專利名稱：傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禾傭環(huán)介導(dǎo)紫顯擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣盼^I檢測(cè)的方法，具體是一種傷寒沙門氏菌決速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法。
技術(shù)背景傷寒沙門氏(Salmonella enterica)是一類大小0. 6 1. 0X2 3um，無(wú)芽胞的革 蘭氏陰性桿菌，是病原件腸道細(xì)菌的一個(gè)屬，包括腸傷寒桿菌， 一般有鞭毛，無(wú)刻莫， 多數(shù)有菌毛，在形態(tài)l:和生理上都極似大腸桿菌，1885年沙門氏等在霍舌L流行時(shí)分離到 豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬有的專對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物 致病，也有對(duì)人和動(dòng)物者降文病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所弓跑的X寸人類、 家畜以皿生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污,品，可使 人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中 毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌分布很廣，廣泛在于自然界 中，?？稍诟鞣N動(dòng)物，如豬、牛、羊、馬、等家畜忠鳥(niǎo)、鴨、鵝、等家禽，飛鳥(niǎo)、鼠類 等野生動(dòng)物的腸道中發(fā)現(xiàn)。雞是沙門氏菌最大的儲(chǔ)存儲(chǔ)主，雞群暴發(fā)死亡率高達(dá)80%， 也存在于蛋類、穀分及其它食物中(牛肉、豬肉、魚肉、香腸、，退等)。傷寒沙門氏菌， 甲、乙、丙型副傷寒沙門氏菌和仙臺(tái)沙門氏菌等只對(duì)人類致病，而馬流產(chǎn)沙門氏菌，雛 沙門氏菌只對(duì)馬和雞致病。可引起如下類型的疾病:(1)腸熱癥(2)食物中毒(3)慢性腸 炎(4)敗血癥。人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測(cè)方法的過(guò)程巾，作出了不懈的努力，現(xiàn)有樹(shù)則方 法主要有1、同位素fei己，該方溜頓同位素1^i己的傷寒沙門氏菌DNA片段，經(jīng)大約 48h的增菌步驟后，其檢測(cè)敏感性高，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，目前尚未見(jiàn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 方法檢測(cè)傷寒沙門氏菌的試劑紐離測(cè)方法附艮道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種傷寒沙門氏菌的快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)，從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全掛共科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。本發(fā)明的主要原理為(1 )特殊設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)弓I 物(上游內(nèi)弓嫩和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外弓物)，而且內(nèi)引物包含耙DNA的正義鏈和反義能(2)其中一個(gè)內(nèi)弓物首先和靶DNA雜交，隨后的f趕換 DNA合成在具有高度,連置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單f連 DNA，并作為由雜交到耙的另一端的一個(gè)內(nèi)弓嫩和一個(gè)夕卜弓嫩啟動(dòng)的DNA合j^對(duì)反，產(chǎn)生 -個(gè)原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn) 生一個(gè)原始的蓬環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍蓮長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA; (4)在^M條件下，內(nèi)引 物以莖環(huán)DNA為t對(duì)及，ffiilf趕換形成多4^有-革巴DNA重mi^列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí) 內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使革巴DNA累積到109拷貝，可fflJl熒光染料^^^T增結(jié)果。本發(fā)明涉及的傷寒沙門氏菌卜魏檢測(cè)試劑盒，其中的試劑包括如下(1) - (4):(1)環(huán)介導(dǎo)紫顯擴(kuò)增(L鮮)反應(yīng)液 其中包括10XThermopol反應(yīng)緩沖液、300—500 timol/L dNTP、 2—4mmol/L硫酸 鎂(MgS04)、 0. 8—1. 2umol/L上游引內(nèi)物(FIP)、 0. 8—1. 2umol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 2—0. 3 y mol/L上游外弓l物(F3)、 0. 2—0. 3 li mol/L下游外弓l物(B3)和1—1. 5mol/L 甜熟庇上游內(nèi)引物5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、 下游內(nèi)引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC陽(yáng)TAACGCAGCGAGAATGGC -3 、上游外弓l物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ， 其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。其中所述的lOXThemopol反應(yīng)緩沖液中含有200 mmol pH8. 8的三羥基甲基MS 甲烷—鹽酸(Tris—HC1)、 100mirol/L氯化鉀(KC1)、 100腿ol/L硫酸智((肌)2SO〗)、 20 imol/L硫^!美(MgSCU禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/";(3) Bst DNA聚合酶8 U /uL;(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液中每管23 uL的最佳紹成為2.5uL 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 0 u L 10ramol/L dNTP、 1. 