專利名稱：酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種？L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，特別是涉及一種利用Y-谷氨酰 轉(zhuǎn)肽酶的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法。
技術(shù)背景Y-L-谷氨酰-L-半胱氮酸是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時(shí)含有 Y-谷氨?；蛶€基的具有生物活性的二肽化合物，是生物體內(nèi)的非蛋白巰基化合物谷胱 甘肽的前體化合物，在醫(yī)藥、食品和保健品領(lǐng)域具有廣泛的用途。同半胱氨酸和谷胱甘 肽相比，，L-谷氨酰-L-半胱氨酸能更加有效的提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度，所以醫(yī)學(xué)上用 于抗氧化衰老、解毒保肝、治療白內(nèi)障等疾病。在食品方面可以強(qiáng)化食品的風(fēng)味防止食 品的褐變等。目前，L-谷氨酰-L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法制 備Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸由于涉及六個(gè)功能基團(tuán)的保護(hù)和脫保護(hù)，所以合成路線較長(zhǎng)， 容易產(chǎn)生消旋體，同時(shí)大量有機(jī)溶劑會(huì)污染環(huán)境；而發(fā)酵法制備？L-谷氨酰-L-半胱氨酸 主要有以下不足產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率較低、發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、下游分離難度大、設(shè)備成本 高。近年來(lái)，隨著對(duì)，L-谷氨酰-L-半胱氨酸研究的深入，Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸在醫(yī)學(xué)、 食品、保健等方面越來(lái)越引起人們的重視。？L-谷氨酰-L-半胱氨酸生產(chǎn)市場(chǎng)需求正迅速 擴(kuò)大，抓緊開(kāi)發(fā)研制并投入生產(chǎn)已是現(xiàn)在Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的研究熱點(diǎn)。專利號(hào)為WO2006102722名稱為"Process For the Production Of y-Glutamylcysteine" 公開(kāi)了一種酶法合成，L-谷氨酰-L-半胱氨酸及其類似物的方法。該方法利用，谷氨酰轉(zhuǎn) 肽酶、蛋白酶、脂肪酶和水解酶等酶將谷氨酰基從谷氨?；w化合物轉(zhuǎn)移到谷氨酰基 受體化合物(L-半胱氨酸及其類似物)從而制得？L-谷氨酰-L-半胱氨酸及其類似物。該 方法的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)條件溫和，立體專一性強(qiáng)，谷氨酰胺不需要側(cè)鏈的保護(hù)，反應(yīng)過(guò)程 中不消耗ATP。但是該方法采用的底物經(jīng)過(guò)基團(tuán)衍生后水溶性較強(qiáng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的后處理及分離純化 難以通過(guò)離子交換-結(jié)晶分離的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，這限制了該方法的推廣使用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效利用Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成，L-谷氨酰-L-半胱氨酸的 酶學(xué)方法，以便于后續(xù)結(jié)晶分離過(guò)程，減少生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法包括如下步驟1、 利用化學(xué)法合成底物S-芐基-L-半胱氨酸；2、 將Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶加入到底物S-芐基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中， S-芐基-L-半胱氨酸的起始質(zhì)量百分比為反應(yīng)物總質(zhì)量的1.46~2.92%， L-谷氨酰胺的起始 質(zhì)量百分比為反應(yīng)物總質(zhì)量的0.5~2%，，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的加入體積為底物混合水溶液體 積的0.5~10%，反應(yīng)pH為9.0~11.0，反應(yīng)溫度為35~45'C，反應(yīng)時(shí)間為2~5小時(shí)；3、 將反應(yīng)得到的S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸分離，濃縮，結(jié)晶；4、 將S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-芐基去除，得，L-谷氨酰-L-半胱氨酸。 步驟1中，化學(xué)法合成S-芐基-半胱氨酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。底物L(fēng)-半胱氨酸的巰基用芐基保護(hù)后，降低了它們?cè)谒械娜芙舛?，有利于后續(xù)分離過(guò)程通過(guò)結(jié)晶 實(shí)現(xiàn)，減少生產(chǎn)成本。S-芐基-L-半胱氨酸的其余官能團(tuán)無(wú)需保護(hù)，可促進(jìn)底物與酶中心 的結(jié)合從而強(qiáng)化反應(yīng)過(guò)程，有利于底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。步驟2中，反應(yīng)底物起始濃度高，有利于酶反應(yīng)。