專利名稱：：快速鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)鑒別方法。技術(shù)背景在周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)中(如斷肢再植)，難點(diǎn)之一是手術(shù)中不能正確分辨出神經(jīng)干內(nèi)運(yùn)動(dòng)束與感覺(jué)束，現(xiàn)有的縫合方法如神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜縫合法，由于不能實(shí)現(xiàn)兩斷端相同神經(jīng)束正確縫合，嚴(yán)重影響了患者的神經(jīng)功能恢復(fù)，若能實(shí)現(xiàn)神經(jīng)兩斷端感覺(jué)束對(duì)感覺(jué)束。運(yùn)動(dòng)束對(duì)運(yùn)動(dòng)束的正確縫合，將極大提高神經(jīng)功能恢復(fù)率。目前采用的酶組織化學(xué)法，根據(jù)運(yùn)動(dòng)束和感覺(jué)束中一種神經(jīng)遞質(zhì)酶——乙酰膽堿酯酶的含量差別，作為鑒別運(yùn)動(dòng)束與感覺(jué)束的標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)乙酰膽堿酯酶主要為酶組織化學(xué)染色法，根據(jù)反應(yīng)形成亞鐵氰化銅(一種棕色沉淀)出現(xiàn)于酶活性部位，運(yùn)動(dòng)纖維呈強(qiáng)陽(yáng)性，感覺(jué)纖維大部分呈陰性，少部分呈弱陽(yáng)性的原理，對(duì)神經(jīng)束性質(zhì)進(jìn)行判定。然而此法染色時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，且不能進(jìn)行原位染色，故臨床應(yīng)用也受到一定限制。近年來(lái)，電化學(xué)技術(shù)因其簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確靈敏及選擇性好等特點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)，食品工業(yè)和臨床分析等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于代謝物，如葡萄糖和激素的測(cè)定，以及大分子，如細(xì)胞和蛋白質(zhì)的檢測(cè)；而微型化電極在電活性神經(jīng)遞質(zhì)的體外和在體檢測(cè)方面，也很有研究?jī)r(jià)值。在電化學(xué)家的努力下，檢測(cè)未知生物樣品中的乙酰膽堿酯酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)也指日可待。由此可見(jiàn)，電化學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)的結(jié)合推動(dòng)了電化學(xué)傳感器在臨床分析中的應(yīng)用，并取得了不俗的進(jìn)展。目前，提高電化學(xué)傳感器性能的焦點(diǎn)集中在電極材料的選擇和表面修飾方面。很多先進(jìn)材料，如納米材料，高分子聚合物材料，因其具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，已被應(yīng)用于電極的制備和表面修飾，并在化學(xué)傳感器和納米器件的構(gòu)建中展示了良好的應(yīng)用前景。而表面科學(xué)技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合制備成化學(xué)修飾電極，其潛在的應(yīng)用價(jià)值也引起了科學(xué)界廣泛的研究興趣，推進(jìn)了近20年來(lái)電化學(xué)生物傳感器的迅速發(fā)展。因此，將電化學(xué)技術(shù)與納米技術(shù)、表面科學(xué)相結(jié)合，制備高性能的電化學(xué)生物傳感器，并將其應(yīng)用于手術(shù)中快速鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)，可提高周圍神經(jīng)損傷修復(fù)后的功能恢復(fù)率，給廣大患者帶來(lái)福音。
