專利名稱：一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及其快速制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)試劑制備和基因工程應(yīng)用領(lǐng)域，具體來說就是通 過基因工程手段構(gòu)建超級(jí)質(zhì)粒，通過大腸桿菌發(fā)酵和限制性內(nèi)切酶酶切的方 法制備一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
背景技術(shù)：
在DNA合成及各種方式的基因操作過程中，需要對(duì)合成的或進(jìn)行操作的 DNA分子大小變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，常用的方法是通過將待測(cè)DNA分子與一種己知分 子量的DNA混合標(biāo)準(zhǔn)物(分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA marker)同時(shí)進(jìn)行電泳，通過比較 待測(cè)DNA分子與DNA分子標(biāo)準(zhǔn)在電泳過程中的遷移距離來判斷DNA樣品分子的 大小。因此，需要制備一些已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA混合物。
現(xiàn)有技術(shù)中制備標(biāo)準(zhǔn)DNA的方法已有多種方法
化學(xué)合成法通過化學(xué)反應(yīng)的方法將4種不同的脫氧核糖核苦酸腺嘌呤 (dATP)，鳥嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺卩密啶(dTTP)結(jié)合在一起， 合成目標(biāo)大小的DNA片段。該方法操作十分繁瑣，效率極低，合成的DNA長(zhǎng)度 受到嚴(yán)重的限制， 一般可合成DNA的長(zhǎng)度不超過400hp，大分子量的DNA片段 無法直接用化學(xué)合成法來合成，成本太高，因而不適用DNA分子量的常規(guī)制備。
片段連接法先用PCR或者合成的方法獲得小分子量的DNA分子(如 100bp)，再用酶促連接反應(yīng)將小分子DNA—個(gè)一個(gè)順序連接起來，形成不同 大小的DNA分子(100 bp、 200 bp、 300 bp、 400 bp、…)。該方法理論上講 可以制備各種大小的DNA分子，但操作卻十分繁瑣，可再現(xiàn)性差，無法實(shí)現(xiàn)大 規(guī)模制備。
聚合酶鏈反應(yīng)法DNA聚合酶鏈反應(yīng)己廣泛用于基因克隆和DNA片般的制 備。目前國(guó)內(nèi)外已被廣泛用來制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。但是該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 是一種勞動(dòng)密集型的生產(chǎn)方式，其生產(chǎn)能力有限。
酶切法用一種或兩種限制性內(nèi)切酶組合對(duì)噬菌體DNA或人工設(shè)計(jì)的質(zhì) 粒進(jìn)行切割，產(chǎn)生不同大小的DNA片段，以作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。該方法的優(yōu) 點(diǎn)是容易大量制備，產(chǎn)率高。但該方法的缺點(diǎn)也很突出酶切產(chǎn)生的DNA片段 大小受到所用的限制性酶種類的限制，其制約因素是人工構(gòu)建質(zhì)粒的設(shè)計(jì)水 平。
長(zhǎng)期以來，分子生物學(xué)試劑與基因工程應(yīng)用領(lǐng)域，需要一種設(shè)計(jì)水平高、 制備方便的偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，以及該偶數(shù)200bp梯度DNA分子
量標(biāo)準(zhǔn)快速生產(chǎn)方法(生產(chǎn)工藝)。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)室研究，本發(fā)明恰恰滿足了上述需求，其目的在于提 供一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的進(jìn)一歩目的在于提供一種快速、大量地制備一種偶數(shù)200bp梯 度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
通過PCR的方法以Lambda DNA為模板分別擴(kuò)增了 400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp幾條片段，其中1400 bp和1000 bp通過pfo DNA聚 合酶進(jìn)行擴(kuò)增，而400 bp-A、 400 bp-B、 600 bp、 800 bp分別用Taq DNA聚合 酶進(jìn)行擴(kuò)增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性對(duì)1400 bp和1000 bp兩條 片段加T。再利用A/T互補(bǔ)的原理在離心管中建立連接體系，利用T4連接酶使 600bp、 800bp、 1000bp連接成一個(gè)600-1000-800的單元，同樣400 bp-A、 400 bp-B 和1400bp連接成400A-1400-400B的單元。然后通過T/A克隆試劑盒，把上述 兩個(gè)單元分別克隆到T載體中形成中間載體T681和T4144。
通過Pst I酶切將400A-1400-400B單元從T4144中切出來，并利用核酸純 化回收試劑盒進(jìn)行回收和純化。同時(shí)T681載體也被PstI酶切完全酶切，并利用 小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)進(jìn)行載體脫磷處理，以防止載體自連。建立合適的 連接體系，把400-1400-400單元連接進(jìn)脫磷處理的T681載體所得中間載體命名 為T6814144。通過與上述過程相近的技術(shù)路線，利用PCR方法從Lambda DNA 中擴(kuò)增獲得一個(gè)2000bp的片段，并克隆到T載體中，然后用內(nèi)切酶SphI再切 出來，連入同樣Sph I酶切和CIAP脫磷處理的T6814144，獲得質(zhì)粒pYE9600。
