毒接種在受精的雞胚中以便進(jìn)行培養(yǎng)。但也可利 用培養(yǎng)的細(xì)胞(如猴或人)或持續(xù)感染系統(tǒng)(即一種培養(yǎng)液，其中已將一種水 解酶如胰蛋白酶添加至培養(yǎng)的組織中)培養(yǎng)HVJ,或通過以克隆化病毒基因 組感染培養(yǎng)的細(xì)胞，導(dǎo)致持續(xù)感染，而培養(yǎng)HVJ。
在本實(shí)施例中，HVJ如下培養(yǎng)。
利用SPF(不含特異性病原體的)受精卵培養(yǎng)HVJ種子病毒。將分離并 純化的HVJ(Z種)分配至保存細(xì)胞的試管中，添加10。/。DMSO后保存于液氮中。
取剛剛完成受精的雞卵，將其置于培養(yǎng)箱(SHOWA-FURANKIP-03型； 能容納約300個(gè)受精卵)中，在36.5。C和40%以上濕度的環(huán)境下培養(yǎng)10-14 天。在暗室中，用檢卯器(其中將來自燈泡的光線引導(dǎo)穿過一個(gè)直徑約1.5 cm 的窗口)證實(shí)胚的活力以及氣室和絨毛尿嚢膜的位置。用鉛筆標(biāo)出絨毛尿嚢 膜上方約5 mm處的病毒注入部位(選擇該部位應(yīng)避開任何厚血管)。將種子 病毒(其取自液氮)用多聚蛋白胨溶液(其中將1 %多聚蛋白胨與0.2 % NaCl混 合，用1 MNaOH調(diào)節(jié)至pH 7.2,然后經(jīng)高壓滅菌，保存在4。C)稀釋500 倍，并于4。C靜置。雞胚用IsodineTM和乙醇消毒。用錐子(pick)在病毒注射 部位制造一個(gè)小洞。用1 ml的注射針(26號)將0.1 ml稀釋的種子病毒液注 入絨毛尿嚢腔。用Pasteur移液管以Molten石蠟(熔點(diǎn)50-52。C)封閉洞口 。 將受精卵置于培養(yǎng)箱中，在36.5。C和40。/。以上濕度的環(huán)境下培養(yǎng)3天。然 后，將已接種的受精卵于4。C靜置過夜。第二天，用小鑷子打開氣室，將帶 有18號針頭的10 ml注射器深入絨毛尿嚢膜中以吸取尿嚢液，將其收集在 無菌小瓶中，4。C保存。
(2: HVJ的純化)
HVJ可通過利用離心進(jìn)行純化的方法，利用層析柱進(jìn)行純化的方法，或領(lǐng)域內(nèi)已知的任何其它方法來純化。
(2.1:通過離心進(jìn)4亍純化的方法)
簡單說，收集含病毒的溶液，低速離心以除去該培養(yǎng)液以及絨毛尿嚢
液中的組織或細(xì)胞碎片。其上清利用蔗糖密度梯度(30-60。/。w/v)經(jīng)高速離心 (27,500 x g， 30分鐘)和超速離心(62,800 x g,卯分鐘)來純化。純化期間盡 可能溫和地處理病毒，將病毒4。C保存。
具體在本實(shí)施例中，HVJ用如下方法純化。
將約100 ml含HVJ的絨毛尿嚢液(取自含HVJ的雞胚，收集并保存于 4。C)用Komagome型廣口移液管裝入兩個(gè)50 ml離心管中(見Saeki， Y.和 Kaneda,Y:用于運(yùn)送基因、寡核苷酸和蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)修飾型脂質(zhì)體(HVJ-脂質(zhì)體).細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版)，J. E. Celis編(Academic Press Inc.， San Diego),第四巻，127-135頁，1998),于4。C以3000 rpm低速離心10 分鐘(關(guān)閉制動(dòng)閘(brake))。以此除去雞胚中的組織石爭片。
離心后，將上清轉(zhuǎn)移至4個(gè)35ml離心管(高速離心型)，用角度轉(zhuǎn)子以 27,000g離心30分鐘(加速器和制動(dòng)閘均打開)。除去上清，沉淀中加入BSS (10 mM Tris陽HCl(pH 7.5), 137 mM NaCl, 5.4 mM KC1;高壓滅菌，4。C保存) 約5ml/管，4。C靜置過夜。用Komagome型廣口移液管輕輕吹打沉淀并轉(zhuǎn)移 至一個(gè)試管中，用角度轉(zhuǎn)子以27,000g類似地離心30分鐘。除去上清，沉 淀中加入約10 ml BSS， 4'C靜置過夜。用Komagome型廣口移液管輕輕吹 打沉淀，4。C以3000 rpmj氐速離心IO分鐘(制動(dòng)閘關(guān)閉)，乂人而除去尚未徹 底除去的組織碎片和病毒凝集塊。將上清轉(zhuǎn)移至新的無菌試管中，4'C保存， 作為純化的病毒備用。
將0.9 ml BSS加入0.1 ml該病毒液中，用分光光度計(jì)測定540 nm處的 吸收值。將病毒滴度轉(zhuǎn)換為紅細(xì)胞凝集活性(HAU)。 540nm處的吸收值為1 約相當(dāng)于15,000 HAU。據(jù)認(rèn)為，HAU與融合活性基本成正比。此外，紅細(xì) 胞凝集活性可利用含雞紅細(xì)胞(0.5 %)的溶液進(jìn)行真實(shí)地測定(見"動(dòng)物細(xì)胞 操作實(shí)用手冊，，)，REALIZE公司(內(nèi)田，大石，古編)，259-268, 1984)。
此外，必要時(shí)可利用蔗糖密度梯度純化HVJ。具體是，將病毒懸浮液 轉(zhuǎn)移至已將60 %和30 %的蔗糖溶液(已高壓滅菌)分層的離心管中，以62,800 xg密度梯度離心120分鐘。離心后，回收60%蔗糖溶液中所發(fā)現(xiàn)的一條 帶。將所回收的病毒懸浮液于4。C對BSS或PBS溶液透析過夜，以除去蔗糖。如果不必立即使用該病毒懸浮液，可加入甘油(已高壓滅菌)和0.5 M
