專利名稱：構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白工程菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)糖基化工程領(lǐng)域，本發(fā)明涉及借助基因工程手段構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈 修飾的工程菌株的方法，本發(fā)明還涉及對糖蛋白N-糖基化修飾糖鏈的設(shè)計(jì)與改造，根據(jù)需要, 所述糖蛋白可以含有結(jié)構(gòu)為Man5GlcNAc2 、 GalGlcNAcMan5GlcNAc2禾B /或 SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的修飾糖鏈。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)藥物一直是全球開發(fā)的熱點(diǎn)。目前已有多種重組蛋白在臨床治療中發(fā)揮著重要的 作用，如胰島素、生長激素等。這類重組蛋白大多屬于糖蛋白，即在多肽骨架的一個(gè)或多個(gè) 位點(diǎn)上共價(jià)結(jié)合有寡糖的糖基化修飾蛋白。糖蛋白中糖鏈的主要功能有兩大類a)參與分子
內(nèi)作用，如蛋白質(zhì)的正確折疊、細(xì)胞內(nèi)定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半壽期、蛋
白酶敏感性等；b)參與分子間作用，如趨靶于溶酶體、趨靶于組織、細(xì)胞-細(xì)胞黏附和結(jié)合病 原體等。歸根結(jié)底，糖鏈影響著蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象，從而影響由構(gòu)象決定的所有功能。
糖蛋白上的糖鏈從連接方式上可分為兩類 一類是與天冬氨酰(Asn)殘基連接，即N陽
連接糖蛋白，另一類與絲氨酸或蘇氨酸連接，稱為o-連接糖蛋白。
N-糖鏈通常都有一個(gè)五糖核心[Manal—6(Manal—3)Man卩l(xiāng)—4GlcNAc卩1—4GlcNAc]-((Man) 3 (GlcNAc) 2)，根據(jù)它們的外層鏈結(jié)構(gòu)的不同，可分為高甘露糖型(Highmannose type),雜合型(Hybridtype)與復(fù)合型(Complextype)。如圖1所示，三者之間的區(qū)別在于高甘 露糖型只含有多個(gè)(x連接的甘露糖殘基，而復(fù)雜型具有巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和唾液 酸(SA)為組分的糖鏈天線，雜合型則兼具二者特點(diǎn)。許多研究表明三種類型的糖鏈具有 共同的生物合成起源，即高甘露糖聚合物前體。該前體并非直接在蛋白質(zhì)上合成出來的，而 是在脂質(zhì)載體多砲醇(Dol)上合成寡糖鏈后轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)受體上。
前體物(Glc) 3 (Man) 9 (GlcNAc) 2從脂供體在穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粗面(RER)膜時(shí)轉(zhuǎn)到新生 肽的Asn上，加工過程是以一個(gè)特異a1—2葡萄糖苷酶去除葡萄糖末端開始的。然后內(nèi)部的 兩個(gè)葡萄糖殘基被a1—3葡萄糖苷酶II切除，這些葡萄糖苷酶和al,2-甘露糖苷酶都位于RER 上。有人推測，葡萄糖修飾的目的是為了更有效地將蛋白從RER運(yùn)到高爾基(Golgi)體。
糖蛋白到達(dá)Golgi體后，那些最終成為復(fù)合性結(jié)構(gòu)的寡糖，通過N-己酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移 酶I添加N-已酰葡萄糖胺殘基，由Golgi體內(nèi)的a-甘露糖酶II切除兩個(gè)甘露糖殘基，隨后由GlcNAc轉(zhuǎn)移酶加入天線上的GlcNAc殘基。同時(shí)，F(xiàn)uc轉(zhuǎn)運(yùn)酶可能轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)Fuc到糖鏈的 GlcNAc上。復(fù)合型寡糖的合成最后步驟發(fā)生在Golgi體的反面囊腔中。此時(shí)Gal或SA轉(zhuǎn)移 酶催化添加Gal和SA。最后新合成的糖蛋白離開Golgi體，運(yùn)送到最終目的地。
最終的寡糖結(jié)構(gòu)在很大程度上取決于糖蛋白在處理過程中與糖基化酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的作 用順序，以及它們特異性作用，許多不同的酶催化不同的反應(yīng)，最后形成最終的寡糖結(jié)構(gòu)。
酵母是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一((J.M. Cregg， 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1) 45-66)。該系統(tǒng)兼有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)易于操作培養(yǎng)、快 速生長、表達(dá)量高，同時(shí)又能對外源真核基因進(jìn)行正確翻譯和翻譯后加工與修飾，并能對許 多蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行分泌表達(dá),使產(chǎn)物易于提純。己用該系統(tǒng)成功表達(dá)了數(shù)百種來自病毒、細(xì)菌、 真菌、動(dòng)植物和人的蛋白，如胰島素、白介素、人血清白蛋白、腫瘤壞死因子、乙肝表面抗 原、水蛭素等等。
雖然酵母和哺乳動(dòng)物具有相同的糖基化起始步驟及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的修飾過程，但由于酵母高 爾基體中常產(chǎn)生高甘露糖型糖鏈并且缺少部分合成復(fù)雜型糖鏈的所需的系列酶，所以酵母工 程菌株所表達(dá)糖蛋白的N-糖基化修飾主要為高甘露糖型。眾所周知，高甘露糖型糖鏈糖蛋白 具有很強(qiáng)的免疫原性，且在人體中半衰期短，易被清除。同時(shí)，不同類型的糖基化修飾對治 療性蛋白質(zhì)的性質(zhì)與療效有很大影響。因此利用基因工程手段對酵母工程菌株進(jìn)行遺傳改造， 使其產(chǎn)生具有不同類型糖基化修飾的糖蛋白，對于研究其性質(zhì)、功能與療效尤為有用。
Hamilton等人利用組合文庫篩選的方法對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)N-糖基化進(jìn)行了人源化改 造(S.R. Hamilton, Science 313,1441-1443)，但該方法是對野生型酵母菌株進(jìn)行改造，由于文 庫篩選方法本身成本較高，操作復(fù)雜，不適合對已構(gòu)建好的工程菌株進(jìn)行改造，本發(fā)明從這 一要求出發(fā)，利用不同定位信號引導(dǎo)，同時(shí)借助各種篩選標(biāo)志，以相對簡便的方法對不同的 糖蛋白表達(dá)工程菌株進(jìn)行改造，使其產(chǎn)生的糖蛋白能夠滿足不同的目的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)糖基化工程領(lǐng)域，本發(fā)明涉及對工程菌株進(jìn)行遺傳改造的方法，以使 其表達(dá)的異源糖蛋白N-糖基化修飾具有期望的糖鏈類型，所述糖鏈的末端糖基為選自甘露 糖、葡萄糖、半乳糖和唾液酸中的一種或多種。
本申請中的術(shù)語"工程菌株"包括但不限于酵母工程菌株，例如，穩(wěn)定表達(dá)異源蛋白的 釀酒酵母、畢赤酵母或漢遜酵母。
本發(fā)明目的在于提供構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白工程菌株的方法。
一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白工程菌株的方法，該方法包括下 列步驟a)以編碼糖苷酶cx-1，2-甘露糖苷酶或其功能結(jié)構(gòu)域的編碼序列替換a-1，3-甘露 糖基轉(zhuǎn)移酶或a-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因的內(nèi)部編碼序列，構(gòu)建同源重組突變基因序列； b)將步驟a)獲得的重組突變基因序列插入具有篩選標(biāo)志序列的載體中，得到重組質(zhì)粒；c) 將N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和P-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列的編碼序列分別與各自定 位信號編碼序列相連接，得到兩種融合基因序列；d)將步驟c)獲得的兩種融合基因序列插入 具有篩選標(biāo)志序列的載體中，得到重組質(zhì)粒e)將a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列和唾液酸 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列連接，得到融合基因序列；f)向載體中插入唾液酸合成酶編碼序列使與載 體內(nèi)的篩選標(biāo)志編碼序列相連接，然后再向載體中插入步驟e)獲得的融合基因序列，得到重 組質(zhì)粒；g)將(i)步驟a)得到的重組質(zhì)粒，(ii)步驟a)和步驟b)得到的重組質(zhì)粒，或者(iii) 步驟a)、 b)和c)得到的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入工程菌株，借助篩選標(biāo)志篩選發(fā)生表型改變的工程菌 株；h)在培養(yǎng)基中對所述工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，收集上清中的糖蛋白并對其N-糖基 化修飾糖鏈進(jìn)行分析，確認(rèn)工程菌株表達(dá)的糖蛋白N-糖基化修飾為預(yù)定糖鏈。
一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的a-l,2-甘露糖苷酶編碼序列為SEQIDNO: l。
