專利名稱：小麥禾谷鐮刀菌莖腐病苗期接種鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥禾谷鐮刀菌莖腐病fOovwi od苗期快速接種鑒定方法，尤其是 對(duì)小麥抗莖腐病資源材料的篩選方法，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥鐮刀菌fykyahw/^是危害小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要致病菌之一。鐮刀菌可以引 起兩種主要的小麥病害即赤霉病6^ea/wa6J和莖腐病fcraw"ra"， 80年代后期 以來，由于全球氣候變化和耕作制度的影響，小麥赤霉病在歐洲、美國、加拿大、中 國、南美等地頻繁發(fā)生，對(duì)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的損失，為此人們對(duì)小麥赤霉 病已經(jīng)進(jìn)行了廣泛深入的研究，并取得了顯著的成就。我國是全球小麥赤霉病受害面 積最大的國家，主要致病菌為禾谷鐮刀菌fF^a〃'wngrflm/"efl陽附人長江中下游和華南 冬麥區(qū)及東北春麥區(qū)東部小麥赤霉病尤為嚴(yán)重，每年小麥赤霉病的發(fā)生面積已超過 700萬hm2，約占全國小麥總面積的1/4。但對(duì)由鐮刀菌引起的小麥莖腐病的研究在我 國尚沒有引起重視。而小麥莖腐病在澳大利亞、北美阿根廷、意大利、南非、土耳其 等地小麥種植區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，己經(jīng)引起當(dāng)?shù)匦←溣N和病理學(xué)者們的廣泛關(guān)注。美國小 麥莖腐病主要發(fā)生于氣候較溫暖的愛達(dá)荷州、俄勒岡州和華盛頓、科羅拉多州、懷俄 明州及德克薩斯州等西北太平洋各州，研究表明，許多引起小麥赤霉病的鐮刀菌如黃 色鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、銳頂鐮刀菌(F. culmorum, F. avenaceum, F.graminearum and F. acuminatum)也能引起小麥莖腐病，如在澳大利亞發(fā)現(xiàn)在同一田 塊小麥赤霉病和莖腐病同時(shí)發(fā)生。但是與小麥赤霉病的研究相比，小麥莖腐病抗性的 研究較少，對(duì)小麥莖腐病抗性鑒定及其抗性遺傳機(jī)制進(jìn)展緩慢。我國禾谷鐮刀菌約占鐮刀菌種或變種的94.5%，遍及21個(gè)省(市)，是導(dǎo)致目前小 麥赤霉病流行的優(yōu)勢鐮刀菌種，赤霉病危害區(qū)域逐年擴(kuò)大己波及黃淮海和西北等廣大 冬麥區(qū)，因此受到廣泛關(guān)注和研究，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病粒發(fā)芽率低，帶菌種子還 會(huì)造成苗枯及莖基部腐爛。而國外研究已經(jīng)表明，許多鐮刀菌gra"ri"eara", F cw/mwwm, F 禾口 A' w'w/e)可以弓I起小麥莖腐病(crown rot)，其中尤其以未谷鐮刀菌致病性最強(qiáng)。我國對(duì)小麥根部病害也有報(bào)道，在我國小麥赤霉病流行的部分地區(qū)具備小麥莖腐病發(fā)生的條件。但至今我國尚未詳細(xì)報(bào)道由禾谷鐮刀菌引起的小麥 莖腐病，而有關(guān)未谷鐮刀菌莖腐病的鑒定方法更沒有報(bào)道。鑒于近年來我國小麥鐮刀 菌引起的小麥赤霉病發(fā)病嚴(yán)重并有北方蔓延趨勢，因此，建立小麥禾谷鐮刀菌莖腐病的鑒定方法對(duì)篩選抗性資源和研究小麥莖腐病抗性機(jī)制等問題勢在必行。 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對(duì)我國小麥禾谷鐮刀菌莖腐病苗期鑒定方法的 空白，提供一種快速苗期高效鑒定小麥資源材料抗性的方法。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的小麥未谷鐮刀菌莖腐病苗期鑒定方法，其特征在于禾谷鐮刀菌菌種活化后于滅菌的0.6%綠豆湯培養(yǎng)基(mung bean agar,MBA) 25'C振蕩培養(yǎng)72h，多層紗布過濾，調(diào)節(jié)菌液濃度至1()S個(gè)孢子/mL懸浮 液。