專利名稱：：混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是一種采用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)燃料乙醇的方法，屬于可再生能源制造的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：隨著世界工業(yè)化進(jìn)程及現(xiàn)代化的飛速發(fā)展，不可避免地會出現(xiàn)各種問題，能源供給是其中最嚴(yán)重的問題之一。石油、煤炭、天然氣等化石能源是滿足現(xiàn)階段能源需求的主要資源，但是化石能源資源是有限且不可再生的，據(jù)預(yù)測，到2050年原油的生產(chǎn)將由現(xiàn)在的每年250億桶下降到50億桶，煤炭及天然氣也會在有限的時間里開發(fā)罄盡。因此，全球范圍內(nèi)對于開發(fā)新的可替代能源的興趣及研究力度越來越大。太陽能、風(fēng)能和生物質(zhì)能源都是取之不盡、用之不竭的可再生能源資源，所以是研究開發(fā)的重中之重。近幾年，生物能源的研究與應(yīng)用取得了巨大的進(jìn)展["3]，其中生物乙醇已成為一種可替代石油、環(huán)保的能源。但是，以傳統(tǒng)的方法采用淀粉質(zhì)谷物或糖蜜為原料發(fā)酵，乙醇的成本價是汽油的兩倍，且消耗大量的糧食，與人類的生存相競爭。另一方面，地球上存在豐富的木質(zhì)纖維素資源，如麥草、玉米秸稈、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣、制漿和造紙廠的纖維渣、鋸末、林業(yè)廢棄物等[4，僅我國每年的農(nóng)作物秸桿就約8億噸之多，該類物質(zhì)除少量用于紡織，造紙和飼料加工等行業(yè)，大部分被廢棄或燒毀，既造成了資源浪費，又造成環(huán)境污染[5]。如果能將工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄的纖維素進(jìn)行發(fā)酵，既可以拓寬飼料和人類食品的新來源，同時又可以處理廢物，凈化環(huán)境，保護(hù)生態(tài)。因此，從人類的長遠(yuǎn)利益著想，以地球大量存在且可再生的天然纖維素尤其是各種廢棄纖維素資源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究具有極其重要的意義。世界上許多發(fā)達(dá)國家正大力開展纖維素類生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究，每年都有數(shù)百篇研究論文和專利發(fā)表6—9。最有代表性的是美國弗羅里達(dá)州立大學(xué)的Ingram團(tuán)隊，他們在纖維素和木聚糖發(fā)酵方面做了大量的工作[1()—11]，構(gòu)建了發(fā)酵木聚糖的大腸桿菌工程菌，革蘭氏陽性菌工程菌，外源基因整合染色體工程菌等。在優(yōu)化的條件下，大腸桿菌基因工程菌在含有10%葡萄糖和8%木糖的每升發(fā)酵液中發(fā)酵可分別獲得54.4和41.6克乙醇，相關(guān)研究先后申請了近20項專利。我國政府也已將纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇引入國家發(fā)展計劃。早在2000年9月國務(wù)院正式批準(zhǔn)了在國內(nèi)發(fā)展燃料乙醇試點，并將由木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化成燃料乙醇列入863項目指南，現(xiàn)已取得了一些初步成就。己自主開發(fā)了以甜高粱莖稈為原料生產(chǎn)燃料乙醇的技術(shù)，并在黑龍江等地開展了甜高梁的種植及發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇試點，在安徽豐原等企業(yè)已形成年產(chǎn)600噸的試驗生產(chǎn)能力。但總的來說，這類研究還剛剛起步，直接用基因工程菌發(fā)酵纖維素、木聚糖等生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的報道為數(shù)不多[2'4，6，12'13]，發(fā)酵成本還普遍較高。在化石能源日益短缺、能源形勢日益嚴(yán)重的今天，加大力度開展纖維素類生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究非常重要。[1]J.Lee，v/bMmfl/q/"歷她c^mo/ogy，1997,56:1-24.[2]曲音波，高培基會^與發(fā)摩JT襲1993,19(6):62-65.[3]N.Nagie，K.Ibsen,Wfl/"jBz'0c/^w/s^75/ofec/mo/ogy,1999,599-607.[4]張繼泉王瑞明，孫玉英.凝激辟拔2003，(1):39-41.[5〗L.G.Ljungdahl,K.E.Eriksson,爿rfv.M/cro6.￡co/.，1985,(5):237-299.[6]S.D.Zhu,Y.X.Wu,e/fl/.,眾學(xué)與主激^X^，2003，20:8-11.[7]B.S.Dien,M.A.Cotta,efa/"j4p//z'ecMkro6!'ofogyanc5z'ofec/i"o/ogy,2003,63:258-266.[8]YSun，J.Y.Cheng,歷omsowrcerec/wo/ogy,2002,83:1-11.[9]M.Galbe，WJWifcro6w/ogKBio/ec/mo/ogy,2002，59:618-628.[10]B.E.Wood,Ingram,Wa/"WO2007005646A2,2007.[11〗Ingram,"a/.,US7192772,2007[12]J.Lh^H.Z.Chen，"a/.，工f徵f激2001,31(2):36-37.[13]馮玉杰、李冬梅,中國發(fā)明專利申請，申請?zhí)?200610010183.