所獲得的pYE9600是一種全新的超級(jí)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。其中含有400 bp、 600 bp、 800 bp、 1000 bp、 1400bp、 2000bp六條片段，其中400bp為雙拷 貝，以增強(qiáng)其凝膠電泳后染色觀察時(shí)的熒光強(qiáng)度。質(zhì)粒pYE9600經(jīng)EcoRI酶切 后可以獲得一個(gè)由7條片段組成的200bp偶數(shù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度。同時(shí)各條
DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具有一定的比列關(guān)系(4: 3: 4: 5: 7: 10: 15)。
限制性內(nèi)切酶切割DNA分子的原理
核酸限制性內(nèi)切酶能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別DNA雙鏈上某堿基順序，如若用EcoRI酶 切只有一個(gè)切點(diǎn)的環(huán)狀雙鏈DNA分子，就能產(chǎn)生兩個(gè)帶有AATT堿基順序的 粘性末端的線狀DNA分子。核酶限制性內(nèi)切酶作用于底物DNA時(shí)，受到許多 要素的制約，主要有以下幾個(gè)
1) 底物DNA樣品的純度在制備DNA樣品中，由于各種條件的影響，存 在著一些非DNA物質(zhì)，這些物質(zhì)有的對(duì)酶切反應(yīng)影響較大，如抽提過程中，有 機(jī)物質(zhì)的殘留成份酚、氯仿、酒精，都會(huì)破壞酶的活性，另外未除去的蛋白質(zhì)， 也會(huì)千擾酶的反應(yīng)，殘留的染色體DNA則會(huì)相對(duì)降低酶對(duì)底物DNA的濃度。
2) 離子濃度限制性核酸內(nèi)切酶專 一性需要鎂離子以作為輔基。并且要求 一定的鹽離子濃度，在使用...匕通常把限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)鹽離子的要求分為三 類高鹽、中鹽和低鹽，它們所需的Na+分別為100mmol/L、 5Ommol/L。如果離 子濃度使用不當(dāng)，酶反應(yīng)不完全或會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，例如高鹽類的 EcoRI酶當(dāng)Na+離子濃度低于50mmol/L時(shí)，它的專一性就降低。只能識(shí)別中間的 4個(gè)核苷酸序列(此活性記為EcoRP)由于EcoRI酶切反應(yīng)需要高鹽緩沖液， 在中鹽緩沖液中反應(yīng)比較慢，Hind III酶切反應(yīng)需要中鹽緩沖液，實(shí)驗(yàn)要求EcoR I與Hind III酶同時(shí)消化DNA時(shí)，而酶切反應(yīng)要完全，則選用了中鹽緩沖液。
3) 底物DNA的量商品限制性內(nèi)切酶以酶單位計(jì)算， 一個(gè)酶單位的定義 是在規(guī)定的溫度和緩沖液內(nèi)，于20微升反應(yīng)液內(nèi)1小時(shí)完全消化1微克DNA 所需要的酶量。所以若是底物DNA的量超過酶的酶單位所規(guī)定的消化量，則反 應(yīng)不能完全。不過商品酶多是濃溶液，每微升含10單位以上，價(jià)格昂貴，所以 使用時(shí)要盡量節(jié)省。4) 酶反應(yīng)溫度與酶反應(yīng)終止:大部分限制性核酸內(nèi)切酶最適的反應(yīng)溫度在37 °C，極個(gè)別在6(TC，所以酶反應(yīng)后要使酶的活性失活時(shí)，可把反應(yīng)液置于65'C 內(nèi)保溫10-15分鐘，以終止酶反應(yīng)，但此法對(duì)個(gè)別酶(最適溫度在6(TC的酶) 不適合。
5) 酶切反應(yīng)時(shí)間酶消化時(shí)間通常依酶的濃度、底物的濃度和純度而定， 通常是30分鐘到2個(gè)小時(shí)，甚至更長(zhǎng)些，但不能過長(zhǎng)。因?yàn)樯唐访笜O有可能含 有雜酶，時(shí)間過久，微量雜酶的酶反應(yīng)也會(huì)積累到干擾整個(gè)酶切反應(yīng)的程度。
一、材料
1質(zhì)粒pGM-T easy為通用質(zhì)粒，為閉環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)DNA，全長(zhǎng)為 3015bp，其核酸序列如下所示。該質(zhì)粒保存在大腸桿菌DH5ot中，購(gòu)自北京天 為時(shí)代公司，并保存于本實(shí)驗(yàn)室，由其制備的T載體為自制產(chǎn)品。 1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCGGCCGCG
51 GGAATTCGAT* ATCACTAGTG AATTCGCGGC CGCCTGCAGG TCGACCATAT
101 GGGAGAGCTC CCAACGCGTT GGATGCATAG CTTGAGTATT CTATAGTGTC
151 ACCTAAATAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT
201 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG
251 TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC
301 GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA
351 TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC
401 CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG
451 CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG
501 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA
551 CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG
601 ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA
651 GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC
701 TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT
751 CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG
801GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGT GTGCACGAACCCCCCGTTCA
851 GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG
卯l TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC
951 AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA
1001 CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC
1051 CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC
1101 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG
1151 AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG
1201 CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA
1251 AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC
1301 AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA
1351 TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT
1401 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC
1451 TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG
1501 ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT
1551 CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC
1601 TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGGCATTG
1651 CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAG(
1701 TCCGG'iTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA
1751 AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG
1801 CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT
1851 GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA
1901GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACC GAGTTGCTCTTGCCCGGCGT
1951 CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC
2001 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT
2051 GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT
2101 CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT
2151 GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT
2201 CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA
2251 GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG
2301 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGTA TGCGGTGTGA AATACCGCAC
2351 AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGAAATTGTA AACGTTAATA
2401 TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATATTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC
2451 CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA
2501 GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA
2551 ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC
2601 CCACTACGTG AACCATCACC CAAATCAAGT TTTTTGCGGT CGAGGTGCCG 、
2651 TAAAGCTCTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC
2701 GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA
2751 GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC
2801 CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC ATTCGCCATT
2851 CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT
2901 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA
2951 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT
3001 GTAATACGAC TCACTATA2試劑
大腸桿菌(￡. co//strain: DH5a);
質(zhì)粒DNA回收、純化試劑盒，由北京博大泰恒公司生產(chǎn)； TaqDNA聚合酶、T叫DNA聚合酶緩沖液，北京博大泰恒有限公司生產(chǎn)； 4XdNTP由dATP、 dCTP、 dTTP、 dGTP四種單脫氧核糖核著酸組成， 每種的商品濃度為10mM，購(gòu)自深圳華賽因公司； DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)北京博大泰恒有限公司； 氨芐青霉素， 瓊脂糖，
溴化乙啶，貯存液為10mg/ml， 溴酚蘭，
三羥甲基氨基甲烷(Tris) 乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na2) 氯仿，
70%冷乙醇，
無水乙醇，
蛋白胨(OXOID),
酵母抽提物(OXOID)，
NaCl，
瓊l^粉，
無離子水。
3設(shè)備
微量移液器(GILSON)， PCR儀(MJ PTC-200)，
紫外透射儀，
冷凍高速離心機(jī)，
電泳儀，
恒溫箱，
恒溫?fù)u床，
搖床
二、試劑配制
LB固體和液體培養(yǎng)基配制1升LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨(tryptone) 10g、酵母膏(yeast extract)5g、氯化鈉10g、加幾滴5M NaOH調(diào)節(jié)至pH 7. 0， 高壓(12rC)滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基(不含氨芐)每升液體培養(yǎng)基中 加入15克瓊脂(Agar)高壓(121°C)滅菌20分鐘，適當(dāng)冷卻后，倒平板。
氨芐青霉素(Ampicillin， Amp)母液配成50mg/ml水溶液，-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 含Amp的LB固體培養(yǎng)基將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60 r左右，加入A卿儲(chǔ)存液，使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪平板。
1XTE緩沖液(pH8. 0):含10腸1/L Tris-HCl (pH8. 0) ， 1畫1/L EDTA-Na2 (pH8. 0)，以103. 4Kpa高壓蒸汽滅菌，4°C貯存。
凝膠上樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)，40%"八)蔗糖水溶液。 50XTAE電泳緩沖液的配制:242gTris-Cl， 57. lml醋酸，37. 2g EDTA-Na" 加水至1L，室溫保存，用時(shí)加蒸餾水稀釋至1X即可。1%瓊脂糖凝膠在一個(gè)250ml的錐形瓶中，加入100ml 1XTAE電泳緩 沖液，l.Og瓊脂糖，混勻后在微波爐或電爐上加熱溶解，待瓊脂糖完全融化 后冷卻到60。C，加入一滴濃度為10mg/ml的溴化乙啶，搖勻，然后在插有梳 子的凝膠槽中灌制凝膠，冷卻后即可進(jìn)行電泳。 三、引物設(shè)計(jì)與合成
本發(fā)明所用到的PCR引物均為本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)噬菌體Lambda DNA 的核酸序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件DNAstarPrimerselect進(jìn)行設(shè)計(jì)。分別如下
通用正向引物5， -GGG ATG TTT ATG ACG AGC A-3'
800bp反向5' -GAA TTC ( EcoR I)TGC ATC TCT TCG ACC TGA GC-3'
1000 bp反向5' -GAA TTC ( EcoR I)CAC GAT GAT ATT CAC CAC AC-3';
600 bp反向5' -GGA ACG GAT A AC CTC ACC GG-3，;
400bpA-反向5， -GAA TTC ( EcoR I)CCG TAA AAA AAG CCG CAC AG-3';
1400bp反向5， -GAA TTC ( EcoR I)CAG GGT CAG CCA GCA GCA TC-3，;
400bpB-反向5' -GCA TGC (Sph I) GGC CTT TAG TGA TGA AGG GT-3，
2000bp正向5' -CTG CAG(Pst I)GGG ATG TTT ATG ACG AGC AA-3，;
2000bp反向5' -CTC ACC GGA TGT AAT GGT GG_3，;
引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，合成后的干粉樣引物 用TE緩沖液溶解成濃度為lOuM的溶液。
本發(fā)明的有益效果在于通過基因工程手段構(gòu)建超級(jí)質(zhì)粒，通過大腸桿 菌發(fā)酵和限制性內(nèi)切酶酶切的方法制備一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)， 過程快速，產(chǎn)率高，可以放大到工業(yè)級(jí)生產(chǎn)規(guī)模。


圖1用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切質(zhì)粒pYE9600所產(chǎn)生的偶數(shù)200bp梯度 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