EDTA(已高壓滅菌)至終濃度分別為10。/。和2-10mM,溫和凍存于-80。C，并 最終凍存于液氮(該凍存可用10 mM DMSO代替甘油和0.5 M EDTA溶液)中。
(2.2:利用層析柱和超過濾進(jìn)行純化的方法)
利用層析柱進(jìn)行HVJ純化的方法也可取代通過離心進(jìn)行純化的方法而 應(yīng)用于本發(fā)明。
簡單說，利用截留分子量為50,000的超濾膜進(jìn)行濃縮(約IO倍)和通過 離子交換層析(0.3 M-l MNaCl)進(jìn)行洗脫均可達(dá)到純化的目的。 具體在本實(shí)施例中，用以下方法層析純化HVJ。
收集絨毛尿嚢液，經(jīng)濾膜(80jum-10iim)過濾。將0.006-0.008 % BPL(終濃 度)加至絨毛尿嚢液中(4。C, l小時(shí))，以滅活HVJ。將絨毛尿嚢液于37。C保 溫2小時(shí)以滅活BPL。
用500 KMWCO (A/G Technology, Needham, Massachusetts)經(jīng)切向流超 濾法濃縮約10倍。所用緩沖液為50mMNaCl， 1 mMMgCl2,2o/。甘露醇，以 及20 mM Tris (pH 7.5)。 HAU分析表明，HVJ產(chǎn)量接近100。/。。故，獲得了 極好的結(jié)杲。
用Q Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech KK， Tokyo)經(jīng)柱層析純 化法(緩沖液20 mM Tris HC1 (pH 7.5)， 0.2-1 M NaCl)可純化HVJ。產(chǎn)量為 40-50%,純度為99%或更高。
用500 KMWCO (A/G Technology)經(jīng)切向流超濾法濃縮HVJ級分。
(3: HVJ的滅活)
如果必須滅活HVJ,可如下通過UV光輻射或烷基化試劑處理而實(shí)施。 (3.1: UV光輻射法)
將1 ml HVJ懸浮液置于一個(gè)直徑30 mm的平皿中，接受99或198 mJ/cn^的輻射。也可使用Y射線輻射(5-20Gy),但它不能徹底滅活。 (3.2:用烷基化試劑進(jìn)行處理)
使用前，在10mMKH2PO中制備0.01%(3-丙醇酸內(nèi)酯。制備期間將該 溶液保持在4'C，操作應(yīng)快速完成。
將P-丙醇酸內(nèi)酯加入剛剛完成純化的HVJ懸浮液中至終濃度為0.01 %,于水上靜置60分鐘。然后于37。C將該混合物保溫2小時(shí)，再分配至Eppendorf管(10,000 HAU/管)，以15,000 rpm離心15分鐘。沉淀物-20。C保 存。不用上述滅活法，無需將沉淀物在-20。C保存，可經(jīng)表面活性劑處理摻 入DNA, 乂人而構(gòu)建一個(gè)載體。 (4: HVJ包膜載體的構(gòu)建)
將含有200-800昭外源DNA的92|il溶液加入保存的HVJ中，吹打使 之充分懸浮。將該溶液于-20。C保存至少3個(gè)月。DNA在與HVJ混合前加 入硫酸魚精蛋白可將表達(dá)效力增強(qiáng)2倍或更多倍。
將所述混合物于水上靜置1分鐘，加入8^1辛基葡糖苦(10%)。使該試 管在水上振動(dòng)15秒，水上靜置45秒。用表面活性劑進(jìn)行處理的時(shí)間優(yōu)選 為l巧分鐘。也可用Triton-X00(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、CHAPS(3-[(3-氯酰氨基丙基)-二曱基氨]-l-丙烷磺酸)(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]陽l-propane sulfonate)、或NP-40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇) 等表面活性劑代替辛基葡糖香。Triton-X100， NP-40和CHAPS的終濃度分 別優(yōu)選為0.24-0.80% 、 0.04-0.12%、和1.2-2.0%。
加入lml冷BSS，迅速將該溶液以15,000 rpm離心15分鐘。在所得沉 淀中加入300plPBS或鹽水等，經(jīng)渦旋或吹打使沉淀懸浮?？蓪⒃搼腋∫褐?接用于基因轉(zhuǎn)移或可在-20。C保存后用于基因轉(zhuǎn)移。保存至少2個(gè)月后，該 HVJ包膜載體維持了同樣的基因轉(zhuǎn)移效力。
(實(shí)施例9: HVJ包膜栽體中Fl蛋白與HN蛋白之比)
(1:樣品制備)
(i) 將相當(dāng)于10,000 HAU的純化HVJ以15,000 rpm離心15分鐘，將沉 淀懸浮于300filPBS中，-20°<:保存。
(ii) 用紫外線(198 mJ/cm"對相當(dāng)于10,000 HAU的純化HVJ進(jìn)行輻射， 然后以15,000 rpm離心15分鐘，4吏沉淀懸浮于300|ilPBS中，-20。C保存。
(iii) 用紫外線(198 mJ/cm"對相當(dāng)于10,000 HAU的純化HVJ進(jìn)行輻射， 然后以15,000 rpm離心15分鐘。向沉淀中加入200pl pcLuci DNA(溶液 92^1),通過吹打來懸浮。將懸浮液置于水上，加入8|11辛基葡糖苷(10%)。 用手將試管振動(dòng)15秒，于冰上靜置45秒。加入lml冷BSS,迅速以15,000 rpm離心15分鐘。此后，使沉淀懸浮于300)alPBS中，-20°(3保存。