發(fā)明內(nèi)容一種快速鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法，它由下列步驟組成步驟1.將金電極在碳化硅細(xì)砂紙上打磨，再分別用加0.3pm和0.05nm氧化鋁懸濁液的麂皮拋光成"鏡面"，最后經(jīng)乙醇、二次水超聲清洗，備用，步驟2.將金電極固定在旋轉(zhuǎn)涂布儀中，表面朝上，將0.1mL以質(zhì)量比例為7:10:l混合好的20%聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量100000-20000)水溶液，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化劑(Si-H官能交聯(lián)劑)滴涂在電極表面，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)涂布儀，在20002500轉(zhuǎn)/分的速率下旋轉(zhuǎn)15分鐘，隨后在80。C烘箱中靜置一個(gè)小時(shí)，使電極表面聚合物薄膜固化，步驟3.將步驟2修飾了聚合物薄膜的金電極浸入盛有質(zhì)量百分濃度為0.5%氯金酸溶液的燒杯中，4。C下靜置8小時(shí)，通過(guò)固化劑中Si—H鍵的還原作用，使金納米粒子還原沉積在聚合物薄膜表面，步驟4.將步驟3修飾了聚合物一金納米粒子復(fù)合膜的金電極浸入盛有2imit/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽堿氧化酶溶液的eppendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)金納米粒子良好的生物相容性，使膽堿氧化酶富集在電極表面。步驟5.將步驟4修飾好的金電極浸入盛有2unit/mL的標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶溶液的eppendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)聚合物薄膜對(duì)乙酰膽堿酯酶的吸附性和金納米粒子良好的生物相容性，使乙酰膽堿酯酶富集在電極表面。步驟6.將步驟5修飾好的金電極(4)取出，與參比電極(5)，對(duì)電極(6)共同插入檢測(cè)池(2)中，加入2mL0.1MpH7.4的磷酸鹽緩沖液，將各電極連接在所用的電化學(xué)工作站(7)上，電化學(xué)工作站(7)與計(jì)算機(jī)(8)相連，步驟7.在電化學(xué)工作站的技術(shù)選項(xiàng)中選擇安培電流一時(shí)間曲線法，電位設(shè)置在0.7V，運(yùn)行電化學(xué)工作站進(jìn)行掃描，待基線平穩(wěn)后，加入2pL0.2M/L氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)其電化學(xué)響應(yīng)，步驟8.分別用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0和10.0unit/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度乙酰膽堿酯酶溶液重復(fù)上述4，5步驟，采用origin作圖。由于孵育溶液中乙酰膽堿酯酶濃度直接影響電極對(duì)乙酰膽堿的響應(yīng)，得到0.7V下氧化電流變化與乙酰膽堿酯酶濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。步驟9.將神經(jīng)根新鮮的標(biāo)本分別裝入標(biāo)本瓶中，迅速放在液氮中保存?zhèn)溆?，取用時(shí)在室溫下自然解凍，解凍后保存在濕盒中，防止標(biāo)本干燥脫水，步驟IO.將步驟9中得到神經(jīng)標(biāo)本浸入0.05MlmLpH7.4磷酸鹽緩沖溶液，在組織勻槳器中打碎。然后在1000020000轉(zhuǎn)/分鐘，04。C條件下離心15min,取上清液加入硫酸銨至25%飽和度。之后在10000~20000轉(zhuǎn)/分鐘，04。C條件下離心15min，取下層沉淀，力口入100pL二次蒸餾水溶解沉淀。步驟U.用步驟IO制備得到的祌經(jīng)勻漿代替乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)步驟5、6和7，通過(guò)電極對(duì)氯化乙酰膽堿的響應(yīng)來(lái)判斷神經(jīng)勻漿中是否含有乙酰膽堿酯酶，從而進(jìn)一步鑒別周圍神經(jīng)束的性質(zhì)(有明顯響應(yīng)證實(shí)為運(yùn)動(dòng)祌經(jīng)束，無(wú)明顯響應(yīng)則為感覺(jué)神經(jīng)束)。本發(fā)明采用了一種生物相容性好，穩(wěn)定性良好且價(jià)格低廉的高分子聚合物材料，聚二甲基硅氧烷，作為修飾電極的材料。