專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于發(fā)酵制備尸胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的主題在于重組微生物，在該重組微生物中增強(qiáng)用于編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核苷酸，且在使用該重組微生物情況下發(fā)酵生產(chǎn)尸胺(1，5-二氨基戊烷)，其中優(yōu)選使用可再生的原材料如，例如葡萄糖、蔗糖、糖蜜等等用作碳源。技術(shù)背景聚酰胺(PA)是一類(lèi)重要的聚合物，從它們可以制取一系列用于汽車(chē)、體育和生活工業(yè)的特種塑料。二胺是這些聚胺的重要單體單元。其與二羧酸一起縮合以生產(chǎn)各種聚合物，二胺和二羧酸的鏈長(zhǎng)決定塑料的性質(zhì)。迄今為止，二胺是由石油基原材料(Albrecht,Klaus等人；Plastics;Winnacker-Kuechler:ChemischeTechnik(第5版)(2005),5465-819)經(jīng)二羧酸中間體或者通過(guò)氨基酸的化學(xué)的脫羧作用(Suyama,Kaneo.TheDecarboxylationofAminoAcids(4),YakugakuZasshi,(1965),Vol.85(6),513-533)進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)。由于油價(jià)升高，迅速轉(zhuǎn)變到由可再生的原材料通過(guò)生物工程學(xué)的方法(如，例如發(fā)酵)合成二胺是理想的。在該類(lèi)問(wèn)題的背景下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從生產(chǎn)賴(lài)氨酸的微生物開(kāi)始，通過(guò)引入編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的任選地異源基因可以產(chǎn)生尸胺生產(chǎn)者。能夠生產(chǎn)尸胺的有機(jī)體在以下文獻(xiàn)中得到描述(Tabor,Herbert;Hafner,EdmundW.;Tabor,CeliaWhite.ConstructionofanEscherichiacolistrainunabletosynthesizeputrescine,spermidine,orcadaverine:characterizationoftwogenescontrollinglysinedecarboxylase.JournalofBacteriology(1980),144(3),952-6,TakatsukaYumiko;KamioYoshiyukiMoleculardissectionoftheSelenomonasruminantiumcellenvelopeandlysinedecarboxylaseinvolvedinthebiosynthesisofapolyaminecovalentlylinkedtothecellwallpeptidoglycanlayer.Bioscience,biotechnology,andbiochemistry(2004),68(1),1-19)。在增加尸胺的合成的嘗試中，使用了具有用于過(guò)表達(dá)宿主同源的賴(lài)氨酸脫羧酶(cadA)的質(zhì)粒的大腸桿菌菌林。這種大腸桿菌菌株過(guò)表達(dá)同源的cadA基因后，生產(chǎn)尸胺的量增加(JP2002-223770)。在更進(jìn)一步發(fā)展中，和在大腸桿菌中培養(yǎng)和表達(dá)cadA之后，這些有機(jī)體被用來(lái)作為用于轉(zhuǎn)化外部進(jìn)料賴(lài)氨酸的全細(xì)胞催化劑(JP2002-223771、JP2004-000114、EP1482055),其中所述脫羧酶也可以呈遞于大腸桿菌細(xì)胞表面上(JP2004-208646)。另外的方法是通過(guò)分離的cadA酶將賴(lài)氨酸-HC1轉(zhuǎn)化為尸胺(JP2005-060447)。生態(tài)方面是關(guān)鍵性的進(jìn)步，:發(fā)酵方法中，、產(chǎn)物是直接地獲得的:、
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人的目的是提供用于從可再生的原材料發(fā)酵生產(chǎn)尸胺的新方法。本發(fā)明的主題在于具有高L-賴(lài)氨酸滴定度的產(chǎn)尸胺重組微生物，其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核苷酸以與作為親株的、這種酶未被修飾的微生物相比較增強(qiáng)量存在。限定詞"具有高賴(lài)氨酸滴定度"表明該親抹優(yōu)選為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸生產(chǎn)者，它在更大量地生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸和在細(xì)胞或者在周?chē)l(fā)酵培養(yǎng)基中積聚L-賴(lài)氨酸方面不同于初始菌抹(如，例如，野生型菌抹)。該滴定度是按質(zhì)量/體積(g/l)測(cè)量的。在野生型菌林中，嚴(yán)格的調(diào)節(jié)機(jī)制阻止代謝物(如L-氨基酸)的生產(chǎn)超過(guò)該自身需要的量，并阻止它們釋放到培養(yǎng)基中。因此，該被廠家稱(chēng)為氨基酸生產(chǎn)者的菌株的構(gòu)造要求克服這些代謝調(diào)節(jié)。誘變方法，采用挑選和選擇突變體以消除調(diào)節(jié)機(jī)制并改善這些微生物的性能。這樣獲得的菌抹對(duì)代謝物(如，例如，對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨乙基)半胱氨酸或者纈氨酸類(lèi)似物2-p塞唑丙氨酸(2-Thiazoloalanin)有抗性并產(chǎn)生化合物(例如L-氨基酸如L-賴(lài)氨酸或者L-纈氨酸)。很多年來(lái)，還使用了重組DNA技術(shù)的方法，通過(guò)增強(qiáng)或者減弱各氨基酸生物合成基因和研究對(duì)化合物生產(chǎn)的影響，使用產(chǎn)L-氨基酸的菌林(例》口,谷氨酸才奉卄犬4干菌(Co^ywe6a"en.wmg/wto/m'cwm)和大腸才干菌)以進(jìn)行定向菌林改進(jìn)。關(guān)于谷氨酸棒狀桿菌的生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物工程學(xué)的綜述可以在以下文獻(xiàn)中找到在"HandbookofCorynebacteriumglutamicum"(編者L.Eggeling和M.Bott,CRCPress,Taylor&Francis,2005);在JournalofBiotechnology(總編A.Piihler)的專(zhuān)刊中，題目為"ANewErainCorynebacteriumglutamicumBiotechnology"(JournalofBiotechnology104/1-3,(2003));和在T.Scheper(主編)的書(shū)中"MicrobialProductionofL畫(huà)AminoAcids"(AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology79,SpringerVerlag,Berlin,德國(guó)，2003)。谷氨酸棒狀桿菌的基因組的核苷酸序列在Ikeda和Nakagawa(AppliedMicrobiologyandBiotechnology62，99-109(2003))中,在EPU08790和在Kalinowski等人的(JournalofBiotechnology104/1-3,(2003))中得到描述。編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的適當(dāng)?shù)亩嗪塑账峥梢詮囊韵挛⑸锏木ǐ@得,例如，大腸桿菌(五sc/zen'c/naco//)、耐石咸芽孢桿菌(^2c,〃z^/za/o(iwram)、蠟樣芽孑包桿菌(Bad〃z^cerew力、枯草芽孢桿菌(i^a"〃w51sw6""力、蘇云金芽孑包桿菌(Sa"'〃wsf/mn力ge"w、)、伯克霍爾德氏菌(SwA:/2oAie〃'aam6z/an'a)、越南伯克霍爾德'氏菌(SwA/zoAien'av/e^ame/is7'a)、石竹伯克霍爾德、氏菌(丑2^A;/zo/t/en'ace"oce/a/7'a)、青紫色素4干菌(C7zromo6""e〃'wmv,'o/acewm)、反芻月開(kāi)j單月包菌(Se/ewomo"asrwm/waw/7wm)、霍舌U瓜菌(F7^,'oc/zc>/erae)、副溶血孑瓜菌(r/6n'opara/z(3e/7o(y〃'cm)、天藍(lán)色鏈霉菌(51/7，麵;^"(96//'610/0。、毛鏈霉菌(iSVreT^omycwpo/oyz^)、噴蝕艾肯氏菌(￡7/^""〃<3conxxie"力、嗜氨基酸真^干菌(Zw6""e〃'wwac/c/"mz'"op/z,7ww)、土^立熱弗朗西絲氏菌(Fraw"'"〃afw/a"'e肌力、Get^(3c/〃1^A:鼎加p/n7z^、傷寒沙門(mén)氏菌(Sa/mowe〃a妙/z/)、E^另寒沙、門(mén)氏菌(Sa/附o"e〃a(yp/n'柳wn'wm)、蟲(chóng)奪房p合夫尼亞菌(/7a/m'aa/ve/)、月囟月莫炎奈瑟氏球菌(A^z'5^en'ofmem"g7力'(sfes1)、嗜酸熱原體(77zermo//cwmaac^o//n7wm)、惡性癡原蟲(chóng)(尸/as70(i/wm/a/c^3^rwm)、耐輻射動(dòng)球菌(^力eococcz^ra^由/era—、(9ceawc^a"'〃ws//^e腦's、火球菌(尸jvrococcwsa6jAw/)、尸oroc/2/orococcus"mo77'"z^、普通變形診干菌(尸n^eus1vw/gan外紅育菌(朋0(io/erajc/e/T抄e(iwce朋)、S"cc/2arap/zagi^(iegradcmL月申炎鏈球菌(5Vr印fococcz^/wewmom'ae)、聚i求藍(lán)纟田菌屬的物種(Synechococcussp.)?？捎迷诒景l(fā)明的方法的適當(dāng)?shù)馁?lài)氨酸脫羧酶被理解為能夠脫羧賴(lài)氨酸的酶和它們的等位基因或突變體。根據(jù)本發(fā)明使用的用于編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核苷酸優(yōu)選地源于大腸桿菌SEQIDNO:1。