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明主要目的是提供一種混菌發(fā)酵纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的方法，解決纖維素混菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝及有關(guān)問題，以期降低生產(chǎn)成本，提高我國對資源充分合理應(yīng)用的技術(shù)，提高產(chǎn)能，降低對國際化石能源的依賴。技術(shù)方案有鑒于此，我們從南京紅山森林動物園食草動物的糞便及土樣中分離出纖維素分解菌14株，鑒定后將其中的1號菌株——大腸桿菌(Eco//)用紫外線誘變育種以后，獲得了高產(chǎn)酶活性的大腸桿菌突變株(EM)，使其與釀酒酵母混菌發(fā)酵以簡單的切碎方法處理的水稻秸稈等，發(fā)酵液中乙醇的濃度主要與大腸桿菌的產(chǎn)酶活性有關(guān)，乙醇的濃度可達(dá)7.65%。纖維素是由p-D-葡萄糖結(jié)構(gòu)單元以P-l,4-苷鍵連接而成的直鏈高分子，分子量可達(dá)數(shù)十萬甚至上百萬，呈微元纖束狀態(tài)，具有很強的結(jié)晶性，不溶于水及一般有機溶劑。纖維素類生物質(zhì)是地球上最豐富的有機資源，在木材、樹枝、木材加工剩余的碎木和鋸木屑中，纖維素含量一般為40%60%(干基計)，植物的莖葉也含有大量的纖維素。木質(zhì)纖維素不能為微生物細(xì)胞直接利用，需要通過纖維素酶的降解，再被微生物吸收利用。發(fā)酵前用稀硫酸等對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，可以破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)，提高酶的結(jié)合性和催化水解速率；產(chǎn)酶微生物EM產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶可使纖維原料水解糖化轉(zhuǎn)變成葡萄糖；釀酒酵母利用葡萄糖厭氧發(fā)酵生成酒精，同時釋放熱能。該方法具體為a.從食草動物糞便中分離出能分解纖維素的大腸桿菌；以致死率為20%90%的紫外線劑量對上述大腸桿菌誘變育種，選擇出具有較高產(chǎn)酶活性的大腸桿菌突變株EM1和EM2;b.以EM1或EM2和從甜酒曲中分離的釀酒酵母Sl或S2在一定溫度下混菌發(fā)酵經(jīng)粉碎和稀硫酸處理過的木質(zhì)纖維素2-4天，過濾后蒸出乙醇溶液。發(fā)酵溫度為20-40°C;木質(zhì)纖維素是水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、大麥秸稈、木屑、其它含纖維素植物莖、葉中的一種或多種的混合。有益效果隨著化石資源的逐漸減少，原油價格節(jié)節(jié)攀升，尤其是2007年到2008年7月初，國際原油期貨價格上漲了l倍多，因此開發(fā)新的替代能源曰益緊迫。另一方面，世界纖維素類可再生資源異常豐富，已利用的只是其中有限的部分，大部分纖維素資源被白白浪費，同時也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。本發(fā)明的技術(shù)產(chǎn)業(yè)化以后，可以更充分利用纖維素資源；所產(chǎn)生的酒精可以作為汽、柴油的替代能源，降低對化石能源的依賴；發(fā)酵液殘渣含有大量酵母，其具有較高的蛋白質(zhì)含量，可用作富營養(yǎng)動物飼料。具體實施方式a.從食草動物糞便中分離出能分解纖維素的大腸桿菌；以致死率20%90%的紫外線劑量對上述大腸桿菌誘變育種，誘變后的培養(yǎng)物用纖維素——剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行初篩選，初篩得到的產(chǎn)酶活性較高的菌株用產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩，篩選出產(chǎn)酶活性高的突變株EM1和EM2。b.以EM1或EM2和從甜酒曲中分離的釀酒酵母Sl或S2在一定溫度下混菌發(fā)酵經(jīng)粉碎和稀硫酸處理過的木質(zhì)纖維素2-4天，過濾后蒸出乙醇溶液。發(fā)酵液中乙醇濃度最高可達(dá)7.65%。發(fā)酵溫度為20-40°C;木質(zhì)纖維素是水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈、木屑、其它含纖維素植物莖、葉中的一種或多種的混合。實施例第一步取6個4)9cm培養(yǎng)皿，每皿中加入5ml合適濃度的Eco"菌懸液，在20W紫外燈下30cm處選擇20%卯％致死率的照射劑量照射菌懸液。