專利名稱：一種重組人白細胞介素21工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人白細胞介素21工程菌及其制備方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
白細胞介素-21屬于I類細胞因子，屬于γc(共同γ鏈)依賴性細胞因子家族成員，與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15共用受體γ鏈。IL-21對各種免疫細胞都具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，能促進CD8+T、NK細胞功能的成熟，增強其細胞毒活性；促進CD4+T細胞分化及細胞因子的分泌；促進B細胞功能成熟、Ig類別轉(zhuǎn)換及漿細胞的分化。IL-21通過對不同狀態(tài)下免疫細胞的活化或凋亡清除的網(wǎng)絡(luò)性調(diào)節(jié)而維持免疫細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對預(yù)防自身免疫性疾病、腫瘤形成和抗感染都發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是一個有潛力的用于免疫治療的細胞因子，值得深入地進行研究和開發(fā)，而這又是以能夠大量制備白細胞介素-21為前提的。
基因工程方法生產(chǎn)生物藥品是一種普遍采用的成熟而簡便的方法，其中用基因工程菌發(fā)酵的方法又是最常采用的生產(chǎn)方法，它具有生產(chǎn)流程簡單易操作、蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、表達量穩(wěn)定、便于純化回收等優(yōu)點。


發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種重組人白細胞介素21工程菌及其制備方法，并對其發(fā)酵條件進行了探索。
一種構(gòu)建重組人白細胞介素21工程菌的方法，步驟如下 (1)合成PCR引物上游引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物為5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′； (2)PCR擴增目的片段以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-21基因片段； (3)DNA測序鑒定將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段和pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-IL-21，將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，用含氨芐霉素的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并進行DNA測序鑒定； (4)構(gòu)建重組載體將pMD18-T-IL-21重組質(zhì)粒與pET30a(+)載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA連接酶的作用連接，溫度為16～25℃，時間16～20℃時，時間≥6h；20～25℃時，時間≥5min； (5)轉(zhuǎn)化將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-21工程菌； 所述步驟(2)的具體操作過程為以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，于50μl反應(yīng)體系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR條件95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延長7min；PCR產(chǎn)物用1％低熔點瓊脂糖電泳純化回收。
所述步驟(3)的具體操作過程為將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段與pMD18-T載體在連接復(fù)合物作用下于16℃連接；將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平鋪于含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定。
一種人白細胞介素21工程菌，是由如下步驟構(gòu)建而成 (1)合成PCR引物上游引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物為5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′； (2)PCR擴增目的片段以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-21基因片段； (3)DNA測序鑒定將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段和pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-IL-21，將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，用選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定； (4)構(gòu)建重組載體將pMD18-T-IL-21重組質(zhì)粒與pET30a(+)載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA連接酶的作用連接，溫度為16～25℃，時間16～20℃時，時間≥6h；20～25℃時，時間≥5min； (5)轉(zhuǎn)化將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-21工程菌； 所述重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21是這樣構(gòu)建的先采用RT-PCR技術(shù)從人外周血單個核細胞獲得IL-21DNA(506bp)，然后采用常規(guī)技術(shù)將其導(dǎo)入質(zhì)粒pcDNA3，得到重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21。