(2:蛋白質(zhì)電泳)
將x 5 Laemli樣品緩沖液加入三種樣品(5， 10， 20 pl)中，進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。脫色后，將凝膠
貼在玻璃紙(cell叩hane)上，風(fēng)干。 (3:蛋白質(zhì)鑒定)
將已電泳并染色的樣品插入LAS2000(富士膠巻，東京)(圖7)，測定對 應(yīng)于F1和HN的蛋白質(zhì)帶的濃度。對每種樣品的三種不同量進(jìn)行電泳。計(jì) 算各自的F1/HN密度，并計(jì)算每份樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
(4:結(jié)果)
樣品(i)、(ii)和(iii)的F1/HN保持在約1.7?？紤]到Fl(51kD)和HN(68kDa) 的分子量，分子比應(yīng)為2.3。這與報(bào)道(實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，142， 95-101， 1985) 一致，該報(bào)道中，F(xiàn)1/HN值約為2時(shí)，F(xiàn)l和HN所重構(gòu)的脂質(zhì)體具有最佳 融合。在其他研究者所報(bào)道的重構(gòu)類型中，該比例不同于野生型病毒的(病 毒學(xué)雜志，67， 3312-3318， 1993)。其它蛋白組合物在HVJ和HVJ包膜載 體之間也基本相同。
(實(shí)施例10: DNA向HVJ包膜栽體中的包裹以及包裹率)
(1: HVJ包膜載體的電子顯微鏡顯像)
(其中的DNA被包膜包裹或未被包膜包裹)
如上述，將130(ig pSFV-LacZ (14.5kb)包入10,000 HAU的HVJ(已用紫 外線滅活)中，并制備HVJ包膜載體。
將已包入的HVJ包膜載體懸浮于30(^1 PBS中，-20°(3保存。IO天后， 將1^1該懸浮液置于柵格(grid)中，負(fù)染后用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。用未包 裹DNA的HVJ包膜載體作對照。
(結(jié)果)
結(jié)果見圖8。大多數(shù)HVJ包膜載體具有基本相同于HVJ病毒本身所具 有的外膜構(gòu)象。與未包入DNA的HVJ包膜載體相比，在應(yīng)用了 DNA的 HVJ包膜載體中可觀察到一種高電子密度結(jié)構(gòu)。另一方面，所述未包裹的 HVJ包膜載體具有較高的內(nèi)部透光率，據(jù)此可推論病毒基因組已被破壞或 丟失。
(2: HVJ包膜載體中的DNA包裹率)
將157(ig pcLuci (7.4kb)以上述方式包裹至6,700 HAU的HVJ(UV滅活 型)中，從而制備HVJ包膜載體。將該HVJ包膜載體懸浮于300jilBSS中， 用15個(gè)單位的微球菌(Micrococcal)核酸酶、2mMCaCl2、以及20|ig/ml RNA酶A于20。C處理30分鐘，對1L PBS透析(4。C ，過夜)。將HVJ包膜載體 用1 %SDS于37。C處理1分鐘，再用500|ul苯酚(phenol)和500|il氯仿-異戊 醇處理，然后進(jìn)行乙醇沉淀。將該沉淀物懸浮于100falBSS中，用分光光度 計(jì)測定260 nm或280 nm處的吸光度值。 (結(jié)果)
產(chǎn)量為85.7%。將其轉(zhuǎn)化后，可得HVJ包膜栽體中DNA摻入效率為 3.8 % 。將279嗎pcLuci摻入10,000 HAU的HVJ中時(shí)，效率為7.2 % 。
才艮據(jù)以上結(jié)果推斷，當(dāng)使用辛基葡糖苷時(shí)，向10,000 HAU的HVJ中 摻入DNA的效率約為6 - 7 % ，但根據(jù)DNA的使用量不同略有變化。此外， 已發(fā)現(xiàn)當(dāng)^6危酸魚精蛋白與DNA和HVJ包膜載體同時(shí)存在時(shí)，導(dǎo)入效率提 高，認(rèn)為這是由于DNA被HVJ包膜載體包裹的效率得到提高。據(jù)推斷，使 用Triton-XlOO或NP-40可使效率進(jìn)一步提高約10 - 40 % 。
(實(shí)施例11:借助HVJ包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞)
(1:基因轉(zhuǎn)移方法)
將l，OOO HAU裝入Eppendorf管(30(il)中，加入5^1硫酸魚精蛋白(l mg/ml)。更換BHK-21細(xì)胞(其于前一天以200,000個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在6 個(gè)孔中)的培養(yǎng)基，每孔加0.5 ml培養(yǎng)基(10o/。FCS-DMEM)。每孔加上述載 體(相當(dāng)于1，000HAU)與硫酸魚精蛋白的混合物，前后左右搖晃該平板，使 載體與細(xì)胞充分混合。將混合物于5%0)2培養(yǎng)箱中37。C保溫10分鐘。
