專利名稱：一種石榴酒酵母的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酒類酵母的選育方法，具體地說(shuō)是一種石榴酒酵母的選育 方法。
背景技術(shù)：
石榴含有大量的氨基酸、維生素和多種微量元素。石榴酒系采用石榴為主 要原料，經(jīng)去皮、壓榨、發(fā)酵、分離、陳釀而成的果酒。石榴酒色澤光亮透明， 有石榴的天然風(fēng)味，含有大量的氨基酸、多種維生素等。具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 并有生津化食、健脾益胃、降壓降脂、軟化血管、保健美容及止瀉之功效。釀 造石榴酒必須有酵母，現(xiàn)在的石榴酒酵母是用市場(chǎng)上購(gòu)置的果酒酵母或存在于 果皮中的自然酵母，但是現(xiàn)有酵母存在著發(fā)酵不徹底，石榴酒殘?zhí)歉?、酒度低?揮發(fā)酸高、果香淡薄、不宜儲(chǔ)存等缺點(diǎn)。因此發(fā)明一種能夠使石榴汁發(fā)酵徹底， 石榴酒殘?zhí)堑?、酒度高、揮發(fā)酸低、果香濃郁、適宜長(zhǎng)期儲(chǔ)存的新的石榴酒酵 母是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種石榴汁發(fā)酵徹底，石榴酒殘?zhí)堑?、酒度高、揮發(fā) 酸低、果香濃郁、適宜長(zhǎng)期儲(chǔ)存的石榴酒酵母的選育方法。 本發(fā)明內(nèi)容如下-
一種石榴酒酵母的選育方法，包括下列步驟
(1) 取石榴園的土壤、石榴樹(shù)葉、石榴樹(shù)皮、腐爛石榴、完整石榴的表皮
各10重量份，放入裝有80份水的瓶中，離心機(jī)旋轉(zhuǎn)30分鐘，120轉(zhuǎn)/分；取0.2 毫升接種到用98%的無(wú)菌石榴汁和2%的瓊脂制作的營(yíng)養(yǎng)基中；
(2) 取果酒干酵母lg ,用35—40'C水100毫升活化后，取0. 1毫升接種于 培養(yǎng)基中，28'C培養(yǎng)一天；
(3) 將上述(1) 、 (2)兩種菌種接在培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)一天；將培養(yǎng) 后的酵母菌斑接種到用石榴汁97%，蛋白胨2%，酵母膏1%殺菌制成的溶液 中，35°C， 250轉(zhuǎn)/分搖床震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)；(4)取(3)菌液5毫升，3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用磷酸緩沖液洗2次， 加3毫升預(yù)處理劑，29。C培養(yǎng)10分鐘后，離心5分鐘，3500轉(zhuǎn)/分，棄去上清 液；
(5 )取(3 )所得菌液5毫升用蝸牛酶處理30-40分鐘； (6)取(4) 、 (5)所得菌液各0.5毫升混合，用0.4mol/L CaCl2洗滌、 離心，涂于培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)3天；用電擊儀電擊，電擊時(shí)間40分鐘；
(7) 取5毫升電擊后菌液置于直徑9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm 處照射1一2分鐘，并不斷攪拌，稀釋涂布誘變培養(yǎng)基中；
(8) 取澄清的石榴汁，調(diào)整糖度12-14%，PH:5-6，加瓊脂2-2.5%，加熱 至90-95'C溶化，分裝于試管中，塞上棉塞，115'C高溫殺菌30-40分鐘；冷凝 后制成酵母培養(yǎng)基；取(7)菌種接種到酵母培養(yǎng)基上，在28-3(TC恒溫箱中培 養(yǎng)3天，取出放在一1(TC以下保存；數(shù)日后反復(fù)培養(yǎng)、提純，置于一7(TC以下 貯存。
培養(yǎng)基為澄清石榴汁90%、蛋白胨2%、葡萄糖5%、酵母膏1%、瓊脂2 %制成；磷酸緩沖液為92份0. 2mol/L NaH2P0jtl 8份0. 2moL/L NaHP04 、PH=5. 8 制成；預(yù)處理劑為100毫升磷酸緩沖液中加0. 1毫升EDTA和0. 1毫升P -巰 基乙醇制成；誘變培養(yǎng)基為培養(yǎng)基加0.2X的LiCl制成。
