專利名稱：：一種豬苓多糖精制中的脫色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種豬苓多糖精制中的脫色方法。
背景技術(shù)：
：中藥豬苓是多孔菌科多孔菌屬真菌豬苓[A^ypor"si/;^eJJa"s(Pers.)Fr.]的干燥菌核，在我國己有2000年的藥用歷史，具有補血滋陰、生津潤燥和利水滲濕等作用。1973年日本首次從豬苳中分離出豬苓多糖，并證明其對動物移植性腫瘤有抑制作用，隨后圍繞豬苓多糖開展了很多研究工作?，F(xiàn)已證明，豬苓多糖具有免疫刺激作用，可提高人體免疫力。臨床應(yīng)用豬苓多糖配合乙肝疫苗或干擾素治療乙型肝炎，或佐以化療藥物治療原發(fā)性肺癌、子宮頸癌、鼻咽癌、食道癌和白血病等腫瘤疾病。豬苓多糖能顯著降低肝臟中氧化清除自由基損傷的作用，對于延緩組織細胞老化、保護機體、抗老防衰十分有益。在我國上世紀八、九十年代已有豬苓多糖注射液、豬苓多糖膠囊等產(chǎn)品問世，并在臨床及日常保健中廣為應(yīng)用。目前豬苓多糖主要是從豬苓菌核中提取獲得。豬苓藥用需求的不斷擴大以及對豬苓的采挖缺乏有效的管理，導(dǎo)致其野生資源銳減，已經(jīng)面臨資源瀕危的狀態(tài)。利用蜜環(huán)菌伴栽豬苓菌核的人工栽培方法存在兩方面問題，一是栽培中需要大量豬苓菌核作為種苓，消耗了一部分豬苓的產(chǎn)量；二是栽培豬苓的繁殖率低，生長周期長，產(chǎn)量有限。此外，人工栽培的豬苓容易存在重金屬易超標的問題。這些因素造成目前豬苓的藥材產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增長的國內(nèi)外市場對豬苓的需求。發(fā)酵工程技術(shù)是通過現(xiàn)代微生物工程技術(shù)進行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)，是大部分生物技術(shù)藥物工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。采用深層發(fā)酵法培養(yǎng)豬苓，周期短，成本低，產(chǎn)量大，產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定，大大提高了豬苓多糖的生產(chǎn)能力。己有研究表明從豬苓菌絲體中提取的多糖和從豬苓菌核中提取的多糖均能提高機體免疫力。豬苓粗多糖為深褐色，不利于有效成分的進一步純化和保健產(chǎn)品的開發(fā)。目前應(yīng)用于多糖脫色的方法主要有活性炭吸附、雙氧水氧化、DEAE纖維素柱層析等。H202脫色效果較好，但脫色耗時長，反應(yīng)過程可能會對多糖結(jié)構(gòu)造成一定影響。DEAE纖維素屬于離子交換纖維素，價格高于活性炭，能取得較好的脫色效果，但色素洗脫困難，其原因可能是層析介質(zhì)被毒化，逆轉(zhuǎn)困難，難以重新獲得交換能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在豬苓多糖的精制過程中提供一種效率高、成本低、操作簡單、重復(fù)性3好的脫色方法。使用該方法處理，不會影響多糖的生物活性，且多糖的損失小，適合應(yīng)用于大量生產(chǎn)中。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先制備豬苓粗多糖，再使用活性炭對粗多糖溶液進行脫色處理。具體地說，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下1.粗多糖的制備豬苓菌粉，可以是豬苓菌核粉以及豬苓固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的菌絲體粉，經(jīng)過脫脂處理;脫脂后的干燥菌粉加水提取2-4次，提取溫度為80-10(TC，前兩次提取時間為2-5小時，提取時水用量(V)為菌粉重量(W)的5-15倍，第三次及以后提取時間均為1-4小時，提取時水用量(V)為菌粉重量(W)的5-10倍；合并提取液，常壓加熱濃縮或60-90'C減壓濃縮，濃縮液體積(V)為菌粉重量(W)的0.5-4倍，減壓濃縮時真空度為0.6-0.8;提取濃縮液加入95%乙醇或無水乙醇沉淀多糖，溶劑用量(V)為提取濃縮液體積(V)的3-6倍；分離沉淀部分，以適量水溶解，溶液經(jīng)冷凍干燥，制得粗多糖。2.