更換培養(yǎng)基，于5%<:02培養(yǎng)箱中37。C保溫過夜(16-24小時(shí))，然后檢 查基因表達(dá)。如果檢查螢光素酶(pcLuci:帶有CMV啟動(dòng)子的螢光素酶基因)， 則細(xì)胞用0.5ml細(xì)胞裂解緩沖液(Promega)裂解，用營光素酶分析試劑盒 (Promega)測定20|il溶液的活性。如果是綠色焚光蛋白(pCMV-GFPE; Promega),則在熒光顯微鏡下觀察完整細(xì)胞，放大400倍的情況下觀察5-8 個(gè)視野，計(jì)算發(fā)出熒光的細(xì)胞的比率。
(2:有關(guān)培養(yǎng)細(xì)胞之導(dǎo)入效力的影響條件的研究)
用BHK-21細(xì)胞作為培養(yǎng)的細(xì)胞。
(2.1:對HVJ包膜載體的制備中辛基葡糖苷(OG)濃度的研究) 對上述(l)的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行以下改變，并檢查辛基葡糖苷(OG)在以
下濃度(即用于制備HVJ包膜載體時(shí)的OG終濃度)之時(shí)通過HVJ包膜載體
對基因轉(zhuǎn)移的影響(A) 辛基葡糖苷濃度1、 2、或3%;
制備HVJ包膜載體時(shí)滅活的HVJ接受OG處理的時(shí)間1分鐘、5分 鐘、或IO分鐘；
進(jìn)行或不進(jìn)行超聲處理(聲處理)。
(B) 辛基葡糖苷濃度0,125-1.25%; 用于轉(zhuǎn)染的載體的體積lO(il, lOOpl。
(C) 辛基葡糖苷0.55-0.8%; 轉(zhuǎn)染時(shí)間30分鐘，過夜(0/N)。 結(jié)果見圖9。
(2.2:向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的條件，硫酸魚精蛋白(PS)的濃度/處理時(shí)間) 對上述(1)的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行以下改變，并4全查碌u酸魚精蛋白通過 HVJ包膜載體對基因轉(zhuǎn)移的影響
(A) 硫酸魚精蛋白濃度0-100嗎/ml培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染時(shí)間20、 40、或60分鐘。
(B) 硫酸魚精蛋白濃度040ng/ml培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染時(shí)間5、 10、或20分鐘。 結(jié)果見圖10。
(2.3:包入HVJ包膜載體的DNA的濃度對基因表達(dá)水平的影響) 對上述(l)的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行以下改變，并檢查該實(shí)驗(yàn)所用DNA量通 過HVJ包膜載體對基因轉(zhuǎn)移的影響
(A) DNA量20-200|ig;
將HVJ包膜載體于-20。C或-8(TC保存5天。
(B) DNA量180-360|ig/HVJ 10,000 HAU。
結(jié)果見圖11。
(2.4:用于基因轉(zhuǎn)移的HVJ滴度對基因表達(dá)水平的影響)
對上述(l)的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行以下改變，并檢查基因轉(zhuǎn)移所用HVJ滴 度通過HVJ包膜載體對基因表達(dá)量的影響
利用滴度為5,000、 10,000、或20,000 HAU的HVJ制備HVJ包膜載體, 用相當(dāng)于250、 500、 l，OOO、或2,000 HAU的量轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。
結(jié)果見圖12。(2.5: HVJ滅活條件對HVJ包膜載體的基因轉(zhuǎn)移效力的影響) 對上述(l)的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行以下改變，并檢查HVJ滅活方法(UV或 P-丙醇酸內(nèi)酯)對BHK-21細(xì)胞中螢光素酶基因表達(dá)的影響
(A) 用于UV輻射的輻射量0-231 mJ/cm2。
(B) 用于HVJ處理的P-丙醇酸內(nèi)酯(BPL)的濃度0-0.025 % 。 結(jié)果見圖13。
(實(shí)施例U:利用HVJ包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至各種細(xì)胞)
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例11所述，將基因轉(zhuǎn)移至人舌上的鱗狀細(xì)胞癌(SAS) 中。結(jié)果見圖14。通過基因轉(zhuǎn)移，用于轉(zhuǎn)染的硫酸魚精蛋白濃度和保溫時(shí) 間發(fā)生變化，如圖14所示，根據(jù)螢光素酶基因的表達(dá)來測定基因轉(zhuǎn)移效力。 在用于轉(zhuǎn)染的條件下，當(dāng)用200iLig/ml硫酸魚精蛋白轉(zhuǎn)染60分鐘時(shí)，基因轉(zhuǎn) 移的效力最大。但通過進(jìn)一步增加硫酸魚精蛋白的濃度，有望進(jìn)一步提高 基因轉(zhuǎn)移效力。
用本發(fā)明實(shí)施例11的方法向人的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)中導(dǎo)入基 因。結(jié)果見圖15。
