專(zhuān)利名稱(chēng)：一種液體發(fā)酵培養(yǎng)富硒、鋅元素的金針菇菌絲體的方法
一種液體發(fā)酵培養(yǎng)富硒、鋅元素的金針菇菌絲體的方法 技術(shù)領(lǐng)域一種液體發(fā)酵培養(yǎng)富硒、鋅元素的金針菇菌絲體的方法，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。涉及發(fā)酵法培養(yǎng)金針菇菌絲體，是將金針菇孢子接種至新鮮的固體斜 面上進(jìn)行培養(yǎng)，待斜面長(zhǎng)好后接種至含較低濃度無(wú)機(jī)硒與無(wú)機(jī)鋅的液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行種子的培養(yǎng)，即對(duì)菌種加以馴化；再接入添加了適量硒元素、鋅元素的 發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用金針菇的富集與轉(zhuǎn)化功能，使菌絲 體中積累高濃度的有機(jī)硒和有機(jī)鋅。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)對(duì)菌體的收集、烘干， 得到同時(shí)富含有機(jī)硒元素、有機(jī)鋅元素的金針菇菌絲體粉。
背景技術(shù)：
金針菇(Flammulinavelutipes)是世界著名的食用菌之一，屬擔(dān)子菌亞門(mén)， 層菌綱，傘菌目，口蘑科，冬菇屬(Flammulina)或金錢(qián)菌屬(Collybia)。金針菇肉 質(zhì)細(xì)嫩、軟滑，味道宜人。其蛋白質(zhì)含量高。據(jù)分析表明，每百克鮮金針菇中 含維生素8253.2毫克，維生素C10.9毫克。每百克干金針菇中含蛋白質(zhì)13克， 碳水化合物52克，礦物質(zhì)7.56克，還含有胡蘿卜素、多種氨基酸和核酸。金針 菇含有人體必需氨基酸成分較全，尤其是賴(lài)氨酸和精氨酸的含量特別高，有益于兒童腦細(xì)胞的發(fā)育，因此國(guó)外稱(chēng)其為"增智菇"。金針菇中還含有一種叫樸菇素 的物質(zhì)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的抗御能力。金針菇含有的金針菇多糖具有降低 膽固醇、抗菌活性、免疫活性和抗腫瘤作用。它可以調(diào)節(jié)機(jī)體代謝水平，提高 肝臟解毒能力，促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)生物合成，有助于損傷細(xì)胞的修復(fù)和更新， 從而延緩細(xì)胞衰老，有益于延年益壽。研究表明，常以子實(shí)體用藥的真菌，在 它們的菌絲體中亦含有與子實(shí)體相同的藥效成分與相似有效成分含量。這就給 液體發(fā)酵法生產(chǎn)金針菇菌絲體提供了理論依據(jù)。硒是一種準(zhǔn)金屬元素，是生物體必需的微量元素之一，它在人體內(nèi)具有抗氧 化、防衰老作用，能保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力,對(duì)于心血管功能、 生育、視力等有重要影響，而真正發(fā)揮生物活性作用的是有機(jī)硒。世界上有40多 個(gè)國(guó)家和地區(qū)缺硒,我國(guó)72%地區(qū)為缺硒、低硒地區(qū)，膳食中硒攝入量的不足嚴(yán)重 影響著人們的身體健康。天然食品的硒含量中,亞硒酸鈉等的無(wú)機(jī)硒因毒性較高 只能用于醫(yī)藥不能用于食品，況且無(wú)機(jī)硒的利用率也很低。鋅也是對(duì)人體機(jī)能有重要作用的金屬元素之一。鋅是很多金屬酶的組成成 份或酶的激活劑。與鋅有關(guān)的酶大約有70—100種。鋅無(wú)法在人體內(nèi)合成，只能從體外獲得。鋅缺乏在中國(guó)人群中普遍存在，嬰兒、兒童、孕婦和育齡婦女缺 鋅尤其嚴(yán)重。補(bǔ)充有機(jī)態(tài)鋅可以消除無(wú)機(jī)鋅對(duì)人體的副作用和對(duì)胃腸的刺激，從 而使鋅能被人體更高效、更安全地吸收利用。金針菇已證實(shí)具有一定富鋅能力和富硒能力菌絲體中硒和鋅有機(jī)化程度 高。硒存在于含硫元素的化合物中，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、核糖核酸等生物大分子物質(zhì)中。而金針菇內(nèi)的有機(jī)鋅50%以上與蛋白結(jié)合，34%與糖和脂類(lèi)結(jié)合，特別容易被人體吸收和利用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種深層液體發(fā)酵法培養(yǎng)同時(shí)富含有機(jī)硒元素、有機(jī) 鋅元素的金針菇菌絲體粉的方法。本發(fā)明采用先進(jìn)的生物技術(shù)，并且利用高等 真菌具有轉(zhuǎn)化性的富集微量元素能力的特點(diǎn)，進(jìn)行純種液體深層發(fā)酵培養(yǎng)金針 燕菌絲體，創(chuàng)造性使一種食用菌產(chǎn)品成為可以同時(shí)補(bǔ)充兩種微量元素的功能型 食品添加劑。本發(fā)明的技術(shù)方案將金針菇孢子接種至新鮮的固體斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，待 斜面長(zhǎng)好后接種至加入了較低濃度的無(wú)機(jī)硒和鋅離子的液體種子培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)擴(kuò)大的同時(shí)，對(duì)菌種加以馴化，再將適量濃度的無(wú)機(jī)硒與無(wú)機(jī)鋅加入到深層 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用金針菇菌的富集與轉(zhuǎn)化功能，使絲體中積累較高 濃度的有機(jī)硒和有機(jī)鋅。