本發(fā)明的要點(diǎn)在于根據(jù)自然界中野生酵母菌的存在，取石榴園的土壤、 石榴樹(shù)葉、石榴樹(shù)皮、腐爛石榴、完整石榴的表皮加水離心分離培養(yǎng)；取果酒 干酵母，用水活化培養(yǎng)；再將上述兩種菌種接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)；經(jīng)緩沖液沖洗、 蝸牛酶處理、電擊、紫外光照射誘變，最后經(jīng)酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)制成。
本發(fā)明的第一步是根據(jù)自然界中野生酵母菌的存在，選擇樣品來(lái)源。樣品 主要來(lái)源于石榴園的土壤，瑪瑙石榴葉表皮，石榴樹(shù)腐朽樹(shù)皮及腐爛石榴和完 整石榴的表皮。本發(fā)明采用先富集然后分離純化的順序，取每種樣品各10份， 分別放入裝有80份的無(wú)菌水瓶中。離心機(jī)120轉(zhuǎn)/分，旋轉(zhuǎn)分離30分鐘后，取 0.2毫升涂布在平皿上。平皿基用98%的無(wú)菌石榴汁和2%的瓊脂制作，每個(gè)樣 品3個(gè)平行。從上述平皿中挑選典型菌落，再通過(guò)平皿進(jìn)行分離純化，選育出 直徑大、活力強(qiáng)、純度高的酵母菌，接種斜面培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的制備方法是澄清石榴汁、90%、蛋白胨2%、葡萄糖5%、酵母 膏1%、瓊脂2%，經(jīng)115-C滅菌30分鐘制成。
第二步取現(xiàn)有商品酵母果酒活性干酵母lg ，用35—4(TC水100毫升進(jìn)行活 化后，取O. l毫升接種于斜面培養(yǎng)基中，28'C溫度培養(yǎng)一天。
第三步將上述第一步、第二步培養(yǎng)的兩種菌接種在培養(yǎng)基斜面上，3(TC培 養(yǎng)一天，重復(fù)兩次，將活化的酵母菌斑用接種針挑取適量接種到殺過(guò)菌的石榴 汁97%,蛋白胨2%，酵母膏1%的溶液中，35°C， 250轉(zhuǎn)/分鐘搖床震蕩培養(yǎng) 10-12小時(shí)，此時(shí)可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
第四步制備原生質(zhì)體
取上述活化的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌液(濃度約為2X1()7個(gè)毫升)5毫 升，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘得到菌體，用磷酸緩沖液(0.2mol/L NaH2P04 92 毫升和0. 2moL/L NaH2P04 8毫升，PH=5. 8)洗2次，加3毫升預(yù)處理劑(100毫 升磷酸緩沖液中加0. 1毫升EDTA和0. 1毫升P -巰基乙醇)29。C培養(yǎng)10分鐘。 再經(jīng)3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清夜，得到一種原生質(zhì)體；用蝸牛酶處 理30-45分鐘得另一種原生質(zhì)體。蝸牛酶可以購(gòu)買，例如從北京欣經(jīng)科生物技 術(shù)有限公司購(gòu)得。需經(jīng)稀釋，稀釋方法為；取適量蝸牛酶加入到用92毫升的 0. 2moL/L NaH2P04和8毫升的0. 2moL/L NaHP04，加17g蔗糖配制成的溶液中， 稀釋成濃度為1. 5%的溶液，用0. 22um濾膜過(guò)濾除菌。
第五步融合處理將兩種原生質(zhì)體進(jìn)行種內(nèi)和種間融合。
融合步驟取兩種原生質(zhì)體各0.5毫升等量混合，離心；用0. 4mol/L CaCl2 洗滌、離心，后涂于培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)3天。
