專利名稱：：生物農(nóng)藥梧寧霉素的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及——禾中由不吸水鏈霉菌梧外l亞禾中(5trepto歷/cesa力j^r。,sropicussw/6p.r股力o"e/7Si's;i.5'"65'p)產(chǎn)生的生物農(nóng)藥——梧寧霉素改進的制備方法以及該產(chǎn)品在防治蘋果斑點落葉病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：.我國是農(nóng)業(yè)大國，常年種植糧食作物l億公頃以上，棉花480萬公頃以上，油料作物1400萬公頃以上，蔬菜瓜果1800萬公頃以上，常年需要防治面積超過3億公頃，為了防治病蟲害，保證農(nóng)業(yè)的正常生產(chǎn)，長期以來，人們大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害。化學(xué)農(nóng)藥的使用對保證農(nóng)作物正常生產(chǎn)起到有效作用，但隨著長期以來大量化學(xué)農(nóng)藥的使用，對生態(tài)環(huán)境已造成嚴重破壞，如土壤結(jié)構(gòu)破壞、土壤中酶活性降低、土質(zhì)和水體嚴重污染等等，破壞了整個生態(tài)環(huán)境，糧食、蔬菜、水果等幾乎所有食品中有毒農(nóng)藥殘留量嚴重超標，食用殘留化學(xué)農(nóng)藥嚴重超標的瓜果蔬菜造成人畜中毒的事件也時有發(fā)生。針對中國入世，發(fā)達國家紛紛調(diào)整提高了產(chǎn)品進口的技術(shù)門檻，農(nóng)產(chǎn)品受到的影響首當(dāng)其沖。我國僅農(nóng)副產(chǎn)品因農(nóng)藥殘留超標而遭國外"綠色壁壘"封殺的損失每年就高達70億美元。發(fā)展無公害的生物農(nóng)藥是解決現(xiàn)有農(nóng)藥及農(nóng)產(chǎn)品出口問題的主要途徑。生物農(nóng)藥屬于環(huán)境友好型產(chǎn)品，使用生物農(nóng)藥，不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥和化肥的使用，有效地實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)，提升農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟附加值，而且可為我國農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)造有利條件，極大地增強我國農(nóng)產(chǎn)品的國際競爭力。對我國推進綠色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展及發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟、增加農(nóng)民收入、促進農(nóng)村繁榮具有重要的推進作用。蘋果斑點落葉病主要危害展葉不久的幼嫩葉片，也能危害嫩梢和果實。病斑初期為褐色小點，以后擴大成直徑56毫米的紅褐色圓斑，邊緣紫揭色，中心有一深褐色小點，其周圍有深褐色環(huán)紋，狀如蛙眼。天氣潮濕時，病斑正反面均可產(chǎn)生墨綠色霉狀物。發(fā)病后期，病斑繼續(xù)擴大成不規(guī)則形，病斑部分或全部呈灰白色，其上散生小黑點，有的病斑破裂或穿孔。在高溫多雨季節(jié)，病斑迅速擴人成不規(guī)則形褐色大斑，葉片焦枯脫落。秋梢嫩葉發(fā)病最重，一張葉片上?？砂l(fā)生數(shù)十個甚至上百個大小不等的病斑，許多病斑連綴在一起，呈云朵狀，葉尖干枯，葉片扭曲畸形早落。葉柄受害發(fā)生橢圓形暗褐色凹陷病斑并易折斷。枝條一年生枝或徒長枝易發(fā)病，病枝皮孔突起，芽周變黑，凹陷壞死，邊緣開裂。幼果被害，以果為中心產(chǎn)生褐色圓斑，表面略凹陷，附近果肉變褐木栓化，不深入果肉深處，若被二次寄生可使果實腐爛。蘋果斑點落葉病是70年代末到80年代初在我國流行的一種新的蘋果葉斑病，目前己在很多地區(qū)發(fā)生，且有日益發(fā)展的趨勢。目前，我國登記注冊的生物農(nóng)藥(防治植物病、蟲、草、鼠害)有效成分77個，占有效成分的13.4%。產(chǎn)品691個，占整個農(nóng)藥產(chǎn)品的7.1%,制劑產(chǎn)量接近10萬噸，采用生物農(nóng)藥防治病蟲害的占10%左右。一些生物農(nóng)藥制劑也成為出口的重要品種，如阿維菌素、井岡霉素和赤霉素。