專利名稱：：抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物藥物篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法。
背景技術(shù)：
：近年來，由于植物資源的匱乏，而植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生某些特殊生理活性物質(zhì)，因此國(guó)內(nèi)外藥學(xué)家們對(duì)內(nèi)生菌的研究廣泛關(guān)注。在植物內(nèi)生菌的分離過程中，用到的消毒方法主要有物理消毒法和化學(xué)消毒法，化學(xué)消毒劑的選擇上存在幾種組合75%酒精；75%酒精+升汞；75%酒精+次氯酸鈉。因?yàn)橄静粡氐?，所以選用物理消毒法和單獨(dú)選擇酒精作為消毒劑的較少。后兩者組合是常用的，國(guó)外學(xué)者多采用75%酒精+次氯酸鈉這個(gè)組合，主要考慮到次氯酸鈉，較之升汞，無毒。但這個(gè)組合通常不如75%酒精+升汞這個(gè)組合消毒徹底，而且對(duì)外植體處理時(shí)間較長(zhǎng),也容易引起內(nèi)生菌死亡。國(guó)內(nèi)學(xué)者常使用75%酒精+升汞這一消毒劑組合進(jìn)行表面消毒，但因研究者的喜好不同，宿主植物的種類以及宿主組織類型的不同，這個(gè)組合也不盡相同。因此，一個(gè)快速有效的化學(xué)消毒組合，對(duì)內(nèi)生菌的分離是至關(guān)重要的。植物內(nèi)生菌的抗菌抗腫瘤活性，許多科學(xué)家進(jìn)行了深入的研究，并得到了一系列活性單體，而通過優(yōu)化的表面消毒方法，研究香樟、狹葉十大功勞木等植物內(nèi)生菌的抗菌抗結(jié)核活性，通過發(fā)酵獲得對(duì)人畜病原菌及人型結(jié)核分枝桿菌具有抑制作用的次生代謝產(chǎn)物，從而獲得抗菌抗結(jié)核活性菌株，這在內(nèi)生菌研究領(lǐng)域還未受到過多關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種通過優(yōu)化的化學(xué)方法從抗菌抗結(jié)核植物組織中，分離篩選出次生代謝產(chǎn)物對(duì)人畜病原菌及人型結(jié)核分枝桿菌有明顯抑制作用的內(nèi)生菌的方法，使植物內(nèi)生菌資源得到更有效的利用，從而實(shí)現(xiàn)從微生物中篩選抗菌抗結(jié)核菌株，從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中提取抗菌抗結(jié)核物質(zhì)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。1、一種抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，其特征是步驟如下(1)抗菌抗結(jié)核植物組織的準(zhǔn)備采集植物的根、莖、葉、果實(shí)等組織；(2)表面消毒與無菌檢測(cè)在無菌工作臺(tái)內(nèi)，將步驟(1)各部分組織用無菌水沖洗3次，采用75%酒精+0.1%升汞組合進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗5次后，種植于水瓊脂培養(yǎng)基中，27'C下恒溫培養(yǎng)。表面消毒的最后一次沖洗用無菌水作為空白對(duì)照；(3)植物內(nèi)生菌的分離純化將步驟(2)長(zhǎng)出的內(nèi)生菌，挑取不同形態(tài)的菌落，真菌至PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌至牛肉浸膏固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)至純后，保存于相應(yīng)的試管斜面中備用；(4)內(nèi)生真菌發(fā)酵將PDA液體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少許步驟(3)純化的內(nèi)生真菌菌絲于培養(yǎng)瓶中，置27。C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)6-7天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(5)內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵將牛肉浸膏液體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少量步驟(3)純化的內(nèi)生細(xì)菌菌落于培養(yǎng)瓶中，置37"C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)2-3天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(6)發(fā)酵液的處理向步驟(4)(5)的上清液中加入95°/。