小麥種子經(jīng)0.1%升汞消毒10min后再用75%酒精消毒5min,無菌水沖洗3-4次。 在培養(yǎng)皿中催芽，種子萌發(fā)后播種于8X8cm營養(yǎng)缽中生長，營養(yǎng)缽中裝有經(jīng)過121 'C高壓滅菌40min的土壤，生長期溫度保持20-25°C/10-15°C (晝/夜)，小麥出苗后10d (播種后約13-14天)在每株幼苗莖基部距離土表約0.5-1.0cm處纏繞少量浸濕的醫(yī)用 脫脂棉球，在棉球內(nèi)側(cè)小麥莖部接觸處接種0.5mL己經(jīng)調(diào)整好濃度的孢子液，接種后 用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，并采用彌霧系統(tǒng)將接種幼苗置于近飽和的相對(duì)濕度下48h，而后 去除遮陽網(wǎng)幼苗正常生長管理。接種后35d對(duì)小麥莖基部進(jìn)行莖腐病調(diào)查。病情指數(shù) =S病情級(jí)別X該級(jí)株數(shù)/(調(diào)查總株數(shù)X最高病級(jí))]X 100% 。病情指數(shù)<10%為抗?。?病情指數(shù)10.01-20.0%為中抗；病情指數(shù)20.01-30.0%為中感；病情指數(shù)>30.01%為感病。 鑒定試驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每處理15株。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于在我國率先建立了小麥未谷鐮刀菌莖腐病抗性苗 期鑒定新方法。本發(fā)明對(duì)我國部分小麥育種資源和引自澳大利亞小麥禾谷鐮刀菌抗/ 感材料進(jìn)行鑒定取得了滿意結(jié)果。表明該方法可以用于快速篩選我國小麥資源中具有 禾谷鐮刀菌莖腐病抗性的小麥種質(zhì)資源，拓寬小麥資源利用。
具體實(shí)施方式
取保存的未谷鐮刀菌菌種在超凈工作臺(tái)上挑取一小塊菌絲接種在配制好的PDA 培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)上活化培養(yǎng)3天。然后挑取一小塊菌絲接種在滅菌后的0.6%綠豆湯液體培養(yǎng)基中(mungbeanagar,MBA)。在25。C控溫?fù)u床上180r/min振蕩 培養(yǎng)72h，多層紗布過濾，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)菌液濃度至105個(gè)孢子 /mL懸浮液，4'C保存?zhèn)溆?。小麥種子經(jīng)0.1 %升汞消毒10min后再用75%酒精消毒5min，無菌水沖洗3-4次。 在無菌操作下將種子在培養(yǎng)皿中催芽，培養(yǎng)皿中墊一層濾紙。種子萌發(fā)后播種于8X8cm營養(yǎng)缽中生長，營養(yǎng)缽中土壤經(jīng)過高溫高壓滅菌40分 鐘，冷卻后裝營養(yǎng)缽。生長期溫度保持20-25'C/10-15t:(晝/夜)。小麥出苗后10d (播種后約13-14天)在每株幼苗莖基部距離土表約0.5-1.0cm處 纏繞少量浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，在棉球內(nèi)側(cè)與小麥莖部接觸處接種0.5mL已經(jīng)調(diào)整好 濃度的孢子液，接種后用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，并采用彌霧系統(tǒng)或噴霧器在遮陽網(wǎng)上彌霧， 將接種幼苗置于近飽和的相對(duì)濕度下48h，而后去除遮陽網(wǎng)幼苗正常生長管理。接種后35d對(duì)小麥莖基部進(jìn)行莖腐病調(diào)查。病情指數(shù)E病情級(jí)別X該級(jí)株數(shù)/(調(diào) 査總株數(shù)X最高病級(jí))]X100X。病情指數(shù)<10%為抗病；病情指數(shù)10.01-20.0%為中抗； 病情指數(shù)20.01-30.0%為中感；病情指數(shù)>30.01%為感病。