通過基因轉(zhuǎn)移，用于轉(zhuǎn)染的硫酸魚精蛋白濃度和保溫時(shí)間發(fā)生變化， 如圖15所示，根據(jù)螢光素酶基因的表達(dá)來測定基因轉(zhuǎn)移效力。在用于轉(zhuǎn)染 的條件下，當(dāng)用100嗎/ml硫酸魚精蛋白轉(zhuǎn)染60分鐘時(shí)，基因轉(zhuǎn)移的效力最 大。但通過進(jìn)一步增加硫酸魚精蛋白的濃度，有望進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)移效 力。
(實(shí)施例13:利用HVJ包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至各種類型的體內(nèi)組織中)
本實(shí)施例描述利用實(shí)施例11所述的HVJ包膜載體將基因轉(zhuǎn)移至各種 類型的體內(nèi)組織中。 (13.1:小鼠肝臟)
將0.8 %辛基葡糖苷與200昭pcLuci(其已懸浮于300fil PBS中)一起在水 上靜置1分鐘，由此制備HVJ包膜載體。所制備的懸浮液取1/10 (30|^1,相 當(dāng)于1,000 HAU)，用70(ilPBS稀釋(總量100^1),將該稀釋液注射至小鼠 (C57BL/6)肝臟的 一個(gè)小葉中。
通過與200i!gpcLuci—起渦旋/擠壓，然后進(jìn)行蔗糖梯度離心(62000g, 90分鐘)，可制備HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂質(zhì)體。然后通過離心(27000g， 30分鐘)使該制劑沉淀，將沉淀懸浮于500|al PBS中。取100pl該樣品注射至小鼠(C57BL/6)肝臟的一個(gè)小葉中。
24小時(shí)后，分離所注射的肝臟小葉，用螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega)分 析肝小葉的螢光素酶活性。
結(jié)果見圖16A。這些結(jié)果清楚表明，本發(fā)明的HVJ包膜載體顯示了非 常高的基因轉(zhuǎn)移效力，該效力比傳統(tǒng)HVJ-AVE脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)移效力高出 約2倍。
(13.2:小鼠子宮)
如13.1所述制備HVJ包膜載體。將50^1和100|al樣品用PBS稀釋至 50(Hd，灌注至小鼠的輸卵管，將子宮頸結(jié)扎IO分鐘。24小時(shí)后，分離小 鼠子宮，用螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega)分析小葉或子宮的螢光素酶活性。 結(jié)果見圖16B。本發(fā)明的HVJ包膜載體能將基因轉(zhuǎn)移至小鼠子宮中，而利平。
含pcLuci的HVJ包膜載體如13.1所述制備。為了進(jìn)行LacZ表達(dá)，用 200昭pEB-CMV-LacZ(13kb)制備含有該質(zhì)粒的HVJ包膜載體。將含有這些 質(zhì)粒的HVJ包膜載體如上注射至子宮中。結(jié)果見圖16C。通過LacZ染色， 測得LacZ基因的表達(dá)主要見于子宮內(nèi)膜的腺上皮中。
(13.3:大鼠腦部)
用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的制備方法類似的方法制備含 pEGFP-l(即，已將水母的綠色熒光蛋白基因(約0.7kb)引入攜有巨細(xì)胞病毒 啟動(dòng)子的表達(dá)載體中的一種載體；可得自Clontech，PaloAlto,CA)的HVJ包 膜載體。將30^1該載體(相當(dāng)于1000 HAU，該制品的1/10)注射至SD (Sprague- Dawley)大鼠的頸動(dòng)脈或經(jīng)小腦延髓池注射至髓腔內(nèi)?；蜣D(zhuǎn)移的 3-4天后，將大鼠處死，制備腦組織切片但不固定。在焚光顯微鏡下觀察熒 光。如圖16D的結(jié)果所示，綠色焚光蛋白(GFP)的腦內(nèi)表達(dá)在注射至頸動(dòng)脈 或經(jīng)小腦延髓池注射至髓腔內(nèi)的情況下都可觀察到。另一方面，當(dāng)利用 HVJ-AVE脂質(zhì)體經(jīng)大鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行類似的基因轉(zhuǎn)移時(shí)，未觀察到腦內(nèi)GFP 表達(dá)。
(13.4:家兔眼部)
pCMV-NK4由大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系研究科中村敏一教授等友情贈(zèng)送，該質(zhì) 粒是將人HGF(肝細(xì)胞生長因子)基因的突變體，NK4 cDNA (1.4kb)克隆至pCDNA3 (InVitrogen， SanDiego， CA)的HindlII/Xbal位點(diǎn)而構(gòu)建成的。