的乙醇，混合后使乙醇濃度為75%，靜置過夜，處理液4000r/min離心10—15min，取上清液，40'C減壓蒸餾，真空干燥后保存于4'C冰箱備用；(7)菌體的處理將步驟(4)(5)的菌體置于園底燒瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提兩次，4000r/min離心20min，6(TC減壓蒸餾，濃縮干燥后保存于4'C冰箱備用；(8)有效抗菌菌株篩選稱取步驟(6)(7)粉末，加入一定無菌水，使藥液濃度為10mg/ml，采用改進(jìn)K一B紙片法，通過測(cè)量菌圈大小，判斷抑制效果；(9)有效抗結(jié)核菌株篩選將10mg/ml藥液與一定改良羅氏培養(yǎng)基混合成斜面后，接種濃度為103mg/ml的人型結(jié)核分枝桿菌，接種量為O.lml。37'C培養(yǎng)，觀察菌落出現(xiàn)情況；(10)菌種的保存將步驟(7)篩選出的高抑制效率內(nèi)生菌菌株接種于25%無菌甘油中，一8(TC保存，備用。本發(fā)明步驟(2)對(duì)抗菌抗結(jié)核植物組織各部分消毒時(shí)間如下根、莖75%酒精浸泡lmin，無菌水沖洗3次，0.1%升汞漂洗1.5min;葉、果實(shí)75%酒精浸泡lmin，無菌水3次，0.1%升汞漂洗0.5-lmin。水瓊脂培養(yǎng)基組分為瓊脂1.5g，蒸餾水1000ml，PH自然。本發(fā)明步驟(3)、(4)、(5)所述的PDA培養(yǎng)基，其組分與含量為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，PH7.0左右。所述的牛肉浸膏培養(yǎng)基其組分與含量為牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，PH7.0左右。本發(fā)明(8)、(9)所述供試菌為金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單孢桿菌(ATCC27853)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)、大腸桿菌(CMCC(B)44103)、白色念珠球菌(ATCC10231)、肺炎氏鏈球菌(ATCC49619)、人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)、人型結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株等，其中的一種或幾種(以上均為人畜常見致病及流行性病原菌)。本發(fā)明步驟(8)采用的改進(jìn)K—B紙片法，是將活化好的供試菌按照麥?zhǔn)媳葷嵯♂尦?.0X106CFU，與冷卻至5(TC左右的牛肉浸膏固體培養(yǎng)基混合，待凝固后，每個(gè)培養(yǎng)基平面放四個(gè)直徑為5mm的無菌紙片，將配制好的藥液按15ul的量打入紙片，置37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。本發(fā)明步驟(9)所述改良羅氏培養(yǎng)基味精(谷氨酸鈉95%以上)7.2g，磷酸二氫鉀2.4g，硫酸鎂0.24g，檸檬酸鎂0.6g，甘油12mL，蒸餾水600mL，馬鈴薯淀粉30g，全卵液1000mL，2X孔雀綠20mL;制備法將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸鎂、味精和甘油加蒸餾水后，置沸水中中加熱溶解，將溶液從沸水浴中取出，稍冷后加入馬鈴薯淀粉，置沸水浴中繼續(xù)加熱，并不斷攪拌或搖動(dòng)，使之成均勻糊狀。取新鮮雞蛋用肥皂洗凈后置75X酒精中浸泡30min，取出后用無菌紗布擦干擊破蛋殼，將蛋黃和蛋白收集，一并收集于滅菌燒杯里，用滅菌玻棒打成均勻蛋液，用滅菌紗布過濾，收集卵液1000ml，加入降溫至60'C以下的馬鈴薯糊，并加入孔雀綠水溶液。充分混合后，分裝于滅菌試管中，于烘箱中擺成斜面，85°C60rain間歇滅菌兩次(每天一次)。含藥培養(yǎng)基于滅菌前定量加入，滅菌后將不含藥培養(yǎng)基置37'C培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行無菌試驗(yàn)，證明無菌生長(zhǎng)即可使用。