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)對(duì)菌體的收集、烘干，得到同時(shí)富 含有機(jī)硒元素、有機(jī)鋅元素的金針菇菌絲體粉。 步驟為1)待用菌種的培養(yǎng)出發(fā)菌株為金針菇(F/a/nm"/f"a ^/m^ m) F12;該金針菇菌株已在"生物 技術(shù)"雜志2002年06期，2002年12月，題目為《食用菌深層發(fā)酵工藝研究及 功能性食品開(kāi)發(fā)》中公開(kāi)。① 斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)麩皮40 ,蔗糖20 ，磷酸二氫鉀3.0，硫酸鎂1.5 ,瓊脂 20.0, pH自然；培養(yǎng)方法將保存在木屑上的菌種接種到新鮮的空白斜面上，在26士rc下培養(yǎng)7-10天；② 一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量150mL/500mL:培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖20，黃豆粉10，玉米粉25，磷酸二氫鉀1.0， 硫酸鎂0.5和維生素Bi 0.05， pH自然；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的斜面接種至事先滅菌的搖瓶中，在26士rc，轉(zhuǎn)速 110rpm下培養(yǎng)7天；③ 二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量400mL/1000mL:培養(yǎng)基配方與一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基配方相同；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的一級(jí)種子以10%的接種量接種至事先滅菌的搖瓶中， 在26士rC，轉(zhuǎn)速110rpm下擴(kuò)大培養(yǎng)2天，即成待用菌種； 3 )50L —級(jí)液體種子培養(yǎng)，裝液量25-30L:① 一級(jí)液體種子培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖20，黃豆粉IO，玉米粉25， 麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母膏3.0,維生素B，0.05，硫酸鎂0.5， 磷酸二氫鉀1.0，亞硒酸鈉O.Ol，硫酸鋅0.2，豆油2.0， pH自然；② 控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量5%-10%接入待 用菌種，溫度26士rC，罐壓0.05Mpa，通氣量1 :0.3， V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm;③ 轉(zhuǎn)罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間30-35小時(shí)，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合， 無(wú)雜菌；3) 500L 二級(jí)液體種子培養(yǎng)，裝液量250-300L:① 培養(yǎng)基配方與一級(jí)液體種子配方相同② 控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10%-15%接入一 級(jí)種子，溫度26士rC，罐壓0.05Mpa，通氣量1 :0.3， V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，③ 轉(zhuǎn)罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間20-25小時(shí)，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合， 無(wú)雜菌；4〕 3000L深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量1800L:① 發(fā)酵培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖30，黃豆30，黃豆浸泡后用膠體磨磨 漿離心后取汁，玉米粉10，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，維生素Bi 0.05， 硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1.0，酵母膏3.0,豆油2.0和亞硒酸鈉0.05，硫酸鋅0.7，pH 自然；② 控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10%-15%接入二 級(jí)種子，溫度26士rC，罐壓0.05Mpa，通氣量1 : 0.3， V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，③ 放罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間40—45小時(shí)，pH〉5，平板無(wú)雜菌，菌絲球上浮二 分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合，菌絲球不能自溶；5) 菌絲體的提取將培養(yǎng)好的發(fā)酵液用5000-6000 rpm的離心機(jī)處理，收集菌絲體；6) 菌絲體的烘干將收集的菌絲體用真空干燥箱在50—60'C下烘干7) 菌絲體的粉碎用帶冷凍的粉碎機(jī)將烘干的菌絲體粉碎至80目以上既 得產(chǎn)品。