用于蘋果斑點落葉病生物農(nóng)藥以多抗霉素為主，但多抗霉素多為進口制劑，增加了成本，急需研究開發(fā)出新型的生物農(nóng)藥，解決現(xiàn)有生物農(nóng)藥成本高、防治率低等問題。梧寧霉素作為已知化合物，是由不吸水鏈霉菌梧州亞種(5"tr印t咖ycesa力jg7Y^cc^'cusr"^o〃e"w's".s"力卬)(《微生物學(xué)報》1988年，28巻(1)85-87頁)產(chǎn)生的，由于梧寧霉素的生物效價低，保質(zhì)期較短，對蘋果腐爛病的防治效果不夠理想，在使用和藥效方面受限；除發(fā)明單位對梧寧霉素新用途進行研究外，尚未見到其它單位將梧寧霉素作為生物農(nóng)藥還有其它新用途的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供利用不吸水鏈霉菌梧州亞種(5Yr印to歷yce5a力j^rosc卬i'ci/ss"Z^a/f^力o"e/7W's/7.w力邵)制備梧寧霉素的方法，進一步提高對蘋果腐爛病的防治效果；本發(fā)明另一個目的是該方法制備的梧寧霉素在防治蘋果斑點落葉病中的應(yīng)用。用不吸水鏈毒菌梧州新亞禾中(■SYrepto/ffycesa/j^roscopicuss"6sp,fkz/w〃e/7sj's/7.制備梧寧霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明方法是以不吸水鏈霉菌梧州亞禾中(Strepto/ffycesa力jgroscopic6ASs〃Z^a脂z力m/e"w's/7.s〃fep)(《微生物學(xué)報》1988年，28巻(1)85-87頁)作為出發(fā)菌株(該菌種保存在遼寧省微生物菌種保藏中心，自申請日起20年內(nèi)公眾可從該中心獲取該菌種)，通過菌種液體深層發(fā)酵制取生物農(nóng)藥梧寧霉素，其特征在于它包括以下方法a)種子發(fā)酵培養(yǎng)基的制備每100毫升中含有黃豆餅粉0.5-1.5g，淀粉0.5-1.5g，葡萄糖0.5-1.5g，蛋白胨0.1-0.5g,硫酸鎂0.01-0.05g，硫酸銨0.1-0.5g，憐酸氫二鉀0.01-0.05g，碳酸鈣0.1-1.0g，氯化鈉0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，PH自然;(2)種子發(fā)酵條件和方法按5-20%的接種量取不吸水鏈霉菌梧州亞種(6Y7^oto//cesa力j^rosc，ycuss"力s/./feioi/e/wh/7.犯6砂)菌株，于25-35。C在種子發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時，通風(fēng)量1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，制取種子發(fā)酵液備用；(3)深層發(fā)酵培養(yǎng)基的制備每100毫升中含有葡萄糖1.0-3.0g，淀粉1.0-2.0g，玉米面0.5-1.5g，黃豆餅粉1.0-2.0g，蛋白胨(或玉米漿)0.2-0.6g,硫酸銨O.1-0.5g，硫酸鎂0.01-0.05g，磷酸氫二鉀0.01-0.05g，碳酸鈣O.l-1.0g，氯化鈉0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，滅菌后加入培養(yǎng)基體積0.3-0.5%的正丙醇，PH自然；(4)梧寧霉素發(fā)酵液的制備按5-20%的接種量取上述種子發(fā)酵液于25-35'C進行深層發(fā)酵培養(yǎng)64-72小時，通風(fēng)量前期0-12小時、中期12-40小時、后期40-42小時1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，得到梧寧霉素發(fā)酵液。本發(fā)明還涉及梧寧霉素作為在防治蘋果斑點落葉病的生物農(nóng)藥的應(yīng)用。梧寧霉素是一種復(fù)合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白諾氏菌素和茴香菌素。