所述連接復(fù)合物pMD18-T載體，購自于寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa CodeD101A。
本發(fā)明具有的有益效果主要表現(xiàn)在(1)本工程菌雖然是IPTG誘導(dǎo)的，但是其表達對溫度非常敏感，其最佳誘導(dǎo)表達的溫度為42℃，在37℃基本不表達。而對于以pET30a(+)為載體的重組質(zhì)?；蚬こ叹浒l(fā)酵溫度通常為37℃或者更低，這為工程菌發(fā)酵條件的探索提供了有益的啟示；(2)表達的重組人IL-21是以高純度的包涵體形式存在，可有效避免細胞水解酶對蛋白質(zhì)的破壞，有利于目的蛋白質(zhì)的保護和分離；(3)目的蛋白質(zhì)含6×His tag結(jié)構(gòu)，便于蛋白質(zhì)的純化；(4)目的蛋白表達量高，以現(xiàn)有的蛋白質(zhì)復(fù)性方法，能夠得到具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)成本低。



圖1為重組載體pET30a(+)-IL-21的構(gòu)建圖譜； 圖2為pMD18-T-IL-21重組克隆載體的雙酶切電泳分析圖； 其中，1.人IL-21基因的PCR產(chǎn)物；2.pMD18-T-IL-21雙切后得到的pMD18-T和IL-21兩個片段；3.標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量1Kb DNA ladder。
圖3為pET30a(+)-IL-21重組克隆載體的雙酶切電泳分析圖； 其中，4.人IL-21基因PCR產(chǎn)物；5.標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量1Kb DNA ladder；6.pET30a(+)-IL-21雙切后得到的兩個片段。
圖4為實施例3中的SDS-PAGE電泳分析圖； 其中，7.誘導(dǎo)0h；8.誘導(dǎo)4h；9.洗滌后包涵體；10.20mM咪唑緩沖液洗脫掉的雜蛋白；11.純化得到的rhIL-21；M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mark。
圖5為實施例3中的Western-blot鑒定圖； 其中，12.誘導(dǎo)4h時工程菌總蛋白；13.低分子量蛋白質(zhì)Mark。
圖6為rhIL-21協(xié)同IL-2對NK92的促增殖效應(yīng)圖； 其中，橫坐標(biāo)表示不同濃度的rhIL-21，單位為ng/ml；縱坐標(biāo)表示培養(yǎng)48h后不同藥物濃度下NK細胞數(shù)，單位為104/ml。

具體實施例方式 實施例構(gòu)建一種重組人白細胞介素21的工程菌，步驟如下 (1)合成PCR引物上游引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′，外設(shè)NdeI酶切位點并包含起始密碼子ATG； 下游引物為5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′，外設(shè)XhoI酶切位點。引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成和純化。
(2)PCR擴增目的片段以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，于50μl反應(yīng)體系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR條件為95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延長7min；PCR產(chǎn)物用1％低熔點瓊脂糖電泳純化回收。
(3)DNA測序鑒定將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段與pMD18-T載體在連接復(fù)合物pMD18-T vector(購自于寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa CodeD101A)作用下于16℃連接；將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平鋪于含Amp抗生素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定。
(4)構(gòu)建重組載體將pMD18-T-IL-21重組質(zhì)粒與pET30a(+)載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA連接酶的作用下16℃過夜(約10小時)連接，如圖1所示。
(5)轉(zhuǎn)化將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌先取連接復(fù)合物加入到200μlBL21感受態(tài)細胞中混勻，冰浴30分鐘；然后于42℃熱休克90秒，再轉(zhuǎn)到冰浴中2分鐘；再加LB培養(yǎng)基800μl，于37度搖床120轉(zhuǎn)/分鐘，45分鐘；最后把菌液平鋪于含卡那霉素的平板上，晾干倒置于37℃孵育箱，12小時后觀察有無單克隆菌株出現(xiàn)，若有，即為轉(zhuǎn)化成功的工程菌。