8) 檢驗(yàn)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)如下i. 產(chǎn)品外觀(guān)顏色為深黃色粉末，細(xì)度80目，具有金針菇香味，無(wú)異味。ii. 多糖含量》6X。iii. 蛋白質(zhì)含量》8X。iv .有機(jī)硒含量》20微克/克。v. 有機(jī)鋅含量》4. 0mg/gvi. 水分《8X。vii. 菌落總數(shù)《1000cfii/g，大腸菌群《40npn/100g，酵母《25cfii/g,，霉菌《 25cfii/g，致病菌不得檢出。LD50為陰性。 'viii. 鉛《1.5mg/kg，砷《1.0mg/kg。產(chǎn)品均由衛(wèi)生防疫部門(mén)檢測(cè)合格后方可銷(xiāo)售。包裝檢驗(yàn)合格后用鋁膜包 裝袋包裝后即得產(chǎn)品富含有機(jī)硒、有機(jī)鋅的金針菇粗菌體粉，可作為食品添加 劑，做為功能性食品的主要成份。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用先進(jìn)的生物技術(shù)，并且利用高等真菌具有轉(zhuǎn)化性的富硒能力的特點(diǎn)，進(jìn)行純種液體深層發(fā)酵培養(yǎng)金針菇菌體，大大縮短了生產(chǎn)周期，本發(fā)明的生產(chǎn)周期為5天，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)子實(shí)體的周期一般在 30-50天左右。本發(fā)明全部采用糧食原料，污染小，成本低，工藝簡(jiǎn)便，科技含 量高，不易被仿冒，有效成分含量高，附加值高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。富含有機(jī) 硒、有機(jī)鋅的金針菇粗菌體粉，且具有金針菇特有的香味，可以與多種食品配 伍，制成多種口味，成為具有補(bǔ)充有機(jī)硒和有機(jī)鋅功能的，且易于人體吸收和 利用的功能性食品。
具體實(shí)施方式
1、 待用菌種的培養(yǎng)將木屑孢子接種至事先滅好菌的用上述斜面配方配制的一只空白茄子瓶斜面上，在26t下培養(yǎng)7-10天后將斜面上的菌體刮入事先滅 好菌的裝有玻璃珠的250ml三角瓶中，另加30ml無(wú)菌水振蕩10分鐘，制成菌 懸液。吸4ml該菌懸液于事先滅好菌的2只500ml三角瓶中(按上述一級(jí)搖瓶 種子配方配制的培養(yǎng)基，裝液量為150ml)，在26。C，轉(zhuǎn)速110r/min下培養(yǎng)7天 得一級(jí)搖瓶種子；將培養(yǎng)好的一級(jí)搖瓶種子各一瓶在無(wú)菌操作下倒入事先滅好 菌的用上述二級(jí)搖瓶種子配方配制的5000mL (裝液量為1500mL)的三角瓶中， 在26。C，轉(zhuǎn)速110r/min下擴(kuò)大培養(yǎng)2天，長(zhǎng)好后將兩瓶種子液合并即成待用菌 種。2、 一級(jí)液體種子培養(yǎng)按上述一級(jí)液體種子培養(yǎng)基配方，在O.l，a下滅 菌30分鐘冷卻后接入搖瓶種子。按上述一級(jí)液體種子培養(yǎng)參數(shù)培養(yǎng)。采用50L 全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為25-30L。3、 二級(jí)液體種子培養(yǎng)按上述二級(jí)液體種子培養(yǎng)基配方，在O.lMpa下滅 菌30分鐘冷卻后接入一級(jí)種子。按上述二級(jí)種子罐培養(yǎng)參數(shù)培養(yǎng)。采用500L 發(fā)酵罐，裝液量為250-300L。4、 深層液體發(fā)酵培養(yǎng)采用3000L發(fā)酵罐，裝液量為1800L。按上述發(fā)酵 培養(yǎng)基配方，相同條件滅菌后接入二級(jí)液體種子。按上述發(fā)酵罐的培養(yǎng)參數(shù)培養(yǎng)。5、 菌絲體的提取按上述菌體提取方法收集菌絲體，得到288公斤濕菌絲體。6、 富含有機(jī)硒、有機(jī)鋅金針菇菌體粉的獲得按上述菌體的烘干和粉碎方 法得到產(chǎn)品47公斤。
權(quán)利要求
1、一種液體發(fā)酵培養(yǎng)富硒、鋅元素的金針菇菌絲體的方法，其特征是將金針菇孢子接種至新鮮的固體斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，待斜面長(zhǎng)好后接種至含較低濃度無(wú)機(jī)硒與無(wú)機(jī)鋅的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子的培養(yǎng)，即對(duì)菌種加以馴化；再接入添加了適量硒元素、鋅元素的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用金針菇菌的富集與轉(zhuǎn)化功能，使絲體中積累高濃度的有機(jī)硒和有機(jī)鋅。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)對(duì)菌體的收集、烘干、粉碎，得到同時(shí)富含有機(jī)硒元素、有機(jī)鋅元素的金針菇菌絲體粉。