專利名稱：利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAα1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖溶酶原激活劑的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn) 重組吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑去氨普酶al (DSPAal)的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
去氨普酶(DSPA)是南美一種吸血蝙蝠唾液中分離的纖溶酶原激活劑，主要包括四 種蛋白質(zhì)DSPAal、 DSPAa2、 DSPAp和DSPAy。試驗發(fā)現(xiàn)，其中DSPAal具有最好的生物 化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，所以被進一步研究。研究表明在纖維蛋白刺激下，DSPAal活性增 加10500倍，而組織纖溶酶原激活劑(tPA)僅為550倍；在纖維蛋白與纖維蛋白原存 在的條件下，DSPAal活性的比率為12900倍，而tPA僅為72倍，DSPAal具有更高的纖 維蛋白選擇性。藥理學(xué)研究表明，在肺栓塞的模型中，與tPA相比，DSPAal具有更好的 纖維蛋白凝塊專一性；在鼠的人工模型中，DSPAal也表現(xiàn)出比tPA更好的纖維蛋白專一 性和更長的半衰期；在狗急性心肌梗塞的冠狀血栓形成模型中，DSPAal具有更快的再灌 注和更低的再閉塞率；在鼠腸系膜靜脈模型中，相比較與tPA， DSPAal表現(xiàn)出較低的出 血率；另外在鼠和獼猴藥理學(xué)實驗中，DSPAal也表現(xiàn)出比tPA更低的清除率。在實驗過 程中，未發(fā)現(xiàn)DSPAal直接的毒性作用，僅在大劑量時表現(xiàn)出副作用。
目前DSPAal已進行了 II期臨床實驗DIAS試驗及DEDAS試驗，其中DIAS試驗結(jié) 果表明安慰劑對照和給藥兩組血流再灌注率分別達到46. 7%和71. 4%,患者腦部栓塞 血流獲顯著改善，有效的阻止了腦部損傷。90天時，兩組分別有46. 7%和60%的患者達 到主要臨床終點，顱內(nèi)出血發(fā)生率兩組均為3.3M(tPA在大型試驗中，出血發(fā)生率為6% 左右)；DEDAS試驗是一個多中心、劑量遞增的II期臨床試驗研究，目的為評價急性腦 缺血癥狀發(fā)作3 9小時內(nèi)，DSPAal隨劑量遞增(具體試驗劑量未見報道)的療效和安 全性，結(jié)果表明共有38例病人在卒中癥狀發(fā)作3 9小時內(nèi)接受了安慰劑治療、 90mcg/kg的DSPAal治療或125mcg/kg的DSPAal治療，受試者的入選標準是MRI證實 彌散灌注缺失面積達2(^以上和皮層組織低灌注區(qū)域超過2cra，在第90天時，安慰劑組 有25%的病人臨床結(jié)果有所改善，90mcg/kg組有28.6%的病人結(jié)果有所改善，而 125mcg/kg組的比例為6(^。重要的是，在接受治療的病人中，無人出現(xiàn)腦出血。
DSPAal早期直接從吸血蝙蝠唾液腺中分離，但含量少，純化成本高，難以大量獲 得。國外也進行了利用基因工程的方法生產(chǎn)DSPAal，包括在植物中、昆蟲細胞sf9和中 國倉鼠卵巢細胞CHO中表達，其表達量分別達到30mg/L、 10mg/L和60mg/L,但由于這 些表達系統(tǒng)中表達量較低，且具有成本髙、周期長、技術(shù)難度高等缺點，不利于大規(guī)模 的工業(yè)化生產(chǎn)。
酵母表達系統(tǒng)既有原核生物生長快、操作簡單的優(yōu)點，又具有真核生物能夠?qū)Φ鞍?質(zhì)進行翻譯后修飾的優(yōu)點，能夠表達糖蛋白等結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白。酵母表達系統(tǒng)主要有釀酒 酵母表達系統(tǒng)和畢赤酵母表達系統(tǒng)等。釀酒酵母具有一定的局限性，如產(chǎn)量低、表達質(zhì)
4粒易丟失、外源基因過度糖基化、分泌效果差、不適合高密度發(fā)酵等?；谏鲜鰡栴}， 人們利用其它酵母菌株構(gòu)建了可高效穩(wěn)定表達外源基因的新表達系統(tǒng)，即甲醇營養(yǎng)型酵 母表達系統(tǒng)。作為第二代酵母表達系統(tǒng)，它克服了釀酒酵母表達系統(tǒng)的諸多不足，尤其 是其中的畢赤酵母表達系統(tǒng)已成為目前廣泛應(yīng)用的理想的基因表達系統(tǒng)。
畢赤酵母(尸/c力^ pa^or&)表達系統(tǒng)是上個世紀70年代隨著人們對甲醇利用酵
母的研究而發(fā)展起來的。最初的目的是尋找甲醇利用菌來消化環(huán)境中的甲醇，從而發(fā)現(xiàn) 了畢赤酵母等幾種甲醇利用酵母，當初畢赤酵母只用于制備單細胞蛋白，由此形成了畢 赤酵母的發(fā)酵技術(shù)。80年代畢赤酵母被開發(fā)成一種異源表達系統(tǒng)，到1985年，Cregg等 首次報道了利用CaCl2-聚乙二醇介導(dǎo)原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法成功的將帶有His4選擇標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 入組氨酸脫氫酶基因缺陷型畢赤酵母菌株GS115中，使轉(zhuǎn)化效率提高到105轉(zhuǎn)化子Aig。在 1994年，F(xiàn)aber等又發(fā)現(xiàn)了電擊法可提高酵母細胞的轉(zhuǎn)化率，且線狀的質(zhì)粒比環(huán)狀的質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化效率高。