后者在國(guó)際可用的數(shù)據(jù)庫(kù)中(如，例如，美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館和國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的數(shù)據(jù)庫(kù))以登錄號(hào)NC007946是可免費(fèi)獲得的。相同的序列也可在巴斯德研究所(法國(guó))在colibri網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器以編號(hào)b4131或者基因名cadA免費(fèi)獲得。該相同序列也可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器ExPasy以編號(hào)P0A9H4或者基因名cadA免費(fèi)獲得，該網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器由瑞士生物信息學(xué)研究所維護(hù)。使用產(chǎn)生提高量L-賴(lài)氨酸的本發(fā)明的微生物的措施不能從現(xiàn)有技術(shù)中推導(dǎo)出來(lái)。相反地，US5,827,698描述了降低賴(lài)氨酸脫羧酶的活性提高了大腸桿菌中L-賴(lài)氨酸的產(chǎn)量。在該產(chǎn)尸胺的重組細(xì)胞中另外的過(guò)表達(dá)編碼被稱(chēng)為尸胺/賴(lài)氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核普酸有助于尸胺的生產(chǎn)，優(yōu)選地，該多核苷酸從大腸桿菌(SEQIDN0:3;TC2.A.3.2.2)中獲得，該多核苦酸促進(jìn)上述的化合物從細(xì)胞向培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)。其他合適的尸胺/賴(lài)氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白源自于例如大腸桿菌、嗜酸熱原體或者霍亂弧菌的菌抹。使用能自然地輸出尸胺或者相關(guān)二胺，或者由于突變獲得能輸出尸胺或者相關(guān)二胺的這種能力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是可行的。本發(fā)明還包括谷氨酸棒狀桿菌的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過(guò)表達(dá)，所述基因編碼催化尸胺的輸出的蛋白質(zhì)。同樣地，本發(fā)明優(yōu)選地包括在產(chǎn)尸胺的菌林中進(jìn)行無(wú)竟?fàn)幮再?lài)氨酸或者精氨酸的輸出，即，相應(yīng)的輸出基因或者輸出功能以降低水平存在或者是被關(guān)閉的。本發(fā)明的主題在于重組微生物，特別涉及棒狀桿菌，其包含增強(qiáng)量的編碼上述的蛋白質(zhì)的多核苦酸。優(yōu)選地增強(qiáng)、特別是過(guò)表達(dá)該編碼賴(lài)氨酸脫羧酶和/或賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核普酸序列。優(yōu)選的微生物來(lái)自腸桿菌科，特別地為埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和特別地為大腸桿菌屬物種和枯草芽孢桿菌屬物種，提高尸胺產(chǎn)量的賴(lài)氨酸脫羧酶可以為內(nèi)源性的或者外源性的。在根據(jù)本發(fā)明的重組微生物中，所述編碼賴(lài)氨酸脫羧酶和/或賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的被過(guò)表達(dá)多核苷酸可以來(lái)自于不同的科或?qū)俚奈⑸?。由于上述基因的過(guò)表達(dá)，分別地或者共同地，同上述基因沒(méi)被過(guò)表達(dá)的微生物相比，這些微生物在增加程度上生產(chǎn)尸胺。根據(jù)本發(fā)明的重組微生物通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組基因工程方法形成。通常，具有上述基因的載體通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入到細(xì)胞中。適當(dāng)?shù)姆椒梢栽赟ambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,1989)中找到。本發(fā)明的主題還在于載體，特別涉及到質(zhì)粒，其包含根據(jù)本發(fā)明使用的多核苷酸和視需要在細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制。同樣地，本發(fā)明的主題在于重組微生物，其已經(jīng)用上述的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本文中，該兩種多核苷酸可以是在單一啟動(dòng)子控制下，或者兩種啟動(dòng)子控制下。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)"描述在微生物中一種或多種酶或者蛋白質(zhì)在胞內(nèi)的活性或者濃度的增加，該酶或者蛋白質(zhì)由相應(yīng)的DNA進(jìn)行編碼，其中例如通過(guò)使一種或多種基因的、一種或多種ORF的拷貝數(shù)增加至少一個(gè)(l)拷備，通過(guò)功能連接強(qiáng)啟動(dòng)子與基因，或者通過(guò)使用編碼相應(yīng)的具有高活性的酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因或ORF，和，視需要通過(guò)結(jié)合這些措施。在大腸桿菌中l(wèi)ac、tac和trp被稱(chēng)為強(qiáng)啟動(dòng)子。開(kāi)放閱讀框(ORF)指的是編碼或能編碼蛋白質(zhì)或多肽或核糖核酸的核普酸序列片段，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，沒(méi)有功能歸于這些核苷酸序列片段。在功能已經(jīng)分配給核苷酸序列的相關(guān)片段之后，通常叫做基因。等位基因通常被理解是指所給基因的替換形式。這些形式的區(qū)別在于在核苦酸序列中的差異?；虍a(chǎn)物泛指由核苷酸序列(即ORF、基因或者等位基因)編碼的蛋白質(zhì)、或者被編碼的核糖核酸。通過(guò)增強(qiáng)、特別是過(guò)表達(dá)的方法，通常提高所述蛋白質(zhì)的活性或者濃度至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%、或者500%,最大直至1000%或者2000%(以野生型蛋白質(zhì)的活性或者濃度，或者相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)未重組的微生物或者親抹中的蛋白質(zhì)的活性或者濃度為基準(zhǔn))。未重組微生物或親林理解為是指在其上進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的增強(qiáng)或過(guò)表達(dá)的微生物。所述基因或者基因構(gòu)建體可以或者存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，或者在該染色體中被整合和擴(kuò)增?；蛘?，所述基因的過(guò)表達(dá)還可以通過(guò)改變培養(yǎng)基組成和過(guò)程控制(Kulturfiihrung)來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了提高cadA等位基因的拷貝數(shù)，合適的是在棒狀細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒。大量已知的質(zhì)粒載體如，例如，pZl(Menkel等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1989)64:549-554),pEKExl(Eikmanns等人:Gene102:93-98(1991))或pHS2-l(Sonnen等人,Gene107:69-74(1991))是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519、pBLl或pGAl。其他的質(zhì)粒載體如，例如那些基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters66,119-124(1990))或pAGl(US-A5,158,891)的質(zhì)粒載體，可以相同方式進(jìn)行使用。在Tauch等人(JournalofBiotechnology104(1-3),27-40(2003)中綜述了谷氨酸棒狀桿菌的質(zhì)粒載體。用于復(fù)制或者擴(kuò)增該hom-thrB操縱子的染色體基因擴(kuò)增方法(例如(1994))所描述^)也可以用于提高拷貝數(shù)。在該方法中，完整的基因或者等位基因被克隆到能夠在宿主(一般地為大腸桿菌)中、但不能在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體中。合適的載體是，例如，pSUP301(Simon等人，Bio/Technology1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等人，Gene145,69-73(1994))，pGEM-T(PromegaCorporation,Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman,JournalofBiologicalChemistry269:32678-84(1994);US-A5,487,993),pCR⑧Blunt(Invitrogen公司，Groningen,Netherlande;Bernard等人，JournalofMolecularBiology,234:534-541(1993))，pEMl(Sch畫(huà)pf等人，JournalofBacteriology173:4510-4516(簡(jiǎn)))或pBGS8(Spratt等人，Gene41:337-342(1986))。包含待擴(kuò)增的基因或者等位基因的質(zhì)粒載體隨后通過(guò)接合或者轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)移到所希望的谷氨酸棒狀桿菌菌林。該接合方法例如在Schafer等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60,756-759(1994))中得到描述。