根據(jù)梧寧霉素A1的核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)M.i梧寧霉素Al的分子式應(yīng)為(]3孔2船13，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為根據(jù)類似HQ梧寧霉素Al分離鑒定方法，通過核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出梧寧霉素B化學(xué)結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>根據(jù)類似梧寧霉素A1分離鑒定方法，通過核磁共振、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜確定的分子量和其他一些理化數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出梧寧霉素C化學(xué)結(jié)構(gòu)式為<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>梧寧霉素生物檢測方法方法管碟法指示菌清酒酵母(fecc/zaroffl/cwsaAe)培養(yǎng)基上層PDA下層水瓊脂標準品四霉素A純品產(chǎn)品標定指示菌蘋果斑點落葉病菌、蘋果腐爛病菌等梧寧霉素毒理實驗(1)梧寧霉素小白鼠和大白鼠急性毒性動物性別LD50(mg/kg)小白鼠雄2851.31(2632.83-3087.92)雌2949.87(2661.75-3269,18)大白鼠雄~4000雌~4000結(jié)論從急性毒性實驗結(jié)果可以看；ii梧寧霉素毒性較低。(2)梧寧霉素對CHL-1細胞SCE頻率的影響表1:梧寧霉素對CHL細胞SCE頻率的影響(非活化系統(tǒng))受試物及濃度(化/ml)觀察細胞數(shù)SCE數(shù)湖胞平均土SEt檢驗陰性對照25897848677895896138875657967.32±0.37Bap6.7256871081088786886978897586677.6±0.26t=0.617P>0.5訓(xùn)2569787656107776794571197810877.32±0.34t=0P>0.5梧50257796878596979611811789588577,6±0.33t=0.569P>0.5寧霉2525657711399910895576896710866107.44±0.40t=0.2218P>0.5素12.5257888678658988767896759887.7.32±0.23t=0P>0.56.28257107410756710812937678898712887.72土0.43t=0.7099P>0.57表2:梧寧霉素對CHL細胞SCE頻率的影響(活化系統(tǒng))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>梧寧霉素CHL細胞SCE頻率的影響實驗結(jié)果表明梧寧霉素的5個濃度都沒有引起SCE頻率的增加。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理與陰性對照比均PX).l。Bap代謝活化明顯的誘發(fā)了SCE頻率增加，與陰性對照比PO.001,差異非常顯著。以上結(jié)果表明，梧寧霉素5個濃度均未見引起SCE頻率增加，結(jié)果可視為致突變陰性。(3)梧寧霉素的微核試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結(jié)果表明梧寧霉素樣品與陰性對照比較均PX).l，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。陽性對照與陰性對照比PO.OOl，有顯著差異。以上結(jié)果表明梧寧霉素未引起微核的增加，結(jié)果為陰性。(4)梧寧霉素皮膚毒性和兔眼刺激性試驗將梧寧霉素涂抹于去除腹部毛的大白鼠腹部，觀察7天，結(jié)果證明皮膚LD50在4000mg/kg以上，表明梧寧霉素皮膚毒性較低，且涂抹梧寧霉素的局部皮膚未見損害；將梧寧霉素配制成10mg/ml澄明液體，滴5只大耳白兔左眼一滴，右眼滴生理鹽水，每日滴兩次，連續(xù)3天，停藥后繼續(xù)觀察3天，結(jié)果表明梧寧霉素對兔眼無刺激性。(5)梧寧霉素大鼠蓄積毒性①將梧寧霉素配制成400mg/ml濃度，冉用蒸餾水稀釋40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml，PH均為5.5.②以梧寧霉素對大鼠LD50為4000mg/kg為基準，設(shè)三個給藥劑量，1/5LD50(800mg/kg)、l/10LD50(400mg/kg)、1/20LD50(200mg/kg)。③大鼠80只，雌雄各半，均勻分為四組，每組雌雄各10只，以蒸餾水作對照，每天灌胃給藥1次，連續(xù)28天。④停藥后處死一半動物，雌雄各半，另一半動物觀察兩周后處死。