一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I及定位信號的編碼序列為SEQ ID NO: 2。
一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的P-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及定位信號的編碼序列為SEQ ID NO:3。
一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的a-2,6-唾液酸酶和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列為SEQIDNO:4。
一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的唾液酸合成酶的編碼序列為SEQIDNO: 5。 本發(fā)明中，所述的預(yù)定糖鏈的末端糖基為選自甘露糖、葡萄糖、半乳糖和唾液酸中的一種 或多種。
本發(fā)明中，其中所述的預(yù)定糖鏈的結(jié)構(gòu)為選自下列其中的一種或多種Man5GlcNAc2、 GalGlcNAcMan5GlcNAc2和SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。
一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建表達(dá)低甘露糖型糖鏈糖蛋白的工程菌株的方法，該方法 包括通過基因工程手段對工程菌株進(jìn)行改造，使其表達(dá)的異源糖蛋白的糖鏈由原來的高甘露 糖型糖鏈變?yōu)槊庖咴暂^低的短甘露糖型糖鏈，其特征在于所述短甘露糖型糖鏈的結(jié)構(gòu)為 Man5GlcNAc2。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建異源糖蛋白表達(dá)工程菌株，使其基因組a-l,6-甘露糖基 轉(zhuǎn)移酶失活，同時(shí)工程菌株獲得a-l,2-甘露糖苷酶活性。
具體而言，以a-l，2-甘露糖苷酶與篩選標(biāo)志的編碼序列替換a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和/或 a-l,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列，構(gòu)建兩側(cè)與基因組ct-l,6-糖基轉(zhuǎn)移酶和/或a-l，3糖基 轉(zhuǎn)移酶基因同源，而內(nèi)部編碼序列被a-l，2-甘露糖苷酶編碼序列取代的同源重組突變序列， 將突變序列導(dǎo)入工程菌株，通過篩選標(biāo)志篩選發(fā)生同源重組的工程菌株。發(fā)生同源重組指的 是工程菌株基因組上a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列被外源插入序列所取代，從而使所述工 程菌株失去a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活的同時(shí)獲得了 a-l，2-甘露糖苷酶活性。
另一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建表達(dá)雜合型糖鏈糖蛋白的工程菌株的方法，該方法包 括在前述構(gòu)建的短甘露糖型修飾糖蛋白表達(dá)工程菌株的基礎(chǔ)上，通過基因工程手段進(jìn)一歩對 其進(jìn)行改造，使其表達(dá)的異源糖蛋白的糖鏈由原來的高甘露糖型糖鏈或短甘露糖型糖鏈變?yōu)?雜合型糖鏈，其特征在于所述雜合型糖鏈的結(jié)構(gòu)為GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的基因工程手段為引入N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 I和β-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
具體而言為，將N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I與其定位信號的編碼序列相連接，插入含有 篩選標(biāo)志基因序列的載體；將β-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶與其定位信號的編碼序列相連接，插入 相應(yīng)載體后切下含有啟動(dòng)子和編碼序列部分，插入前述構(gòu)建的含有N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 I的載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，導(dǎo)入前述短甘露糖型工程菌株，篩選具有篩選標(biāo)志表型的重組菌株， 使其獲得N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和β-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
另一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建表達(dá)復(fù)合型糖鏈糖蛋白的工程菌株的方法，該方法包 括在前述構(gòu)建的雜合型糖鏈糖蛋白的工程菌株的基礎(chǔ)上，通過基因工程手段進(jìn)一步對其進(jìn)行 改造，使其表達(dá)的異源糖蛋白的糖鏈由原來的高甘露糖型糖鏈或短甘露糖型糖鏈或雜合型糖 鏈變?yōu)閺?fù)合糖鏈，其特征在于所述復(fù)合型糖鏈的結(jié)構(gòu)為SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的基因工程手段為引入a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾液 酸合成酶活性，使其產(chǎn)生的糖蛋白糖基化修飾具有糖鏈末端為唾液酸的復(fù)合型結(jié)構(gòu)。
具體而言為，將a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶與唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列相連接，插入含有篩選 標(biāo)志序列的載體；將唾液酸合成酶編碼序列與載體中篩選標(biāo)志的編碼序列相連接，構(gòu)建重組 質(zhì)粒，導(dǎo)入前述雜合型工程菌株，篩選具有篩選標(biāo)志表型的重組菌株，使其獲得a-2,6-唾液 酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸合成酶活性。
另一方面，本發(fā)明提供了用上述方法生產(chǎn)的能夠表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白的工程菌株。 其中所述的預(yù)定糖鏈類型為短甘露糖型糖鏈、雜合型糖鏈或復(fù)合型糖鏈，所述糖鏈的末端糖 基為選自甘露糖、葡萄糖、半乳糖和唾液酸中的一種或多種。


圖1描述用于同源重組引入a-l，2-甘露糖苷酶基因，同時(shí)失活基因組a-l,6-糖基轉(zhuǎn)移酶基 因的重組質(zhì)粒構(gòu)建策略。
圖2描述根據(jù)本發(fā)明所述方法改造后，p-IFN/GS115表達(dá)工程菌株所產(chǎn)生的P-IFN糖鏈 的質(zhì)譜分析圖，1904位置的峰對應(yīng)于SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。
除非本文另有定義，本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的 含義。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法進(jìn)行。通常，與本文所述相 關(guān)使用的命名，以及本文所述的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以 及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)雜交技術(shù)及電泳分析技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的而且普遍使用的。除非另 有說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常按照本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知以及更為具體的參考文獻(xiàn)中所記 載的常規(guī)方法進(jìn)行。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor， Kurt Drickamer， Oxford Univ. Press(2003);
除非另有說明，下列術(shù)語應(yīng)被理解為如下含義
N-糖基化修飾指包含N-乙酰葡萄糖胺殘基的糖鏈與多肽鏈中天冬酰胺(Asn)殘基的酰 胺氮相連接，糖鏈的主要組分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。糖基化修飾主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔與翻譯同時(shí)進(jìn)行，并在高爾基體 中繼續(xù)反應(yīng)成N-糖基化蛋白。
N-糖基化修飾類型指糖蛋白中與多肽鏈中Asn相連的外部糖鏈類型。外部糖鏈類型主要 有高甘露糖型(High mannose type),雜合型(Hybrid type)與復(fù)合型(Complex type)三種。
本文使用的術(shù)語，"基因序列"是指具有預(yù)定功能的DNA序列，可以是基因組中含有基 因外元與內(nèi)元的DNA序列，可以是編碼或不編碼氨基酸的DNA序列，可以是構(gòu)成載體元件 的人工DNA序列。
本文使用的術(shù)語，"編碼序列"是指能按照密碼子規(guī)則翻譯成預(yù)定氨基酸序列的DNA序列。