電擊融合用電擊儀進(jìn)行電擊，條件為5KV/cm， 25MF和200Q，電擊時(shí)間 40分鐘。
第六步誘變處理采用紫外照射誘變，取5毫升菌液于直徑9cm的平皿中， 用20W紫外光管放于30cm處分別照射一段時(shí)間， 一般為1—2分鐘，同時(shí)不斷攪
拌，然后在紅光下操作稀釋涂布在誘變培養(yǎng)基中；誘變培養(yǎng)基用第一步所述的培 養(yǎng)基加0.2X的LiCl制成。
第七步石榴專用酵母菌制備取澄清的石榴汁，調(diào)整糖度12-14%, PH:5-6， 加瓊脂2-2.5%，加熱至90-95。C溶化，分裝于預(yù)先洗凈、干熱殺菌的試管中，每管裝量以制成斜面后約占試管長(zhǎng)度的1/3為宜，塞上棉塞，在115。C高溫鍋內(nèi) 殺菌30-40分鐘，殺菌后趁熱制成斜面，冷凝后置于28-3CTC恒溫箱中觀察培養(yǎng) 3天。若無(wú)雜菌繁殖，便可種植由上述方法經(jīng)選育、原生質(zhì)體融合雜交、誘變而 得到的菌株較大的菌種，將該菌種移植到斜面培養(yǎng)基上，在28-3(TC恒溫箱中培 養(yǎng)3天，待菌株繁殖良好后，取出放在一1(TC以下的冰箱中保存，數(shù)日后再重 新移植培養(yǎng)幾次，這樣反復(fù)培養(yǎng)、提純，以免菌種衰老變異。待該菌種穩(wěn)定后， 即可存入一7(TC以下的專用菌種培養(yǎng)箱中貯存，使用時(shí)通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，即可得 到生產(chǎn)工藝的要求。
采用上述方法制得的石榴酒酵母細(xì)胞透明、呈圓或橢圓型，形態(tài)肥大，一 般在7-12um，是釀造優(yōu)質(zhì)石榴干酒的主要酵母，發(fā)酵力超過(guò)任何其它現(xiàn)有使用的 酵母，對(duì)乙醇、單寧、S02抵抗力強(qiáng)，能生成更多的乙醇，代謝附產(chǎn)物豐富，產(chǎn) 香明顯突出，易長(zhǎng)期保存。
本發(fā)明由于選用石榴表皮和樹(shù)干、土壤中的野生酵母和優(yōu)質(zhì)果酒活性干酵 母進(jìn)行原生質(zhì)體融合、誘變、馴化等方法進(jìn)行雜交育種而得，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)， 特別適用于石榴酒的發(fā)酵。尤其是本發(fā)明方法可以根據(jù)各種石榴酒釀造使用的 不同石榴品種，不同種植地區(qū)的土壤做樣品，選取野生酵母菌，就更使得本發(fā) 明具有創(chuàng)造性。經(jīng)廣泛查詢國(guó)內(nèi)外出版物和專利文獻(xiàn)，均未見(jiàn)有相同的方法選 育石榴酒酵母的報(bào)道。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.發(fā)酵力強(qiáng)，超過(guò)任何其它酵母； 2.對(duì)乙醇、單寧、S02抵抗力強(qiáng)；3.能生成更多的乙醇；4.釀造出的石榴干酒 酒香突出，易長(zhǎng)期保存；5.繁殖培養(yǎng)容易，由一菌株發(fā)出，就能逐步擴(kuò)大培養(yǎng) 制造出釀造所需的酒母。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明-l.取懷遠(yuǎn)地區(qū)瑪瑙石榴園的土壤，瑪瑙石榴葉表皮，石榴樹(shù)腐朽樹(shù)皮及腐 爛石榴和完整石榴的表皮，每種樣品各10克，分別放入裝有80毫升無(wú)菌水的 250毫升三角瓶中。離心機(jī)120轉(zhuǎn)/分，旋轉(zhuǎn)30分鐘后，取0.2毫升涂布在平皿 上，平皿基用98%的無(wú)菌石榴汁和2%的瓊脂制作，3個(gè)平行樣品，從上述平 皿中挑選典型菌落，再通過(guò)平皿進(jìn)行分離純化，選育出直徑大、活力強(qiáng)、純度高的酵母菌，接種斜面培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的制備方法為澄清石榴汁90%、蛋
白胨2%、葡萄糖5%、酵母膏1%、瓊脂2%， 115'C滅菌30分鐘。