畢赤酵母表達系統(tǒng)相比其它表達系統(tǒng)更具有較大的優(yōu)勢能對蛋白質(zhì)翻譯后加工、 糖基化適度、菌體生長速度快、操作簡單、費用低廉、適合高密度發(fā)酵等。已有大量的 蛋白質(zhì)類藥物在畢赤酵母中成功表達，人血清白蛋白在畢赤酵母中通過高密度發(fā)酵，其 表達量達到10g/L;破傷風(fēng)毒素片段C的表達量達到12g/L。對溶栓蛋白質(zhì)來說，前期有 tPA在畢赤酵母中表達的報道，但由于較低的酶活而不適于工業(yè)化生產(chǎn)；2007年，有報 道DSPAa2在畢赤酵母中表達，其表達量僅為25mg/L，但至今還未見DSPActl在畢赤酵 母中成功表達的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的利用酵母表 達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法。
本發(fā)明所述的酵母表達系統(tǒng)是畢赤酵母表達系統(tǒng)，這一系統(tǒng)能夠高水平表達異源蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是合成DSPAal基因序列或在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎(chǔ) 上，對DSPAal基因密碼子按照畢赤酵母偏好密碼子進行基因序列優(yōu)化，然后對合成的或 優(yōu)化的基因序列兩端進行限制性內(nèi)切酶酶切后，將其克隆到畢赤酵母中進行穩(wěn)定表達。 實驗證實表達的DSPAal蛋白質(zhì)具有真核細胞的修飾基團，且具有生物學(xué)活性。
本發(fā)明所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，具體步驟包括(1)合成 DSPAal基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優(yōu)化DSPAal基因的核苷酸序 列；(2)雙酶切合成的或優(yōu)化的DSPAal基因序列，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒X-DSPAal (X代 表可選擇的表達質(zhì)粒)；(3)轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(4)畢赤 酵母重組菌株發(fā)酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal。
上述步驟(1)中所述合成DSPAal基因的核苷酸序列指DSPAal野生型基因序列， Gene Bank登錄號為M63986; DSPAal的基因序列也可以是DSPAal突變體，即對DSPAal 野生型進行優(yōu)化而得。所述按照畢赤酵母偏好密碼子序列優(yōu)化DSPAal基因的核苷酸序 列的方法是在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎(chǔ)上按照畢赤酵母偏好密碼子對DSPAal 全基因序列進行合成，并在兩種DSPAal 5'端引入/力at酶切位點和釀酒酵母a因子信號肽Kex2切割信號氨基酸密碼子AAMGA，同時在3'端引入fcoRI或;V"I酶切位點， 合成的DSPAal優(yōu)化基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
上述步驟(2)中所述構(gòu)建重組表達質(zhì)粒的方法是指利用和fcoRI雙酶切合成 的或優(yōu)化的DSPAal基因序列，將其克隆到表達質(zhì)粒a因子下游，再酶切連接獲得重組 表達質(zhì)粒X-DSPAal (X代表可選擇的表達質(zhì)粒，如pPIC9K、 pPIC9、 pPICZaA/B/C、 pGAPZaA/B/C)。
上述重組表達質(zhì)粒X-DSPAal可以是pPIC9K — DSPAal 、 pPIC9 — DSPAal 、 pPICZaA/B/C—DSPAal、 pGAPZaA/B/C—DSPAal、 pPIC3. 5K—DSPAal或pA0815—DSPAal。
其中所述重組表達質(zhì)粒X-DSPAal優(yōu)選pPIC9K—DSPAal或pPIC9—DSPAal 。
其中重組表達質(zhì)粒pPIC9K-DSPAal具體的構(gòu)建方法是將DSPAal克隆到pPIC9a 因子下游，然后利用5p/ I、 fcoRI雙酶切pPIC9-DSPAal和pPIC9K，將含有DSPAal的 pPIC9-DSPAal酶切片段與含卡那霉素抗性基因的pPIC9K片段利用T4 DNA連接酶連接， 得重組表達質(zhì)粒pPIC9K -DSPAal 。
上述步驟(3)中所述轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細胞的方法包括電擊轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化等。
其中電擊轉(zhuǎn)化是指利用^scl或5"aH對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行線性化，然后以電壓 1.5kV，電容25PF，電阻200Q ，放電時間4.0ms電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株感受態(tài)細胞； 平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子是指通過MD平板篩選獲得his+轉(zhuǎn)化子或含Zeocin的YPDS平板篩 選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