本發(fā)明的術(shù)語，"定位信號"是指能使蛋白質(zhì)錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或高爾基體外側(cè)網(wǎng) 絡(luò)中預(yù)定位置的多肽序列。所述多肽序列可分為如下三類a)N-末端序列，該序列編碼胞質(zhì) 尾(ct)、跨膜功能結(jié)構(gòu)域(tmd)以及部分或全部的莖區(qū)(sr)，其共同或獨(dú)立地將蛋白質(zhì)錨 定在高爾其體內(nèi)；b)回收信號，其通常位于C-端，例如HDEL或KDEL四肽；和c)源自 各種蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的序列，例如定位于高爾基體的核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
本文使用的術(shù)語，"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)與其連接的另一基因序列的DNA分子。載 體的一種類型是"質(zhì)粒"，其是環(huán)狀雙鏈的DNA環(huán)，其可連接其它DNA片段成雙鏈環(huán)狀DNA。 某些載體可以在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，其它載體可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)
胞的基因組中，并隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，載體還含有預(yù)定的控制序列。己有多種載 體商品化并可應(yīng)用細(xì)菌、病毒、真菌、植物和動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如Invitrogen公司的系列載 體。
本發(fā)明的術(shù)語，"篩選標(biāo)志"是指賦予宿主細(xì)胞抗藥性或補(bǔ)足宿主細(xì)胞代謝缺陷的基因序 列。篩選標(biāo)志的存在用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化子篩選。例如在酵母中，可有的篩選標(biāo)志包括HIS4,GENETICN,ZEO,BLA,URA3,URA5,bLASTICIDIN基因。多種篩選標(biāo)志是已知的并已應(yīng)用 于細(xì)菌、病毒、真菌、植物和動(dòng)物宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的術(shù)語"工程菌株"，包括但不限于，能產(chǎn)生某種預(yù)定蛋白質(zhì)的工程化菌株，其穩(wěn) 定表達(dá)所述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有某種預(yù)定的應(yīng)用價(jià)值。所述工程菌株可以通過誘變篩選， 也可以通過基因工程手段建立。多種工程菌株可由商業(yè)上獲得或可釆用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
改造工程菌株蛋白糖基化修飾類型
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供構(gòu)建工程菌株的方法，將其表達(dá)的異源糖蛋白的高甘露糖型糖 鏈改造成免疫原性較低的短甘露糖型糖鏈的方法，其特征在于糖蛋白的修飾糖鏈的結(jié)構(gòu)為 Maii5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，以基因重組方式對異源糖蛋白表達(dá)工程菌株進(jìn)行改造，向基因組中原01-1,6-糖基轉(zhuǎn)移酶或a-l,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列位置處插入a-l,2-甘露糖苷酶編碼序列，破壞工 程菌株a-l,6-糖基轉(zhuǎn)移酶或a-l,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的同時(shí)，獲得了 a-l，2-甘露糖苷酶活性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以a-l,2-甘露糖苷酶與篩選標(biāo)志的編碼序列替換a-l,6-甘露糖 基轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)部的編碼序列。
通過PCR方法從工程菌株中獲得a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的兩側(cè)基因片段，其中上游片段的3'端保留a-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的跨膜區(qū)部分；在去掉自身跨膜區(qū)的α-l,2-甘露糖 苷酶編碼序列的C端引入篩選標(biāo)志，然后在此序列的兩側(cè)分別與a-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶上、 下游的側(cè)翼片段相連，設(shè)計(jì)上確保α-l，2-甘露糖苷酶與原α-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的跨膜區(qū)融合， 構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化工程菌株。利用篩選標(biāo)志和PCR方法篩選發(fā)生同源重組的工程菌株，最 后借助分析手段對異源表達(dá)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行確認(rèn)。
用于遺傳改造的a-l,2-甘露糖苷酶基因選自哺乳動(dòng)物如人、小鼠，植物如大豆或真菌如黑 曲霉或里氏木霉，優(yōu)選里氏木霉α-l，2-甘露糖苷酶基因，優(yōu)選根據(jù)密碼子偏嗜性優(yōu)化的序列 如SEO IDNO.l;
所述a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶側(cè)翼片段，通過PCR方法從工程菌株的基因組獲得。跨膜序 列前保留核苷酸長度100bp以上，優(yōu)選500bp以上，更優(yōu)選900bp以上，插入序列后保留核 苷酸長度100bp以上，優(yōu)選400bp以上。
所述的篩選標(biāo)志選自///W、 G￡A^77C/W、 Z￡0、 S丄丄WMJ、 W A5、 S丄AS77C/D/A^， 優(yōu)選G￡7V￡77C/iV。
所述載體為整合型質(zhì)粒載體，例如美國Promega公司(Promega, USA)的系列載體。
工程菌株包括但不限于，酵母工程菌株例如釀酒酵母和畢赤酵母表達(dá)工程菌株，優(yōu)選 GS115表達(dá)工程菌株。
導(dǎo)入工程菌株的方法，可以使用任何方便的DNA轉(zhuǎn)化方法，例如電穿孔、PEG-氯化鋰或 原生質(zhì)球法。
篩選除利用篩選標(biāo)志獲得相應(yīng)表型外，還要對工程菌株通過PCR鑒定和異源糖蛋白糖鏈 結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行確認(rèn)。篩選方法可通過一系列表型富集和/或排除步驟來進(jìn)行。例如，可通過特 異性結(jié)合N-寡糖的凝集素，對具有正確糖基化表型的菌株加以富集；隨后，可采用多種分析 方法對糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，例如熒光測定法。可選地，采用本領(lǐng)域已知技術(shù)分離并 純化糖蛋白，使用諸如內(nèi)切-e-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(New England Biolabs)從糖蛋白上切 下糖鏈，然后通過毛細(xì)管電泳或質(zhì)譜或其它適宜的方法對其加以分析。
本發(fā)明進(jìn)一步提供將異源表達(dá)糖蛋白的高甘露糖型糖鏈改造成雜合型糖鏈的方法，其特 征在于具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，在構(gòu)建前述短甘露糖型修飾糖蛋白表達(dá)工程菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和P-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合成N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I與其定位信號的融合編碼序 列，其中定位信號位于酶編碼序列的N-端。將合成序列插入含有篩選標(biāo)志基因序列的載體； 合成卩-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶與其定位信號的融合編碼序列定位信號位于酶編碼序列的C-端， 插入相應(yīng)載體后切下含有啟動(dòng)子和融合序列部分，插入前述構(gòu)建的含有N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn) 移酶I融合序列的載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，導(dǎo)入前述短甘露糖型工程菌株，篩選具有篩選標(biāo)志 表型的重組菌株，使其獲得N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和P-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
所述N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I基因選自哺乳動(dòng)物、人、昆蟲和植物。優(yōu)選地，將N-乙 酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I基因與早期高爾基體定位信號編碼序列相連接，優(yōu)選的定位信號為 MNN9，優(yōu)選人工合成根據(jù)密碼子偏嗜性的融合序列如SEOIDN0.2。
所述P-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因選自哺乳動(dòng)物、人、昆蟲和植物。優(yōu)選地，將P-l,4-半乳 糖基將轉(zhuǎn)移酶基因與中期高爾基體定位信號編碼序列相連接，優(yōu)選的定位信號為HDEL，優(yōu) 選人工合成根據(jù)密碼子偏嗜性的融合序列如SEO IDN0.3。
所述篩選標(biāo)志選自<sequence>see original document page 11</sequence>