2. 取實(shí)驗(yàn)室保存的法國(guó)拉曼公司生產(chǎn)的DV10果酒活性干酵母lg，用35°C 水100毫升進(jìn)行活化后，取0.1毫升接種于斜面培養(yǎng)基中，28r培養(yǎng)一天。
3. 將上述培養(yǎng)的兩種菌接種在培養(yǎng)基斜面上，3(TC培養(yǎng)一天；再接種重復(fù) 培養(yǎng)兩次；將活化的酵母菌斑用接種針挑取適量接種到殺過(guò)菌的石榴汁97%， 蛋白胨2%，酵母膏1%的溶液中，35°C， 250轉(zhuǎn)/分鐘搖床震蕩培養(yǎng)10-12小 時(shí)，此時(shí)可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
4. 取上述活化的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌液(濃度為2Xl()7個(gè)/毫升)5毫 升，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘得到菌體。
配制磷酸緩沖液、預(yù)處理劑和蝸牛酶磷酸緩沖液(0.2mol/L NaH2P04 92 毫升和0.2moL/L NaH2P04 8毫升，PH二5.8)。預(yù)處理劑(100毫升磷酸緩沖液中 加0. l毫升EDTA和O. 1毫升P-巰基乙醇)。蝸牛酶(92毫升的0. 2moL/L NaH2P04 和8毫升的0. 2moL/L NaHP04，加17g蔗糖，稀釋成濃度為1. 5%的溶液,用0. 22um 濾膜過(guò)濾除菌)。用磷酸緩沖液洗菌體2次，加3毫升預(yù)處理劑29。C培養(yǎng)10 分鐘。再經(jīng)3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，得到一種原生質(zhì)體；用蝸 牛酶處理30-45分鐘得另一種原生質(zhì)體。
5. 將兩種原生質(zhì)體進(jìn)行種內(nèi)和種間融合。
a. 兩種原生質(zhì)體各取0. 5毫升等量混合，離心；用0.4mol/L CaCh洗滌、 離心，后涂于培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)3天。
b. 培養(yǎng)3天后用電擊儀進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間40分鐘，條件為5KV/cm， 25MF 和200 Q 。
6. 取5毫升菌液于直徑9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm處照射1 分鐘，同時(shí)攪拌，然后在紅光下稀釋涂布在誘變培養(yǎng)基中；誘變培養(yǎng)基用培養(yǎng)基 加0.2X的LiCl制成。
7. 石榴專用酵母菌制備取澄清的石榴汁，調(diào)整糖度12-14%, ra:5-6，加 瓊脂2-2.5%，加熱至90-95"C溶化，分裝于預(yù)先洗凈、干熱殺菌的試管中，每 管裝量以制成斜面后約占試管長(zhǎng)度的1/3為宜，塞上棉塞，在115。C高溫鍋內(nèi)殺 菌30-40分鐘，殺菌后趁熱制成斜面，冷凝后置于28-3(TC恒溫箱中培養(yǎng)3天。再將該菌種移植到斜面培養(yǎng)基上，在28-30。C恒溫箱中培養(yǎng)3天，取出放在一IO 'C以下的冰箱中保存。5日后再移植培養(yǎng)，存入一7(TC以下的專用菌種培養(yǎng)箱中 貯存。使用時(shí)取出擴(kuò)大培養(yǎng)即可得到符合生產(chǎn)工藝的要求優(yōu)質(zhì)石榴酒酵母。命 名為CG-01石榴酒專用酵母菌。