結(jié)果表明各劑量組動物均無死亡。蓄積系數(shù)計算結(jié)果為5,6.從而看出梧寧霉素為弱蓄積性物質(zhì)。(6)梧寧霉素Ames試驗按照Ames平板摻入法進行梧寧霉素的試驗，結(jié)果如下:藥物與劑量(g/皿)TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9十S9突發(fā)回變142±32136±429±630±153士119143±2224]±38245土10溶劑對照146±"27±330土6147土24130i7247±10292±21梧寧歸5000135±141S7土627±1172±17172±17164±11303士18351±10IO()()138±"26±5136土16136±16240+16271±23200150±17130±〗225±2133±10133±10141±32246±13245±32IO()128土17139±U35土13149土25149±25'135土9250±7254土135(138±19147±627±8141±10141±10125±11262±9248±182A「l(J149±3224土9053±32210±2615S±151103土133NQO1761±34174±6正定51201±]87()■1122±471258±1080.她l1188士611216土87BaP4281土6635±659從表中結(jié)果表明在未加S9活化和加S9活化的條件下，梧寧霉素五個劑量對四株鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TAIOO、TA102的回變數(shù)無影響，與自然回變數(shù)無顯著差異；在未加S9活化和加S9活化的條件下，梧寧霉素高劑量達到5mg/皿時，四株鼠傷寒沙門氏菌的回變數(shù)為增加，這個結(jié)果說明用Ames試驗觀察梧寧霉素的致突變結(jié)果為陰性。梧寧霉素作為生物農(nóng)藥在防治蘋果斑點落葉病的應(yīng)用試驗示范例1、試驗示范試驗地點陜西省咸陽市禮泉縣試驗作物及品種蘋果，品種紅富士防治對象蘋果斑點落葉病(ylfe/^幼;7i/7s/ffl3Jj'(P.Henn.))試驗?zāi)康臑榱蓑炞C梧寧霉素防治蘋果斑點落葉病防治效果、有效劑量及對蘋果的安全性等環(huán)境條件試驗安排在陜西省咸陽市禮泉縣，果園面積10畝，12年生蘋果樹，株行距2x3m2，土壤類型為土婁土，有機質(zhì)含量為1.05%,PH值為中性。試驗藥劑梧寧霉素陽性對照藥劑10%多抗霉素B可濕性粉劑用量與處理編號處理編號藥劑施藥劑量施藥量(有效成分量)(1)梧寧霉素800倍1.88郵/kg(2)梧寧霉素1000倍1.5mg/kg(3)梧寧霉素1200倍1.25mg/kg")陽性對照10%多抗霉素B1000倍100nig/kg(5)清水對照一—使用方法采用植株莖葉噴霧處理試驗周期和施藥次數(shù)2006年5月-8月，共9次施藥調(diào)查方法于春梢停止抽生期和秋梢停止抽生期各進行一次防效調(diào)査。每小區(qū)調(diào)查2株，每區(qū)分東、西、南、北、中五個方向調(diào)查新梢抽生旺盛的5個當(dāng)年生枝條的全部葉片，記錄總?cè)~數(shù)、病葉數(shù)、病斑數(shù)。10分級方法0級:無病斑；1級:病斑面積占整個葉面積的10%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的11-25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26-40%;7級:病斑面積占整個葉面積的41-65%;9級:病斑面積占整個葉面積的66%以上。藥效計算方法i:(各級病葉數(shù)x相對級別數(shù))病情指數(shù)=-~x100調(diào)查總?cè)~數(shù)X9CKO—PT1防治效果(％)=(1--)xiooCKl-PT0式中CK0、CK1分別為空白對照區(qū)施藥前、后的病情指數(shù)；PT0、PT1分別為藥劑處理區(qū)施藥前、后的病情指數(shù)。