所述載體為整合型質(zhì)粒載體，例如美國Invitrogen公司的系列載體，優(yōu)選酵母表達(dá)載體， 更優(yōu)選畢赤酵母表達(dá)載體，更優(yōu)選pGAPZA(Invitrogen, USA)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供將異源表達(dá)糖蛋白的具有復(fù)合型糖鏈修飾的方法，其特征在于具有 SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，在構(gòu)建前述雜合型工程菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步獲得a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾 液酸合成酶活性，使其產(chǎn)生的糖蛋白糖基化修飾具有糖鏈末端為唾液酸的復(fù)合型結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合成a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶與唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的融合編碼序列， 插入含有篩選標(biāo)志序列的載體；將唾液酸合成酶編碼序列與載體中篩選標(biāo)志的編碼序列相連 接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，導(dǎo)入前述雜合型工程菌株，篩選具有篩選標(biāo)志表型的重組菌株，使其獲 得a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸合成酶活性。
所述唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因選自哺乳動(dòng)物、人、昆蟲、植物和光合細(xì) 菌。優(yōu)選a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶自身C端含有定位于晚期高爾基體序列的大鼠a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移 酶，優(yōu)選地，人工合成根據(jù)密碼子偏嗜性的a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的融合序 列如SEO IDN0.4。
所述唾液酸合成酶基因選自哺乳動(dòng)物、人、昆蟲、植物和真菌。優(yōu)選小鼠唾液酸合成酶。 優(yōu)選地，人工合成根據(jù)密碼子偏嗜性的唾液酸合成酶編碼序列如SEOIDN0.5。
所述篩選標(biāo)志選自HIS4,GENETICIN,ZEO,BLA,URA3,URA5,BLASTICIDIN,優(yōu)選BLASTICIDIN.
所述載體為整合型質(zhì)粒載體，例如美國Invitrogen公司的系列載體，優(yōu)選酵母表達(dá)載體， 更優(yōu)選畢赤酵母表達(dá)載體，更優(yōu)選pPIC6(Invitrogen, USA)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供構(gòu)建預(yù)定修飾糖鏈工程菌株的方法，其特征在于可設(shè)計(jì)產(chǎn)生 的糖蛋白，其糖基化修飾糖鏈具有滿足預(yù)定需要的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，可選擇性地，分別或同時(shí)破壞工程菌株的a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和/或(x-l,3 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性，分別或同時(shí)向工程菌株中引入a-l,2-甘露糖苷酶、N-乙酰氨基葡萄糖 轉(zhuǎn)移酶I和P-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸合成本科活性，使其產(chǎn)生的 糖蛋白糖基化修飾糖鏈根據(jù)需要，所述糖鏈的末端糖基為選自甘露糖、葡萄糖、半乳糖和唾 液酸中的一種或多種。
預(yù)定結(jié)構(gòu)的糖基化修飾糖鏈在治療性糖蛋白的靶向中尤為有用。不同的糖鏈修飾在體內(nèi) 的組織分布有很大差異。例如甘露糖可靶向溶酶體，而半乳糖可靶向肝臟。此外，糖基化的 末端糖鏈還影響到糖蛋白的免疫原性和體內(nèi)半衰期等。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明。
實(shí)施例
實(shí)施例1 a-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的失活與a-l，2-甘露糖苷酶的引入
本實(shí)施例通過在a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因中插入a-l,2-甘露糖苷酶和GENETICIN編碼 序列，然后轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌株IFN/GS115，通過篩選抗GENETICIN表型的工程菌株， 得到a-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶失活而同時(shí)擁有a-l,2-甘露糖苷酶活性的工程菌株，其表達(dá)的糖蛋 白具有結(jié)構(gòu)為Man5GlcNAc2的修飾糖鏈。
材料與方法
畢赤酵母工程菌株GS115購自Invitrogen公司，表達(dá)糖基化IFN的GS115工程菌株可從
菌種保藏中心購買，也可采用Invi加gen公司的Original尸fc/^fl Expression Kit，按照其相關(guān)
專利美國專利號4,879,231、 4,882,279、 4,885,242、 4,895,800、 4,929,555自行構(gòu)建，本發(fā)明
在此一并引入作為參考。本實(shí)施例中，使用EasySelect Pichia Expression Kit試劑盒(購自Invitrogen公司)，按照專利CN1325651C中酵母表達(dá)部分的操作方法(在此引入作為參考)， 以所述試劑盒中的pPICZaA載體自行構(gòu)建了能夠表達(dá)帶有His標(biāo)簽的P-干擾素的工程菌株。
載體pPIC9K、 pPIC9和pPIC6均購自Invitrogen公司。
1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
本發(fā)明人根據(jù)酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)并合成了 a-l，2-甘露糖苷酶的編碼基因，其核苷酸序 列如SeqIDNO.l所示，將合成序列克隆于pUC19載體中，得到質(zhì)粒pUC19-M。
根據(jù)GenBank中報(bào)道的畢赤酵母a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(ocW )基因序列(E12456)、 Hypocrea jecorina a-l,2-甘露糖苷酶編碼序列(AF212153)和質(zhì)粒pPIC9K中的kanamycin編 碼序列(賦予大腸桿菌卡那抗性，而使酵母具有Geneticin抗性的基因，位于載體的4928-5743 位，815bp)，設(shè)計(jì)4對寡核苷酸引物P1和P2 、 P3和P4， P5和P6、 P7和P8。
Pl: 5'-TCAGAAACAGACACAGAGCGTTCTG-3'， (OCH1基因F1的正向引物)，
P2: 5'-AGCGTTCCAAGAAGTTTGGAATATTTTTGGAGATGATATAATTGTTGTG-3'(OCH1基因F1的反向引物)；
P35'-CACAACAATTATCATCTCCAAAAATATTCCAAACTTCTTGAACGCT-3'(甘露糖苷酶編碼序列M的正向引物)，
P45'-CGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATTAGGCTAAGTGACCACCTCTACG-3'( 甘露糖苷酶編碼序列M的反向引物)；
霉素的正向引物)
P45'-CGTAGAGTGTCACTTAGCCTAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACG-3' (卡那霉素的正向引物)
P6: 5'-ATCTATTTTACTCTAGCTTTCTTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'(卡那霉素的反 向引物)；
P7: 5'-GATGCTCGATGAGTTTTTCTAAAGAAAGCTAGAGTAAAATAGAT-3， (OCH1基因 F2的正向引物)，
P8: 5'-GTCGACGTTCTTGTCAATTCGGAAAG-3'(OCHl基因F2的反向向引物)。
采用基因組提取試劑盒(購自Invitrogen公司)提取GS115工程菌株基因組DNA。在5(Hil 的PCR反應(yīng)體系中加入2Xmaster mix(Qiagen公司)25pl、基因組DNA模板2u1引物Pl和P2 (各0.5pl) 1u1、 Pfo (高保真DNA聚合酶，Qiagen公司)1^1，補(bǔ)水至體積為;于94 。C變性5min，然后94。C，30s、 60°C， 45s、 72°C， 60s共循環(huán)30次，最后72。C延伸10min， 所得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收950bp的目的條帶備用[oWl編碼 序列上游片段Fl，243-1167，950bp，其中Fl的3，端保留有a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶跨膜區(qū)(29aa)的基因編碼序列(1080-1167， 87bp)]。以同樣反應(yīng)體系，改以P7和P8 (各0.5ul)為擴(kuò)增引物， 94℃變性5min，然后94℃,30s、 54°C， 45s、 72°C， 45s循環(huán)30次，最后72。C延伸7min，所 得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收650bp的目的條帶(odzl編碼序列下 游片段F2， 2241-2858， 650bp)備用。