步驟為1)待用菌種的培養(yǎng)出發(fā)菌株為金針菇(Flammulina Valutipes)F12；①斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)麩皮40，蔗糖20，磷酸二氫鉀3.0，硫酸鎂1.5，瓊脂20.0，pH自然；培養(yǎng)方法將保存在木屑上的菌種接種到新鮮的空白斜面上，在26±1℃下培養(yǎng)7-10天；②一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量150mL/500mL培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖20，黃豆粉10，玉米粉25，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂0.5和維生素B10.05，pH自然；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的斜面接種至事先滅菌的搖瓶中，在26±1℃，轉(zhuǎn)速110rpm下培養(yǎng)7天；③二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量400mL/1000mL培養(yǎng)基配方與一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基配方相同；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的一級(jí)種子以10％的接種量接種至事先滅菌的搖瓶中，在26±1℃，轉(zhuǎn)速110rpm下擴(kuò)大培養(yǎng)2天，即成待用菌種；2)50L一級(jí)液體種子培養(yǎng)，裝液量25-30L①一級(jí)液體種子培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖20，黃豆粉10，玉米粉25，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母膏3.0，維生素B10.05，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1.0，亞硒酸鈉0.01，硫酸鋅0.2，豆油2.0，pH自然；②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量5％-10％接入待用菌種，溫度26±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm；③轉(zhuǎn)罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間30-35小時(shí)，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合，無(wú)雜菌；3〕500L二級(jí)液體種子培養(yǎng)，裝液量250-300L①培養(yǎng)基配方與一級(jí)液體種子配方相同②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10％-15％接入一級(jí)種子，溫度26±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，③轉(zhuǎn)罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間20-25小時(shí)，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合，無(wú)雜菌；4〕3000L深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量1800L①發(fā)酵培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)葡萄糖30，黃豆30，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉10，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，維生素B10.05，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1.0，酵母膏3.0，豆油2.0和亞硒酸鈉0.05，硫酸鋅0.7，pH自然；②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10％-15％接入二級(jí)種子，溫度26±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm；③放罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間40-45小時(shí)，pH＞5，平板無(wú)雜菌，菌絲球上浮二分之一，鏡檢有鎖狀聯(lián)合，菌絲球不能自溶；5〕菌絲體的提取將培養(yǎng)好的發(fā)酵液用5000-6000rpm的離心機(jī)處理，收集菌絲體；6〕菌絲體的烘干將收集的菌絲體用真空干燥箱在50-60℃下烘干；7〕菌絲體的粉碎用帶冷凍的粉碎機(jī)將烘干的菌絲體粉碎至80目以上既得產(chǎn)品。
全文摘要
一種液體發(fā)酵培養(yǎng)富硒、鋅元素的金針菇菌絲體的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要包括菌種的培養(yǎng)，液體種子培養(yǎng)，即二元素馴化，深層液體二元素富集發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體的收集、干燥、粉碎。用本發(fā)明方法得到的同時(shí)富含有機(jī)硒和有機(jī)鋅的金針菇菌絲體干品中有機(jī)硒含量達(dá)35μg/g以上，有機(jī)鋅含量達(dá)4.25mg/g。該菌絲體粉可以做為一種食品添加劑，與適當(dāng)?shù)氖称放湮?，制成功能型食品，?duì)由于微量元素硒和鋅的攝入量不足而處于亞健康狀態(tài)的人群，具有良好的保健作用。本發(fā)明科技含量高，生產(chǎn)的產(chǎn)品有效成分含量高，附加值高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23L1/212GK101228830SQ200810020678
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日
發(fā)明者棟 張, 楊春霞, 沈國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)