專(zhuān)爭(zhēng)4匕方〉去在^f列3口Thierbach等人(AppliedMicrobiologyandBiotechnology29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(Bio/Technology7,1067-1070(1989))以及Tauch等人(FEMSMicrobiologicalLetters123,343-347(1994))中得到描述。通過(guò)"交換，，事件進(jìn)行同源重組后，所得菌抹包含至少兩個(gè)拷貝的所述基因或等位基因。特別地，還可以使用如在WO03/014330中描述的串聯(lián)擴(kuò)增方法或者如在WO03/040373中描述的在期望的位點(diǎn)上通過(guò)整合進(jìn)行擴(kuò)增的方法以使拷貝數(shù)提高至少1、2或者3。術(shù)語(yǔ)"減少"或者"以減少"描述了在微生物中一種或多種由相應(yīng)DNA編碼的酶或者蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性的減少或關(guān)閉，其中例如使用弱的啟動(dòng)子，或者使用編碼相應(yīng)的低活性酶的基因或者等位基因，或者通過(guò)對(duì)相關(guān)基因或者酶或者蛋白質(zhì)滅活，和視需要結(jié)合這些方法。通過(guò)該減少措施，相應(yīng)的蛋白質(zhì)的活性或者濃度通常被減少到野生類(lèi)型蛋白質(zhì)的活性或者濃度、或者起始微生物中該蛋白質(zhì)的活性或者濃度的0-75%、0-50%、0-25%、0-10%、或者0-5%。"起始微生物"理解為是指在其中進(jìn)行相應(yīng)基因減少的微生物。要求保護(hù)的特別地為棒狀桿菌，在其中存在增強(qiáng)的，優(yōu)選過(guò)表達(dá)的編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的上述多核苷酸。因?yàn)榘魻顥U菌不天然地包含任何編碼這種酶的多核苷酸，所以已經(jīng)存在編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的來(lái)自于異源有機(jī)體的基因之一的拷貝被稱(chēng)為過(guò)表達(dá)。本發(fā)明的主題還在于生產(chǎn)尸胺的方法，其中微生物、特別地為棒狀桿菌，用上述的多核苷酸之一進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得的重組細(xì)菌在合適的培養(yǎng)基中和在適于表達(dá)由這種多核苷酸編碼的賴(lài)氨酸脫羧酶條件下被發(fā)酵，累積并分離形成的尸胺，視需要還與來(lái)自發(fā)酵液的其它溶解組分和/或該生物量(^0至100%)—起被分離。特別地，本發(fā)明的主題在于生產(chǎn)尸胺的方法，其中通常進(jìn)行以下步驟a)在適于形成酶和尸胺的條件下進(jìn)行重組微生物、特別是棒狀桿菌的發(fā)酵，其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的核苷酸序列，且優(yōu)選編碼被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸，以增強(qiáng)的量、特別地以過(guò)表達(dá)的量存在，和b)尸胺在發(fā)酵液和/或在上述的細(xì)菌的細(xì)胞中的累積。隨后可以對(duì)尸胺從該發(fā)酵液和/或在上述的細(xì)菌的細(xì)胞中進(jìn)行分離，視需要，來(lái)自發(fā)酵液的組分和/或該生物量也部分地或者完全地被去除，或者完全地保留在產(chǎn)物中。來(lái)自大腸桿菌的cadA基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:1中。在棒狀桿菌屬中，特別地提及在本專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)已知的谷氨酸棒狀桿菌物種。用于本發(fā)明的微生物的起始物料例如為已知的谷氨酸棒狀桿菌的野生型菌抹，如，例如谷氨酸棒狀桿菌(Co，e^a"en.應(yīng)g/她加'c謹(jǐn))ATCC13032醋谷才奉;]犬;f干菌(Co^7eZ^"en'wmacefog/w/^m/cww)ATCC15806p耆乙酰乙酸才奉4犬斥干菌(Cc^ywe6a"en'wm"cWoacz'c/o//zz7ww)ATCC13870棲#唐蜜才奉狀桿菌(CoA7"e6a"e/7'wmme/"^eco/a)ATCC17965戎A產(chǎn)氨才奉卄犬4干菌(Co^y"eZ^"e〃.wmf/zermo"m/"oge"e力FERMBP-1539黃色短桿菌CS廠eW^"e〃wm//avi/m)ATCC14067乳酸發(fā)酵短桿菌(S/^vz力a"ehwmA3"q/^me"&m)ATCC13869和谷氨酉臾才奉^l犬4干菌C8/^W6a"en.w附tZ/v"n'ca化m)ATCC14020。根據(jù)本發(fā)明使用的菌株合適的前體為已知的棒狀桿菌的菌林，該菌株具有產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的能力，如，例如以下菌株在EP0358940中描述的谷氨酸棒狀桿菌DM58-l/pDM6(=DSM4697),在EP0435132中描述的谷氨酸棒狀桿菌MH20(=DSM5714),在EP1108790中描述的谷氨酸棒狀桿菌AHP-3(=FermBP-7382),在US5250423中描述的熱產(chǎn)氨棒狀桿菌AJ12521(=FERMBP-3304),谷氨酸棒狀桿菌DM1800(GeorgiT,RittmannD,WendischVF(2005)MetabolicEngineering7:291-301)名為"ATCC"的菌4木可以從AmericanTypeCultureCollection(Manassas,VA,USA)獲得。名為"DSM"的菌4朱可以從DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ，Braunschweig,德國(guó))獲得。名為"FERM"的菌林可以從theNationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology(AISTTsukubaCentral6,1-1-1Higashi,TsukubaIbaraki,Japan)獲得。關(guān)于上組細(xì)菌的菌林的分類(lèi)學(xué)分類(lèi)的信息，尤其，在Kampfer和Kroppenstedt(CanadianJournalofMicrobiology42,989-1005(1996》和在US-A-5,250,434找到。多年來(lái)，(Liebl等人，InternationalJournalofSystematicBacteriology41(2),255-260(1991)),種名為"黃色短桿菌，，"乳酸發(fā)酵短桿菌，，和"谷氨酸棒狀桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)"的棒狀桿菌被指定到谷氨酸棒狀桿菌屬物種。種名為"棲糖蜜棒狀桿菌"的棒狀桿菌也屬于谷氨酸棒狀桿菌屬物種。適于本發(fā)明措施的微生物優(yōu)選具有產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的能力，在細(xì)胞中積聚L-賴(lài)氨酸能力或者將L-賴(lài)氨酸分泌到周?chē)鸂I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基并在那里積聚L-賴(lài)氨酸的能力。特別地，所使用的菌抹在它們被賴(lài)氨酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化之前具有在《(最大值)120小時(shí)、《96小時(shí)、<48小時(shí)、《36小時(shí)、《24小時(shí)或《12小時(shí)的時(shí)間里產(chǎn)〉(至少)lg/1、>15g/l、>20g/l或>30g/l的L-賴(lài)氨酸的能力。它們可以是已經(jīng)通過(guò)誘變和篩選、通過(guò)重組DNA技術(shù)、或者通過(guò)這兩種方法的結(jié)合產(chǎn)生的菌抹。傳統(tǒng)的體內(nèi)誘變方法可以用來(lái)進(jìn)行所述誘變，其中使用誘變劑如，例如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍，或者紫外線。此外，對(duì)于該誘變，使用體外方法如，例如用羥胺處理(Miller,J.H.:AShortCourseinBacterialGenetics.ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,1992)或者用誘變寡核普酸處理(T.A.Brown:GentechnologiefiirEinsteiger,SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg,1993)或者用如在HandbuchvonNewtonundGraham(PCR,SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg,1994)中所描迷的聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)也是可行的。對(duì)于突變的產(chǎn)生的進(jìn)一步的指導(dǎo)可以在現(xiàn)有技術(shù)和已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的教科書(shū)如，例如Knippers的教科書(shū)("MolekulareGenetik",第6版，GeorgThiemeVerlag,Stuttgart,德國(guó)，1995),Winnacker的教科書(shū)("GeneundKlone",VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim,德國(guó),1990)或者Hagemann的教科書(shū)("AllgemeineGenetik",GustavFischerVerlag,Stuttgart,1986)可以找到。當(dāng)使用體外方法時(shí)，在現(xiàn)有技術(shù)中描述的cadA基因從野生型菌林的分離的總DNA借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，視需要被克隆到合適的質(zhì)粒載體中，然后DNA經(jīng)受所述誘變方法。