里氏木霉a-l，2-甘露糖苷酶除去跨膜區(qū)(29aa)的編碼序列M (1446bp)由上海生物工程 有限公司合成，克隆于pUC19中，所得質(zhì)粒命名為pUC19-M。在50pl的PCR反應(yīng)體系中加 入2Xmaster mix(Qiagen公司)25ul、質(zhì)粒pUC19-M模板0.1u1，引物P3和P4 (各0.5ul) 1u1、 Pfu (高保真DNA聚合酶，Qiagen公司)1u1，補(bǔ)水至體積為50u1 ;于94℃變性5min，然后 94℃,30s、 55。C， 45s、 72°C, 90s共循環(huán)30次，最后72℃延伸10min，所得PCR產(chǎn)物在1% 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收1480bp的目的條帶(a-l,2-甘露糖苷酶編碼序列M， 1480bp)備用。
在50ul的PCR反應(yīng)體系中加入2Xmaster mix(Qiagen公司)25ul、質(zhì)粒pPIC9K模板O.lul， 引物P5和P6 (各0.5u1) 1u1、 Pfu (高保真DNA聚合酶，Qiagen公司)lul，補(bǔ)水至體積為 ;于94。C變性5min，然后94℃,30s、 58°C， 45s、 72°C， 90s共循環(huán)30次，最后72℃延 伸7min，所得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收850bp左右的目的條帶 (Kanamycin編碼序列K， 850bp)備用。
在50pl的PCR反應(yīng)體系中加入2Xmastermix(Qiagen公司)25ul、前述PCR產(chǎn)物F1、 F2、 M、 K各2nl， PfU (高保真DNA聚合酶，Qiagen公司)2pl，補(bǔ)水至體積為;于94℃ 變性5min，然后94℃，30s、 50℃， 120s， 68℃， 120s循環(huán)5次，最后72℃延伸7min。然后 加入引物Pl和P8各0.5nl，繼續(xù)循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。所得PCR產(chǎn)物在0.8% 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收3800bp左右的目的條帶(F1-MK-F2片段)，連接到 pEGM-Teasy載體(Promega公司,USA)中，經(jīng)序列分析結(jié)果得到驗(yàn)證。重組質(zhì)粒的構(gòu)建策 略如圖l所示。
2)工程菌株的轉(zhuǎn)化與篩選
構(gòu)建好的質(zhì)粒以EcoRI酶切，回收F1-MK-F2片段。采用前述電穿孔方法轉(zhuǎn)化工程菌株， 涂布于含有Geneticin的YPD平板上進(jìn)行篩選。挑選能夠在Geneticin抗性平板上生長的菌株， 提取基因組DNA，分別以P3和P6為引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電 泳上進(jìn)行分析，能擴(kuò)增出2300bp特異性產(chǎn)物的菌株為陽性基因重組工程菌株，命名為 IFN/GSm。
3)工程菌株表達(dá)糖蛋白的純化與鑒定
將工程菌株IFN/GSm接種于lOOmL BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至O.D6(X)=6.0左右，離心去 除培養(yǎng)上清，以BMMY重懸，使其O.D60()=1.0，繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)充誘導(dǎo)劑甲醇至終 濃度為1%。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集培養(yǎng)上清，首先采用Ni-親和層析柱從上清中純化P-IFN， 純化后的重組P-IFN用內(nèi)切-f5-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(New England Biolabs)從糖蛋白上 切下糖鏈，再采用ConA親和層析柱(Qiagen, German)純化回收切下的糖鏈，通過MALDI-TOF 分析其糖鏈結(jié)構(gòu)，通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜進(jìn)行比較，確認(rèn)工程菌株IFN/GSm表達(dá)的IFN-e的N 糖基化修飾糖鏈具有Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)(圖未給出)。
實(shí)施例2 n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和P-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶甘露糖苷酶活性的引入
本實(shí)施例是向?qū)嵤├?構(gòu)建的工程菌株IFN/GSm基因組中整合含有定位序列的N-乙酰氨 基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和)3-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列，使改造后的工程菌株表達(dá)的e-IFN 具有結(jié)構(gòu)為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的修飾糖鏈。
材料與方法
1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
IFN/GSm工程菌株按照實(shí)施例1制備，根據(jù)酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)并合成了 N-乙酰氨基 葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I及定位信號MNN9融合蛋白的編碼序列mGn,其中MNN9定位信號(38aa)的 編碼序列位于N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I的5'-端，并在序列的5'端和3'端分別引入EcoRI 和Notl酶切位點(diǎn)，序列如Seq ID N0.2所示，將合成序列克隆于pUC載體中；根據(jù)酵母密碼 子偏嗜性設(shè)計(jì)并合成卩-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及定位信號HDEL的編碼序列Gah，其中HDEL 定位信號位于(3-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的C-端，并在序列的5'端和3'端分別引入EcoRI和Notl 酶切位點(diǎn)，序列如S叫ID N0.3所示，合成序列克隆于pUC載體中，所得質(zhì)粒命名為pUC-Gah。
以pPIC9載體為模板，采用引物對P9和P10擴(kuò)增HIS編碼序列(1980-4584，宿主細(xì)胞 的組氨酸缺陷代償基因)
P9: 5，-GGATCCATGACATTTCCCTTGCTACCTGCATAC-3' P10: 5' -GATATCTTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATAC匿3'
上游引物引入BamHI位點(diǎn)，下游引物引入五coRV位點(diǎn)，在PCR反應(yīng)體系中加入2 Xmaster mix(Qiagen公司)25(xl、質(zhì)粒pPIC9模板O.lnl，引物P9和P10 (各0.5jj1) 1(_U、 Pfu
(髙保真DNA聚合酶，Qiagen公司)1u1，補(bǔ)水至體積為50ul :于94℃變性5min,然后94 ℃,30s、 55℃， 45s、 72℃， 90s共循環(huán)30次，最后72℃延伸10min,所得PCR產(chǎn)物在0.8% 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，回收2600bp左右的目的條帶(His序列H， 2610bp)?；厥债a(chǎn) 物經(jīng)5amHI和五coRV雙酶切后再進(jìn)行膠回收，與同樣酶切的pGAPZA載體以T4 DNA連接 酶16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，篩選Zeocin (Invitrogen公司)抗性菌，提取質(zhì)粒進(jìn) 行酶切鑒定，切下插入片段條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，命名為pPH。
分別以EcoRI和M)tl雙酶切mGn序列和Gah序歹U， 1%瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)片段(1350bp 和950bp)。分別將mGn序列和GaH序列與同樣酶切的pPH載體，以T4 DNA連接酶16°C 連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，篩選Zeocin (Invitrogen公司)抗性菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒 定，能切下插入片段條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，分別命名為pPHmGn和pPGah。以SglII和5amHI 酶切pPGah質(zhì)粒，得到與5'AOXl啟動(dòng)子連接的Gah序列PGaH;以5amHI酶切pPHmGn 質(zhì)粒，利用BglII與BamHI同尾酶的特性將PGah插入pPHmGn，篩選能切下插入片段的重 組質(zhì)粒，命名為pPH-GnGa。
2) 工程菌株的轉(zhuǎn)化與篩選
按照pPIC9K Mannual (Invitrogen公司)操作手冊所述電穿孔方法，將質(zhì)粒pPH-GnGa 轉(zhuǎn)化工程菌株IFN/GSm，篩選能在MD (His缺陷型培養(yǎng)基)平板上生長的菌株。所得菌株 再分別以mGn和GaH的特異性引物對Pll和P12、 P13和P14進(jìn)行PCR鑒定。