本發(fā)明是根據(jù)抗菌抗結(jié)核植物表面消毒時(shí)間的不同，通過化學(xué)方法對(duì)不同植物不同組織進(jìn)行消毒處理，確定一套快速可行的方案，為篩選抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌提供一種方法；二是本發(fā)明跟蹤測(cè)定了分離的各內(nèi)生菌菌株次生代謝產(chǎn)物對(duì)供試人畜病原菌及人型結(jié)核分枝桿菌的抑制作用，從而獲得有效菌株，為抗菌抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供一批出發(fā)菌株；三是本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、易行。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法作進(jìn)一步描述。實(shí)施例h選用采自重慶大學(xué)校園內(nèi)的狹葉十大功勞木各部分組織作為內(nèi)生菌宿主樣品，按以下程序進(jìn)行表面消毒(1)在無菌操作臺(tái)內(nèi)，將植物內(nèi)生菌的宿主樣品用無菌水沖洗3次；(2)采用75%酒精+0.1%升汞的消毒組合，設(shè)定75%酒精中浸泡l-5min(間隔lmin)，無菌水沖洗3次，0.1%升汞中漂洗0.5-2min(間隔0.5min)，無菌水沖洗5次，收集最后一次用沖洗植物組織的無菌水作為對(duì)照。結(jié)果顯示根、莖75%酒精浸泡lmin，無菌水沖洗3次，O.1%升汞漂洗1.5min，無菌水5次；葉、果實(shí)75%酒精浸泡lmin，無菌水3次，0.1%升汞漂洗1.5-lmin，無菌水5次。此條件下分離得到的內(nèi)生菌無雜菌干擾。實(shí)施例2:(1)通過實(shí)例1的消毒方案，將從抗菌抗結(jié)核植物組織中生長(zhǎng)出的內(nèi)生菌,根據(jù)不同菌落形態(tài)，挑取內(nèi)生細(xì)菌劃線接種到牛肉浸膏固體培養(yǎng)基上，37'C恒溫培養(yǎng)；挑取內(nèi)生真菌劃線接種到PDA培養(yǎng)基上，27'C恒溫培養(yǎng)。經(jīng)純化后接種相應(yīng)斜面保存?zhèn)溆茫?2)將上述內(nèi)生菌菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基，內(nèi)生細(xì)菌為牛肉浸膏液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少許純化的內(nèi)生菌于培養(yǎng)瓶中，真菌置27'C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)6_7天，細(xì)菌置37。C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)2-3天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(3)發(fā)酵液處理向上清液中加入95%的乙醇，混合后使乙醇濃度為75%，靜置過夜，處理液4000r/min離心10—15min，取上清液，減壓蒸餾，真空干燥后，將粉末收集保存于4'C冰箱備用；(4)菌體的處理將菌體置于園底燒瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提兩次，4000r/min離心20min，減壓蒸餾，濃縮干燥后保存于4°C冰箱備用；(5)抗菌活性測(cè)定粉末配制成濃度為10mg/ml的藥液，將活化好的供試菌按照麥?zhǔn)媳葷?，與冷卻至50'C左右的牛肉浸膏固體培養(yǎng)基混合，使供試菌濃度達(dá)1.0X106CFU，待凝固后，每個(gè)培養(yǎng)基平面放四個(gè)直徑為5mm的無菌紙片，將配制好的藥液按15ul的量打入紙片，置37T:培養(yǎng)箱培養(yǎng)一天后，測(cè)量菌圈大小，判斷抑制效果；(6)結(jié)果顯示從川黃檗莖(PE-Sll)、金蕎麥根(FE-R9)、款冬根(TE-R7)各分離到一株內(nèi)生真菌，其次生代謝產(chǎn)物對(duì)供試人畜病原菌都有明顯的抑制作用，抑菌圈大小如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例3:(1)通過實(shí)例1的消毒方案，將從藥用植物組織中生長(zhǎng)出的內(nèi)生菌，根據(jù)不同菌落形態(tài)，挑取內(nèi)生細(xì)菌劃線接種到牛肉浸膏固體培養(yǎng)基上，37'C恒溫培養(yǎng);挑取內(nèi)生真菌劃線接種到PDA培養(yǎng)基上，27'C恒溫培養(yǎng)。