通過(guò)摻雜聚二烯丙基二甲基胺和原位合成金納米粒子，這種聚合物一金納米粒子復(fù)合薄膜顯示了對(duì)蛋白質(zhì)極好的吸附性能，可連續(xù)吸附多種蛋白質(zhì)。對(duì)于乙酰膽堿酯酶的檢測(cè)可以通過(guò)電化學(xué)監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物的氧化電流變化實(shí)現(xiàn)。膽堿氧化酶/乙酰膽堿酯酶雙酶體系催化底物反應(yīng)過(guò)程如下乙酰膽堿+水乙,堿,膽堿+醋酸鹽膽堿+氧氣膽麵^三甲銨乙內(nèi)酯+過(guò)氧化氫乙酰膽堿酯酶催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解，生成醋酸鹽和膽堿。隨后，膽堿在氧氣存在的環(huán)境中，被膽堿氧化酶的催化生成過(guò)氧化氫。通過(guò)監(jiān)測(cè)過(guò)氧化氫在+0.7V(vs.飽和甘汞電極)的條件下的氧化電流，可實(shí)現(xiàn)對(duì)乙酰膽堿的檢測(cè)。而由于溶液中乙酰膽堿酯酶濃度不同，相同條件下吸附在電極表面的酶的量也不同，通過(guò)對(duì)于底物乙酰膽堿的檢測(cè)，可測(cè)定溶液中乙酰膽堿酯酶的濃度，或判斷組織勻漿溶液中是否含有乙酰膽堿酯酶。傳感器制備過(guò)程如圖1所示。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酰膽堿酯酶的濃度進(jìn)行了檢測(cè)，并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3中乙酰膽堿酯酶在l.Ounit/mL到2.0unit/mL濃度范圍內(nèi)與乙酰膽堿響應(yīng)的安培電流呈線性關(guān)系。對(duì)Beagle狗神經(jīng)組織勻漿進(jìn)行了檢測(cè)，如圖4所示，修飾電極在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組織勻漿中孵育后，經(jīng)電化學(xué)測(cè)定對(duì)乙酰膽堿有明顯的安培響應(yīng)(曲線a)，而在感覺(jué)神經(jīng)組織勻漿中孵育后，對(duì)乙酰膽堿基本沒(méi)有響應(yīng)(曲線b)。對(duì)24根Beagle狗神經(jīng)束進(jìn)行了鑒別，準(zhǔn)確率達(dá)到91.7%，與常規(guī)Karnovsky-Roots酶組織染色法和Fuminori酶組織染色法得到的結(jié)果對(duì)比，電化學(xué)方法準(zhǔn)確率較高，結(jié)果列于表l中。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明這種方法可將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)有效地區(qū)分開(kāi)來(lái)，有著良好的臨床應(yīng)用前景。6本發(fā)明的具體效果如下本發(fā)明方法采用生物相容性好，穩(wěn)定性良好且價(jià)格低廉的聚合物材料修飾金電極，提高了傳感器的穩(wěn)定性，并降低了成本；在聚合物薄膜表面原位合成金納米粒子，制備的聚合物一納米粒子復(fù)合材料對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附力，簡(jiǎn)化了檢測(cè)乙酰膽堿酯酶的步驟；選擇純綠色試劑，確保了無(wú)污染檢測(cè)；成功對(duì)狗祌經(jīng)組織勻漿中的乙酰膽堿酯酶進(jìn)行定性檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)周圍神經(jīng)束性質(zhì)的快速鑒別。圖1為本方法制備乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髦饕^(guò)程。圖2為三電極電化學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)造示意圖。圖中1，磁力攪拌器；2，電化學(xué)檢測(cè)池；3，磁力攪拌子；4，電化學(xué)工作電極；5，電化學(xué)參比電極；6，電化學(xué)對(duì)電極；7，電化學(xué)工作站；8，計(jì)算機(jī)。圖3為聚合物/金納米粒子/膽堿氧化酶修飾電極檢測(cè)乙酰膽堿酯酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，插圖為部分標(biāo)準(zhǔn)曲線的放大圖。