<sequence>see original document page 16</sequence>PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳上分析，能同時(shí)擴(kuò)增680bp和418bp片段的菌株為陽性基 因重組工程菌株，命名為IFN/GSmGna。
3) 工程菌株表達(dá)糖蛋白的純化與鑒定
按照實(shí)施例1中步驟3操作，純化工程菌株IFN/GSmGna表達(dá)的IFN，并對其糖鏈結(jié)構(gòu) 進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，確認(rèn)工程菌株表達(dá)糖蛋白的糖基化修飾糖鏈結(jié)構(gòu)為 GalGlcNacMan5GlcNAc2 (圖未給出)。
實(shí)施例3引入唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性
本實(shí)施例是向?qū)嵤├?構(gòu)建的工程菌株IFN/GSmGna基因組中整合含有定位序列的唾液 酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列，使工程菌株表達(dá)的β-IFN的具有結(jié)構(gòu)為 SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2修飾糖鏈。
材料與方法
1) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
IFN/GSmGna工程菌株按照實(shí)施例2制備，根據(jù)酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移 酶及唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白融合蛋白的編碼序列STC，其上下游分別引入五coRI和M)tl酶切位點(diǎn)， 序列如SeqlDN0.4所示，由上海生工生物工程有限公司合成，克隆于pUC載體中，命名為 pUC-STC;質(zhì)粒pUC-STC經(jīng)EcoRI和iVotl雙酶切后，膠回收STC片段，與同樣酶切的pPIC6 載體以T4 DNA連接酶16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)，篩選Blasticidin (Invitrogen公司) 抗性菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，能切下插入片段條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，命名pPIC6-STC。
根據(jù)酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)并合成唾液酸合成酶的編碼序列SS，其下游引入iVcoI酶切位 點(diǎn)，序列如SEQIDN0.5所示，由上海生工生物工程有限公司合成，克隆于pUC載體中，命 名為pUC-SS。以EcoRI酶切pUC-SS, Klenow酶(NEB公司)補(bǔ)平后再用WcoI酶切，膠回 收切下的片段，與他ol酶切并去磷酸化的pPIC6-STC質(zhì)粒以T4 DNA連接酶16'C連接過夜， 轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，篩選Zeocin (Invitrogen公司)抗性菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，能切下 插入片段條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，命名pPIC6-STCS。
2) 工程菌株的轉(zhuǎn)化與篩選
按照pPIC9K MannuaKInvitrogen公司)操作手冊所述電穿孔方法，將質(zhì)粒pPIC6H-GnGa 轉(zhuǎn)化工程菌株IFN/GSmGna，篩選能在blasticidin抗性平板上生長的菌株。所得菌株再分別以 STC和SS的特異性引物對PI5和P16、 P17和P18進(jìn)行PCR鑒定。
P15: GGAATTGGCTAAGTTGTCCGTCCC
PI2: CAACAAGGCACCCAAAGCGAAAGAC
PI3: GGTATGGATGAAATGGCCGTTGAA
P14: TAAAGAAGCGGAGTGATCGGAACCC
同時(shí)擴(kuò)增出660bp和430bp片段的菌株為陽性基因重組工程菌株命名為IFN/GSmGnaS。
3)工程菌株表達(dá)糖蛋白的純化與鑒定
按照實(shí)施例i中步驟3操作，不同之處在于，分別采用內(nèi)切-e-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶 (New England Biolabs)從工程菌株IFN/GSmGnaS表達(dá)的IFN糖蛋白上切下糖鏈，并且采用 Qproteome Sialic Glycoprotein Kit (Qiagen， German)純化，采用毛細(xì)管電泳法對其糖鏈結(jié)構(gòu) 進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，如附圖2所示，確認(rèn)IFN- e的N-糖基化修飾具有 SAGalGlcNAcMan5GlcNAcGlc2的糖鏈結(jié)構(gòu)。
序列表
<110> 高新
< 120〉構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白工程菌株的方法
<130> xxx
〈160〉 5
<170> Patentln version 3.4
〈210〉 1<211> 1446〈212〉 DNA<213>人工序列
<220〉<221〉 CDS<222〉 (1). . (1446)
<400> 1
ttc caa act tct tgg aac get tac cac cac ttc gcc ttc cca cat gat 48
Phe Gin Thr Ser Trp Asn Ala Tyr His His Phe Ala Phe Pro His Asp 15 10 15
gat tta cac cca gtt tct aac tct ttt gac gac gag aga sac ggt tgg 96
Asp Leu His Pro Val Ser Asn Ser Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp 20 25 30
ggt age tec get att gat ggc ttg gat acc get att ttg atg ggt gac 144
Gly Ser Ser Ala lie Asp Gly Leu Asp Thr Ala lie Leu Met Gly Asp 35 40 45
get gac att gtt aac act ate ttg caa tac gtt cca caa att aac ttc 192
Ala Asp lie Val Asn Thr lie Leu Gin Tyr Val Pro Gin lie Asn Phe 50 55 60acc act acc get gtt gcc aac c犯ggt tec tec gtc ttc gaa acc aac 240 Thr Thr Thr Ala Val Ala Asn Gin Gly Ser Ser Val Phe Glu Thr Asn 65 70 75 80
ate aga tac ttg ggt ggt ttg ttg tct get tac gac ttg ttg aga ggt 288 lie Arg Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Leu Arg Gly 85 90 95
cct ttc tct tct eta get act aac caa acc ttg gtt aac tct ttg ttg 336 Pro Phe Ser Ser Leu Ala 丁hr Asn Gin Thr Leu Val Asn Ser Leu Leu 100 105 110
aga caa get caa acc ttg get aac ggt ttg aag gtc get ttc act acc 384 Arg Gin Ala Gin Thr Leu Ala Asn Gly Leu Lys Val Ala Phe Thr Thr 115 120 125
cca tct ggt gtt cca gac cct act gtc ttc ttc aac cca act gtt aga 432 Pro Ser Gly Val Pro Asp Pro Thr Val Phe Phe Asn Pro Thr Val Arg 130 135 140
aga tec ggt gcc tct tct aac aac gtc get gaa ate ggt tec ttg gtc 480 Arg Ser Gly Ala Ser Ser Asn Asn Val Ala Glu lie Gly Ser Leu Val 145 150 155 160
ttg gaa tgg acc aga ttg tct gac ttg act ggt aac cca caa tac get 528 Leu Glu Trp Thr Arg Leu Ser Asp Leu Thr Gly Asn Pro Gin Tyr Ala 165 170 175
caa ttg get caa aag ggt gaa tct tac ttg eta aac cca aag ggt tct 576 Gin Leu Ala Gin Lys Gly Glu Ser Tyr Leu Leu Asn Pro Lys Gly Ser 180 185 190
cca gaa get tgg cca ggt ttg ate ggt act ttc gtt tct act tec aac 624 Pro Glu Ala Trp Pro Gly Leu lie Gly Thr Phe Val Ser Thr Ser Asn 195 200 205
ggt act ttc caa gac tct tct ggt tct tgg tct ggt ttg atg gac tct 672 Gly Thr Phe Gin Asp Ser Ser Gly Ser Trp Ser Gly Leu Met Asp Ser 210 215 220ttc tac gaa tac ttg ate aag atg tac ttg tat gat cca gtc get ttc 720 Phe Tyr Glu Tyr Leu lie Lys Met Tyr Leu Tyr Asp Pro Val Ala Phe 225 230 235 240