粗多糖的脫色上述方法制備的粗多糖配成0.5-3%的水溶液，向其中加入活性炭的重量(W)為溶液體積(V)的2-4%，溶液于40-7(TC下保溫40-60分鐘進行脫色處理；過濾去除活性炭；用分光光度法于250mn處分別檢測脫色前后多糖溶液的吸光度(A)值，脫色后溶液的吸光度(A)應(yīng)不高于脫色前溶液吸光度(A)的1/3。具體實施方式實施例取豬苓菌核粗粉500g，用5倍體積80%乙醇浸泡過夜，抽濾，藥渣揮干至無醇味，加水于10(TC煮提2次，每次4h，提取時水的用量均為7L。合并兩次提取液，減壓濃縮至0.5L，加入無水乙醇2L至醇終濃度80X，4。C放置過夜，5000rpm離心15min分離沉淀。沉淀以少量去離子水溶解，冷凍干燥，得棕色粗多糖粉末(菌核多糖)7.lg。上述粗多糖加lL水溶解，取少量溶液經(jīng)l:25稀釋，于250nm測量吸光度(A)為0.578。向粗多糖溶液中加入活性炭20g，于60'C保溫60min。脫色后的溶液經(jīng)12000rmp離心，微孔濾膜過濾去除活性炭，取少量溶液經(jīng)l:25稀釋，于250nm測量吸光度(A)為O.180。比較例l:取烘干的發(fā)酵培養(yǎng)豬苓菌絲體500g，用5倍體積80%乙醇浸泡過夜，抽濾，藥渣揮干至無醇味，加水于10(TC煮提3次，每次4h，水的用量分別為7L，7L和6L。合并三次提取液，減壓濃縮至2L，加入無水乙醇8L至醇終濃度80X，4'C放置過夜，5000rpm離心15min分離沉淀。沉淀以少量去離子水溶解，冷凍干燥，得棕色粗多糖粉末(菌絲體多糖)25.2g。上述粗多糖加水制成1%水溶液，取少量溶液經(jīng)l:25稀釋，于250nm測量吸光度(A)為.1.75。向粗多糖溶液中加入3%活性炭(重量/體積百分比)，于6(TC保溫40min。脫色后的溶液經(jīng)12000rmp離心，微孔濾膜過濾去除活性炭，取少量溶液經(jīng)h25稀釋，于250nm測量吸光度(A)為O.38。比較例2:取豬苓菌絲體粗多糖5g，加水配成1%的粗多糖溶液。取該溶液6份各25ml，其中4份分別添加活性炭0.25克，0.5克，DEAE纖維素0.25克，0.5克，均于50。C保溫30min，脫色后的溶液經(jīng)12000rmp離心，微孔濾膜過濾去除脫色劑；l份用氨水調(diào)pH至8.0，加入15X雙氧水10ml，5(TC保溫30min，透析12h;l份為對照。對照及脫色處理后的各組溶液經(jīng)l:25稀釋，在190700nm處掃描各溶液的吸光度(A)，檢測脫色效果，在250nm測量各溶液的吸光度(A)，測量結(jié)果見表l。表l不同處理方法吸光度(A)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>結(jié)果顯示，活性炭脫色效果最好，并表現(xiàn)出顯著的濃度效應(yīng)。DEAE纖維素的濃度效應(yīng)不顯著，高濃度的活性炭脫色效果明顯優(yōu)于相同用量的DEAE纖維素。DEAE纖維素為離子交換型纖維素，有較好的脫色效果，它的缺點是價格高，且色素洗脫困難，其原因可能是層析介質(zhì)被毒化，逆轉(zhuǎn)困難，難以重新獲得交換能力。雙氧水脫色效果較好，其缺點是脫色后的多糖溶液需要經(jīng)過透析處理。此外，經(jīng)過H202處理后多糖溶液紫外區(qū)196nm處的多糖特征吸收峰出現(xiàn)大幅度衰減，推測其反應(yīng)過程中對多糖結(jié)構(gòu)造成一定影響。綜合考慮三種脫色劑的脫色效果、對多糖造成的損失以及脫色成本等方面因素，選用活性炭作為脫色劑。比較例3活性炭脫色的工藝條件研究(1)脫色溫度對脫色效果的影響取濃度為l"/。的豬苓菌絲體粗多糖5ml，加入O.l克活性炭，分別在40、50、60、70、80'C條件下脫色60min，離心后微孔濾膜過濾。粗多糖溶液(對照)和處理后的各組溶液均經(jīng)過1:25稀釋，于250nm下測量吸光度(A)，結(jié)果見表2:表2脫色溫度對吸光度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)脫色時間對脫色效果的影響取濃度為1。/。的豬苓菌絲體粗多糖5ml，加入O.l克活性炭，在6(TC下分別脫色20、30、40、50、60min，離心后微孔濾膜過濾。粗多糖溶液(對照)和處理后的各組溶液均經(jīng)過1:25稀釋，于250nm下測量吸光度(A),結(jié)果見表3:表3脫色時間對吸光度的影響時間(tnin)2030405060對照A2500.6540.6120.5680.5200.5181,748(3)活性炭用量對脫色效果的影響取濃度為1。