關(guān)于DNA序列借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增的指導(dǎo)尤其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在HandbuchvonGait:OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,UK,1984)和在Newton和Graham:PCR(SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg，德國(guó)，1994)中找到。同樣地，使用體外誘變方法也是可4亍的，該方法如，例如在已知的Sambrook等人的手冊(cè)(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,USA,1989)中得到描述。相應(yīng)方法也可以在市場(chǎng)上以所謂"試劑盒，，的形式得到，如，例如，來(lái)自Stratagene7>司(LaJolla,USA)的"QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit",其由Papworth等人(Strategies9(3)，3-4(1996))進(jìn)行了描述。隨后使用上述方法對(duì)合適的cadA等位基因進(jìn)行選擇和研究。本發(fā)明的主題在于用于發(fā)酵產(chǎn)生尸胺的菌抹，優(yōu)選棒狀桿菌，特別是谷氨酸棒狀桿菌，其具有至少一種異源表達(dá)的編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的基因，優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌的cadA。合適的還有埃希氏桿菌屬的相應(yīng)的菌抹。該優(yōu)選使用的賴(lài)氨酸脫羧酶等位基因或者基因可以通過(guò)基因置換方法被轉(zhuǎn)移到合適的菌抹之中，該基因置換方法由Schwarzer和Piihler(Bio/Technology9,84-87(1991))或Peters-Wendisch等人(Microbiology144,915-927(1998))進(jìn)行了描述。這里，所述的賴(lài)氨酸脫羧酶等位基因被克隆到不在谷氨酸棒狀桿菌中進(jìn)行復(fù)制的載體，如，例如pK18mobsacB或者pK19mobsacB(Jager等人，JournalofBacteriology174:5462-65(1992))或pCR⑧Blunt(Invitrogen公司，Groningen,Netherlande;Bernard等人，JournalofMolecularBiology,234:534-541(1993))，且這種載體隨后通過(guò)轉(zhuǎn)化或者接合被轉(zhuǎn)移到希望的谷氨酸棒狀桿菌宿主中。在通過(guò)第一次"交換，，事件和合適的第二次"交換，，事件進(jìn)行的同源重組之后，該突變成功地被引入，其中該第一次"交換，，事件引起整合，該第二次"交換"事件引起在靶基因或者靶序列中的切除。最后，可以使用在WO03/014330和WO03/040373中描述的擴(kuò)增方法。另外，除表達(dá)根據(jù)本發(fā)明使用的賴(lài)氨酸脫羧酶基因或者等位基因之外，同時(shí)地增強(qiáng)特別是過(guò)表達(dá)一種或多種賴(lài)氨酸生物合成酶對(duì)于尸胺的生產(chǎn)可以是有利的。通常優(yōu)選使用內(nèi)源性基因。"內(nèi)源性基因"或者"內(nèi)源性核苷酸序列"理解為是指存在于種群中的基因或者核苷酸序列和等位基因。在本文中，術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)"描述了在微生物中一種或多種由相應(yīng)的DNA編碼的酶或者蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或者濃度的增加，例如增加該一種或多種基因的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)的啟動(dòng)子，或者使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或者等位基因，和視需要結(jié)合這些措施。另外，為了提高賴(lài)氨酸在要求保護(hù)的有機(jī)體中的產(chǎn)量，在用上述方法生產(chǎn)的棒狀桿菌中，過(guò)表達(dá)各自生物合成途徑的、糖酵解的、糖回補(bǔ)的、戊糖磷酸循環(huán)的、氨基酸輸出的一種或多種酶，和視需要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)對(duì)于提高尸胺的產(chǎn)量可以是有利的。通常在上述措施中，使用內(nèi)源性基因是優(yōu)選的。因此，過(guò)表達(dá)一種或多種選自以下的基因?qū)τ谔岣甙魻顥U菌微生物中L-賴(lài)氨酸的產(chǎn)量是有利的編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的dapA基因如，例如在EP0197335中描述的野生型谷氨酸棒狀桿菌的dapA基因。編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因如，例如野生型谷氨酸棒狀桿菌的zwf基因，該基因在JP-A-09224661和EP-A-1108790中得到描述。在US-2003-0175911-A1中描述的編碼蛋白質(zhì)的谷氨酸棒狀桿菌的zwf等位基因，在所述蛋白質(zhì)中，例如在氨基酸序列的243位的L-丙氨酸被L-蘇氨酸取代，或者在其中245位的L-天冬氨酸被L-絲氨酸取代。在WO2005/058945中描述的編碼蛋白質(zhì)的谷氨酸棒狀桿菌的zwf等位基因，在所述蛋白質(zhì)中，例如在氨基酸序列8位的L-絲氨酸被L-蘇氨酸取代，或者在其中在321位的L-甘氨酸被L-絲氨酸取代。編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因如，例如野生型谷氨酸棒狀桿菌的pyc基因，該基因在DE-A-19831609和EP11087卯得到描述。在EP1108790中描述的編碼蛋白質(zhì)的谷氨酸棒狀桿菌的pyc等位基因，在所述蛋白質(zhì)中，在氨基酸序列的458位的L-脯氨酸被L-絲氨酸取代。在WO02/31158和特別地在EP1325135B1中描述的編碼蛋白質(zhì)的谷氨酸棒狀桿菌的pyc等位基因，其中所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸取代在l位的L-纈氨酸被L-曱石克氨酸取代，在153位的L-谷氨酸被L-天冬氨酸取代，在182位的L-丙氨酸被L-絲氨酸取代，在206位的L-丙氨酸被L-絲氨酸取代，在227位的L-組氨酸被L-精氨酸取代，在455位的L-丙氨酸^皮甘氨酸取代，和在1120位的L-天冬氨酸被L-谷氨酸取代。編碼天冬氨酸激酶的lysC基因如，例如，野生型谷氨酸棒狀桿菌的lysC基因，該基因在EP-A-1108790中被描述為SEQIDNO:281(參看登錄號(hào)AX120085和120365)，和該基因在WO01/00843描述為SEQIDNO:25(參看登錄號(hào)AX063743)。編碼抗反饋的天冬氨酸激酶變體的lysCFBR等位基因?？?反饋"的天冬氨酸激酶被理解是指與野生型相比顯示出對(duì)抑制作用敏感性降低的天冬氨酸激酶，該抑制作用由賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)和蘇氨酸的混合物或者單獨(dú)賴(lài)氨酸或者單獨(dú)的AEC引起。編碼這些脫敏天冬氨酸激酶的基因或者等位基因也被稱(chēng)為lysCFBR等位基因?，F(xiàn)有技術(shù)描述大量的編碼天冬氨酸激酶變體的lysCFBK等位基因，同野生型蛋白質(zhì)相比，該變體具有氨基酸取代。谷氨酸棒狀桿菌的野生型lysC基因的編碼區(qū)相應(yīng)于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)AX756575。下列l(wèi)ysCFBR等位基因是優(yōu)選的lysCA279T(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的279位，蘇氨酸取代丙氨酸)、lysCA279V(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的279位，纈氨酸取代丙氨酸)、lysCS301F(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的301位，苯丙氨酸取代絲氨酸)、lysCT308I(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的308位，異亮氨酸取代蘇氨酸)、lysCS301Y(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的308位，酪氨酸取代絲氨酸)、lysCG345D(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的345位，天冬氨酸取代甘氨酸)、lysCR320G(在天冬氨酸激酶蛋白的320位，甘氨酸取代精氨酸)、lysCT311I(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的311位，異亮氨酸取代蘇氨酸)、lysCS381F(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的381位，苯丙氨酸取代絲氨酸)、lysCS317A(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的317位，丙氨酸取代絲氨酸)和lysCT380I(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的380位，異亮氨酸取代蘇氨酸)。尤其優(yōu)選的是lysCF服等位基因lysCT31ll(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的311位，異亮氨酸取代蘇氨酸)和包含至少一種選自以下取代的lysCFBR等位基因A279T(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的279位，蘇氨酸取代丙氨酸)和S317A(在被編碼的天冬氨酸激酶蛋白的317位，丙氨酸取代絲氨酸)。不同的是，編碼賴(lài)氨酸輸出蛋白的lysE基因(如，例如，在DE-A-19548222中描述的野生型谷氨酸棒狀桿菌的lysE基因)被減少或被關(guān)閉。編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因如，例如在EP1108790中描述的野生型谷氨酸棒狀桿菌的ddh基因。