get cac tac犯a gac aga tgg gtt ttg ggt get gac tct act ate ggt 768 Ala His Tyr Lys Asp Arg Trp Val Leu Gly Ala Asp Ser Thr lie Gly 245 250 255
cac ttg ggt tct cac cct tec acc aga aag gac ttg acc ttc eta tct 816 His Leu Gly Ser His Pro Ser Thr Arg Lys Asp Leu Thr Phe Leu Ser 260 265 270
tct tac aac ggt caa tct act tec cca aac tct ggt cat ttg gcc tec 864 Ser Tyr Asn Gly Gin Ser 丁hr Ser Pro Asn Ser Gly His Leu Ala Ser 275 280 285
ttc ggt ggt ggt aac ttt ate tta ggt ggt att ttg ttg aac gaa caa 912 Phe Gly Gly Gly Asn Phe lie Leu Gly Gly lie Leu Leu Asn Glu Gin 290 295 300
aag tac att gac ttc ggt att aag ttg get tec tct tac ttc ggt act 960 Lys Tyr lie Asp Phe Gly lie Lys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe Gly Thr 305 310 315 320
tac acc caa act gcc tct ggt ate ggt cca gaa ggt ttc gcc tgg gtt 1008 Tyr Thr Gin Thr Ala Ser Gly lie Gly Pro Glu Gly Phe Ala Trp Val 325 330 335
gac tct gtt acc ggt get ggt ggt tec cca cca tct age caa tec ggt 1056 Asp Ser Val Thr Gly Ala Gly Gly Ser Pro Pro Ser Ser Gin Ser Gly 340 345 350
ttc tac tec tct gcc ggt ttc tgg gtc acc get cca tac tac att ttg 1104 Phe Tyr Ser Ser Ala Gly Phe Trp Val Thr Ala Pro 丁yr Tyr lie Leu 355 360 365
cgt cca gaa act ttg gaa tct ttg tac tac get tac aga gtc acc ggt 1152 Arg Pro Glu Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Tyr Ala Tyr Arg Val Thr Gly370 375 380
gac tcc朋g tgg caa gac ttg get tgg gaa get ttg tec gcc ate gaa 1200 Asp Ser Lys Trp Gin Asp Leu Ala Trp Glu Ala Leu Ser Ala lie Glu 385 390 395 400
gac get tgt aga get ggt tcc gcc tac tcc tct att aac gac gtt acc 1248 Asp Ala Cys Arg Ala Gly Ser Ala Tyr Ser Ser lie Asn Asp Val Thr 405 410 415
caa get aac ggt ggt ggt get tct gac gat atg gaa tcc ttt tgg ttc 1296 Gin Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ser Asp Asp Met Glu Ser Phe Tirp Phe 420 425 430
get gaa get ttg aag tac get tac tta ate ttc gcc gaa gaa tcc gat 1344 Ala Glu Ala Leu Lys Tyr Ala Tyr Leu lie Phe Ala Glu Glu Ser Asp 435 440 445
gtc caa gtt caa get acc ggt ggt aac aag ttc gtt ttc aac act gaa 1392 Val Gin Val Gin Ala Thr Gly Gly Asn Lys Phe Val Phe Asn Thr Glu 450 455 460
get cac cca ttc tct ate aga tcc tct tct cgt aga ggt ggt cac tta 1440 Ala His Pro Phe Ser lie Arg Ser Ser Ser Arg Arg Gly Gly His Leu 465 470 475 480
gcc taa 1446 Ala
<210〉 2
<211〉 1355
<212> DNA <213>人丁序列
<220>
<221> 融合基因 <222> (1).. (1355)
〈400〉 2
<formula>see original document page 23</formula>aaggaattag gtgaagttag agttcaatac accggtagag actccttcaa ggctttcgcc 1200
aagccttgg gtgttatgg3 cgscttgaag tctggtgtcc caagagctgg ttacagaggt 1260
attgttacct tccaattcag aggtcgtaga gttcacttgg ctccaccacc aacttgggaa 1320
ggttacgacc catcttggaa ccattaggcg gccgc 1355
<210〉 3
〈211〉 956
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉融合基因 <222〉 (1).. (956)
〈400〉 3
gaattcgctt cctctcaacc aagaccaggt ggtgactctt ctccagtcgt cgactctggt 60
ccaggtccag cctccaactt gacctctgtt ccagtcccac acactactgc tttgtccttg 120
ccagcttgtc cagaagaatc tccattgttg gtcggtccaa tgttgattga atttaacatg 180
ccagttgatt tggaattggt tgctaaacaa aacccaaacg tcaagatggg tggtagatac 240
gccccaagag attgtgtctc cccacacaag gtcgctatca tcatcccatt tagaaaccgt 300
caagaacact tgaagtactg gttgtactac ttgcacccag tcttgcaacg tcaacaattg 360
gactacggta tctacgttat caaccaagct ggtgacacta tcttcaacag agctaagttg 420
ttgaacgttg gcttccaaga agctctaaag gactacgatt acacctgttt tgtcttctcc 480
gacgtcgact tgatcccaat gaacgatcac aacgcttata gatgtttctc tcaaccaaga 540<sequence>see original document page 25</sequence>
〈210〉 4
〈211〉 2087
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉
〈221〉融合基因 〈222〉 (1).. (2087)
<400〉 4
<sequence>see original document page 25</sequence>tgtcacttga gagaccacgt taacgtctct atgatcgaag ccaccgactt ccctttcaac 480
accactgaat gggaaggtta cttgccaaag gaaaacttcc gtaccaaggt cggtccatgg 540
caaagatgtg ctgtcgtttc ctccgccggt agtttgaaga actcccaact aggtagagaa 600
attgacaacc acgatgctgt cttaagattt aacggtgctc caactgacaa ctttcaacaa 660
gacgttggtt ctaagactac tatcagattg atgaactctc aattggtcac cactgaaaag 720
agattcttga aggattcctt gtacactgaa ggtatcttga tcgtttggga tccatccgtc 780
taccacgctg acatcccaaa gtggtaccaa aagccagatt acaacttctt cgaaacttac 840
aagtcttacc gtagattgaa cccatctcaa ccattctaca tcttgaagcc acaaatgcca 900
tgggaattgt gggatatcat tcaagaaatc tctgctg3tt tgatccaacc aaacccacca 960
tcctccggta tgttgggtat cattatcatg atgactttgt gtgatcaagt cgacatctac 1020
gaattcttgc catccaagcg taagaccgac gtctgttact accaccaaaa gttcttcgac 1080
tccgcttgta ctatgggtgc ttacgatcca ttgttgttcg aaaagaacat ggtcaagcac 1140
ctaaacgaag gtaccgatga sgacatctst ttgttcggta aggctacctt gtctggtttc 1200
agaaacattc gttgtatgac tttggtcgct gctgcttaca ccgtcgcttt aagatacacc 1260
agaaccaccg ctgaagaatt gtacttttct actaccgctg tctgtatcac cgaagtcatt 1320