圖4為聚合物/金納米粒子/膽堿氧化酶修飾電極在Beagle狗運(yùn)動(dòng)神經(jīng)(a)和感覺(jué)神經(jīng)(b)組織勻漿孵育10min后，對(duì)0.2mM乙酰膽堿的安培響應(yīng)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的水均為二次蒸餾水，實(shí)驗(yàn)所用試劑包括膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯酶、氯化乙酰膽堿、聚二烯丙基二甲基胺、聚二甲基硅氧垸和氯金酸等均為光譜純或分析純?cè)噭?。檢測(cè)溶液均采用0.1M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例la.實(shí)驗(yàn)前先將金盤電極(4)在碳化硅細(xì)砂紙上打磨，再分別用加0.3nm和0.05pm氧化鋁懸濁液的麂皮拋光成"鏡面"，最后經(jīng)乙醇、二次水超聲清洗，備用。1.修飾電極過(guò)程中，首先將金電極固定在旋轉(zhuǎn)涂布儀中，表面朝上，將O.lmL以質(zhì)量比例為7:10:1混合好的20%聚二甲基二烯丙基胺水溶液(重均分子量100000，Aldrich公司)，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化劑(Sylgard184DowComing公司)滴涂在電極表面，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)涂布儀，在2000轉(zhuǎn)/分的速率下旋轉(zhuǎn)15分鐘，隨后在80°<:烘箱中靜置一個(gè)小時(shí)，使電極表面聚合物薄膜固化。2.將修飾了聚合物薄膜的金電極浸入盛有質(zhì)量百分濃度為0.5%氯金酸溶液的燒杯中，4°C下靜置8小時(shí)，通過(guò)固化劑中Si—H鍵的還原作用，使金納米粒子還原沉積在聚合物薄膜表面。3.將修飾了聚合物一金納米粒子復(fù)合膜的金電極浸入盛有2unit/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽堿氧化酶溶液的eppendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)金納米粒子良好的生物相容性，使膽堿氧化酶富集在電極表面。4.然后，將修飾了聚合物/金納米粒子/膽堿氧化酶的金電極浸入盛有2unit/mL的標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶溶液的印pendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)聚合物薄膜對(duì)乙酰膽堿酯酶的吸附性和金納米粒子良好的生物相容性，使乙酰膽堿酯酶富集在電極表面。5.檢測(cè)時(shí)，首先將電化學(xué)檢測(cè)池(2)中放一粒磁力攪拌子(3)，置于磁力攪拌器(1)上。將修飾好的金電極(4)取出，與參比電極(5)，對(duì)電極(6)共同插入檢測(cè)池(2)中，加入2mL0.1MpH7.4的磷酸鹽緩沖液，將各電極連接在所用的電化學(xué)工作站(7)上，電化學(xué)工作站(7)與計(jì)算機(jī)(8)相連(見(jiàn)圖2)，在電化學(xué)工作站的技術(shù)選項(xiàng)中選擇安培電流一時(shí)間曲線法，電位設(shè)置在0.7V，運(yùn)行電化學(xué)工作站進(jìn)行掃描，待基線平穩(wěn)后，加入2^L0.2M/L氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)其電化學(xué)響應(yīng)。6.分別用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0,5.0，8.0，10.0unit/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度乙酰膽堿酯酶溶液重復(fù)上述4，5步驟，采用origin作圖。由于孵育溶液中乙酰膽堿酯酶濃度濃度直接影響電極對(duì)乙酰膽堿的響應(yīng)，得到0.7V下氧化電流變化與乙酰膽堿酯酶濃度的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。實(shí)施例lb.實(shí)驗(yàn)前先將金盤電極(4)在碳化硅細(xì)砂紙上打磨，再分別用加0.3^m和0.05pm氧化鋁懸濁液的麂皮拋光成"鏡面"，最后經(jīng)乙醇、二次水超聲清洗，備用。1.