專利名稱：一種牛冷凍精液稀釋液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域.，涉及動物精液的超低溫冷凍保存，特別涉及 一種牛冷凍精液稀釋液及其制備方法。
背景技術(shù)：
牛精液冷凍保存與人工受精技術(shù)的結(jié)合在現(xiàn)代養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著極其 重要的作用，應(yīng)用冷凍精液進行人工受精可以不受時間、地域、牛品種及個 體體格的限制，并且大量減少公牛的飼養(yǎng)數(shù)量，降低生產(chǎn)成本，提高優(yōu)良種公牛的利用率，為養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。同時，牛精液冷凍技術(shù)的發(fā)展和牛冷凍精液的使用在牛品種引進、雜交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及牛遺傳多樣性保護方面具有重要的意義。稀釋液在冷凍精液的制作過程中是必不可少的成分，可以補充精子的營養(yǎng)，減少精液黏稠度，降低異物對精子的影響，同時緩和代謝產(chǎn)物的危害作用；另外還能夠保護精子，增強其抵抗低溫打擊和抗氧化的能力，減少冷凍所造成的損傷。目前，在冷凍精液的制作過程中，常常選擇易于抑制精子活動，減少能量消耗，延長精子壽命的弱酸性稀釋液。通常選用葡萄糖、檸檬酸鈉、卵黃、甘油、抗生素等作為稀釋液的主要成分。其中添加卵黃的目的是為了降低在向5 。C降溫過程中精子遭受冷休克的受損程度，但是，卵黃中并不是所有成分都對精子有益，其中某些成分可抑制精子呼吸，降低精子活率，如高密度脂蛋白。卵黃中對精子起保護作用的有效成分則是磷脂和低密度脂蛋白，如果在稀釋液中用低密度脂蛋白替代卵黃，則可提高冷凍一解凍 后精子質(zhì)量。在我國，盡管近幾年來牛精液冷凍技術(shù)有了一定的發(fā)展，冷凍精液廣泛應(yīng)用，但是目前使用的牛冷凍精液活率仍然很低， 一般在36%左右(我國牛冷 凍精液活率標準為30。％)，遠遠低于國外所使用的活率標準(50% 60%)。 由于我國牛冷凍精液活率較低，人工授精后母牛的情期配種率低，受胎率低， 從而嚴重影響了我國牛冷凍精液的進一步推廣應(yīng)用及生產(chǎn)效率的提高。 發(fā)明內(nèi)容針對目前我國牛精子冷凍后活率相對較低的缺陷，本發(fā)明的目的在于提 供一種牛冷凍精液稀釋液，應(yīng)用該稀釋液冷凍牛精液解凍后活率達到50% 68%的效果，大大的提高了我國牛冷凍精液生產(chǎn)效率。實現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案是一種牛冷凍精液稀釋液，其特征在于，該 100 ml稀釋液中各原料的用量為果糖0.8 1.2g、檸檬酸鈉1.4 1.6g、TRIS2.3 2.6g、低密度脂蛋白7.5 9.5 g、甘油5 8ml、青霉素8.5 12萬IU、余量為蒸餾水。本發(fā)明的最佳配方該100ml稀釋液中各原料的用量為果糖l.Og、檸檬酸鈉L48g、 TRIS 2.42 g、低密度脂蛋白7.5 9.5 g、甘 油6.4ml、青霉素10萬IU、余量為蒸餾水。本發(fā)明所述的低密度脂蛋白是提取于新鮮雞蛋的卵黃。本發(fā)明還有一個目的是提供制備上述牛精液冷凍稀釋液的方法，其特征在于，包括下列步驟1)稱取各種原料果糖、檸檬酸鈉、TRIS、青霉素G鈉、甘油、低密度脂蛋白、蒸餾水備用；2) 將所述量的果糖、檸檬酸鈉、TRIS用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3) 在步驟2)所配置的基礎(chǔ)液中添加所述量的青霉素G鈉和低密度脂蛋 白配制成I液；4) 在步驟3)所配置的I液中加入所述量的甘油制成II液；5) 用酸或堿調(diào)整pH值為6 7.5，然后進行過濾滅菌，冷卻至室溫，放 入2 5 。C冰箱中備用。(本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)出來的只有一種產(chǎn)品II.液，但是后邊使用方法中卻是先使用I液，后使用II液，這樣寫上—F文不一致)說明最終產(chǎn)品是II液，但首先要配置I液，前面交代清楚了，應(yīng)該沒有問題。本發(fā)明在國內(nèi)首次將低密度脂蛋白添加到基礎(chǔ)冷凍液中，進行牛精液的 冷凍保存，獲得了良好的效果，解凍后精子的存活率大大提高，顯著提高了 精液品質(zhì)，該發(fā)明進一步拓展了超低溫生物學(xué)研究的范圍，為超低溫保護材 料提供了新的途徑。該方法無論在超低溫生物學(xué)領(lǐng)域，還是在動物繁殖生產(chǎn) 方面，均具有其創(chuàng)造性和實用性。