經(jīng)純化后接種相應(yīng)斜面保存?zhèn)溆茫?2)將上述內(nèi)生菌菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基，內(nèi)生細(xì)菌為牛肉浸膏液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少許純化的內(nèi)生菌于培養(yǎng)瓶中，真菌置27。C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)6_7天，細(xì)菌置37'C搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)2-3天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(3)發(fā)酵液處理向上清液中加入95%的乙醇，混合后使乙醇濃度為75%，靜置過夜，處理液4000r/min離心10—15min，取上清液，減壓蒸餾，真空干燥后，將粉末收集保存于4'C冰箱備用；(4)菌體的處理將菌體置于園底燒瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提兩次，4000r/min離心20min，減壓蒸餾，濃縮干燥后保存于4°C冰箱備用；(5)改良羅氏培養(yǎng)基的制備味精(谷氨酸鈉95%以上)7.2g，磷酸二氫鉀2.4g，硫酸鎂0.24g，檸檬酸鎂0.6g，甘油12mL，蒸餾水600mL，馬鈴薯淀粉30g，全卵液1000mL,2X孔雀綠20mL;制備法將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、擰檬酸鎂、味精和甘油加蒸餾水后，置沸水中加熱溶解，將溶液從沸水浴中取出，稍冷后加入馬鈴薯淀粉，置沸水浴中繼續(xù)加熱，并不斷攪拌或搖動(dòng)，使之成均勻糊狀。取新鮮雞蛋用肥皂洗凈后置75W酒精中浸泡30min，取出后用無菌紗布擦干擊破蛋殼，將蛋黃和蛋白收集，一并收集于滅菌燒杯里，用滅菌玻棒打成均勻蛋液，用滅菌紗布過濾，收集卵液1000ml，加入降溫至6(TC以下的馬鈴薯糊，并加入孔雀綠水溶液。充分混合后，分裝于滅菌試管中，于烘箱中擺成斜面，85°C60min間歇滅菌兩次(每天一次)。含藥培養(yǎng)基于滅菌前定量加入，滅菌后將不含藥培養(yǎng)基置37。C培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行無菌試驗(yàn)，證明無菌生長(zhǎng)即可使用；(6)抗結(jié)核活性測(cè)定將10mg/ml藥液與一定改良羅氏培養(yǎng)基混合成斜面后，接種濃度為103mg/ml的人型結(jié)核分枝桿菌，接種量為O.lml。37'C培養(yǎng)，觀察菌落出現(xiàn)情況。(7)結(jié)果顯示從商陸的莖(ES-S23)、狹葉十大功勞的葉(EM-L40)、香樟的莖(EC-S44)各分到一株內(nèi)生真菌，其次生代謝產(chǎn)物對(duì)人型結(jié)核分枝桿菌具有一定的抑制作用，并且，對(duì)四種人畜病原菌也具有明顯的抑制作用。權(quán)利要求1、一種抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，其特征是步驟如下(1)抗菌抗結(jié)核植物組織的準(zhǔn)備采集植物的根、莖、葉、果實(shí)等組織；(2)表面消毒與無菌檢測(cè)在無菌工作臺(tái)內(nèi)，將步驟(1)各部分組織用無菌水沖洗3次，采用75％酒精+0.1％升汞組合進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗5次后，種植于水瓊脂培養(yǎng)基中，27℃下恒溫培養(yǎng)，表面消毒的最后一次沖洗用無菌水作為空白對(duì)照；(3)植物內(nèi)生菌的分離純化將步驟(2)長(zhǎng)出的內(nèi)生菌，挑取不同形態(tài)的菌落，真菌至PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌至牛肉浸膏固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)至純后，保存于相應(yīng)的試管斜面中備用；(4)內(nèi)生真菌發(fā)酵將PDA液體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少許步驟(3)純化的內(nèi)生