修飾電極過(guò)程中，首先將金電極固定在旋轉(zhuǎn)涂布儀中，表面朝上，將O.lmL以質(zhì)量比例為7:10:1混合好的20%聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量20000，Aldrich公司)水溶液，聚二甲基硅氧垸(重均分子量60000)和固化劑(Sylgard184DowCorning公司)滴涂在電極表面，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)涂布儀，在2500轉(zhuǎn)/分的速率下旋轉(zhuǎn)15分鐘，隨后在80。C烘箱中靜置一個(gè)小時(shí)，使電極表面聚合物薄膜固化。其它步驟同實(shí)施例la，得到的結(jié)果與實(shí)施例la完全相同。實(shí)施例2.1.將Beagle犬分次麻醉后處死，立即從后背正中將椎管打開(kāi)，取從硬膜外到脊神經(jīng)根管入口這一段走行的Tu—S2脊神經(jīng)的前根和后根(前根為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，后根為感覺(jué)神經(jīng))，將每一條犬的兩類神經(jīng)根新鮮的標(biāo)本分別裝入標(biāo)本瓶中，迅速放在液氮中保存?zhèn)溆?。取用時(shí)在室溫下自然解凍，解凍后保存在濕盒中，防止標(biāo)本干燥脫水。2.將一根神經(jīng)標(biāo)本浸入0.05MlmLpH7.4磷酸鹽緩沖溶液，在組織勻漿器中打碎。然后在10000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心15min，取上清液加入硫酸銨至25%飽和度。之后在10000轉(zhuǎn)/分鐘，4。C條件下離心15min，取下層沉淀，加入100pL二次蒸餾水溶解沉淀。3.用步驟2制備得到的神經(jīng)勻漿代替實(shí)施例乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)實(shí)施例1的步驟5、6和7，通過(guò)電極對(duì)氯化乙酰膽堿的響應(yīng)來(lái)定性判斷神經(jīng)勻槳中是否含有乙酰膽堿酯酶(圖4),從而進(jìn)一步鑒別周圍神經(jīng)束的性質(zhì)。實(shí)施例3.1.取24根神經(jīng)標(biāo)本，重復(fù)實(shí)施例2的步驟2，3，對(duì)神經(jīng)束性質(zhì)進(jìn)行鑒別。2.將鑒別結(jié)果與常規(guī)Karnovsky—Roots酶組織染色法，F(xiàn)uminori酶組織染色法得到的鑒別結(jié)果進(jìn)行對(duì)照(表l)。表1.電化學(xué)傳感器法，Kamovsky—Roots酶組織染色法，F(xiàn)uminori酶組織染色法的鑒別Beagle狗周圍神經(jīng)束性質(zhì)的成功率。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種快速鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法，它由下列步驟組成步驟1.將金電極在碳化硅細(xì)砂紙上打磨，再分別用加0.3μm和0.05μm氧化鋁懸濁液的麂皮拋光成“鏡面”，最后經(jīng)乙醇、二次水超聲清洗，備用，步驟2.將金電極固定在旋轉(zhuǎn)涂布儀中，表面朝上，將0.1mL以質(zhì)量比例為7∶10∶1混合好的20％重均分子量為100000-20000的聚二甲基二烯丙基胺水溶液，重均分子量為60000的聚二甲基硅氧烷和Si-H官能交聯(lián)劑的固化劑滴涂在電極表面，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)涂布儀，在2000轉(zhuǎn)/分的速率下旋轉(zhuǎn)15分鐘，隨后在80℃烘箱中靜置一個(gè)小時(shí)，使電極表面聚合物薄膜固化，步驟3.將步驟2修飾了聚合物薄膜的金電極浸入盛有0.5％氯金酸溶液的燒杯中，4℃下靜置8小時(shí)，通過(guò)固化劑中Si-H鍵的還原作用，使金納米粒子還原沉積在聚合物薄膜表面，步驟4.將步驟2修飾了聚合物-金納米粒子復(fù)合膜的金電極浸入盛有2unit/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽堿氧化酶溶液的eppendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)金納米粒子良好的生物相容性，使膽堿氧化酶富集在電極表面，步驟5.