鑒定試驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每處 理15株。試驗(yàn)分別以澳大利亞小麥品種Sunco和Kennedy (V. Mitter,M. C. Zhang, C. J. Liu et al,. A high-throughput glasshouse bioassay to detect crown rot resistance in wheat germplasm, Plant Pathology , 2006,55, 433441)作為抗/感對(duì)照品種。依據(jù)病害程度調(diào)查結(jié)果，按照病害分級(jí)和病情指數(shù)對(duì)小麥資源進(jìn)行評(píng)價(jià)。如本試驗(yàn)中，部分材料鑒定結(jié)果如表l，在鑒定的35份材料中，不同時(shí)期鑒定結(jié) 果間相關(guān)性顯著(r=0.83)，表明該方法鑒定結(jié)果可靠。鑒定結(jié)果表明，5份材料病情 指數(shù)小于20%為中抗材料；8份材料病情指數(shù)介于20-30%，屬于中感材料，其余22 材料病情指數(shù)大于30%，為感病材料。未發(fā)現(xiàn)對(duì)禾谷鐮刀菌莖腐病高抗的材料。這表 明在小麥莖腐病抗性資源鑒定中需要進(jìn)一步擴(kuò)大種質(zhì)資源篩選范圍，為抗莖腐病育種 提供材料基礎(chǔ)。5表1小麥部分材料禾谷鐮刀菌莖腐病抗性評(píng)價(jià)莖腐病病情莖腐病病情平均病情 指數(shù)小麥材料名稱材料來源指數(shù)指數(shù)抗性評(píng)價(jià)(2007.4)C2007.10)BW264引進(jìn)品種35.1%33.4%34.25%SCI-12633引進(jìn)品系12.2%14.6%13.40%MRHeyme引進(jìn)品系41.0%31.2%36.10%SKalepwa引進(jìn)品系24.6%28.2%26.40%MSOvontun引進(jìn)品種45.4%36.2%40.80%SRenan引進(jìn)品系48.6%33.2%40.90%S安農(nóng)8455一般品種49.1%43.0%46.05%S澳麥引進(jìn)品種32.5%34.3%33.40%S白火麥地方品種45.8%37.2%41.50%S格蘭妮引進(jìn)品種32.1%24.3%28.20%MS關(guān)東107引進(jìn)品種41.3%35.3%38.30%S貴農(nóng)022-2一般品種40.4%43.8%42.10%S紅鈾子地方品種13.6%16.3%14.95%MR淮麥8號(hào)一般品種43.2%36.6%39.90%SJelee引進(jìn)品系28.4%28.6%28.50%MS荊^'H l號(hào)一般品種49.3%32.5%40.90%S魯麥.4號(hào)一般品種36.1%28.5%32.30%S農(nóng)林67引進(jìn)品種41.3%35.4%38.35%S生抗2號(hào)一般品種22.6%26.7%24.65%MS蘇麥3號(hào)地方品種27.2%26.4%26.80%MS皖麥18一般品種38.6%32.4%35.50%S望水白地方品種31.3%23.7%27.50%MS溫州紅和尚地方品種17.8%21.3%19.55%MR渦0102一般品種43.2%39.8%41.500/oS武麥1號(hào)一般品種41.3%44.5%42.90%S西風(fēng)引進(jìn)品種22.5%26.6%24.55%MS西南02335一般品種43.2%35.8%39.50%S揚(yáng)麥11一般品種26.5%22.6%24.55%MS揚(yáng)麥158一般品種39.3%32.6%35.95%SWildcat引進(jìn)品種36.7%26.3%31.50%S鄭卯23一般品種39.3%46.5%42.卯％S中國春地方品種44.4%39.2%41.80%S紫桿子地方品種21.4%17.3%19.35%MRSunco引進(jìn)品種18.10%16.20%18.10%MRKenedy引進(jìn)品種37.50%36.70%37.50%S注抗病(R);中抗(MR);中感(MS);感病(S)。權(quán)利要求