其反應(yīng)方程式如下步驟2中，，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶優(yōu)選純的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，純度大于95%，其加入體積 為底物混合水溶液體積的1%，例如一個(gè)20ml反應(yīng)體積的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，只要加0.21111酶液 即可，比沒(méi)有純化的酶用量要少得多。上述，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶可通過(guò)如下方法制備a、 常規(guī)方法培養(yǎng)5fld/^wto7/"NX-2 ，發(fā)酵產(chǎn)？谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。b、 利用蛋白分離純化系統(tǒng)制備Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。步驟a中，產(chǎn)酶微生物枯草芽孢桿菌wto'/fc NX-2 (保藏號(hào)為CGMCC No . 0833 )的培養(yǎng)為以單糖或雙糖作為碳源，如葡萄糖、蔗糖或麥芽糖；氮源以有機(jī)氮源為佳，效果最好的是玉米漿和酵母膏。該菌是好氧培養(yǎng)菌，在pH8 9、溫度30 4(TC 的通氣條件下，生長(zhǎng)良好。在發(fā)酵時(shí)使用液體培養(yǎng)， 一般發(fā)酵周期在20 30小時(shí)。步驟b中，可采用AKTA explorer 100蛋白純化儀(AmershamPhannacia公司生 產(chǎn))分離純化Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，該純化方法利用儀器，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，屬 于一般的分離純化過(guò)程，依照該系統(tǒng)的使用手冊(cè)即可進(jìn)行操作。步驟3中，可以利用蛋白分離純化系統(tǒng)將反應(yīng)得到的S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨 酸進(jìn)行分離。步驟4中，可以利用三氟甲磺酸進(jìn)行脫芐反應(yīng)去除S-芐基-Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸 中的芐基，反應(yīng)溫度為40 5(TC，反應(yīng)時(shí)間為0.5 1小時(shí)。利用三氟甲磺酸進(jìn)行脫芐法 可參考文獻(xiàn)[Haruaki Yajima， et al. Trifluoromethanesulphonic Acid， as a Deprotecting Reagent in P印tide Chemistry. J.C.S.CHEM.CO函.，1974,107]。本發(fā)明的有益效果如下1、 本發(fā)明采用S-芐基-L-半胱氨酸為反應(yīng)底物之一，L-半胱氨酸的巰基用芐基保護(hù)，降低了它們?cè)谒械娜芙?，有利于后續(xù)分離過(guò)程通過(guò)結(jié)晶來(lái)實(shí)現(xiàn)，減少生產(chǎn)成本。2、 本發(fā)明采用，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化L-谷氨酰胺與S-芐基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，僅 需一步就可以得到S-芐基i-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，收率較高。與化學(xué)合成法相比，不 需對(duì)游離羧基和氨基進(jìn)行保護(hù)與脫除，反應(yīng)過(guò)程中也不會(huì)產(chǎn)生消旋體。3 、本發(fā)明采用的，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是通過(guò)分離純化得到的精制酶，反應(yīng)在堿性的水 溶液中進(jìn)行，促進(jìn)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，提高轉(zhuǎn)化率(詳見(jiàn)實(shí)施例轉(zhuǎn)化效果)。4 、本發(fā)明采用的S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸的下游分離，采用離子交換和結(jié) 晶操作，方法簡(jiǎn)單，成本低，便于放大，可用于工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。 實(shí)施例1:取蔗糖15g ，玉米漿30g ，蛋白胨15g ， K2HPO415g,MgSO40.5g,pH7.5加自 來(lái)水配制成1L液體培養(yǎng)基，按此配方配制3.5L裝入5L發(fā)酵罐中O.lMPa高壓蒸汽滅 菌25分鐘備用。同時(shí)分裝50mL培養(yǎng)基到500mL ，加8層紗布，用牛皮紙包好后， 與發(fā)酵罐一起滅菌備用。將冰箱內(nèi)保存的菌種——枯草芽抱桿菌5ad//^ wto7/" NX-2 (保藏號(hào)為CGMCC No.0833 )取出后，接在新鮮斜面培養(yǎng)基(斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨IO ，牛肉膏 3,NaC15 ，瓊脂20 )上，活化培養(yǎng)24小時(shí)，接入種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，玉米槳IO，蛋白胨IO， K2HP042， MgSO40.25 )在33。C、 220r/min振蕩 培養(yǎng)20小時(shí)。i咅養(yǎng)結(jié)束接入發(fā)酵罐，于33'C、 200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)40小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，8000 r/min離心25分鐘，收集上清液。