具體實施方式
下面結(jié)合發(fā)明人給的產(chǎn)品制備方法實施例、使用方法實施例來進一步說 明本發(fā)明的有益效果，但是本發(fā)明的保護范圍不僅限于此。實施例l低密度脂蛋白的提取工藝新鮮蛋黃收集后，先用等滲鹽溶液(0.17 M NaCl， w/v)將卵黃稀釋2 3 倍，并不斷攪拌lh，然后在4 。C的環(huán)境下10,000xg離心45 min后，將上清液與沉淀物分離。為避免蛋黃中所含有的小顆粒物的干擾，同樣條件下再次 離心所分離出的上清液。將二次離心后收集的上清液與40%的硫酸銨溶液混合，在4。C的環(huán)境下充分攪拌lh后，混合物離心45min (10,000xg， 4°C)， 使溶液分層，以沉淀卵黃蛋白。離心后，棄去沉淀物，將上清液(漂浮物) 用蒸餾水透析12h，以除去溶液中的硫酸銨。在硫酸銨從溶液中完全去除后， 再次將溶液離心45min (10,000xg， 4°C)，所殘余的漂浮即為LDL，其純度 一般可達97%。實施例2牛冷凍精液稀釋液的制備方法用電子分析天平準確稱取l.Og果糖、1.48g檸檬酸鈉、2.42gTRIS，將其 溶解于50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成100ml基礎(chǔ)液。在 基礎(chǔ)液中添加10萬IU的青霉素G鈉和8g低密度脂蛋白配制成I液；在I液 添加6.4ml的甘油配制成II液。再用精密pH計調(diào)整pH為6. 37，然后用0. 22 ym的濾膜進行過濾，放入2 5。C冰箱中備用。I、 1I液需現(xiàn)用現(xiàn)配。.實施例3牛冷凍精液稀釋液的制備方法用電子分析天平準確稱取0.5g果糖、2g檸檬酸鈉、1.5gTRIS，將其溶解 于50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成100ml基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ) 液中添加5萬IU的青霉素G鈉和5g低密度脂蛋白配制成I液；在I液添加 8ml的甘油配制成n液。再用精密pH計調(diào)整pH為6.4，然后用0.22iim的濾 膜進行過濾，放入2 5匸冰箱中備用。I、 II液需現(xiàn)用現(xiàn)配。實施例4牛冷凍精液稀釋液的制備方法用電子分析天平準確稱取1.5g果糖、lg檸檬酸鈉、3g TRIS，將其溶解 于50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成100ml基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ)液中添加12萬IU的青霉素G鈉和10g低密度脂蛋白配制成I液；在I液添 加5ml的甘油配制成II液。再用精密pH計調(diào)整pH為6.2 6. 5，然后用0. 22 um的濾膜進行過濾，放入2 5。C冰箱中備用。I、 n液需現(xiàn)用現(xiàn)配。 試驗例以荷斯坦奶牛精液冷凍保存進行說明。(一) 冷凍稀釋液的配制用電子分析天平準確稱取l.Og果糖、1.48g檸檬酸鈉、2.42gTRIS，將其 溶解于50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成100ml基礎(chǔ)液。在 基礎(chǔ)液中添加10萬IU的青霉素G鈉和8g的低密度脂蛋白配制成I液；在I 液添加6.4ml的甘油配制成II液。再用精密pH計調(diào)整pH為6.37，然后進行 過濾滅菌，冷卻至室溫，放入2 5。C冰箱中備用。I、 II液需現(xiàn)用現(xiàn)配。(二) 精液的采集利用假陰道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在37.5 。C下鏡檢， 觀察精子活力，并用分光光度計在550nm處進行比色，計算精子密度。所采 集的精液為乳白色或乳黃色，無異味，精子形態(tài)正常，密度正常，活力在0.7 以上的方可用于制作細管冷凍精液。(三) 精液冷凍1. 將用含有甘油的II液稀釋的精液快速裝管(0. 25ml細管)，封口完畢 后在5"C冰箱或恒溫箱中平衡1. 5 2h。2. 平衡完畢后，裝細管轉(zhuǎn)移至冷凍室進行冷凍。先用程序冷凍儀冷凍， 其程序是按照3。C/min降溫的速度，從5。C降溫至一6。C。3. 細管精液經(jīng)過程序冷凍儀降溫至一6'C后，將細管迅速從冷凍儀中取 出，放置在離液氮液上方2 3cm處快速降溫，其降溫速率是一14(TC/ min，然后迅速投入液氮冷凍保存。(四)細管凍精的解凍及精液品質(zhì)評定將超低溫冷凍的細管從液氮中迅速取出后，投入36 4(TC水域中30秒， 然后將精液與PBS液混合，在37°C的溫度下評定精液質(zhì)量指標。