將步驟4修飾好的金電極浸入盛有2unit/mL的標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶溶液的eppendorf離心管中，靜置10min，通過(guò)聚合物薄膜對(duì)乙酰膽堿酯酶的吸附性和金納米粒子良好的生物相容性，使乙酰膽堿酯酶富集在電極表面，步驟6.將步驟5修飾好的金電極(4)取出，與參比電極(5)，對(duì)電極(6)共同插入檢測(cè)池(2)中，加入2mL0.1MpH7.4的磷酸鹽緩沖液，將各電極連接在所用的電化學(xué)工作站(7)上，電化學(xué)工作站(7)與計(jì)算機(jī)(8)相連，步驟7.在電化學(xué)工作站的技術(shù)選項(xiàng)中選擇安培電流-時(shí)間曲線法，電位設(shè)置在0.7V，運(yùn)行電化學(xué)工作站進(jìn)行掃描，待基線平穩(wěn)后，加入2μL0.2M/L氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)其電化學(xué)響應(yīng)，步驟8.分別用不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的乙酰膽堿酯酶溶液重復(fù)上述4，5和7步驟，采用origin作圖，步驟9.將神經(jīng)根新鮮的標(biāo)本分別裝入標(biāo)本瓶中，迅速放在液氮中保存?zhèn)溆?，取用時(shí)在室溫下自然解凍，解凍后保存在濕盒中，防止標(biāo)本干燥脫水，步驟10.將步驟9中得到神經(jīng)標(biāo)本浸入0.05M1mLpH7.4磷酸鹽緩沖溶液，在組織勻漿器中打碎。然后在10000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃條件下離心15min，取上清液加入硫酸銨至25％飽和度。之后在10000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃條件下離心15min，取下層沉淀，加入100μL二次蒸餾水溶解沉淀，步驟11.用步驟10制備得到的神經(jīng)勻漿代替乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)步驟5、6和7，通過(guò)電極對(duì)氯化乙酰膽堿的響應(yīng)來(lái)判斷神經(jīng)勻漿中是否含有乙酰膽堿酯酶，從而進(jìn)一步鑒別周圍神經(jīng)束的性質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是所述的乙酰膽堿酯酶溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的檢測(cè)濃度范圍為1.0-2.0unit/mL。全文摘要快速鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法，是一種基于檢測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物在電極表面產(chǎn)生的氧化信號(hào)來(lái)定性檢測(cè)周圍神經(jīng)束中乙酰膽堿酯酶的電化學(xué)檢測(cè)方法。它首先采用聚合物—金納米粒子復(fù)合物修飾電極，然后依次在膽堿氧化酶和乙酰膽堿酯酶溶液中孵育，通過(guò)復(fù)合物膜對(duì)蛋白質(zhì)良好的吸附力，使兩種酶在電極表面富集，通過(guò)三電極系統(tǒng)，基于雙酶體系測(cè)定底物乙酰膽堿的安培響應(yīng)，從而間接實(shí)現(xiàn)對(duì)乙酰膽堿酯酶的檢測(cè)(檢測(cè)濃度范圍1.0-2.0unit/mL)。用神經(jīng)組織勻漿代替標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶溶液進(jìn)行孵育，通過(guò)對(duì)乙酰膽堿是否有響應(yīng)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)運(yùn)動(dòng)束和感覺(jué)束的快速鑒別，是一種在臨床鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)領(lǐng)域的突破。文檔編號(hào)C12Q1/46GK101246141SQ20081002075公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年2月26日優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日發(fā)明者徐靜娟,曹曉建,微趙,陳洪淵申請(qǐng)人:南京大學(xué)