實驗例1對構(gòu)建的pMD18-T-IL-21重組克隆載體進行雙酶切電泳分析和DNA序列檢測，結(jié)構(gòu)如圖2所示，由圖可知，IL-21基因片段有效地連接到pMD-18T載體中了。
實驗例2將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，在含卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性重組子，對陽性重組克隆載體做雙酶切電泳分析，并進行DNA測序鑒定，電泳分析如圖3所示。由圖可知，IL-21DNA已準(zhǔn)確地插入pET30a(+)表達載體酶切位點NdeI和XhoI之間；DNA測序表明無基因突變。
實驗例3參照文獻鄭瑞，許曉群，張彩等.重組人白細胞介素21表達條件的探討[J].中國生化藥物雜志，2007，28(5)294-296中的發(fā)酵條件，進行發(fā)酵挑取單克隆工程菌接種于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液，37℃活化培養(yǎng)。取活化后菌液接種到新的含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A600nm＝1±0.1時，按工程菌與新鮮LB培養(yǎng)基以1∶1.5的接種比例接種至工程菌的濃度為A600nm＝0.4時，直接加終濃度為1mM的IPTG，于42℃恒溫水浴箱誘導(dǎo)發(fā)酵。
收集誘導(dǎo)后4h的工程菌液，超聲波破菌，分別將全菌、超聲破碎后的離心沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳分析(如圖4所示)，并對全菌蛋白進行Western-blot鑒定如圖5所示(人IL-21抗體購自深圳晶美生物工程有限公司，產(chǎn)品號ab5978)。電泳后，凝膠經(jīng)激光掃描并采用Kodark Digital Science 1D分析軟件對IL-21表達量和蛋白分子量進行分析，rhIL-21表達量＝(目的蛋白質(zhì)條帶的掃描密度/工程菌所有蛋白質(zhì)條帶的掃描密度)×100％＝(659542÷20 60170)×100％＝32.01％，SDS-PAGE表明目的蛋白質(zhì)表達量占菌體總蛋白質(zhì)的32％，western-blot顯示有一條與IL-21單克隆抗體(ab5978)結(jié)合的約15-17kD分子量的蛋白質(zhì)電泳帶。
實驗例4提取純化rhIL-21步驟為 (1)參照文獻鄭瑞，許曉群，張彩等.重組人白細胞介素21表達條件的探討[J].中國生化藥物雜志，2007，28(5)294-296中的條件，進行發(fā)酵挑取單克隆工程菌接種于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液，37℃活化培養(yǎng)。取活化后菌液接種到新的含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A600nm＝1±0.1時，按工程菌與新鮮LB培養(yǎng)基以1∶1.5的接種比例接種至工程菌的濃度為A600nm＝0.4時，直接加終濃度為1mM的IPTG，于42℃恒溫水浴箱誘導(dǎo)發(fā)酵。
(2)收集誘導(dǎo)4h的工程菌液500ml，3000rpm×10min離心后用40ml Buffer A(100mMNaH2PO4、10mM Tris、1mM EDTA、40mM β-巰基乙醇、5％甘油、pH 8.0)重懸，用超聲破菌儀破菌，12000g離心30min，離心，收集包涵體。用Buffer B(100mM NaH2PO4、10mM Tris、1M尿素、1mM EDTA、2％Trixton-100、40mM β-巰基乙醇、pH8.0)洗滌包涵體沉淀，12000g離心30min離心獲得包涵體。
(3)包涵體用100ml Buffer C(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素、40mM β-巰基乙醇、pH 8.0)懸起置4℃冰箱6h以上，12000g離心30min，棄沉淀。溶解上清移至透析袋內(nèi)，依次于500ml Buffer D(100mM NaH2PO4、10mM Tris、2M尿素、0.01％SDS、40mM β-巰基乙醇、pH 8.0)、500ml Buffer E(100mM NaH2PO4、10mM Tris、0.01％SDS、40mM β-巰基乙醇、pH 8.0)、500ml Buffer F(100mM NaH2PO4、10mM Tris、pH 8.0)透析液中4℃透析8h，12000g離心30min取上清，得到復(fù)性后蛋白質(zhì)。
(4)根據(jù)Ni-NTA Sepharose純化試劑盒說明書對含6×His tag的目的蛋白質(zhì)進行純化。將復(fù)性后的rhIL-21加到Ni-NTA親和層析柱，用20mM咪唑洗脫掉大部分雜蛋白質(zhì)后，用250mM咪唑洗脫目的蛋白質(zhì)，能獲得純度達95％以上rhIL-21，用考馬斯亮藍G-250染色法測蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果為平均每500ml工程菌最終可以得到8～10mg純化的rhIL-21。
實驗例5rhIL-21的活性檢測(rhIL-21由實驗例4制得) 以10u/ml的IL-2和不同濃度梯度的rhIL-21培養(yǎng)NK92細胞，48h后細胞計數(shù)，以rhIL-21濃度為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)量為縱坐標(biāo)做圖，如圖6所示，由圖可知，rhIL-21在終濃度為275～5500ng/ml時對NK92細胞有不同程度的協(xié)同增殖作用，但最高濃度組rhIL-21對NK92細胞的促增殖作用反而比其他濃度組降低，這可能是因為在復(fù)性過程中使用了SDS，而高濃度rhIL-21組中SDS含量也是最高的，rhIL-21對NK92細胞的促增殖作用一部分被SDS所抵消，低藥物濃度組中SDS對NK92細胞生長的影響很小，所以rhIL-21的促增殖作用能充分的表現(xiàn)出來，且呈現(xiàn)出rhIL-21劑量依賴性的增殖特點。