以60%~90%飽和度的硫酸銨 梯度進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀，分離出的蛋白用等體積Tris-HCl (pH8.0,0.05mol/L)復(fù)溶， 用疏水層析分離，收集30%洗脫液(pH8.0， 0.05mol/LTris-HCl )濃度處的洗脫峰， 10萬(wàn)分子量的透析袋透析過(guò)夜，PEG20000濃縮，再用DEAE離子交換層析，收率20 %~75 %洗脫液(pH8.0， 0.05mol / L Tris-HCl， 0.5mol / L NaCl)(約25min )梯度洗脫 處第一個(gè)洗脫峰得到純的(純度>95%) Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(比活為59.6U/mg蛋白)。(疏 水層析及DEAE離子交換層析的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù))。取15.7g(0.1mol)L-半胱氨酸鹽酸鹽溶解，冷卻至0 5'C后，通過(guò)恒流泵流加165ml 氯化芐的乙醇溶液(氯化芐乙醇=9: 1 (V/V))，控制反應(yīng)溫'度在5'C左右。流加結(jié)束 后，室溫繼續(xù)反應(yīng)約2小時(shí)，然后調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH值5.50，過(guò)濾、洗滌、干燥、得到 結(jié)晶——S-芐基-L-半胱氨酸，產(chǎn)品192g，純度約98.2%，熔點(diǎn)為210 2irC。 實(shí)施例2:Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備及純化方法、底物S-芐基-半胱氨酸的制備方法同實(shí)施例l 。取0 .146g"L-谷氨酰胺，S-芐基-半胱氨酸0 .42g ，以Tris -HC1 (pH 10， 0. lmol /L) 溶解并定容至20mL，再力卩0.2ml的？谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，混合均勻后，攪拌反應(yīng)3小時(shí)， 反應(yīng)溫度為4(TC 。反應(yīng)結(jié)束后，用高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測(cè)(色譜分離條件色譜 柱為KromasilKRl00 5u C18;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;流動(dòng)相為60% KH2P04緩沖液(20 mmol/L), 40%甲醇；流速lmL/min)，對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為27% 。酶催化Y-L-谷氨酰胺，S-芐基-半胱氨酸合成S-芐基-Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的反應(yīng) 結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)超濾除去酶，再用AKTATM explorer 100蛋白純化儀分離純化(色 譜分離條件色譜柱Q Sepharose離子交換柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm;流動(dòng)相為分別為A: pH8.5， 0.05mol/L Tris-HCl ， B: pH8.5， 0 .05mol / L Tris-HCl + lmol / LNaCl;流速 6ml/min; 30min梯度洗脫0~35%B)收集ll~13min洗脫液，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮冷卻 結(jié)晶，即可得產(chǎn)品S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸，回收率94%，純度98%。將l.Og S-芐基-Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸加入到50ml純?nèi)谆撬?TFMSA)中，在 40'C下反應(yīng)0.5小時(shí)，然后用lmol/L的NaOH中和反應(yīng)液到pH 6—7，加l.Og的二硫 蘇糖醇(DTT)在5(TC下反應(yīng)1小時(shí)，還原氧化態(tài)的二聚體。最后利用反相色譜分離純 化還原型Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(色譜分離條件色譜柱Hypersil300AC185pm;檢 測(cè)波長(zhǎng)為214nm;流動(dòng)相A為95%水(含0.1%三氟乙酸)，B為5%甲醇；流速6mL/min)收集7 8min洗脫液，冷凍干燥，可得粉狀的？L-谷氨酰-L-半胱氨酸0.6g，收率 為82%，純度為98%。(反相色譜的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)) 實(shí)施例3:Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備及純化方法、底物S-芐基-半胱氨酸的制備方法同實(shí)施例1 。取0.29g L-谷氨酰胺，S-芐基-半胱氨酸0 .41g，以Tris-HCl(pHlO， 0. lmol/L) 溶解并定容至20mL，再加0,2ml的，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，混合均勻后，攪拌反應(yīng)4小時(shí)， 反應(yīng)溫度為37'C 。反應(yīng)結(jié)束后，用高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測(cè)(色譜分離條件色譜 柱為Kromasil KR100 5u C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流動(dòng)相為60% KH2P04 (20 mmol/L)， 40%甲醇；流速lmL/min)，對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為25.6%。