用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的制備方法類似的方法制備HVJ 包膜載體，不同的是，使用400或800昭pCMV-NK4以及10000 HAU的滅 活HVJ。 pCMV-NK4是表達(dá)能抑制HGF功能的HGF突變體的一種載體。 將50pl該載體(1/6的該制品)注射至已用重組VEGF塊處理以誘導(dǎo)血管生成 的家兔角膜組織中。7天后，將家兔處死，觀察眼內(nèi)的血管生成。結(jié)果如圖 16E所示。pCMV-NK4以劑量依賴的方式抑制由VEGF誘導(dǎo)的血管生成。 (13.5:大鼠肺動(dòng)脈)
用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的制備方法類似的方法制備含 pSV-LacZ (Promega， Madison, WI)的HVJ包膜載體，其中pSV-LacZ含有在 SV40啟動(dòng)子控制下的LacZ基因。將50^1該載體(1/6的該制品)注射至大鼠 氣管。基因轉(zhuǎn)移的3天后，將大鼠處死，組織用1%戊二醛固定，然后用 X-gal顯像動(dòng)脈中的LacZ表達(dá)。結(jié)果見圖16F。在將HVJ包膜載體經(jīng)肺動(dòng) 脈引入的情況下，也觀察到支氣管上皮中有基因表達(dá)(資料未顯示)。
(實(shí)施例I4:病毒包膜載體作為藥物運(yùn)送系統(tǒng)(DDS)的功能)
本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體還可作為寡核苷酸或誘餌(decoy)核酸治療的有 效藥物運(yùn)送系統(tǒng)。
(141:熒光寡核苷酸的導(dǎo)入)
利用本發(fā)明的病毒包膜載體將熒光標(biāo)記的寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。
20體寡核苷酸(5，匿CCTTgAAGGGATTTCCCTCC匿3，) (194嗎/92pl BSS) 在其5'位置用FITC標(biāo)記，將其與10,000 HAU的HVJ(已用198 mJ/cm2的紫 外線滅活)沉淀混合。加入Triton X-100(終濃度0.24%)，將該混合物于水 上靜置1分鐘。加入lfilBSS，將該混合物離心(15，000rpm， 15分鐘，4'C)。 在沉淀中加入100|ilPBS,將該混合物保存在-20。C。 l個(gè)月后，將該混合物 解凍，取10pl與5嗎硫酸魚精蛋白混合，與5,000,000 BHK-21細(xì)胞(于0.5 ml 培養(yǎng)基中)一起保溫(10分鐘，60分鐘)。導(dǎo)入后的第二天，在熒光顯微鏡下 觀察細(xì)胞的熒光。結(jié)果，10分鐘后獲得約10%的寡核苷酸導(dǎo)入效率(圖17B), 60分鐘后寡核芬酸已導(dǎo)入80%或更多的細(xì)胞(圖17B)。
(14.2:用Stat6誘飾核酸治療接觸性皮炎)
利用本發(fā)明的病毒包膜載體將誘餌核酸導(dǎo)入細(xì)胞。
將含有Stat6 DNA結(jié)合序列(5，-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT隱3，和5'陽CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA隱5', (Wang, L.H.等 血液95， 1249-1257， 2000))的雙鏈核酸(250嗎/300|11 BSS)與30,000 HAU的 HVJ(已用99 mJ/cm2的紫外線滅活)沉淀混合。
加入Triton X-100 (終濃度0.24%),將該混合物于冰上靜置1分鐘。 加入lmlBSS，將該混合物離心(15，000rpm， 15分鐘，4'C)。在沉淀中加入 300ji1 PBS,將該混合物保存在-20。C。給小鼠皮下注射該HVJ包膜載體， 導(dǎo)致對IgE-誘導(dǎo)型變態(tài)反應(yīng)和遲發(fā)型皮膚反應(yīng)的抑制。
(實(shí)施例15:向懸浮細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移)
用CCRF-CEM、 NALM-6、 K-562 (其類似人白血病細(xì)胞)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。
將200i^g pCMV-螢光素酶(92pl)與10,000 HAU的滅活HVJ(99 mJ/cm2 紫外線)沉淀混合。
加入Triton X-100 (終濃度0.24%)，將該混合物于冰上靜置1分鐘。 力口入lmlBSS，將該混合物離心(15，000rpm, 15分鐘，4°C)。在沉淀中加入 300(il PBS,由此制備HVJ包膜載體。使60^1載體(相當(dāng)于2,000 HAU)、硫 酸魚精蛋白、及4,000,000該懸浮細(xì)胞在1.5 ml Eppendorf管中混合，離心 (10，000-15，000rpm, 10分鐘，2(TC)。然后，在沉淀中加入培養(yǎng)液，將混合 物置于培養(yǎng)皿中。l天后，測定細(xì)胞的螢光素酶活性。
所用細(xì)胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)當(dāng)使用HVJ-脂質(zhì)體或現(xiàn)有脂 質(zhì)體試劑(Gibco BRL的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine),脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑 (lipofectin))時(shí)顯示極低的導(dǎo)入效率。但如圖18所示，觀察到較高的向這些 細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的效力。