/。的豬苓菌絲體粗多糖5ml，分別加入1%、2%、3%和4%的活性炭，于60。C脫色50min，離心后微孔濾膜過濾。粗多糖溶液(對照)和處理后的各組溶液均經(jīng)過1:25稀釋，于250nm下測量吸光度(A)，結(jié)果見表4:表4活性炭用量對吸光度的影響活性炭用量1%2%3%4%對照A2500.8240.5250.3840.321.748(4)取濃度為1%的豬苓菌絲體粗多糖溶液，在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上選擇溫度、時間、活性炭用量按L9(34)安排正交實驗(表5)，結(jié)果見表6。根據(jù)極差值(R)確定影響活性炭對豬零菌絲體粗多糖溶液脫色效果的因素，按影響程度的大小排列為C〉A(chǔ)〉B，即活性炭用量對脫色效果影響最大，其次是溫度，影響最小的是脫色時間。根據(jù)實驗結(jié)果，活性炭脫色的最佳工藝條件為C3B1A3，即活性炭添加量為3%，脫色溫度為6(TC，脫色時間為40min。表5正交實驗因素水平表因素溫度(x:)時間(min)加碳量(%)水140(Al)40(Bl)l(Cl)平250(A2)50鵬2(C2)360(A3)60卿3(C3)6表6正交試驗方案及結(jié)果表實驗編號溫度rc)時間(min)活性炭用量(%)空白列A25(114040110.73424050220.55134060330.42145040230.52955050310.38365060120.73976040320.35086050130.70796060210.509k1(250)0.5690.5380.7270.542k2(250)0,550.5470.530.547k3(250)'0,5220,5560.3850.552R0.0470.0180.34權(quán)利要求1.一種豬苓多糖精制中的脫色方法，包括以下步驟(1)粗多糖的制備豬苓菌粉經(jīng)過脫脂處理后加水提取多糖；多糖提取液濃縮后加入乙醇沉淀多糖；分離沉淀部分，以適量水溶解沉淀；溶液經(jīng)冷凍干燥，制得粗多糖；(2)粗多糖的脫色上述方法制備的粗多糖以水溶解，溶液中加入活性炭進行脫色處理，過濾去除活性炭；用分光光度法于250nm處分別檢測脫色前后多糖溶液的吸光度(A)，脫色后溶液的吸光度(A)應(yīng)不高于脫色前溶液吸光度(A)的1/3。2.如權(quán)利要求(1)所述的方法，其特征在于所述的豬苓菌粉包括豬苓菌核粉以及豬苓固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的菌絲體粉。3.如權(quán)利要求(1)所述的方法，其特征在于菌粉用80-10(TC的水提取2-4次；前二次提取時間為2-5小時，提取時水用量(V)為菌粉重量(W)的5-15倍；第三次及以后提取時間均為l-4小時，提取時水用量(V)為菌粉重量(W)的5-IO倍。4.如權(quán)利要求(1)所述的方法，其特征在于提取液常壓加熱濃縮或60-9(TC減壓濃縮，濃縮液體積(V)為菌粉重量(W)的0.5-4倍，其中所述減壓濃縮時真空度為0.06-0.08Mpa;提取濃縮液加入95%乙醇或無水乙醇沉淀多糖，溶劑用量(V)為提取濃縮液體積(V)的3-6倍。5.如權(quán)利要求(1)所述的方法，其特征在于粗多糖配成0.5_3%水溶液，向溶液中加入活性炭的重量(W)為溶液體積(V)的2-4%，溶液于40-70。C下保溫40-60分鐘進行脫色處理。6.如權(quán)利要求(l)所述的豬苓多糖精制中的脫色方法可用于豬苓多糖的工業(yè)化生產(chǎn)中。全文摘要本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種豬苓多糖精制中的脫色方法，內(nèi)容包括豬苓多糖的制備和應(yīng)用活性炭對豬苓多糖溶液脫色的方法。本發(fā)明提供的方法脫色成本低、效果好，對豬苓多糖的破壞小，適于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12P19/00GK101525389SQ20081000769公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者沈晶晶,王春蘭,郭順星,陳曉梅申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所