其中上述畢赤酵母菌株選自GS115、 X-33、 KM71、 SMD1168;其中優(yōu)選GS115。
上述步驟(4)中所述畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選是指在平板挑取轉(zhuǎn)化子接種于培 養(yǎng)基中，通過搖瓶發(fā)酵篩選，獲得高分泌表達DSPAal的畢赤酵母菌株。
其中所述的培養(yǎng)基包括BMGY/BMMY、 BMG/BMM、 YPD;其中優(yōu)選BMGY/BMMY培養(yǎng)基。
上述MD平板的配方是(/L): 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4xl(T"/。生物素； 2c/。D-葡萄糖。
上述YPD培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨2% D-葡萄糖。 上述YPDS培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2% D-葡萄糖，1M
山梨醇。
上述BMGY培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；lOOmM磷酸緩沖液 (pH 6.0) ; 1. 34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 X1(T%生物素；1%甘油。
上述BMMY培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷酸緩沖液 (pH 6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 X 10、生物素；0.5%甲醇。
上述BMG培養(yǎng)基的配方是(/L): lOOraM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵 母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；1%甘油。
上述B函培養(yǎng)基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵
6母氮源(YNB) ; 4X10—5%生物素；0. 5%甲醇。
上述步驟(5)中所述由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPActl的方法是 15。C 25'C溫度條件下，先將畢赤酵母重組菌株表達上清液用截留分子量10Kda的超濾 器超濾，使其濃縮到符合陽離子交換層析柱上樣條件，然后將其加樣到用平衡緩沖液平 衡的陽離子交換層析柱上進行洗脫，去除雜蛋白和非蛋白雜質(zhì)，再利用凝膠過濾層析柱 進行上樣洗脫，去除二聚體和小分子雜質(zhì)，洗脫中出現(xiàn)唯一的洗脫峰，即為純化DSPAal 產(chǎn)物。
其中所述陽離子交換層析柱的層析介質(zhì)選自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺 乙基、磺丙基或磷酸基衍生的葡聚糖、硅膠微粒、瓊脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯 乙烯、纖維素或者交聯(lián)的聚丙烯酰胺系列介質(zhì)。
上述分離純化DSPAcd的方法中優(yōu)選的陽離子交換層析柱優(yōu)選CM s印harose FF 層析柱或SP S印hadex C-50層析柱或SP-650-S層析柱。
上述分離純化DSPAcd的方法中所述平衡緩沖液選自pH5. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液 或Na2HP0f擰檬酸緩沖液。
上述分離純化DSPAcd的方法中所述凝膠過濾層析的方法是將經(jīng)陽離子交換層 析分離，濃縮后的蛋白濃度不超過50mg/ml的樣品上樣到凝膠過濾層析柱，以 pH6. 0-7. 5，內(nèi)含0.卜O. 2M NaCl的Tris-HC1緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Na2HP04-檸檬酸 緩沖液為洗脫液進行洗脫，以波長為280nm檢測收集液，洗脫液曲線只有唯一的吸收峰， 收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal的提取液。
其中所述凝膠過濾層析柱的層析介質(zhì)選自交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)聚乙烯醇、葡聚糖凝 膠、烯丙基葡聚糖與N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合凝膠或葡聚糖與高交聯(lián)瓊脂糖的復(fù) 合凝膠；且介質(zhì)能分離分子量在3， 000 300， OOODa的蛋白。
上述分離純化DSPAal的方法中優(yōu)選的凝膠過濾層析柱優(yōu)選S印hadex G-75或 Superdex G-75或S印hacry1-100層析柱。
上述分離純化DSPAal的方法中所述對陽離子交換層析分離的樣品的濃縮用截留 分子量為5KDa的超濾管進行。