優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)移條件如下加入600-l,000[ig/ml硫酸魚精蛋白，于20 。C以10,000 rpm或15,000 rpm離心10分鐘。未觀察到與HVJ包膜載體相關(guān) 的顯著細(xì)胞毒活性。離心和硫酸魚精蛋白的添加是基因轉(zhuǎn)移所必需的。
(實(shí)施例16:向癌組織的基因轉(zhuǎn)移)
將354嗎pCMV-螢光素酶(92pl)與34,000 HAU的滅活HVJ(99 mJ/cm2 紫外線)沉淀混合。加入Triton X-100 (終濃度0.24%),將該混合物于冰上 靜置1分鐘。加入lml BSS，將該混合物離心(10,000 rpm-15，000 rpm, 10 分鐘，20°C)。在沉淀中加入300(il PBS, -20。C保存。l天后，將該混合物 與500|ig/ml或1000昭/ml硫酸魚精蛋白混合。取100|il注射至小鼠黑素瘤B16-F1的腫瘤實(shí)體(直徑7-8 mm)中。1天后測定螢光素酶活性。如圖19 所示，在腫瘤實(shí)體中觀察到基因表達(dá)。優(yōu)選硫酸魚精蛋白的濃度為 500昭/ml。另一方面，使用較低濃度的硫酸魚精蛋白檢測不到基因表達(dá)。
(實(shí)施例n:皰滲病毒包膜載體的制備)
(n.i:滅活病毒的制備)
單純皰滲病毒1型(HSV-1) (101Q空斑形成單位/ml)由大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系研 究科細(xì)菌學(xué)專業(yè)的山西教授友情贈(zèng)送。根據(jù)培養(yǎng)的猴細(xì)胞(Vero細(xì)胞)中病毒 空斑的形成來檢查該病毒的滅活條件。當(dāng)病毒用p-丙醇酸內(nèi)酯(BPL)0.05。/c) 滅活時(shí)，空斑以9.1 x 10"(空斑/Vero細(xì)胞)的頻率出現(xiàn)在Vero細(xì)胞中。另一 方面，當(dāng)病毒用200或400mJ/cn^紫外線滅活時(shí)，空斑出現(xiàn)頻率分別為4.3 x 10-4或2.2 x 1(y6(空斑/Vero細(xì)刀包)。
(17.2:利用滅活病毒進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移)
將10011lHSV-l(l()9顆粒)用620itdPBS稀釋，用400 mJ/cm2紫外線照射 該稀釋液。取其10%(72|11)與DNA(pCMV-螢光酶素8.83昭/^1)混合。于冰上 加入8ji1 3% Triton X-100(終濃度0.24%), 1、 2、 3、 4、 5、或6分鐘后， 加入lml PBS以稀釋該溶液。每種樣品取100|il，導(dǎo)入BHK-21細(xì)胞(在6 孔板中)。將細(xì)胞培養(yǎng)在含10。/。胎牛血清(FCS)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基 (DME)中。在另 一實(shí)驗(yàn)中，每種樣品取100|il與5嗎硫酸魚精蛋白混合，然 后導(dǎo)入BHK-21中。將樣品于培養(yǎng)箱(37。C， 5%032)中放置60分鐘后，培 養(yǎng)液用10。/。FCS-DME更換。22小時(shí)后測定螢光素酶活性。如圖20所示， 用本發(fā)明方法制備的皰疹病毒包膜載體具有較高基因轉(zhuǎn)移效力。經(jīng)形態(tài)學(xué) 觀察，沒有一種樣品顯示任何細(xì)胞毒活性。
皰滲病毒包膜載體用Triton-X100處理5分鐘，于-80。C保存2天，然后 解凍，再次加入BHK-21細(xì)胞中，測定導(dǎo)入效力。這一次，在導(dǎo)入后60分 鐘時(shí)加入10%FCS-DME(2.5 ml/孔)，培養(yǎng)過夜，然后測定活性。對血清的 效應(yīng)以及載體的量進(jìn)行研究。
如圖21所示，即使在-80。C保存2天后仍具有較高基因轉(zhuǎn)移效力。用添 加了 10%血清的培養(yǎng)基比用無血清培養(yǎng)基的導(dǎo)入效力高。用200^1載體溶 液(估計(jì)2.8 x 107個(gè)病毒顆粒/孔)比用100^1載體溶液(估計(jì)1.4xl(^個(gè)病 毒顆粒/孔)的基因轉(zhuǎn)移活性高。
(17.3:利用滅活病毒進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移)根據(jù)以上內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可顯而易見地認(rèn)識到，本發(fā)明利用表 面活性劑產(chǎn)生包膜載體的技術(shù)不僅可應(yīng)用于HVJ,還可應(yīng)用于更大范圍的 具有脂質(zhì)膜的包膜病毒。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可輕易地利用任何其 它包膜病毒，按本發(fā)明的公開內(nèi)容，制備用于基因轉(zhuǎn)移的包膜載體。從而 可產(chǎn)生利用了屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、 副粘病毒禾牛、正粘病毒禾牛、布尼亞病毒-牛、彈4犬病毒牙牛、痘病毒矛牛、皰滲