真菌菌絲于培養(yǎng)瓶中，置27℃搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)6-7天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(5)內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵將牛肉浸膏液體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種環(huán)挑取少許步驟(3)純化的內(nèi)生細(xì)菌菌落于培養(yǎng)瓶中，置37℃搖床，150r/min，振蕩培養(yǎng)2-3天，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10-15min，取上清液；(6)發(fā)酵液的處理向步驟(4)、(5)的上清液中加入95％的乙醇，混合后使乙醇濃度為75％，靜置過夜，處理液4000r/min離心10-15min，取上清液，40℃減壓蒸餾，真空干燥后保存于4℃冰箱備用；(7)菌體的處理將步驟(4)、(5)的菌體置于圓底燒瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提兩次，4000r/min離心20min，60℃減壓蒸餾，濃縮干燥后保存于4℃冰箱備用；(8)有效抗菌菌株篩選稱取步驟(6)、(7)粉末，加入一定無菌水，使藥液濃度為10mg/ml，采用改進(jìn)K-B紙片法，通過測(cè)量菌圈大小，判斷抑制效果；(9)有效抗結(jié)核菌株篩選將10mg/ml藥液與一定改良羅氏培養(yǎng)基混合成斜面后，接種濃度為103mg/ml的人型結(jié)核分枝桿菌，接種量為0.1ml，37℃培養(yǎng)，觀察菌落出現(xiàn)情況；(10)菌種的保存將步驟(7)篩選出的高抑制效率內(nèi)生菌菌株接種于25％無菌甘油中，-80℃保存，備用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，其特征是步驟(2)所述的對(duì)抗菌抗結(jié)核植物組織各部分消毒時(shí)間如下根、莖為75%酒精浸泡lmin，無菌水沖洗3次，0.1%升汞漂洗1.5min;葉、果實(shí)為75%酒精浸泡lmin，無菌水3次，0.1%升汞漂洗0.5-lmin，水瓊脂培養(yǎng)基組分為瓊脂1.5g，蒸餾水1000ml，PH自然。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，其特征是步驟(8)所述的采用改進(jìn)K一B紙片法，是將活化好的供試菌按照麥?zhǔn)媳葷嵯♂尦?.0X106CFU，與冷卻至5(TC左右的牛肉浸膏固體培養(yǎng)基混合，待凝固后，每個(gè)培養(yǎng)基平面放四個(gè)直徑為5mm的無菌紙片，將配制好的藥液按15ul的量打入紙片，置37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，其特征是步驟(9)所述的改良羅氏培養(yǎng)基的組成為味精(谷氨酸鈉95%以上)7.2g，磷酸二氫鉀2.4g，硫酸鎂0.24g，檸檬酸鎂0.6g，甘油12mL，蒸餾水600mL，馬鈴薯淀粉30g，全卵液1000mL，2X孔雀綠20mL。全文摘要本發(fā)明公開了抗菌抗結(jié)核植物內(nèi)生菌的分離篩選方法，該方法包括抗菌抗結(jié)核植物組織的準(zhǔn)備、表面消毒與無菌檢測(cè)、植物內(nèi)生菌的分離純化、內(nèi)生真菌發(fā)酵、內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵、發(fā)酵液的處理、菌體的處理、有效抗菌菌株篩選、有效抗結(jié)核菌株篩選和菌種的保存步驟。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)從微生物中獲取有效抗菌抗結(jié)核物質(zhì)提供了保證，通過本發(fā)明獲得一批有效的菌株。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101225430SQ200810020570公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月14日優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日發(fā)明者唐玉斌,杜慧娟,王伯初,鄧墨淵,魏有章申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)