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，凡 在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種石榴酒酵母的選育方法，包括下列步驟(1)取石榴園的土壤、石榴樹(shù)葉、石榴樹(shù)皮、腐爛石榴、完整石榴的表皮各10重量份，放入裝有80份水的瓶中，離心機(jī)旋轉(zhuǎn)30分鐘，120轉(zhuǎn)/分；取0.2毫升接種到用98％的無(wú)菌石榴汁和2％的瓊脂制作的營(yíng)養(yǎng)基中；(2)取果酒干酵母1g，用35-40℃水100毫升活化后，取0.1毫升接種于培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)一天；(3)將上述(1)、(2)兩種菌種接在培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)一天；將培養(yǎng)后的酵母菌斑接種到用石榴汁97％，蛋白胨2％，酵母膏1％殺菌制成的溶液中，35℃，250轉(zhuǎn)/分搖床震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)；(4)取(3)菌液5毫升，3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用磷酸緩沖液洗2次，加3毫升預(yù)處理劑，29℃培養(yǎng)10分鐘后，離心5分鐘，3500轉(zhuǎn)/分，棄去上清液；(5)取(3)所得菌液5毫升用蝸牛酶處理30-40分鐘；(6)取(4)、(5)所得菌液各0.5毫升混合，用0.4mol/L Cacl2洗滌、離心，涂于培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3天；用電擊儀電擊，電擊時(shí)間40分鐘；(7)取5毫升電擊后菌液置于直徑9cm的平皿中，用20W紫外光管放于30cm處照射1-2分鐘，并不斷攪拌，稀釋涂布誘變培養(yǎng)基中；(8)取澄清的石榴汁，調(diào)整糖度12-14％，PH5-6，加瓊脂2-2.5％，加熱至90-95℃溶化，分裝于試管中，塞上棉塞，115℃高溫殺菌30-40分鐘；冷凝后制成酵母培養(yǎng)基；取(7)菌種接種到酵母培養(yǎng)基上，在28-30℃恒溫箱中培養(yǎng)3天，取出放在-10℃以下保存；數(shù)日后反復(fù)培養(yǎng)、提純，置于-70℃以下貯存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石榴酒酵母的選育方法，培養(yǎng)基為澄清石榴 汁90%、蛋白胨2%、葡萄糖5%、酵母膏1%、瓊脂2%制成；磷酸緩沖液 為92份0. 2mol/L NaH2P04和8份0. 2moL/L NaHP04 、 PH二5. 8制成;預(yù)處理 劑為100毫升磷酸緩沖液中加0. 1毫升EDTA和0. 1毫升P -巰基乙醇制成； 誘變培養(yǎng)基為培養(yǎng)基加0.2X的LiCl制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種石榴酒酵母的選育方法。現(xiàn)在使用的石榴酒酵母存在著發(fā)酵不徹底，石榴酒殘?zhí)歉摺⒕贫鹊?、揮發(fā)酸高、果香淡薄、不宜儲(chǔ)存等缺點(diǎn)。本發(fā)明根據(jù)自然界中野生酵母菌的存在，取石榴園的土壤、石榴樹(shù)葉、石榴樹(shù)皮、腐爛石榴、完整石榴的表皮加水離心分離培養(yǎng)；取果酒干酵母，用水活化培養(yǎng)；再將上述兩種菌種接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)；經(jīng)緩沖液沖洗、蝸牛酶處理、電擊、紫外光照射誘變，最后經(jīng)酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)制成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是酵母發(fā)酵力強(qiáng)，超過(guò)任何其它酵母；對(duì)乙醇、單寧、SO₂抵抗力強(qiáng)；能生成更多的乙醇；釀造出的石榴干酒酒香突出，易長(zhǎng)期保存；酵母繁殖培養(yǎng)容易。
文檔編號(hào)C12N1/16GK101302481SQ20081001718
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者張家訓(xùn), 杰 李 申請(qǐng)人:安徽省成果石榴酒釀造有限公司