0 u L 20 y mol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 1.0iiL20iimol/L下、游內(nèi)弓lt/ (BIP)、 0. 25y L 20 y mol/L Ji游夕卜弓l物(F3)、 0. 25nL20u mol/L下游外引物(B3)、 0. 5 u L 100 mmol/L MgS(X、 12. 5 u L 2M甜菜石堿和4 u L ddH20 (滅菌雙蒸水)。使用上述試劑盒檢測(cè)傷寒沙門氏菌的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):(1) 待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA ，其DNA 0D250/0D250加在1.6-2.0范圍內(nèi)， 濃度在10-100 ng/ ii L范圍內(nèi)。(2) 進(jìn)行傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有23 y L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入1卩L待檢模板DNA，和0. 5 u L的UNG 酶，于恒溫浴上50。C放置3 rain， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 在反應(yīng)管中加入1 li L Bst DNA聚合酶；C. 于恒溫65。C放置45—90 min;D. 將水浴調(diào)到8。C中止反應(yīng)，3—5min后取出待檢；(3) 顯色檢測(cè)在待檢的針?lè)磻?yīng)管中加入b L顯色劑，直接用卿B見(jiàn)察顏色變化，如果顏色為黃 色，說(shuō)明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變?yōu)猷l(xiāng)絶，貝lj說(shuō)明待檢樣品含 有或者為傷寒沙門氏菌。本發(fā)明建立了傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑M檢測(cè)方法，本試劑獻(xiàn)艮 據(jù)傷寒沙門氏菌的gyrA基因的基本保守區(qū)的六個(gè)序列設(shè)計(jì)了兩^#異性內(nèi)弓胸和兩個(gè) 特異性外引物，該保守基因序列為傷寒沙門氏菌各不同血清型和菌株MJ^共有，以保證 從種的水平上檢測(cè)不同來(lái)源的傷寒沙門氏菌株的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的 PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結(jié)果不必用翻交電泳方、 辣觀察，4頓熒光染料來(lái) 觀察即可，簡(jiǎn)單而快速?？捎糜趥抽T氏菌的檢測(cè)，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。下列實(shí)施例進(jìn)一歩說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1按下歹脂己方制作傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)樂(lè)顯擴(kuò)增試劑盒 (1)酉己制LAMP反應(yīng)液含有2.5 u lOXThemopol反應(yīng)緩沖液、l.O卩L 10mmol/L dNTP、 1.0 uL 20Umol/L上游內(nèi)引物(FTP)、 1.0uL20umo〗/L下游內(nèi)弓i物(BIP)、 0. 25y L20"mol/L 上游外引物(F3)、 0.25yL20iimol/L卜游外引物(B3)、 0. 5 u L 100ramol/LMgS04、 12.5 u L 2 mol/L甜^l!^卩4 u L ddH20 。 其中戶7M的上游內(nèi)引稱5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、下游內(nèi)引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、匕游外弓(物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、 下游外弓l物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ;其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/yL;(3) Bst D魁聚合酶8U(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)禾M)字進(jìn)行檢測(cè)(1) 樣品DNA的提取檢測(cè)薪中鼠傷寒沙門氏菌(&ifflQ/ e"s ^iffiwr/履)，薪中來(lái)源中國(guó)檢科院食品安 全微生物薪中保藏中心，編號(hào)IQCC10503.2。 大連寶生物工程公司的植物核 取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D，/ OD觀育夠 達(dá)到1.S，鵬達(dá)到20 ng/uL。(2) 進(jìn)行傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有23 u L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入1 y L待檢豐對(duì)及DNA，禾口 0. 5卩L的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反應(yīng)管中加入l uL Bst DNA聚合酶；C. 于恒溫65 。C放置l小時(shí)；D. 將水浴調(diào)到80 。C中止反應(yīng)，3 min后取出；(3) 顯色檢測(cè)在待檢的旨反應(yīng)管中加入l "L上述顯色劑，直接用肉目歐見(jiàn)察顏色變化，如果顏 色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變?yōu)猷l(xiāng)絶，貝喊明待檢樣品含有或者為傷寒沙門氏菌。實(shí)施例2按下歹鵬己方制作傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增試劑盒 (1)酉己制LAMP反應(yīng)液含有2.5yL lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0yL 10咖ol/L dNTP、 1.0 uL 20u mol/L上游內(nèi)引物(FTP)、 1.0 yL20 yraol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25 yL20幽l/L 上游外引物(F3)、 0.25 uL20 umol/L下游外引物(B3)、 0.5 M L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 u L 2 mo〗/L甜^W3 4 ii L d維其中戶脫的上游內(nèi)弓嫩、下游內(nèi)引物、上游外弓嫩、下游外弓嫩同上。 ，混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。(2) UNG酶1 U/uL;(3) Bst DNA聚合酶8U /uL;(4) 顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 按照以下(1) - (3)禾旨進(jìn)行檢測(cè)(1) 樣品DNA的提取繊隨種甲型副傷寒沙門氏菌(&i/^W&A2ra^/w J)，菌種繊中國(guó)翻棍食 品安全微生物餅中保藏中心，編號(hào)IQCC10518。使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0DM/ 0D， 歸達(dá)到1. 7，濃度達(dá)到22 ng,/ ii L。(2) 進(jìn)行傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增反應(yīng)A. 在^W23uL LAMP反應(yīng)液中的反應(yīng)管中加入luL待檢豐對(duì)及DNA，和0.5uL的 UNG酶，于瞎O7K浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 亍,JC浴上63。C體1 h;D. 將水浴調(diào)到9(TC中止反應(yīng)，3min后取出；(3) 顯色檢測(cè)在待檢的齡鵬管中加入b L顯色劑，直接用卿^見(jiàn)察顏色變化，如果顏色為黃 色，說(shuō)明待檢樣品不含或者不趙勞寒沙門氏菌，如果顏色變?yōu)殒~，則說(shuō)明待檢樣品含 有或者為傷寒沙門氏菌。核苷,列表〈110〉山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)皿,中心〈120〉傷寒沙門氏菌^I檢測(cè)試劑盒的帝恪和檢測(cè)方法〈160〉 4〈210〉 1〈211〉 41〈212〉 DNA〈213〉 AX序列〈221> prim—bind〈222> (1)…(41)〈400> 1ttacgtcacc aaccacacgg gacgtattgg gcaatgactg g 41〈210〉 2 〈211> 40 〈212>醒 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(40) ■> 2cggtaaatac catccccacg gctaacgcag cgagaatggc 40〈210〉 3 〈211> 19 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (19) 〈400〉 3gtcgcgtact ttacgccat 19<210〉 4 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(18) 〈400> 4accctgacca tccaccag 18
權(quán)利要求
1. 一種傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于其中的試劑包括(1)-(4)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內(nèi)引物、0.8-1.2μmol/L下游內(nèi)引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中上游內(nèi)引物；5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游內(nèi)引物；5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征是上述 dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 傷寒沙門氏菌的快速檢測(cè)方法，其特征是依次包括下列(1) -(3)步驟(1) 待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D柳/ 0D，在1. 6-2. 0范圍 內(nèi)，濃度在10-100 ng/uL范圍內(nèi)；(2) 進(jìn)行傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A.在裝有23uLLAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入luL待檢樣品模板DNA，和 0. 5yL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1 — 3 min;B. 在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 再于金屬浴中恒溫60 — 65 。C放置45 — 90 min ;D. 將浴中溫度調(diào)到80 — 95 'C中止反應(yīng)，3 — 5 min后取出待檢；(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入1PL上述的顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化， 如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含或者不是傷寒沙門氏菌，如果顏色變 為綠色，則說(shuō)明待檢樣品含有或?yàn)閭抽T氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測(cè)的方法，具體說(shuō)是一種傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒的制備和檢測(cè)方法。該試劑盒內(nèi)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物5-TTACGTCACCAACGAC ACGGGACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游內(nèi)引物5-CGGTAAATACCATCCCCACGGCT AACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3和甜菜堿；檢測(cè)傷寒沙門氏菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、傷寒沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、顯色檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號(hào)C12Q1/10GK101255460SQ20081001500
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者超 林, 梁成珠, 賈俊濤, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心