結(jié)果與結(jié)論1、結(jié)果(1)春梢停止抽生期梧寧霉素防治蘋果斑點落葉病試驗結(jié)果處理平均病指平均防效(％)差異顯著性5%陽性對照10%多抗霉素B1000倍(有效成分量100mg/kg)0.7385.28bB梧寧霉素800倍(有效成分量1.88mg/kg)0.6686.30A梧寧,素1000倍(有效成分量1.5mg/kg)0.9283.49CC梧寧霉素1200倍(有效成分量1.2mg/kg)1.0480.93dD清水對照5.74---11(2)秋梢停止抽生期梧寧霉素防治蘋果斑點落葉病試驗結(jié)果處<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、結(jié)論(1)試驗期間經(jīng)系統(tǒng)觀察得知，供試藥劑梧寧霉素在試驗劑量范圍內(nèi)對蘋果樹生長發(fā)育無不良影響，果樹生長旺盛；(2)通過試驗，我們認為梧寧霉素對蘋果斑點落葉病有顯著的防治效果，其800-1000倍稀釋，在有效成份用量(1.25-1.88mg/kg)明顯低于陽性對照10。/。多抗霉素B(100mg/kg)的情況下，在春梢停止抽生期的防治效果達到陽性對照的防治效果；秋梢停止抽生期的防治效果也達到陽性對照的防治效果，其中梧寧霉素800倍稀釋液防效高于陽性對照，有效成分用量明顯低于陽性對照。建議對其進行大面積示范推廣。推薦劑量為800-1000倍稀釋液，于蘋果斑點落葉病發(fā)生初期(5月上旬)開始噴藥防治，間隔10-14天左右噴藥一次，連續(xù)噴施3-4次為宜。通過以上試驗結(jié)果，證明本發(fā)明與現(xiàn)在技術(shù)相比，具有下述有益效果1、己知梧寧霉素產(chǎn)生菌是遼寧省微生物科學(xué)研究院從土壤中篩選的一株放線菌，命名為不吸7K鏈毒菌梧州亞禾中(5Yi"e/to邁yces3力/grosco/2'cfASst/zfep.伊股力oue/57's/.sw&sp)《微生物學(xué)報》1988年，28巻(1)85-87頁，該菌種保存在遼寧省微生物菌種保藏中心，自申請日起20年內(nèi)公眾可從該中心獲取該菌種。2、梧寧霉素在施藥量明顯小于陽性對照10%多抗霉素的情況下，800倍稀釋樣品在春梢停止抽生期時防治蘋果腐爛病的效果高于多抗霉素，春梢停止抽生期時平均防效達83%以上，防治效果高于或等同現(xiàn)在大面積推廣的生物農(nóng)藥。將梧寧霉素進一步推廣，不僅可以提高防效，而且可以與其他生物農(nóng)藥交替使用，減緩抗性的產(chǎn)生；123、梧寧霉素具有廣譜性，對酵母、對革蘭氏陰性、陽性細菌以及真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，通過室內(nèi)和田間試驗證明對蘋果腐爛病防治效果提高到95%以上，對蘋果斑點落葉病、水稻稻瘟病以及番茄灰霉病也有良好的防治效果；4、梧寧霉素是一株菌同時產(chǎn)生的含有4種成分的抗生素，屬于環(huán)境友好型農(nóng)藥，且多種抗生素協(xié)同作用，可減少其他農(nóng)藥的使用，對維護生態(tài)環(huán)境有一定意義；5、梧寧霉素經(jīng)試驗證明是低毒的。急性毒性LD50為4000mg/kg,皮膚和粘膜刺激都無異常反應(yīng)，Ames試驗，CHL-1細胞SCE致突變和微核試驗均為陰性。蓄積性毒性試驗檢查結(jié)果表明各器官均無明顯異常，蓄積系數(shù)大于5.6，以上說明梧寧霉素毒性很低，急性毒性和食鹽和小蘇打相仿；6、利用本發(fā)明改進的梧寧霉素制備方法，不僅提高了梧寧霉素的生物效價(添加0.3-0.5%的正丙醇后，發(fā)酵液生物效價提高了15.5%),而且能使保質(zhì)期增長。生產(chǎn)仍采用通用型發(fā)酵設(shè)備，工藝簡單，周期短。生產(chǎn)原料價格便宜，生產(chǎn)過程中不存在三廢問題，不會造成環(huán)境污染；具體實施例方式通過下面給出的具體實施例，可以進一步了解本發(fā)明。但它們并不是對本發(fā)明保護范圍的限制。實施例l:梧寧霉素發(fā)酵液的制備本發(fā)明通過正交試驗優(yōu)選的培養(yǎng)基配方(1)種子發(fā)酵培養(yǎng)基每100毫升中含有黃豆餅粉1.0g，淀粉1.0g，葡萄糖0,7g，蛋白胨0.5g,硫酸鎂0.03g，硫酸銨1.0g，磷酸氫二鉀0.02g，碳酸鈣0.7g，氯化鈉O.lg，植物油0.2g,PII自然；(2)深層發(fā)酵培養(yǎng)基每100毫升中含有葡萄糖2.5g，淀粉l,5g，玉米曲1.0g，黃豆餅粉2,0g，蛋白胨(或玉米漿)0.5g，硫酸銨0.2g，硫酸鎂0.03g，磷酸氫二鉀0.02g，碳酸鈣0.7g，氯化鈉0.1g，植物油0.2g，滅菌后添加培養(yǎng)基體積0.4%的正丙醇，PH自然。本發(fā)明對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化(1)種子發(fā)酵液的制備按5-20%的接種量取不吸水鏈霉菌梧州亞種(5Yr印to/^cess々FgroscoA/c"ss"Z)5A,"z/o〃e/757'51/.s〃Zs^)菌株，于25-35。