1、小麥禾谷鐮刀菌莖腐病苗期接種鑒定方法，其特征在于1)保存的禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)菌種在超凈工作臺(tái)上于PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，3天后挑取菌絲接種在經(jīng)過121℃高壓滅菌的質(zhì)量比0.6％綠豆湯液體培養(yǎng)基中，25℃條件下180轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)72h，過濾，調(diào)節(jié)菌液濃度至105個(gè)孢子/mL獲得禾谷鐮刀菌懸浮液；2)小麥種子于質(zhì)量比0.1％升汞中消毒10min后用體積比75％酒精消毒5min后，再用無菌水沖洗3-4次；3)小麥種子消毒后在培養(yǎng)皿中于25℃下萌發(fā)，種子萌發(fā)后播種于8×8cm營養(yǎng)缽中生長，營養(yǎng)缽中裝有經(jīng)過121℃高壓滅菌40min的土壤，生長期溫度保持晝20-25℃/夜10-15℃，小麥出苗后10天在每株幼苗莖基部距離土表約0.5-1.0cm處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球；4)在纏繞棉球內(nèi)側(cè)與小麥莖部接觸處接種0.5mL濃度為105個(gè)孢子/mL的禾谷鐮刀菌懸浮液，接種后用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，并采用彌霧器，將接種幼苗置于近100％飽和的相對(duì)濕度下48h，而后去除遮陽網(wǎng)，幼苗正常生長管理；5)接種35天后對(duì)小麥莖基部進(jìn)行莖腐病調(diào)查，按莖腐病病重指數(shù)分為0-5級(jí)，即0＝無明顯癥狀；1＝第一葉鞘褐枯小于葉鞘長度10％；2＝第一葉鞘褐枯占葉鞘長度11-25％；3＝第一葉鞘褐枯占葉鞘長度25-50％；4＝第二葉鞘有明顯褐枯；5＝第三葉鞘有明顯褐枯或全株枯死。以病情指數(shù)作為病害評(píng)價(jià)指標(biāo)。病情指數(shù)＝∑病情級(jí)別×該級(jí)株數(shù)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí))]×100％。病情指數(shù)＜10％為抗?。徊∏橹笖?shù)10.01-20.0％為中抗；病情指數(shù)20.01-30.0％為中感；病情指數(shù)＞30.01％為感病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥禾谷鐮刀菌莖腐病(Crown Rot)苗期接種鑒定方法，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，用于快速鑒定、篩選我國小麥資源中具有禾谷鐮刀菌莖腐病抗性的小麥種質(zhì)資源。禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)活化后接種在經(jīng)過121℃高壓滅菌的0.6％綠豆湯液體培養(yǎng)基中，25℃下在搖床中培養(yǎng)72h，獲得10⁵個(gè)孢子/mL禾谷鐮刀菌懸浮液；小麥種子消毒后催芽，萌發(fā)后播種在滅菌的土壤中，出苗后10天接種，接種35天后對(duì)小麥莖基部進(jìn)行莖腐病調(diào)查。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于建立了小麥禾谷鐮刀菌莖腐病苗期接種鑒定方法，為小麥禾谷鐮刀菌莖腐病研究提供了基礎(chǔ)?？煽焖俸Y選小麥抗性資源，提高小麥資源利用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101323875SQ20081002283
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日
發(fā)明者任麗娟, 余桂紅, 周淼平, 旭 張, 鵬 張, 燕 霍, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院