利用超級(jí)質(zhì)粒pYE9600制備生產(chǎn)偶數(shù)200bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度的制備 方法，具體包括如下歩驟
1. 取-20。C冷凍保存的pYE9600質(zhì)粒2-5微升通過熱激轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)入 大腸桿菌DH5ot或JM109中，涂布于含有氨芐青霉素的平板上，倒置于37。C恒 溫箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，第二天挑單菌落，用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(5ml) 培養(yǎng)至OD600=0.8，轉(zhuǎn)接于100ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床 劇烈震蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)，至OD600-0.6時(shí)，繼續(xù)以1: 100的比例轉(zhuǎn)接于已37°C 預(yù)熱的含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1000ml)中培養(yǎng)12-16小時(shí)。
2. 目標(biāo)質(zhì)粒pYE9600的大量制備及純 ，其過程包括以下步驟
(1) 于250ml離心瓶中4100-6000rpm常溫或4"C收菌，離心時(shí)間為3-10 分鐘，獲得菌體沉淀。用20ml的溶液I重懸菌體沉淀。并將之轉(zhuǎn)入600ml的礦 泉水瓶中。
(2) 分別加入40ml新配制的溶液I1，擰好蓋子，輕輕顛倒數(shù)次，使內(nèi)容物 徹底混勻，室溫下放置10-15分鐘。
(3) 分別加入30ml冰預(yù)冷的溶液m，擰好蓋子，輕輕地但完全地顛倒、 震蕩混勻幾次(此時(shí)不應(yīng)再有分離的兩個(gè)液相)。將礦泉水瓶在冰上放10-20分鐘。(4) 將礦泉水瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)入離心瓶中，平衡后離心。
(5) 6000rpm離心20分鐘，將上清輕輕轉(zhuǎn)入量筒中，棄去離心瓶中的沉淀。
(6) 加30ml氯仿抽提。
(7) 轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置5分鐘，待分相后，分別收集下層的有機(jī)相(氯 仿)和上層的水相。
(8) 將水相10, OOOrpm離心10分鐘。
(9) 合并所有水相(加入10ul的RNase，室溫靜置10分鐘)，量其體積，加 入0.7倍體積的異丙醇，并充分混勻，室溫下放置10-20分鐘。
(10) 室溫下8000rpm離心15分鐘，以回收核酸沉淀。
(11) 小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾上以除去殘余的上清。
(12) 室溫下用5ml 70%的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防 止沉淀物的倒出)，并將離心管開口倒置于紙巾上使剩余的乙醇揮發(fā)掉(15-20分 鐘)。
(13) 5ml TE (pH 8.0 )溶解濕潤(rùn)的核酸沉淀。
(14) 溶解后得到的質(zhì)粒溶液用等體積的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋 白質(zhì)。此時(shí)可以獲得澄清的液體。
3. 利用所獲得的pYE9600質(zhì)粒建立酶切反應(yīng)體系，其中反應(yīng)緩沖液的體積 為反應(yīng)總體積的1A0。加入適量的內(nèi)切酶，充分混勻后于37'C水浴保溫20-50 個(gè)小時(shí)。之后將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(TAE),使凝 膠浸于液面下約3mm，將部分酶解產(chǎn)物取出并進(jìn)行梯度稀釋，加入適量的凝 膠上樣緩沖液(loading buffer)并混合，用移液槍將之加入凝膠孔中，以5V /cm的電壓進(jìn)行電泳，使核酸分子向陰極泳動(dòng)，當(dāng)溴酚蘭泳動(dòng)到凝膠的三分 之二處時(shí)停止電泳，在紫外透射儀上觀察酶切產(chǎn)物的純度及產(chǎn)量。
4. 所得的偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的純化用酚氯仿為h l的混 合溶劑抽提，去除其中的蛋白質(zhì)(主要是內(nèi)切酶)成份， 一般經(jīng)過2-3次的抽 提即可達(dá)到滿意的效果。通過向體系中加入適量的TE緩沖液，將3000bp的 DNA條帶定量為150ng,那么其他條帶的量依次為(從大到小)100 ng、 70ng、 50ng、 40ng、 30 ng、 20ng。
權(quán)利要求
1.一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，其特征是由7條DNA帶組成的限制性內(nèi)切酶酶切混合物，長(zhǎng)度分別為400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各條DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具有一定的比列關(guān)系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的快速制備 方法，7條DNA帶是以質(zhì)粒pYE9600酶切對(duì)象，通過大腸桿菌發(fā)酵和堿裂解法 提取目標(biāo)質(zhì)粒pYE9600，經(jīng)過純化，用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切消化，從 而釋放其中所含的200bp系列片段，其特征在于① 取-20。