aagttgttga tttccgtcgg tttgttggct aaggaaaccg gttccttggg tagattcaag 1380
gcttccttgt ccgaaaacgt tttgggttct ccaaaggaat tggctaagtt gtccgtccca 1440
tctttggttt scgctgtgca aaacaatatg gctttcttgg ctttgagtaa cttggacgcc 1500
gctgtttacc aagttaccta ccaattgaag atxccatgta ccgccttgtg taccgtcttg 1560<formula>see original document page 27</formula>
〈210> 5
〈211〉 729
<212〉 DNA
<213>人工序列
<220〉
<221〉 CDS
<222> (1). . (729)
〈400〉 5
<formula>see original document page 27</formula>Tyr Thr Ser Lys His Ser Trp Gly Lys Thr Tyr Gly Glu His Lys Arg 35 40 45
cac ttg gaa ttc tec cac gac caa tac aag gaa ttg caa tct tac gcc 192 His Leu Glu Phe Ser His Asp Gin Tyr Lys Glu Leu Gin Ser Tyr Ala 50 55 60
caa gaa ate ggt att ttc ttc act get tct ggt atg gat gaa atg gcc 240 Gin Glu lie Gly lie Phe Phe Thr Ala Ser Gly Met Asp Glu Met Ala 65 70 75 80
gtt gaa ttc ttg cac gaa ttg aac gtt cca ttc ttc aag gtc ggt tec 288 Val Glu Phe Leu His Glu Leu Asn Val Pro Phe Phe Lys Val Gly Ser 85 90 95
ggc gat act aac aat ttc cca tac ttg gaa aag acc get aag aag ggt 336 Gly Asp Thr Asn Asn Phe Pro Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Lys Lys Gly 100 105 110
aga cca atg gtt ate tec tct ggt atg caa tec atg gat acc atg aag 384 Arg Pro Met Val lie Ser Ser Gly Met Gin Ser Met Asp Thr Met Lys 115 120 125
caa gtc tac caa att gtc aag cca ttg aat cca aac ttt tgt ttc ttg 432 Gin Val Tyr Gin lie Val Lys Pro Uu Asn Pro Asn Phe Cys Phe Leu 130 135 140
caa tgt acc tec get tac cca ttg caa cca gaa gat get aac ttg aga 480 Gin Cys Thr Ser Ala Tyr Pro Gin Pro Glu Asp Ala Asn Leu Arg 145 150 155 160
gtc ate tct gaa tac caa aag ttg ttc cca gac ate cca ate ggt tac 528 Val lie Ser Glu Tyr Gin Lys Leu Phe Pro Asp lie Pro lie Gly Tyr 165 170 175
tec ggt cac gaa act ggt att get att tec gtg gcc get gtt get ttg 576 Ser Gly His Glu Thr Gly lie Ala lie Ser Val Ala Ala Val Ala Leu 180 185 190ggt get aag gtc ttg gaa aga cac ate act ttg gac aag act tgg犯g 624 Gly Ala Lys Val Leu Glu Arg His lie Thr Leu Asp Lys Thr Trp Lys 195 200 205
ggt tec gat cac tec get tct tta gaa cca ggt gaa tta get gaa ttg 672 Gly Ser Asp His Ser Ala Ser Leu Glu Pro Gly Glu Leu Ala Glu Leu 210 215 220
gtt aga tec gtt cgt ttg gtc gaa aga get ttg ggt tct cca acc aag 720 Val Arg Ser Val Arg Leu Val Glu Arg Ala Leu Gly Ser Pro Thr Lys 225 230 235 240
tec atg gcc 729 Ser Met Ala
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾糖蛋白工程菌株的方法，該方法包括下列步驟a)以編碼糖苷酶α-1，2-甘露糖苷酶或其功能結(jié)構(gòu)域的編碼序列替換α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因的內(nèi)部編碼序列，構(gòu)建同源重組突變基因序列；b)將步驟a)獲得的重組突變基因序列插入具有篩選標(biāo)志序列的載體中，得到重組質(zhì)粒；c)將N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I和β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列的編碼序列分別與各自定位信號編碼序列相連接，得到兩種融合基因序列；d)將步驟c)獲得的兩種融合基因序列插入具有篩選標(biāo)志序列的載體中，得到重組質(zhì)粒；e)將α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列連接，得到融合基因序列f)向載體中插入唾液酸合成酶編碼序列使與載體內(nèi)的篩選標(biāo)志編碼序列相連接，然后再向載體中插入步驟e)獲得的融合基因序列，得到重組質(zhì)粒；g)將(i)步驟a)得到的重組質(zhì)粒，(ii)步驟a)和步驟b)得到的重組質(zhì)粒，或者(iii)步驟a)、b)和c)得到的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入工程菌株，借助篩選標(biāo)志篩選發(fā)生表型改變的工程菌株；h)在培養(yǎng)基中對所述工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，收集上清中的糖蛋白并對其N-糖基化修飾糖鏈進(jìn)行分析，確認(rèn)工程菌株表達(dá)的糖蛋白N-糖基化修飾為預(yù)定糖鏈。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的a-l，2-甘露糖苷酶編碼序列為SEQIDNO:l。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I及定位信號的編碼序列為 SEQ ID NO: 2。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的|3-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1及定位信號的編碼序列為SEQ ID NO: 3。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的a-2，6-唾液酸酶和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列為SEQ ID NO: 4。
6. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的唾液酸合成酶的編碼序列為SEQIDNO:5。
7. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的cx-l，2-甘露糖苷酶編碼序列、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移 酶I及定位信號的編碼序列、P-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及定位信號的編碼序列、a-2，6-唾液酸酶 和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列以及唾液酸合成酶的編碼序列可從任何物種，諸如哺乳動(dòng)物、 植物、真菌和細(xì)菌中PCR擴(kuò)增獲得，也可依據(jù)Genebank序列通過人工合成，優(yōu)選根據(jù)酵母 密碼子偏嗜性人工合成。
8. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的預(yù)定糖鏈的末端糖基為選自甘露糖、葡萄糖、半乳糖 和唾液酸中的一種或多種。
9. 權(quán)利要求1或8所述的方法，其中所述的預(yù)定糖鏈的結(jié)構(gòu)為選自下列其中的一種或多種 Man5GlcNAc2、 GalGlcNAcMan5GlcNAc2和SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)糖基化工程領(lǐng)域，本發(fā)明涉及借助基因工程手段構(gòu)建表達(dá)預(yù)定糖鏈修飾的工程菌株的方法，本發(fā)明還涉及對糖蛋白N-糖基化修飾糖鏈的設(shè)計(jì)與改造，使糖蛋白可以根據(jù)需要含有結(jié)構(gòu)選自Man₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂的修飾糖鏈。
文檔編號C12N15/62GK101343635SQ200810007439
公開日2009年1月14日 申請日期2008年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日
發(fā)明者宋海峰, 新 高 申請人:新 高