上述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法中所述純化DSPAal的提取液能 以常規(guī)方法真空冷凍干燥制得固體的DSPAal粉末，可以直接用于制劑的研究和制備。
本發(fā)明有四個顯著優(yōu)點(1)通過對DSPAal基因序列進行畢赤酵母密碼子偏好性 優(yōu)化，使其更適于在畢赤酵母中表達；(2) DSPAal搖瓶發(fā)酵表達量可達到75mg/L,并 且通過高密度發(fā)酵表達量有進一步提高的潛力；(3)利用畢赤酵母生產(chǎn)DSPAal的方法 成本低、周期短、技術(shù)上容易實現(xiàn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)由畢赤酵母重組菌株表達上 清液中分離純化后的DSPAal最終純度大于97%以上，可以直接用于制劑的研究和制備。


圖l畢赤酵母表達DSPAal轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液SDS-PAGE圖。 其中從左向右泳道M為蛋白質(zhì)Marker，泳道l為空白畢赤酵母發(fā)酵液，泳道2
7為誘導(dǎo)表達DSPAal畢赤酵母菌株。
圖2畢赤酵母表達DSPAcd轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活圖。
圖3是陽離子純化時的DSPAal洗脫圖。
圖4是DSPA(il經(jīng)分子篩純化時的洗脫圖。
圖5是DSPAal的SDS-PAGE電泳圖。 其中泳道M為蛋白質(zhì)Marker，泳道l為DSPAal。
圖6是經(jīng)TSK分析后的DSPAal高效液相圖。
具體實施例方式
以下實施例將進一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實施例l
1、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成
合成DSPAal基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優(yōu)化DSPAal基因的
核苷酸序列。
在不改變DSPAal氨基酸序列的基礎(chǔ)上按照畢赤酵母偏好密碼子對DSPAal全基因序 列進行合成，并在DSPAal 5'端引入J力aL酶切位點和釀酒酵母a因子信號肽Kex2切割信號 氨基酸密碼子(AAAAGA)，同時在3'端引入fcoRI或〃ofl酶切位點，合成的畢赤酵母偏好 密碼子優(yōu)化DSPAal基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示(合成工作由上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司承擔(dān))。
2、 重組質(zhì)粒構(gòu)建
步驟如下利用限制性內(nèi)切酶i7 oI和fcoRI雙酶切上述l中DSPAal合成基因和pPIC9 表達載體，凝膠回收法純化1.4kb和8.0kb的目標片段，然后利用T4 DNA連接酶對酶切片 段進行連接，16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，通過LB平板(含Amp)篩 選陽性克隆，隨機挑取單克隆，抽提重組質(zhì)粒(記作pPIC9-DSPAal)，通過酶切鑒定陽
性克隆。
然后利用&M、 fcoRI雙酶切重組質(zhì)粒pPIC9-DSPAal,凝膠回收6.0kb帶，然后連接 到相同酶切的pPIC9K載體片段(4.8kb)上，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-DSPAal，通過酶切鑒 定陽性克隆。
3、 畢赤酵母菌株轉(zhuǎn)化及平板篩選
利用限制性內(nèi)切酶/Z; al酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-DSPAal和空白質(zhì)粒pPIC9K，取5嗎 2(Vg質(zhì)粒進行電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞。
所用Gen印ulsterII電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad laboratories Inc., Hercules, CA)的參 數(shù)是電壓1.5kV，電容25PF，電阻200Q ，放電時間4.0ms。
電擊后立即加入1.0mL冰冷的1.0mol/L山梨醇，迅速涂MD平板(His-), 28 —30。C培 養(yǎng)，篩選His+轉(zhuǎn)化子。
4、 畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株作為對照)進行搖瓶發(fā)酵初步篩選， 篩選方法如下從MD平板上隨機挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基中，28°C 200r/min過夜培養(yǎng)； 接5 8% (v/v)菌液到液體BMGY培養(yǎng)基(20mL/150mL三角瓶)中，于28。C 200r/min培養(yǎng);
8待菌體密度生長到OD6oo"5-15時，4, 000r/min離心5min收集菌體，用液體BMMY培養(yǎng)基重 懸沉淀，再接種至BMMY培養(yǎng)基(50mL/500mL三角瓶，p服.O)中，使其0D柳"2.0， 20°C， 220r/min培養(yǎng)，每天補加0.5%甲醇(v/v)，其間以SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達量(圖l)， 并同時檢測酶活(圖2)、 pH、生物量，每一樣品平行兩份進行檢測。