酶催化L-谷氨酰胺，S-芐基-半胱氨酸合成S-芐基-Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的反應(yīng)結(jié) 束后，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)超濾除去酶，再用AKTATM explorer 100蛋白純化儀分離純化(色譜 分離條件色譜柱Q S印harose離子交換柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm;流動(dòng)相為分別為A: pH8.5， 0 .05mol/LTris-HCl; B: pH8.5， 0 .05mol/LTris-HCl +lmol/LNaCl;流速 6ml/min;梯度洗脫為30min 0~35%B)收集U 13min洗脫液，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮冷卻 結(jié)晶，即可得產(chǎn)品S-芐基-Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，回收率95%，純度98%。將1.2g S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸加入到60ml純?nèi)谆撬?TFMSA)中，在 5(TC下反應(yīng)0.5小時(shí)，然后用lmol/L的NaOH中和反應(yīng)液到pH 6~7，加2.5g的二硫蘇 糖醇(DTT)在5(TC下反應(yīng)1小時(shí)，還原氧化態(tài)的二聚體。然后利用反相色譜分離純化 還原型Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(色譜分離條件色譜柱為Hypersil300Ad8 5nm;檢測(cè) 波長(zhǎng)為214nm，流動(dòng)相為A: 95%的水(含0.1%三氟乙酸)；B: 5%甲醇；流速6mL/ min)收集7 8min洗脫液，冷凍減壓干燥，可得粉狀的？L-谷氨酰-L-半胱氨酸0.73g， 收率為83%，純度為98%。(反相色譜的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù))。
權(quán)利要求
1、一種酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)利用化學(xué)法合成底物S-芐基-L-半胱氨酸；(2)將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶加入到底物S-芐基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中， S-芐基-L-半胱氨酸的起始質(zhì)量百分比為反應(yīng)物總質(zhì)量的1.46～2.92％，L-谷氨酰胺的起始質(zhì)量百分比為反應(yīng)物總質(zhì)量的0.5～2％，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的加入體積為底物混合水溶液體積的0.5～10％，反應(yīng)pH為9.0～11.0，反應(yīng)溫度為35～45℃，反應(yīng)時(shí)間為2～5小時(shí)；(3)將反應(yīng)得到的S-芐基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸分離，濃縮，結(jié)晶；(4)將S-芐基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-芐基去除，得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸方法，其特征在于所述 Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的純度大于95%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸方法，其特征在于，谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶的加入體積為底物混合水溶液體積的1%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸方法，其特征在于所述的，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶通過(guò)下述方法制備(1) 常規(guī)方法培養(yǎng)Bad/^;ywto7toNX-2 ，發(fā)酵產(chǎn)i谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；(2) 利用蛋白分離純化系統(tǒng)制備，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于步 驟(3)中，利用蛋白分離純化系統(tǒng)將反應(yīng)得到的S-芐基-，L-谷氨酰-L-半胱氨酸進(jìn)行分離。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶法合成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于步 驟(4)中，利用三氟甲磺酸進(jìn)行脫芐反應(yīng)將S-芐基- L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-芐基去除， 反應(yīng)溫度為40~50 °C，反應(yīng)時(shí)間為0.5~1小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，包括利用化學(xué)法合成底物S-芐基-L-半胱氨酸；將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶加入到底物S-芐基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中反應(yīng)；將反應(yīng)得到的S-芐基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸分離，濃縮，結(jié)晶；將S-芐基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-芐基去除，得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。利用本方法操作簡(jiǎn)單，成本低，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101215588SQ20081001935
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日
發(fā)明者治 周, 忠 姚, 虹 徐, 松 李, 荀志金, 萍 韋 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)