C在禾中子發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時，通風(fēng)量1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，制取種子發(fā)酵液備用；(2)梧寧霉素發(fā)酵液的制備按5-20%的接種量取上述種子發(fā)酵液于25-35。C進行深層發(fā)酵培養(yǎng)，通風(fēng)量前期0-12小時、中期12-40小時、后期40-42小時1:0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，接種量5-20%，發(fā)酵周期64-72小時，得到梧寧霉素發(fā)酵液。實施例2-5:梧寧霉素防治蘋果斑點落葉病應(yīng)用實例<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種生物農(nóng)藥梧寧霉素的制備方法，是采用不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)通過菌種液體深層發(fā)酵制取的生物農(nóng)藥---梧寧霉素，其特征在于它包括以下方法(1)種子發(fā)酵培養(yǎng)基制備每100毫升中含有黃豆餅粉0.5-1.5g，淀粉0.5-1.5g，葡萄糖0.5-1.5g，蛋白胨0.1-0.5g，硫酸鎂0.01-0.05g，硫酸銨0.1-0.5g，磷酸氫二鉀0.01-0.05g，碳酸鈣0.1-1.0g，氯化鈉0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，PH自然；(2)種子發(fā)酵條件和方法按5-20％的接種量取不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)菌株，于25-35℃在種子發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時，通風(fēng)量1∶0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，制取種子發(fā)酵液備用；(3)深層發(fā)酵培養(yǎng)基制備每100毫升中含有葡萄糖1.0-3.0g，淀粉1.0-2.0g，玉米面0.5-1.5g，黃豆餅粉1.0-2.0g，蛋白胨或玉米漿0.2-0.6g，硫酸銨0.1-0.5g，硫酸鎂0.01-0.05g，磷酸氫二鉀0.01-0.05g，碳酸鈣0.1-1.0g，氯化鈉0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，滅菌后加入培養(yǎng)基體積0.3-0.5％的正丙醇，PH自然；(4)梧寧霉素發(fā)酵液制備按5-20％的接種量取上述種子發(fā)酵液于25-35℃進行深層發(fā)酵培養(yǎng)64-72小時，通風(fēng)量前期0-12小時、中期12-40小時、后期40-42小時1∶0.5-1(V/V)，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分鐘，得到梧寧霉素發(fā)酵液。2、按照權(quán)利要求1制備的梧寧霉素作為生物農(nóng)藥在防治蘋果斑點落葉病中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了由不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)制備生物農(nóng)藥梧寧霉素的方法以及該方法所得產(chǎn)品在蘋果斑點落葉病等病害防治中的用途。利用本發(fā)明方法制備的梧寧霉素，不僅提高了梧寧霉素的生物效價(添加0.3-0.5％的正丙醇后，發(fā)酵液生物效價提高了15.5％)，能使保質(zhì)期延長；該梧寧霉素不僅對防治蘋果腐爛病的效果提高到95％以上，而且對蘋果斑點落葉病、番茄灰霉病等病害均有良好的防治效果；梧寧霉素對酵母、對革蘭氏陰性、陽性細菌以及真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，具有廣譜性，屬于環(huán)境友好型生物農(nóng)藥。文檔編號C12P17/18GK101633941SQ20081001250公開日2010年1月27日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者關(guān)艷麗,吳紅艷,莉李,桓明輝,王志學(xué),郭玲玲,飛陳,韓希軍申請人:遼寧省微生物科學(xué)研究院