其中酶活檢測方法按照纖溶平板法檢測，方法是制作纖維蛋白平板，在平板上打 孔徑為2mm的孔，孑L內(nèi)分別加入標準品和待測樣品，每孔10ul，每稀釋度做2孔，37T濕 盒中孵育24h，縱向和橫向量取溶圈直徑，以標準品溶液的標準曲線定量樣品的活性。
結(jié)果通過上述搖瓶發(fā)酵篩選，獲得了具有高分泌表達DSPActl的畢赤酵母菌株 GS115/pPIC9K-DSPAcd，其生產(chǎn)出的DSPAal具有天然生物學(xué)活性，且搖瓶發(fā)酵表達量達 到75mg/L，初步達到工業(yè)化生產(chǎn)水平，為DSPAal的進一步生產(chǎn)和開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAcd
先用pH為6. 0，濃度為20mraol/L的磷酸鹽緩沖溶液對超濾器和大孔徑(lOKDa)超 濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.3bar和0.3bar，然后對畢赤酵母重組菌株表 達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽緩沖液稀釋，之后 再繼續(xù)超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
用濃度為20mmol/L， pH為6. 0磷酸鹽的平衡緩沖液平衡CM s印harose FF (1. 6X 15cm)層析柱2 3個柱體積，將上述超濾后的濃縮液上柱，進行陽離子交換層析。
具體步驟是用濃度為2Ommol/L， pH為6. 0磷酸鹽的平衡緩沖液平衡層析柱3個 柱體積，換用濃度為20mmol/L， pH為6. 8磷酸鹽緩沖液沖洗2個柱體積，待基線平穩(wěn) 后接著用20mmol/L， pH為6. 8含0. 5M NaCl磷酸鹽緩沖液，從0-0. 5國aCl線形洗脫10 個柱體積，收集洗脫液(見圖3)。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經(jīng)截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃 縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX80cm的S印hadex G-75層析柱進行凝膠過濾層析，先用20mM Tris-HC1、 pH 7. 4、內(nèi)含0.15M NaCl緩沖液平衡2個柱體積，然后將濃縮后的經(jīng)陽離子交換層析 分離的樣品上樣，以0. 5ml/min的流速洗脫，以波長為280nra檢測收集液，洗脫液曲線 只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal的提取液(見圖4)。
純化DSPAal的提取液以常規(guī)方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPAal粉末。
6、 DSPAal純度分析
(1) SDS-PAGE電泳
將上述得到的DSPAal進行SDS-PAGE電泳分析。
取凝膠過濾層析所得的DSPAal的提取液濃縮，不低于lOHg上樣，進行非還原電泳， 考馬斯亮藍染色，經(jīng)電泳灰度掃描后純度在95%以上(見圖5)。
(2) TSK柱純度分析
將上述得到的DSPAal進行TSK-2000高壓液相純度分析，流動相為0.1M磷酸鹽緩 沖液含O. lmol/LNaCl，pH7.0。上樣量不低于20Pg，于波長280nm處檢測，按面積歸一 法計算，純度在97%以上(見圖6)。
實施例2
91、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成 步驟同實施例l。
2、 重組質(zhì)粒構(gòu)建
利用J力oI和Abtl雙酶切構(gòu)建的pPIC9K-DSPAal，回收含DSPAal片段，并與相同酶切 的表達質(zhì)粒pPICZaA用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZaA-DSPAal。
3、 畢赤酵母菌株轉(zhuǎn)化及平板篩選
^7I線性化質(zhì)粒pPICZaA-DSPAal和空白質(zhì)粒pPICZaA，取5嗎 20嗎質(zhì)粒進行電擊轉(zhuǎn) 化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞。
所用Gen印ulsterII電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad laboratories Inc. ， Hercules, CA)的參 數(shù)是電壓1.5kV，電容25PF，電阻200Q，放電時間4. Oms。電擊后立即加入l. OmL冰冷 的1.0mol/L山梨醇，28-3(TC靜置溫育l 2h，然后涂布YPDS (含100mg/ml Zeocin)平板， 28-3(TC培養(yǎng)。
4、 畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株作為對照)進行搖瓶發(fā)酵初步篩選， 篩選的培養(yǎng)基是BMGY/BMMY。篩選方法如下從YPDS平板上隨機挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基 中，具體畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選同實施例l發(fā)酵篩選部分。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal
用pH為6. 4，濃度為20mraol/L的化2朋04-檸檬酸緩沖溶液對超濾器和大孔徑(10KDa) 超濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.2bar和0.2bar，然后對畢赤酵母重組菌株 表達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽緩沖液稀釋，之 后再繼續(xù)超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
將上述超濾后的濃縮液上樣至預(yù)先用濃度為20mmol/L, pH為6. 4磷酸鹽的平衡緩 沖液平衡好的SP S印hadex C-50 (1.6X10cm)層析柱2個柱體積，進行陽離子交換層 析。
具體步驟是用濃度為20mraol/L， pH為6. 4Na2HP04-檸檬酸的平衡緩沖液平衡層析 柱3個柱體積，換用濃度為20咖ol/L， pH為7. 0Na2HPO4-檸檬酸緩沖液沖洗2個柱體積， 待基線平穩(wěn)后接著用20腳ol/L， pH為7. 0Na2HPO4-檸檬酸含0. 4M NaCl，從0-0. 4MNaCl 線形洗脫10個柱體積，收集洗脫液。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經(jīng)截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃 縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX85cra的Superdex G-75層析柱進行凝膠過濾層析，先用20mM NaH2P04-檸檬酸pH 7. 0、內(nèi)含0. 2廳aCl緩沖液平衡2個柱體積，然后將濃縮后的經(jīng)陽離子交換 層析分離的樣品上樣，以1. 5 ml/min的流速洗脫，在波長為280nm檢測收集液，洗脫 液曲線只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPActl的提取液。
純化DSPAal的提取液以常規(guī)方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPA(xl粉末。
實施例3
1、 DSPAal基因及畢赤酵母偏好密碼子序列基因合成 步驟同實施例l。
102、 重組質(zhì)粒構(gòu)建
利用J力oI和Abtl雙酶切構(gòu)建的pPIC9K-DSPAal，回收含DSPAal片段，并與相同酶切 的表達質(zhì)粒pGAPaA用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPaA-DSPAal 。
3、 畢赤酵母菌株轉(zhuǎn)化及平板篩選
5^I線性化質(zhì)粒pGAPaA-DSPAal和空白質(zhì)粒pGAPaA，畢赤酵母菌株GS115轉(zhuǎn)化及平板 篩選同實施例2平板篩選部分。
4、 畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選
隨機選取陽性菌株(同時挑取空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株作為對照)進行搖瓶發(fā)酵初步篩選， 篩選的培養(yǎng)基是BMG/BMM。篩選方法如下從YPDS平板上隨機挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基中， 然后進行培養(yǎng)，28T220r/min發(fā)酵培養(yǎng)，其間以SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達量，并同時檢 測酶活、pH、生物量，每一樣品平行兩份進行檢測。
其中酶活檢測方法按照纖溶平板法檢測，方法是制作纖維蛋白平板，在平板上打 孔徑為2rara的孔，孔內(nèi)分別加入標準品和待測樣品，每孔10uL，每稀釋度做2孔，37T濕 盒中孵育24h，縱向和橫向量取溶圈直徑，以標準品溶液的標準曲線定量樣品的活性。
5、 由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAal
預(yù)先用pH為6. 6，濃度為20mmol/L的磷酸鹽(Na2HP04-KH2P04)緩沖溶液對超濾器和 大孔徑(10KDa)超濾膜進行平衡，保持進出口壓力分別為1.3bar和0.3bar，然后對畢 赤酵母重組菌株表達上清液進行濃縮，當濃縮至1L左右時，用2倍體積的上述磷酸鹽 緩沖液稀釋，之后再繼續(xù)超濾至1L左右，如此稀釋3次，收集濃縮液，備用。
用濃度為20mmol/L， pH為6. 6磷酸鹽的平衡緩沖液平衡SP-650-S (1. 6X 13cm)層 析柱2個柱體積，將超濾后的濃縮液上樣至平衡好的陽離子交換層析柱，進行陽離子交 換層析。
具體步驟是用濃度為20醒ol/L， pH為6.6磷酸鹽緩沖液平衡層析柱3個柱體積， 換用濃度為20nimol/L， pH為7. 6磷酸鹽緩沖液沖洗2個柱體積，待基線平穩(wěn)后接著用 20mmol/L， pH為7. 6磷酸鹽含0. 3M NaCl,從0-0. 3MNaCl線形洗脫10個柱體積，收集 洗脫液。
對陽離子交換層析所得到的洗脫液樣品經(jīng)截留分子量為5KDa的超濾管一次超濾濃
縮到一定體積，以蛋白濃度不超過50mg/ml為準。
選用1. 6cmX90cm的S印hacry1-100層析柱進行凝膠過濾層析，預(yù)先用20mM磷酸
鹽pH 7.6、含0.1MNaCl緩沖液平衡層析柱2個柱體積，然后將濃縮后的經(jīng)陽離子交換