編碼Zwal蛋白的野生型谷氨酸棒狀桿菌的zwal基因(US6，632,644)。同樣地，還要求保護(hù)埃希氏桿菌屬的產(chǎn)尸胺微生物，其中選自下列的一種或多種來(lái)自大腸桿菌的基因同時(shí)被增強(qiáng)或者過(guò)表達(dá)a)根據(jù)US5,827,698的編碼抗反饋天冬氨酸激酶的基因或者等位基因，b)編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的基因，c)編碼二氬吡咬二羧酸還原酶的基因，d)編碼琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因，e)編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫?；傅幕蛄咸幚矸ɑ蛘咧貜?fù)分批進(jìn);^理法分:地進(jìn)行培養(yǎng)以生產(chǎn)-胺。已知的培養(yǎng)方法的綜述在Chmiel的教科書(shū)(Bioprozesstechnik1.EinfiihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))中得到描述，或者在Storhas的教科書(shū)(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中得到描述。將被使用的培養(yǎng)基必須合適地滿(mǎn)足各菌抹的要求。用于各種微生物的培養(yǎng)基的描述可以在AmericanSocietyforBacteriology(WashingtonDC,,USA,1981)的手冊(cè)"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"中找到?？梢允褂玫奶荚词翘呛吞妓衔锶纾?，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、和纖維素，油類(lèi)和脂肪類(lèi)如，例如，豆油、向日葵油、花生油和椰子脂，脂肪酸如，例如，棕櫚酸、硬脂酸、和亞油酸，醇類(lèi)如，例如，甘油和乙醇，和有才幾酸如，例如，乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)地或者以混合物進(jìn)行使用?？梢允褂玫牡礊榘袡C(jī)氮的化合物如，蛋白胨、酵母提取物、肉類(lèi)提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素，或者無(wú)機(jī)化合物如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、和硝酸銨。該氮源可以單獨(dú)地或者以混合物進(jìn)4于使用。可以使用的磷源為磷酸、磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀、或者相應(yīng)的包含鈉的鹽。而且，該培養(yǎng)基還必須包含對(duì)于生長(zhǎng)必需的金屬鹽如，例如，硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除上述的物質(zhì)外，可使用必需生長(zhǎng)因子如，氨基酸和維生素。而且，可以將合適的前體添加到該培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以以單批批料形式被加到該培養(yǎng)物中，或者可以在培養(yǎng)期間以合適的方式凈皮力口入。氬氧化鉀、氨或氨水、或者酸性化合物如磷酸或者硫酸。為了控制泡沫產(chǎn)生，可以使用消泡劑如，例如，脂肪酸聚乙二醇酯。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向該培養(yǎng)基添加合適的選擇性作用物質(zhì)，如，例如，抗生素。為了維持有氧條件，氧或者含氧氣體混合物如，例如，空氣被引入到該培養(yǎng)物中。培養(yǎng)溫度一般為20。C-45。C,且優(yōu)選地在25。C-40。C。繼續(xù)該培養(yǎng)直到生產(chǎn)出最大量的尸胺為止，或者直到產(chǎn)量或者產(chǎn)率達(dá)到期望的最優(yōu)值。該目標(biāo)一般在10小時(shí)-160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。以這種方式生產(chǎn)的尸胺隨后被收集，然后優(yōu)選地進(jìn)行分離和視需要進(jìn)行純化。用于尸胺和L-氨基酸例如L-賴(lài)氨酸的測(cè)定的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。該分析可以以例如Spackman等人(AnalyticalChemistry,30，(1958),1190)描述的通過(guò)陰離子交換色譜法后接茚三酮衍生作用而進(jìn)行，或者該分析可以通過(guò)Lindroth等人(AnalyticalChemistry(1979)51:1167-1174)所描述的反相HPLC實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)使用具有高的賴(lài)氨酸滴定度的微生物用于改善的尸胺的發(fā)酵生產(chǎn)，其中賴(lài)氨酸脫羧酶基因和/或被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)被過(guò)表達(dá)。具體實(shí)施方式實(shí)施例一般技術(shù)通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行DNA操作，該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如，例如在Sambrook,J.等人(1989),MolecularCloning:alaboratorymanual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork所描述。通過(guò)使用SAWADYPwo國(guó)DNA聚合酶(PeqlabBiotechnologie,Erlangen,德國(guó))或者PlatinumPfx-DNA聚合酶(Invitrogen,Karlsruhe,德國(guó))進(jìn)行DNA擴(kuò)增。除非另作說(shuō)明，該聚合酶按廠商的說(shuō)明進(jìn)行使用。用于PCR擴(kuò)增和引入限制切割位點(diǎn)的寡核苷酸從MWG-Biotech(Ebersberg,德國(guó))獲得。通過(guò)使用READYMIXTaq聚合酶(Sigma,Taufkirchen,德國(guó))和質(zhì)粒制備由菌落PCR(Kolonie-PCR)進(jìn)行構(gòu)建的菌抹的檢測(cè)。通過(guò)使用MinElute凝膠回收試劑盒(Quiagen,Hilden,德國(guó))根據(jù)廠商指導(dǎo)純化和獲得DNA片l殳。通過(guò)QiaprepspinMiniprepKit(Quiagen,Hilden,德國(guó))分離質(zhì)粒DNA。所有的被構(gòu)建的質(zhì)粒通過(guò)限制性分析(Restriktionsanalyse)后接測(cè)序進(jìn)行-瞼證。實(shí)施例1:pEKEx2cadA的構(gòu)建pEKEx2cadA通過(guò)使用載體pEKEx2(Kleinertz等人，1991Gene102:93)進(jìn)行構(gòu)建，該載體使得被克隆的基因在異丙基-卩-D-硫代半乳糖吡喃糖普(IPTG)可誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子和lac阻抑蛋白體系(lacIq)的調(diào)控下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼cadA基因的2.2kb尺寸DNA片段通過(guò)以下寡核苷酸和來(lái)自大腸桿菌的DH5的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增SEQIDNO5:pcadAFr5'-ttgtcgacaaggagatatagatATGAACGTTATTGCAATATTGAATC-3'(Sail)SEQIDNO6:pcadARe5'-aaggatccTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC-3'(BamHI)(與該基因組序列互補(bǔ)的序列以黑體大寫(xiě)進(jìn)行打印。該擴(kuò)增物(Amplificate)中還被引入針對(duì)SalI和BamHI的限制切割位點(diǎn)，和起始密碼子上游8個(gè)核苷酸的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(aaggag)。該P(yáng)CR擴(kuò)增物用多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化(Roche,Basle,Switzerland),并被平端克隆到載體pUC18的Smal切割位點(diǎn)(Yanisch-Perron等人，1985,Gene33:103-19)。該插入的同一性和正確性通過(guò)測(cè)序進(jìn)行證實(shí)。其后，2.2kb片段從pUC18衍生物中被分離為SalI-Bamffl片段并與SalI-BamHI-切割載體pEKEx2進(jìn)行連接。所希望的質(zhì)粒根據(jù)限制消化進(jìn)行選擇，且該質(zhì)粒的一種被命名為pEKEx2cadA。實(shí)施例2:pEKEx2cadBA的構(gòu)建pEKEx2cadBA通過(guò)使用載體pEKEx2進(jìn)行構(gòu)建(Kleinertz等人，1991Gene102:93),該載體使得被克隆的基因在異丙基-卩-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子和乳糖阻抑蛋白體系(lacIq)的調(diào)控下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼cadB和cadA基因的3.6kb尺寸DNA片段通過(guò)以下寡核苷酸和來(lái)自大腸桿菌DH5的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增SEQIDNO7:pcadBAFY5'-ttggatccaaggagatatagatATGAGTTCTGCCAAGAAGATCG-3'(BamHI)SEQIDNO8:pcadBARe5'-aaggatccTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC-3'(BamHI)(與該基因組序列互補(bǔ)的序列以黑體大寫(xiě)進(jìn)行打印。