第二步將稀釋倍數(shù)分別為104，105，106，107的經(jīng)過誘變的菌液，分別取O.lml接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基中，涂布均勻，置于3(TC培養(yǎng)4d后，選擇四周有透明水解圈的菌株于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上劃線分離，得到純培養(yǎng)。將純化后的菌株點種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上30'C培養(yǎng)3d,根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小進(jìn)行初篩。第三步根據(jù)初篩結(jié)果，挑選出水解圈與菌落直徑比值較大的菌株，接入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，3CTC培養(yǎng)3d，離心(3500r/min，10min)，上清酶液適當(dāng)稀釋后取lmL加到2mLl。/。的CMC溶液中，5(TC水浴中恒溫20min,立即取出置于沸水中保持5min，使酶失活，得到糖化液。取糖化液lmL，加入DNS試劑3mL，在沸水中顯色5min，冷卻后加蒸餾水21mL搖勻。在分光光度計上于人530nm處測定OD值，并與出發(fā)菌株的相應(yīng)OD值比較，得到2株優(yōu)良變異菌株EM1和EM2，其產(chǎn)酶活性分別是出發(fā)菌株的15.8、12.5倍。第四步從斜面上分別取大腸桿菌的優(yōu)良變異菌株EM1和EM2，以及從甜酒曲中分離的具有較強發(fā)酵能力的釀酒酵母Sl和S2菌株，分別接入液體培養(yǎng)基于3(TC培養(yǎng)6h進(jìn)行活化，然后用生理鹽水稀釋，用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)到108cell/ml。第五步稱取已平衡水分的稻草粉末10.0g，按固液比1:10加入1.0%的稀硫酸，于12rC下保溫2h，冷卻后用300/o的NH4HCO3調(diào)節(jié)pH4.05.0，分裝至4個250ml的錐形瓶中，于12rC下溫?zé)釡缇?0min后冷卻，在無菌操作箱中將EM1和Sl各按10%體積的量接種到一號瓶中，將EM1及S2接入二號瓶，EM2和S1，以及EM2和S2分別接入3號瓶、4號瓶中，放入3(TC恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h。取出各發(fā)酵液過濾，將濾液蒸餾，并用氣相色譜測定餾出液組分。各發(fā)酵瓶中乙醇含量列于表l中，乙醇含量最高可達(dá)7.65%。表l稻草纖維素混菌發(fā)酵液及餾出液中乙醇的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于該方法為a.從食草動物糞便中分離出能分解纖維素的大腸桿菌；以一定致死率的紫外線劑量對上述大腸桿菌誘變育種，選擇出具有高產(chǎn)酶活性的大腸桿菌突變株EM1和EM2；b.以EM1或EM2和從甜酒曲中分離的釀酒酵母S1或S2在一定溫度下混菌發(fā)酵經(jīng)粉碎和稀硫酸處理過的木質(zhì)纖維素2-4天，過濾后蒸出乙醇溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于所述一定致死率是20°/。卯％。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于木質(zhì)纖維素是水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、大麥秸稈、木屑、其它含纖維素植物莖、葉中的一種或多種的混合。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于發(fā)酵溫度為2040°C。全文摘要混菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的方法是一種采用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)燃料乙醇的方法，該方法為a.從食草動物糞便中分離出能分解纖維素的大腸桿菌；以一定致死率的紫外線劑量對上述大腸桿菌誘變育種，選擇出具有產(chǎn)酶活性的大腸桿菌突變株EM1和EM2；b.以EM1或EM2和從甜酒曲中分離的釀酒酵母S1或S2在一定溫度下混菌發(fā)酵經(jīng)粉碎和稀硫酸處理過的木質(zhì)纖維素2-4天，過濾后蒸出乙醇溶液。該方法解決纖維素混菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝及有關(guān)問題，以期降低生產(chǎn)成本，提高我國對資源充分合理應(yīng)用的技術(shù)，提高產(chǎn)能，降低對國際化石能源的依賴。文檔編號C12R1/865GK101333553SQ20081002084公開日2008年12月31日申請日期2008年7月29日優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日發(fā)明者仕翔鳴,焦秀鳳,蔣立建,香陳申請人:東南大學(xué)