層析分離的樣品上樣，以lml/min的流速洗脫，在波長為280nm處檢測洗脫液，洗脫液
曲線只有唯一的吸收峰，即為純化DSPAal的提取液。
純化DSPActl的提取液以常規(guī)方法真空冷凍干燥，制得固體的DSPAal粉末。 本發(fā)明中LB平板的配方是(/L): 1%酵母抽提物；0.5%蛋白胨；1% NaCl。 本發(fā)明中MD平板的配方是(/L): 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4xl0's。/o生
物素；2n/。D-葡萄糖。
本發(fā)明中YPD培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2。/。D-葡萄糖。 本發(fā)明中YPDS培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；2% D-葡萄
糖，1M山梨醇。
11本發(fā)明中BMGY培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷 酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 ><10'5%生物素；1%甘油。
本發(fā)明中BMMY培養(yǎng)基的配方是(/L): 1%酵母抽提物；2%蛋白胨；100 mM磷 酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB) ; 4 x 10_5%生物素；0.5%甲醇。
本發(fā)明中BMG培養(yǎng)基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基 酸酵母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；1%甘油。
本發(fā)明中BMM培養(yǎng)基的配方是(/L): lOOmM磷酸緩沖液(pH6.0) ; 1.34%無氨基 酸酵母氮源(YNB) ; 4X10、生物素；0.5%甲醇。序列表
〈110〉齊魯制藥有限公司
〈120〉利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法
〈141〉 2008-01-11
〈160〉 1
〈210〉 1
〈211〉 1344
〈212〉 DNA
〈213〉畢赤酵母(/Vc力ia paWor^) 〈222〉 (1)…(1344) 〈400〉 1
ctcgagaaaagagcttacggtgttgcttgtaaggacg鄉(xiāng)tcactcagatgacttacaga60
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gac犯catgc3Cttgt犯g3attc134權(quán)利要求
1. 一種利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAα1的方法，步驟包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優(yōu)化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)雙酶切合成的或優(yōu)化的DSPAα1基因序列，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒X-DSPAα1；(3)轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(4)畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAα1；其特征是步驟(1)所述優(yōu)化的DSPAα1基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；步驟(3)所述轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細胞的方法采用電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化；步驟(5)所述分離純化DSPAα1的步驟為15℃～25℃溫度條件下，先將畢赤酵母重組菌株表達上清液用截留分子量10KDa的超濾器超濾，使其濃縮到符合陽離子交換層析柱上樣條件，然后將其加樣到用平衡緩沖液平衡的陽離子交換層析柱上進行洗脫，去除雜蛋白和非蛋白雜質(zhì)，再利用凝膠過濾層析柱進行上樣洗脫，去除二聚體和小分子雜質(zhì)，洗脫中出現(xiàn)唯一的洗脫峰，即為純化DSPAα1產(chǎn)物。
2. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟(2) 所述重組表達質(zhì)粒X-DSPAal是pPIC9K-DSPAal 、 pPIC9-DSPAal 、 pPICZaA/B/C-DSPAal 或pGAPZaA/B/C-DSPAal。
3. 如權(quán)利要求2所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述重 組表達質(zhì)粒X-DSPAal是pPIC9K-DSPAal或pPIC9-DSPAal 。
4. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟(3) 所述畢赤酵母菌株是GS115、 X-33、 KM71或SMD1168。
5. 如權(quán)利要求4所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述畢 赤酵母菌株是GS115。
6. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟(4) 所述畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選的培養(yǎng)基是BMGY/BMMY、 BMG/B醒或YPD。
7. 如權(quán)利要求6所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述畢 赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選的培養(yǎng)基是BMGY/BMMY。
8. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟(5) 所述陽離子交換柱的層析介質(zhì)選自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺乙基、磺丙基或 磷酸基衍生的葡聚糖、硅膠微粒、瓊脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯乙烯、纖維素或 者交聯(lián)的聚丙烯酰胺系列介質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟(5) 所述陽離子交換層析柱選自CM s印harose FF層析柱或SP .S印hadex C-50層析柱或 SP-650-S層析柱。
10. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAcd的方法，其特征是步驟(5)所述平衡緩沖液選自pH5. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液或Na2HP04-檸檬酸緩沖液。
11. 如權(quán)利要求1所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是步驟 (5)所述凝膠過濾層析的方法是將經(jīng)陽離子交換層析分離、濃縮后的蛋白濃度不超過50mg/ml的樣品上樣到凝膠過濾層析柱，以pH6. 0-7.5,內(nèi)含0. 1-0. 2M NaCl的 Tris-HC1緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Na2HP0廠檸檬酸緩沖液為洗脫液進行洗脫，以波長為 280mn檢測收集液，洗脫液曲線只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脫液，即為純化DSPAal 的提取液。
12. 如權(quán)利要求11所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述 凝膠過濾層析柱的層析介質(zhì)選自交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)聚乙烯醇、葡聚糖凝膠、烯丙基葡聚 糖與N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合凝膠或葡聚糖與高交聯(lián)瓊脂糖的復(fù)合凝膠。
13. 如權(quán)利要求12所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述 凝膠過濾層析柱的層析介質(zhì)能分離分子量在3， 000 300， OOODa的蛋白。
14. 如權(quán)利要求11所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所 述凝膠過濾層析柱選自S印hadex G-75或Superdex G-75或S印hacr.yl-100層析柱。
15. 如權(quán)利要求l所述利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAal的方法，其特征是所述 純化DSPAal的提取液能以常規(guī)方法真空冷凍干燥制得固體的DSPAal粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)DSPAα1的方法，步驟包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照畢赤酵母偏好密碼子序列優(yōu)化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)雙酶切合成的或優(yōu)化的DSPAα1基因序列，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒X-DSPAα1；(3)轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細胞及平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(4)畢赤酵母重組菌株發(fā)酵篩選；(5)由畢赤酵母重組菌株表達上清液中分離純化DSPAα1。本發(fā)明的方法成本低、周期短、技術(shù)上容易實現(xiàn)，搖瓶發(fā)酵表達量達到75mg/L，初步達到工業(yè)化生產(chǎn)水平，并且分離純化后的DSPAα1最終純度大于97％以上，可以直接用于制劑的研究和制備。
文檔編號C12N15/58GK101487015SQ20081001377
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者孫麗霞, 李劍鳳, 武國棟, 王慶民, 王晶翼, 巖 閆 申請人:齊魯制藥有限公司