C冷凍保存的pYE9600質(zhì)粒2-5微升通過熱激轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn) 入大腸桿菌DH5a或JM109中，涂布于含有氨芐青霉素的平板上，倒置于37°C 恒溫箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，第二天挑單菌落，用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(5ml) 培養(yǎng)至OD600=0.8，轉(zhuǎn)接于100ml含有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床 劇烈震蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)，至00600=0.6時(shí)，繼續(xù)以l: 100的比例轉(zhuǎn)接于己37。C 預(yù)熱的含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1000ml)中培養(yǎng)12-16小時(shí)；② 目標(biāo)質(zhì)粒pYE9600的大量制備及純化，其過程包括以下步驟(1) 于250ml離心瓶中4100-6000rpm常溫或4"收菌，離心時(shí)間為3-10 分鐘，獲得菌體沉淀；用20ml的溶液I重懸菌體沉淀；并將之轉(zhuǎn)入600ml的礦 泉水瓶中；(2) 分別加入40ml新配制的溶液n，擰好蓋子，輕輕顛倒數(shù)次，使內(nèi)容物 徹底混勻，室溫下放置10-15分鐘；(3) 分別加入30ml冰預(yù)冷的溶液III,擰好蓋子，輕輕地但完全地顛倒、 震蕩混勻幾次(此時(shí)不應(yīng)再有分離的兩個(gè)液相)；將礦泉水瓶在冰上放10-20分 鐘；(4) 將礦泉水瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)入離心瓶中，平衡后離心；(5) 6000rpm離心20分鐘，將上清輕輕轉(zhuǎn)入量筒中，棄去離心瓶中的沉淀；(6) 加30ml氯仿抽提；(7) 轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置5分鐘，待分相后，分別收集下層的有機(jī)相(氯 仿)和上層的水相；(8) 將水相10, OOOrpm離心10分鐘；(9) 合并所有水相(加入10ul的RNase，室溫靜置10分鐘)，量其體積，加 入0.7倍體積的異丙醇，并充分混勻，室溫下放置10-20分鐘；(10) 室溫下8000rpm離心15分鐘，以回收核酸沉淀；(11) 小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾上以除去殘余的上清；(12) 室溫下用5ml 70%的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防 止沉淀物的倒出)，并將離心管開口倒置于紙巾上使剩余的乙醇揮發(fā)掉(15-20分 鐘)；(13) 5ml TE (pH 8.0 )溶解濕潤(rùn)的核酸沉淀；(14) 溶解后得到的質(zhì)粒溶液用等體積的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋 白質(zhì)，獲得澄清的液體；③ 利用所獲得的pYE9600質(zhì)粒建立酶切反應(yīng)體系，其中反應(yīng)緩沖液的體 積為反應(yīng)總體積的1/10;加入適量的內(nèi)切酶，充分混勻后于37'C水浴保溫20-50 個(gè)小時(shí)；之后將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(TAE)，使凝 膠浸于液面下約3mm，將部分酶解產(chǎn)物取出并進(jìn)行梯度稀釋，加入適量的凝 膠上樣緩沖液(loading buffer)并混合，用移液槍將之加入凝膠孔中，以5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，使核酸分子向陰極泳動(dòng)，當(dāng)溴酚蘭泳動(dòng)到凝膠的三分 之二處時(shí)停止電泳，在紫外透射儀上觀察酶切產(chǎn)物的純度及產(chǎn)量；④所得的偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的純化用酚氯仿為l: l的 混合溶劑抽提，去除其中的蛋白質(zhì)(主要是內(nèi)切酶)成份， 一般經(jīng)過2-3次的 抽提即可達(dá)到滿意的效果；通過向體系中加入適量的TE緩沖液，將3000bp的 DNA條帶定量為150ng,其他條帶的量依次為(從大到小)100 ng、 70 ng、 50 ng、 40ng、 30ng、 20ng。
全文摘要
通過全新的基因工程手段構(gòu)建一種超級(jí)質(zhì)粒，通過大腸桿菌發(fā)酵和限制性內(nèi)切酶酶切的方法制備一種偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)是由7條DNA帶組成的限制性內(nèi)切酶酶切混合物，長(zhǎng)度分別為400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各條DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具有一定的比列關(guān)系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)?？焖僦苽浞椒ò?條DNA帶是以質(zhì)粒pYE9600酶切對(duì)象，通過大腸桿菌發(fā)酵和堿裂解法提取目標(biāo)質(zhì)粒pYE9600，經(jīng)過純化，用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切消化，從而釋放其中所含的200bp系列片段。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101575599SQ20081001577
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2008年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者葉春江 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)