本說明書未詳述之處均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握和熟知，不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建重組人白細胞介素21工程菌的方法，其特征在于步驟如下
(1)合成PCR引物上游引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物為5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′；
(2)PCR擴增目的片段以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-21基因片段；
(3)DNA測序鑒定將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段和pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-IL-21，將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，用選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定；
(4)構(gòu)建重組載體將pMD18-T-IL-21重組質(zhì)粒與pET30a(+)載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA連接酶的作用下連接，溫度為16～25℃，時間16～20℃時，≥6h；20～25℃時，≥5min；
(5)轉(zhuǎn)化將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-21工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建重組人白細胞介素21工程菌的方法，其特征在于所述步驟(2)的具體操作過程為以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，于50μl反應(yīng)體系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR條件95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延長7min；PCR產(chǎn)物用1％低熔點瓊脂糖電泳純化回收。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建重組人白細胞介素21工程菌的方法，其特征在于所述步驟(3)的具體操作過程為將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段與pMD18-T載體在連接復(fù)合物作用下于16℃連接；將重組載體pMD18-T-IL-2I轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平鋪于含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定。
4.一種人白細胞介素21工程菌，其特征在于是由如下步驟構(gòu)建而成
(1)合成PCR引物上游引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物為5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′；
(2)PCR擴增目的片段以重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-21基因片段；
(3)DNA測序鑒定將上述PCR擴增得到的IL-21基因片段和pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-IL-21，將重組載體pMD18-T-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，用選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進行DNA測序鑒定；
(4)構(gòu)建重組載體將pMD18-T-IL-21重組質(zhì)粒與pET30a(+)載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA連接酶的作用下連接，溫度為16～25℃，時間16～20℃時，時間≥6h；20～25℃時，時間≥5min；
(5)轉(zhuǎn)化將重組載體pET30a(+)-IL-21轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-21工程菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人白細胞介素21工程菌極其構(gòu)建方法，構(gòu)建步驟為先通過PCR擴增獲得目的片段，然后經(jīng)DNA測序鑒定后，使目的片段與pET30a(+)載體連接，然后轉(zhuǎn)化細菌，即獲得工程菌。本發(fā)明的工程菌的最佳發(fā)酵誘導(dǎo)溫度為42℃，較普通菌高，為工程菌發(fā)酵條件的探索提供了有益的啟示和科學(xué)研究價值；表達的IL-21是以高純度的包涵體形式存在，可有效避免細胞水解酶對蛋白質(zhì)的破壞，表達的目的蛋白質(zhì)含6個His tag結(jié)構(gòu)，便于純化出高純度的重組蛋白質(zhì)。
文檔編號C12R1/19GK101240276SQ20081001517
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日
發(fā)明者許曉群, 王郡甫, 瑞 鄭, 彩 張, 張建華, 劉金生 申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所