向該擴(kuò)增物中引入另外的針對(duì)BamHI的限制切割位點(diǎn)，和起始密碼子上游的8個(gè)核苷酸的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(aaggag))。該P(yáng)CR擴(kuò)增物用多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化(Roche,Basel,Switzerland),并被平端克隆到載體pUC18的SmaI切割位點(diǎn)(Yamsch-Perron等人，1985，Gene33:103-19)。該插入的同一性和正確性通過(guò)測(cè)序進(jìn)行證實(shí)。其后，3.6kb片段從pUC18衍生物中被分離為BamHI片段并與BamHI切割載體pEKEx2進(jìn)行連接。所希望的質(zhì)粒根據(jù)限制消化進(jìn)行選擇，和該質(zhì)粒的一種被命名為pEKEx2cadBA。實(shí)施例3:獲得重組細(xì)胞谷氨酸棒狀桿菌DM1800的感受態(tài)細(xì)胞(Georgi等人，MetabEng.7(2005)291-301)如由Tauch等人(CurrMicrobiol.(2002)45:362-367)所描述地進(jìn)行制備。pEKEx2、pEKEx2cadA和pEKEx2cadBA的DNA通過(guò)電穿孔法被引入，在添加了50mg/l卡那霉素的來(lái)自Merck公司(達(dá)姆施塔特，德國(guó))的腦-心瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體(FEMSMicrobiolLett.,1989,53:299-303)。質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體分離出來(lái)且通過(guò)限制消化進(jìn)行表征。這樣獲得谷氨酸棒狀桿菌pEKEx2、谷氨酸棒狀桿菌pEKEx2cadA和谷氨酸棒狀桿菌pEKEx2cadBA。谷氨酸棒狀桿菌DM1800菌抹通過(guò)的特征在于如下性質(zhì)(同野生型谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032相比較)在等位基因pycP458S(丙酮酸脫羧酶)和lysCT3111(天冬氨酸激酶)中的突變，該突變引起賴(lài)氨酸產(chǎn)量的提高(GeorgiT,RittmannD,WendischVFMetabEng.2005;7(4):291-301,LysineandglutamateproductionbyCorynebacteriumglutamicumonglucose,fructoseandsucrose:rolesofmalicenzymeandfructose-1,6-bisphosphatase.MetabEng.2005.七月；7(4):291-301)。.實(shí)施例4:使用細(xì)菌生產(chǎn)尸胺該重組谷氨酸棒狀桿菌DM1800菌抹在30。C時(shí)在包含25mg/l卡那霉素的復(fù)合培養(yǎng)基CGIII上(Eggeling和Bott,Eds,HandbookofCorynebacteriumglutamicum.，CRCPress,TaylorFrancisGroup)被培養(yǎng)過(guò)夜。接著，細(xì)胞通過(guò)在每次以6000轉(zhuǎn)每分離心5分鐘進(jìn)行收集、重懸浮，吸收到0.9y。NaCl中、再次離心和最后吸收到0.9o/oNaCl中。該細(xì)^^懸液被用來(lái)接種基本培養(yǎng)基CGXII4%葡萄糖、25mg/l卡那霉素(Eggeling和Bott,Eds,HandbookofCorynebacteriumglutamicum.,CRCPress,TaylorFrancisGroup)。然后，該細(xì)胞在:30。C進(jìn)行溫育。在每種情況下進(jìn)行至少兩次獨(dú)立的發(fā)酵。在47小時(shí)之后，取出樣品以測(cè)定尸胺和氨基酸。該測(cè)定通過(guò)高壓液相色譜分析進(jìn)行(JChromat(1983)266:471-482)。發(fā)酵作用的結(jié)果示于表格l中。由此，使用被構(gòu)建和被描述的菌林提供了可以由糖微生物生產(chǎn)尸胺的方法。表格1:尸胺在谷氨酸棒狀桿菌DM1800的重組菌抹的培養(yǎng)物上清液中的累積<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>序列表<110〉DegussaGmbH<120〉用于發(fā)酵生產(chǎn)尸胺的方法<130>2006E00257<160〉8<170〉Pa.tentlnversion3.4<210>1<211>2148<212>DNA<213〉大腸桿菌<400〉1atgaacgttattgcaatattgaat,cacatgggggtttatt.ttaaa,gaagaacccat,ccgt60ga.acttcat.cgcgcgct,tga.a.cgtct,ga.a.ct,tcca.gatt,gt.ttacccga.acga.ccgtgac120gactta.ttaaa.actgat.cgaa.aa.caat,gcgcgtctgt,gcggcgttatt.tt.t,gactgggat,180a.aatataatctcgagctgtgcgaa,gaaat,tagcaaaatgaacgagaacctgccgtt,gtac240gcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacaga.tt300agcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagacc360actgacga.at,atatcaacactat,tctgcctccgctgact,a.a鄰cactgttt,aa.a.t.at,gtt420cgtgaaggtaa.atata.ctttctgt,act.cctggtcacatgggcggtactgcatt,ccagaaa480agcccggtaggtagcctgttct.at.gatttctttggtccga.ataccat.gaaat,ct.gatatt540tccat,ttcagtatctgaactgggttctctgctggatcaca.gtggtccacacaaagaagca600gaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtact660tccactgcgaacaaaattgttggtatgt.actctgctccagcaggcagcaccat.t.ctgat,t720gaccgta.a.ct.gcca.caaatcgctga.c.ccacctgat,gatga.t.ga.gcgat.gt,t,acgcca.a.t,c780tatttccgcccgacccgtaacgct,tacggtattct,tggtggtatcccacagagtgaattc840cagcacgct,accatt,gctaagcgcgtgaaa.gaaacaccaaacgcaacctggccggtacat900gctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccga.ct,t.catcaagaaa960acactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctca1020ccgatttacgaaggtaaa.tgcggtatgagcggtggccgtgt,agaagggaaagtgatttac1080gaaacccagt,ccactcacaaa.ctgctggcggcgt,t,ct.ctcaggcttccatgat'ccacgtt1140a'aaggtgacgtaaacgaagaaacct,t,taacgaagcctacatgatgcacaccaccactt,ct,1200ccgcactacggtatcgtggcgt,ccactgaaaccgctgcggcgatgatgaaaggcaat,gca1260ggtaagcgtctgatcaacggttctat,tgaacgtgcgatca.aattccgtaaagagatcaaa1320cgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtatggcagccggatcatatcga.t1380a.cgactgaa.tgct,ggccgctgcgttctgaca.gcacctggcacggcttcaaa.aacat,cgat1440aacgagcacat,gt,a,tcttgacccga.t,caaagtcaccctgctgact,ccggggatggaaa'aa1500gacggca.ccatga.gcga.ct.ttggtat,tccggccagcatcgtggcgaaat,acctcgacgaa1560catggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggt1620atcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgactttaaacgtgcgttc1680gacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgt.ctctgtatcgt,gaagatcctgaatt.c1740t'atgaaaacatgcgtat'tcaggaactggctcagaat,a.t,ccacaaactgat,tgttcaccac1800aat,ct,gccggatct.gatgt,atcgcgcat,tt,gaagt,gctgccgacgat,ggt,aat,gactccg1860tatgctgcatt.ccagaaagagctgcacggt,at.gaccgaagaagtttacctcgacgaaatg1920gtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtacccgccgggagttcctctggtaatg1980ccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgt2040gaaatcggcgctcactatccgggct,t,tgaaaccgat,a.t,tcacggtgca.taccgtcaggct2100gatggccgctataccgttaaggtattga.aa.gaaga.a鄰ca.aa朋.a.t,aa.2148<210〉2<211>715<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2MetAsnVallieAlalieLeuAsnHisMetGlyValTyrPheLysGlu151015GluProlieArgGluLeuHisArgAlaLeuGluArgLeuAsnPheGin202530lieValTyrProAsnAspArgAspAspLeuLeuLysLeulieGluAsn354045AsnAlaArgLeuCysGlyValliePheAspTrpAspLysTyrAsnLeu505560GluLeuCysGluGlulieSerLysMetAsnGluAsnLeuProLeuTyr65707580AlaPheAlaAsnThrTyrSei'ThrLeuAspVa.lSerLeuAsnAspLeu859095ArgLeuGinlieSerPhePheGluTyrAlaLeuGlyAlaAlaGluAsp100105110lieAlaAsnLyslieLysGinThrThrAspGluTyrlieAsnThrlie115120125LeuProProLeuThrLysAla.LeuPheLysTyrValArgGluGlyLys130135140TyrThrPheCysThrProGlyHisMetGlyGlyThrAlaPheGinLys145150155160SerProValGlySerLeuPheTyrAspPhePheGlyProAsnThrMet165170175LysSerAsplieSerlieSerValSerGluLeuGlySerLeuLeuAsp180185190HisSerGlyProHisLysGluAlaGluGinTyrlieAlaArgVa.lPhe195200205AsnAlaAspArgSerTyrMet,ValThrAsnGlyThrSerThrAlaAsn210215220LyslieValGlyMetTyrSerAlaProAlaGlySerThrlieLeulie225230235240AspArgAsnCysHisLysSerLeuThrHisLeuMetMetMetSerAsp245250255ValThrProlieTyrPheArgProThrArgAsnAla.TyrGlylieLeu260265270GlyGlylieProGinSerGluPheGinHisAlaThrlieAlaLysArg275280285ValLysGluThrProAsnAlaThrTrpProValHisAlaVallieThr290295300AsnSerThrTyrAspGlyLeuLeuTyrAsnThrAspPhelieLysLys305310315320ThrLeuAspValLysSerlieHisPheAspSerAlaTrpValProTyr325330335ThrAsnPheSerProlieTyrGluGlyLysCysGlyMetSerGlyGly340345350ArgValGluGlyLysVallieTyrGluThrGinSerThrHisLysLeu355360365LeuAlaAlaPheSerGinAlaSerMetlieHisValLysGlyAspVal370375380AsnGluGluThrPheAsnGluAlaTyrMetMetHisThrThrThrSer385390395400ProHisTyrGlylieValAlaSerThrGluThrAlaAlaAlaMetMet405410415LysGlyAsnAlaGlyLysArgLeulieAsnGlySerlieGluArgAla420425430lieLysPheArgLysGlulieLysArgLeuArgThrGluSerAspGly435440445TrpPhePheAspValTrpGinProAspHislieAspThrThrGluCys450455柳TrpProLeuArgSerAspSerThrTrpHisGlyPheLysAsnlieAsp465470475480AsnGluHisMetTyrLeuAspProlieLysValThrLeuLeuThrPro485490495GlyMetGluLysAspGlyThrMetSerAspPheGlylieProAlaSer500505510lieValAlaLysTyrLeuAspGluHisGlylieValValGluLysThr515520525GlyProTyrAsnLeuLeuPheLeuPheSerlieGlylieAspLysThr530535540LysAlaLeuSerLeuLeuArgAlaLeuThrAspPheLysArgAlaPhe545550555560AspLeuAsnLeuArgValLysAsnMetLeuProSerLeuTyrArgGlu565570575AspProGluPheTyrGluAsnMetArglieGinGluLeuAlaGinAsn580585590lieHisLysLeulieValHisHisAsnLeuProAspLeuMetTyrArg595600605AlaPheGluValLeuProThrMetValMetThrProTyrAlaAlaPhe610615620GinLysGluLeuHisGlyMetThrGluGluVa'lTyrLeuAspGluMet625630635640ValGlyArglieAsnAlaAsnMetlieLeuProTyrProProGlyVal645650655ProLeuValMetProGlyGluMet,lieThrGluGluSerArgProVal660665670LeuGluPheLeuGinMet,LeuCysGlulieGly675680AlaHisTyrProGly685PheGluThrAsplieHisGlyAlaTyrArgGin690695AlaAspGlyArgTyr700<210>3<211>1335<212>DNA<213〉大腸桿菌<400>3atgagttctgccaagaagatcgggctatttgcctgtaccggtgttgttgccggtaatatg60atggggagcggtattgcattattacctgcgaacct,agcaagtatcggtggtat,t.gctatc120tggggt.t.gga.ttatctctattat,tggtgcaatgt.cgctggcgtatgtat,a,tgcccgact,g180gcaacaaaaaacccgcaacaaggtggccca.a.t.tgct,t,atgccggagaaatt.t,cccctgca240tttggttttcagacaggtgttctttattaccatgctaactggattggtaacctggcgatt300ggt,attaccgctgt.a.tctta.tctttccacctt.cttcccagtattaaatgatcctgttccg360gcgggtatcgcctgtattgctatcgtct.gggta.ttt,acctttgtaa.atatgctcggcggt420act,t,gggta.agccgt,t,taaccactattggtctggtgctggttct,t,attcctgtggtgatg480actgctattgttggct.ggcatt,ggtttgatgcggcaacttatgcagcta.actggaatact.540gcggataccactgatggtcatgcgatcatt,aaaagtattctgctctgcctgtgggccttc600gtgggtgttgaatccgcagctgtaagtactggtatggttaaaaacccgaaacgtaccgtt660ccgctggcaacca.tgct,gggtactggtttagcaggtattgtttacatcgctgcgactcag"720gtgctttccggtatgtatccgtcttctgtaatggcggcttccggt,gctccgtttgcaatc780agtgcttcaact,a.tcctcggtaactgggct,gcgccgct,ggtttctgcat,tcaccgccttt,840gcgtgcct,gacttctct,gggct,cct,ggat,gatgUggt,aggccaggcaggt,gta,cgt,gcc900gctaacgacggtaacttcccgaaagtttatggtgaagt.cgacagcaacggtattccgaaa,960aaaggtctgctgctggctgcagtgaaaatgactgccctgatgatccttatcactctgatg1020aactctgccggtggtaaagcatctgacctgttcggtgaactgaccggtatcgcagtact,g1080ctgacta.tgctgccgtatt,t,cta,ctctt,gcgttgacctgat,t,cgttt,t,gaaggcgttaac1140atccgca.acttt,gtcagcctga.tct,gctctgt,actgggt,t,gcgtgttctgct.tcat,cgcg1200ct,gatgggcgcaagctcct,t,cga.gct.ggcaggta,cct,tcatcgtcagcctgat.tat.cct,g1260atgttctacgctcgcaaaatgcacgagcgccagagccactcaatggataaccacaccgcg1320tctaacgcacattaa1335<210〉4<211>444<212>PRT<2i3〉大腸桿菌<400〉4MetSerSerAlaLysLyslieGlyLeuPheAlaCysThrGlyValValAlaGlyAsnMet.MetGlySerGlylieAlaLeuLeuProAlaAsnLeu202530AlaSerlieGlyGlylieAlalieTrpGlyTrplielieSerlielie354045GlyAla,Met,SerLeuAlaTyrValTyrAlaArgLeuAlaThrLysAsn505560ProGinGinGlyGlyProlieAlaTyrAlaGlyGlulieSerProAla65707580PheGlyPheGinThrGlyVa.lLeuTyrTyrHisAlaAsnTrplieGly859095AsnLeuAlalieGlylieThrAlaValSerTyrLeuSerThrPhePhe100105110ProValLeuAsnAspProValProAlaGlylieAlaCyslieAlalie115120125ValTrpValPheThrPheValAsnMetLeuGlyGlyThrTrpValSer130135140ArgLeuThrThrlieGlyLeuValLeuValLeulieProValValMet145150155160ThrAlalieValGlyTrpHisTrpPheAspAla.AlaThrTyrAlaAla165170175AsnTrpAsnThrAlaAspThrThrAspGlyHisAlalielieLysSer180185190lieLeuLeuCysLeuTrpAlaPheValGlyValGluSerAlaAlaVal195200205SerThrGlyMet,ValLysAsnProLysArgThrValProLeuAla.Thr210215220MetLeuGlyThrGlyLeuAlaGlylieValTyrlieAlaAlaThrGin225230235240ValLeuSerGlyMetTyrProSerSerValMetAlaAlaSerGlyAla245250255ProPheAlalieSerAlaSerThrlieLeuGlyAsnTrpAlaAla.Pro260265270LeuValSerAlaPheThrAlaPheAlaCysLeuThrSerLeuGlySer275280285TrpMetMetLeuValGlyGinAlaGlyValArgAlaAlaAsnAspGly290295300AsnPheProLysVa.lTyrGlyGluVa.lAspSerAsnGlylieProLys305310315320LysGlyLeuLeuLeuAlaAlaVa.lLysMetThrAlaLeuMetlieLeu325330335lieThrLeuMet,AsnSerAlaGlyGlyLysAlaSerAspLeuPheGly340345350GluLeuThrGlylieAlaValLeuLeuThrMetLeuProTyrPheTyr355360365SerCysValAspLeulieArgPheGluGlyValAsnlieArgAsnPhe370375380ValSerLeulieCysSerValLeuGlyCysValPheCysPhelieAla.385390395400LeuMetGlyAlaSerSerPheGluUuAlaGlyThrPhelieValSer405410415LeulielieLeuMetPheTyrAlaArgLysMet,HisGluArgGinSer420425430HisSerMetAspAsnHisThrAlaSerAsnAlaHis435440<210〉5<211>47<212>畫(huà)<213>大腸桿菌<■>5t.tgt.cgacaagga.gata.t鄰ata.t.gaacgt,tat,tgcaata.t.t,gaatc47<210>6<211〉36<212〉醒<213>大腸桿菌<400>6aaggatcctta.ttttt.tgctt.tct,tctt,tcaa.t,acc36<210〉7<211>44<212>DNA<213>大腸桿菌<400〉7ttggatccaaggagatat,a.ga.tatgagttctgccaagaagatcg44<210>8<211>36<212〉DNA<213〉大腸桿菌<400>8aaggatccttattttttgctttcttctttcaatacc3權(quán)利要求1.一種具有高賴(lài)氨酸滴定度的產(chǎn)尸胺的重組微生物，其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核苷酸以相對(duì)于對(duì)于這種酶沒(méi)有修飾的微生物增強(qiáng)的量存在。2.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物，其中編碼被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸以相對(duì)于對(duì)于這種蛋白質(zhì)沒(méi)有修飾的微生物增強(qiáng)的量存在。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的微生物，其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核普酸源自于選自以下的微生物大腸桿菌(￡"/zenc/naco//)、耐堿芽孢桿菌(Sw〃ws/z"/oc/wnms、)、蠟樣芽孑包桿菌C8^cz〃z^cerew力、枯草芽孢桿菌(5acz〃wssw6"7&)、蘇云金芽孑包桿菌(5ac/〃wsf/mn力ge"w'力、伯克霍爾德氏菌(Swnt/zoWen""m6(/^7'a)、越南伯克霍爾德氏菌(^wA/zo/Wen'avz.e&ameww'a)、石竹伯克霍爾德、氏菌(SwA/zoAieh"cewoce/a/7a)、青紫色素才干菌(C7zmmo6"c/^n'i/mv/o/acewm)、反芻月開(kāi)j單月包菌(iS"e/e"omowosn/m,力a/7〃wm)、霍舌L孓瓜菌(F/6〃'oc/7o/erae)、副溶血弧菌(F/Zw'o/ara/aemo/少"'cw力、天藍(lán)色鏈霉菌(5Vre/^omycescoe/z'co/or)、毛鏈霉菌(5Vr，師ycw/7(3/c^—、嚙蝕艾肯氏菌(5VAewa〃acwTO(iews)、嗜氨基酸真沖干菌(五w6a"ehwmac油m/wo//n'/謂)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Frawc&e〃aiW鎖'e腦'力、GeoZac/〃usA鼎加p/n7ws、傷寒沙門(mén)氏菌(S"/mowe〃a妙/z/)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(iSW膨"e〃a妙/n'廳n'應(yīng))、蟲(chóng)奪房哈夫尼亞菌(7/a/m'aa/ve/)、腦膜炎奈瑟氏球菌艦"&g"法力、嗜酸熱原體(T7zermop/asmaac/t/o//n'/wm)、惡'I"生疾原蟲(chóng)(尸/cwmo力wmy^/cZ/arwm)、耐福射動(dòng)3求菌(^7"eococ'cwsra力c^o/era朋)、(9cetmo6"c/〃ws普通變形4干菌(/Vc^ewsvw/gan'力、纟工育菌(i^ocfo/enayc、iSacc/zoTo//zagz^6/egrat/<ms\月申炎鏈球菌(5Vre/toc6icc船/wewmom'(3e)、聚J求藍(lán)纟田菌屬的物種(Synechococcussp.)。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3的微生物，其中編碼被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸源自于選自大腸桿菌、嗜酸熱原體、或者霍亂弧菌的微生物。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4的微生物，其為埃希氏桿菌屬或者芽孢桿菌屬或者棒狀桿菌屬的重組菌抹、特別是棒狀桿菌屬的重組菌抹。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5的微生物，其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶和被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸源自于大腸桿菌屬物種的微生物。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6的微生物，其中通過(guò)同未轉(zhuǎn)化微生物相比較使上述多核苷酸的拷貝數(shù)增加至少一個(gè)或者通過(guò)上述的多核苷酸與同初始菌林相比更強(qiáng)的啟動(dòng)子的結(jié)合而進(jìn)行過(guò)表達(dá)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的微生物，其為棒狀桿菌微生物且其中一種或多種選自下列的來(lái)自棒狀桿菌的基因同時(shí)地被增強(qiáng)或者過(guò)表達(dá)a)編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的dapA基因，b)編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，c)編碼葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的zwf基因和它們的等位基因，d)編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因和它們的等位基因，e)編碼蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶的mqo基因，f)編碼抗反饋天冬氨酸激酶的lysC基因和它們的等位基因，g)編碼Zwal蛋白的zwal基因。9.根據(jù)權(quán)利要求l-8的微生物，其中編碼L-賴(lài)氨酸輸出蛋白質(zhì)的lysE基因被減少或關(guān)閉。10.根據(jù)權(quán)利要求l-7的微生物，其為埃希氏桿菌屬的微生物，其中一種或多種選自下列的來(lái)自大腸桿菌的基因同時(shí)地被增強(qiáng)或者過(guò)表達(dá)a)編碼抗反饋天冬氨酸激酶的基因或者等位基因，b)編碼二氬吡咬二羧酸合成酶的基因，c)編碼二氪吡p定二羧酸還原酶的基因，d)編碼琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因，e)編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫?；傅幕?。11.根據(jù)權(quán)利要求l-IO的微生物，該微生物在被賴(lài)氨酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化之前能夠產(chǎn)L-賴(lài)氨酸。12.包含編碼賴(lài)氨酸脫羧酶多核普酸和/或編碼被稱(chēng)為賴(lài)氨酸/尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體或者質(zhì)粒。13.根據(jù)權(quán)利要求12的載體或者質(zhì)粒，其中所述多核苷酸源自于大腸桿菌。14.一種生產(chǎn)尸胺的方法，其中a)根據(jù)權(quán)利要求l-ll的微生物在形成尸胺的條件下在培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，b)尸胺在所述微生物的細(xì)胞中或者在發(fā)酵培養(yǎng)基中累積。15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中a)尸胺被分離，其中，視需要b)發(fā)酵液的其它溶解組分和/或全部或量為>0-100%的生物量保留在凈皮分離的產(chǎn)物中。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中使用棒狀桿菌。17.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中使用埃希氏桿菌屬的微生物。全文摘要本發(fā)明涉及重組微生物，在該重組微生物中增強(qiáng)編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的多核苷酸，且在使用該重組微生物的條件下發(fā)酵生產(chǎn)了尸胺(1，5-二氨基戊烷)，其中所用碳源優(yōu)選可再生的原材料如，例如，葡萄糖、蔗糖、糖蜜等等。文檔編號(hào)C12N1/21GK101240258SQ20081000533公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者A·卡勞,H·哈格,H·薩姆,L·埃格林,S·弗塞克申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司