1. 用偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(WLJY-9000)測定精子的各種運動相 關(guān)參數(shù)。包括精子活率、活力、前向性(STR)、直線性(L工N)、曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、側(cè)擺幅度(ALH)、鞭打頻率(HZ)、擺動性(W0B)、 平均路徑速度(VAP)、平均移動角度(MAD)以及a、 b、 c、 d四級精子的百 分率等；2. 采用FITC標記的花生凝集素染色后用熒光顯微鏡檢測冷凍一解凍后 精子頂體的完整性。將解凍后的細管精液用37'C的PBS溶液稀釋，調(diào)整精子 密度，用移液槍吸取30叱精液涂片，自然干燥后，室溫下用甲醇固定10min， 然后在每個精液涂片上分別滴上FITC-PNA染液，于37"C、黑暗潮濕環(huán)境下孵 育。之后用PBS液沖洗，自然干燥后滴加增光劑，蓋上蓋玻片，再用無色指 甲油封片。用熒光顯微鏡檢查精子的頂體狀況，并用數(shù)碼相機拍照。3. 利用低滲膨脹試驗(HOST)檢查精子質(zhì)膜的完整性。用移液槍吸取 精液樣品與低滲溶液混合，在37 。C下孵育30 min后，取15 pL精液樣品于 血細胞計數(shù)板上，400X倒置顯微鏡下觀察不同部位的5個視野，根據(jù)精子是 否呈現(xiàn)巻尾來判斷質(zhì)膜的完整性。(六)評定結(jié)果應(yīng)用本發(fā)明的冷凍稀釋液以及精液的冷凍一解凍方法，其評定結(jié)果如下: 1.冷凍一解凍后精子活率達50 68%以上；2. 冷凍一解凍后精子直線運動速度達30 35txm/s;精子直線性達55% 以上；精子平均路徑速度達35 38um/s; a級精子的百分率達到35%以上；3. 精子的頂體完整率達72%以上；4. 精子的質(zhì)膜完整率達55%以上。
權(quán)利要求
1.一種牛冷凍精液稀釋液，其特征在于，該100ml稀釋液中各原料的含量為果糖0.8～1.2g、檸檬酸鈉1.4～1.6g、TRIS2.3～2.6g、低密度脂蛋白7.5～9.5g、甘油5～8ml、青霉素8.5～12萬IU、余量為蒸餾水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的所述牛冷凍精液稀釋液，該100ml稀釋液中各原 料的含量為果糖1 .Og、檸檬酸鈉1.48g、 TRIS 2.42 g、低密度脂蛋白8.0 g、甘油6.4ml、青霉素10萬IU、余量為蒸餾水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述牛冷凍精液稀釋液，其特征在于，所述的低 密度脂蛋白是提取于新鮮雞蛋的卵黃。
4. 制備權(quán)利要求1所述的牛精液冷凍稀釋液的方法，其特征在于，包 括下列步驟1) 稱取各種原料果糖、檸檬酸鈉、TRIS、青霉素G鈉、甘油、低密度 脂蛋白、蒸餾水備用；2) 將所述重量的果糖、檸檬酸鈉、TRIS用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3) 在步驟2)所配置的基礎(chǔ)液中添加所述量的青霉素G鈉和低密度脂 蛋白配制成I液；4) 在步驟3)所配置的I液中加入所述量的甘油制成II液；5) 用酸或堿調(diào)整pH值為6 7.5，然后進行過濾滅菌,冷卻至室^a，放入2 5 x:冰箱中備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛冷凍精液稀釋液，該100ml稀釋液中各原料的用量為果糖0.8～1.2g、檸檬酸鈉1.4～1.6g、TRIS 2.3～2.6g、低密度脂蛋白7.5～9.5g、甘油5～8ml、青霉素8.5～12萬IU、余量為蒸餾水。其制備方法是將果糖、檸檬酸鈉和TRIS溶于蒸餾水中配制成基礎(chǔ)液；在基礎(chǔ)液中加入青霉素G鈉和低密度脂蛋白配制成I液；在I液中添加甘油即配制成II液；再調(diào)pH值為6～7.5，然后進行過濾滅菌，冷卻至室溫，放入2～5℃冰箱中備用。本發(fā)明的牛冷凍精液稀釋液效果良好且可靠，能夠為牛人工受精提供高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)細管冷凍精液，具有十分廣闊的市場應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/06GK101220345SQ20081001738
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者李青旺, 江中良, 胡建宏, 趙宏偉 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)