病毒科、桿狀病毒科、嗜肝DNA病毒科等的病毒的包膜載體。相應(yīng)地，可 以認(rèn)為，將目標(biāo)導(dǎo)入特定器官可利用病毒的組織針對性來實(shí)現(xiàn)。例如，利 用了皰滲病毒的包膜載體可作為導(dǎo)向神經(jīng)的載體來應(yīng)用；利用Epstein-Barr 病毒的包膜載體可作為導(dǎo)向淋巴細(xì)胞的載體來應(yīng)用；利用了流感病毒的包 膜載體可作為導(dǎo)向呼吸器官的載體來應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案在本說明書中作為舉例來描述。但顯然， 在不違背本發(fā)明的精神和范圍的前提下可作各種修改。具體是，盡管本說
明書中的實(shí)施例在利用滅活型HVJ的基因轉(zhuǎn)移載體方面進(jìn)行了描述，但本 領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，利用不同于HVJ的其它滅 活病毒制備本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體，也可不通過滅活步驟而利用類似的制 備方法來制備本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體。因此，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求書 來限定。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供了 一種新的基因轉(zhuǎn)移方法，該方法操作簡單并具有很好的 基因轉(zhuǎn)移效力。據(jù)認(rèn)為這使得能快速篩選基因文庫。本發(fā)明還提供了一種 進(jìn)行大量篩選的試劑盒，它包含本發(fā)明的病毒包膜載體。此外，本申請?zhí)?供的病毒包膜載體可耐受較長期的冷凍保存，使得它無需在使用時(shí)臨時(shí)制 備。從而可極大地簡化操作過程，并可實(shí)現(xiàn)以大量產(chǎn)生的導(dǎo)入載體為基礎(chǔ) 的勻質(zhì)基因轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移栽體使得基因轉(zhuǎn)移比任何傳統(tǒng) 的基于HVJ制備的載體更有效，并使得可將基因轉(zhuǎn)移至比傳統(tǒng)方法更大范 圍的體內(nèi)組織中。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移載體的用于給與藥物的藥物運(yùn)送 系統(tǒng)，藥物篩選系統(tǒng)，以及用于基因治療的載體。
權(quán)利要求
1.仙臺病毒(HVJ)的滅活病毒包膜，其是從病毒分離并純化得到的，在該包膜中，融合活性所需的病毒蛋白的比例與野生型病毒的相同。
2. 權(quán)利要求1的滅活病毒包膜，其未與脂質(zhì)體融合。
3. 權(quán)利要求1的滅活病毒包膜，其是野生型的或重組的。
4. 權(quán)利要求1-3之一的滅活病毒包膜，其中所述滅活經(jīng)UV輻射或經(jīng) 烷基化試劑處理而實(shí)現(xiàn)。
5. 權(quán)利要求1-4之一的滅活病毒包膜，其是通過純化HVJ、再進(jìn)行 33-198 mJ/cm2的UV輻射、然后離心而制得的包膜。
6. 權(quán)利要求1-5之一的滅活病毒包膜，其是通過純化HVJ、再進(jìn)行 33-165 mJ/cm2的UV輻射、然后離心而制得的包膜。
7. 權(quán)利要求l-4之一的滅活病毒包膜，其中純化的HVJ用烷基化試劑 處理、然后離心。
8. 權(quán)利要求7的滅活病毒包膜，其中所述烷基化試劑是P-丙醇酸內(nèi)酯。
9. 權(quán)利要求8的滅活病毒包膜，其中p-丙醇酸內(nèi)酯的濃度為0.0025 % -0.025 % 。
10. 權(quán)利要求8的滅活病毒包膜，其中(3-丙醇酸內(nèi)酯的濃度為0,0075 % -0.025 % 。
11. 權(quán)利要求l-10之一的滅活病毒包膜，其中所述病毒蛋白是F1蛋 白和HN蛋白。
12. 權(quán)利要求l-10之一的滅活病毒包膜，其中所含F(xiàn)1/HN蛋白之比與 野生型的相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包膜載體，還涉及通過將外源基因?qū)霚缁畈《镜陌?，?jīng)由凍融處理或與表面活性劑混合，來制備基因轉(zhuǎn)移載體。本發(fā)明還提供含有該基因轉(zhuǎn)移載體的基因治療藥用組合物，含有該基因轉(zhuǎn)移載體的試劑盒，以及應(yīng)用該基因轉(zhuǎn)移載體的基因轉(zhuǎn)移方法。
文檔編號C12N15/87GK101302536SQ20081000162
公開日2008年11月12日 申請日期2001年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月2日
發(fā)明者金田安史 申請人:安增子摩祺株式會社;金田安史