專利名稱：痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種痰中增殖誘導配體mRNA測定方法。
背景技術(shù)：
肺癌嚴重威脅人類的健康和生命，是人類致死的主要病因之一，且 發(fā)病率逐年增多。研究表明，肺癌的發(fā)生與基因表達變化有關(guān)，基因改變可涉及癌變的初始發(fā)生和后續(xù)發(fā)展。增殖誘導配體(a proliferation—inducing ligand， APRIL)是月中瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族中的一員，1998年首先由Hahne等發(fā)現(xiàn)并 克隆成功。APRIL在正常組織僅有少量表達，而在腫瘤特別是消化道腫瘤 (包括直腸、結(jié)腸、十二指腸)中呈高表達。已有研究證實，APRIL與腫 瘤的生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在體內(nèi)和體外均能剌激腫瘤細胞生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準確可靠，作為肺癌發(fā)生的檢測指標的 痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，其特征是包括下列步驟(1)引物合成依據(jù)Genebank收錄人APRIL mRNA和0 2微球蛋 白mRNA,用Primer Premier 5. 0軟件設計引物，其中APRIL和P 2M弓|物跨內(nèi)含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1個內(nèi)含子，^2M上游引 物跨越3811bp的第l個內(nèi)含子；APRIL上游引物:5， -ACT CTC AGT TGC CCTCTGGTTG-3， (819nt 840nt) ， APRIL下游引物5， -GGA ACT CTG CTC CGG GAG ACT C-3， (984nt 1005nt)，擴增片段長度187bp; 3 2M 上游引物5， —CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3， (119nt 136nt) ， P 2M 下游引物5， -GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3， (342 nt 360nt)，擴 增片段長度242bp;(2) APRIL定量質(zhì)粒標準品及0 2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建a) 標本收集及預處理收集對象晨起用清水漱口后，咳深部痰2 3 口于無菌痰盒內(nèi)，用力振蕩，混勻。痰內(nèi)加入適量0. 1%二硫蘇糖醇 解粘，振蕩液化10 20min至痰中無粘稠痰塊呈均勻液相后，用70ta尼 龍篩網(wǎng)過濾至10ml消毒玻璃管內(nèi)，4。C1200rpm離心8min，棄上清，管 底沉淀物用1X磷酸鹽緩沖液(PBS液)洗2遍，再用1XPBS液重懸， 制成細胞懸液，鏡下計數(shù)細胞，調(diào)細胞懸液濃度至1X107mL， -70°C 冰凍保存，留作RNA提取用；b) 總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄取預處理后痰標本細胞懸液0.8mL加 lmLTrizol提取總RNA，取總RNA 0. 8 u g，以特異性抓尾引物Oligo (DT) |8 為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后-2(TC保存；c) APRIL定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA 1用APRIL上、 下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀進行PCR擴增，反應條件為94。C 3min， 94°C 30s、 62°C 40s、 72。C30s， 33個循環(huán)，72。C延伸5min。 PCR產(chǎn)物 用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pGEM-T easy載體4。C連接12 16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a ，涂布于經(jīng)2%X-gal和20%IPTG 處理的含75 u g/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37。C倒置培養(yǎng)12 16h， 經(jīng)藍白斑篩選，白色菌落經(jīng)PCR初步鑒定后，陽性克隆進行測序分析， 將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀準確定量，并 進行10倍系列稀釋作為標準品，分裝后-2(TC保存；d) 32M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA 2ul，以PW上、 下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀擴增目的片段，其余步驟同APRIL定量 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建，得到IO倍系列稀釋0 2M定量質(zhì)粒標準品，分裝后 -20。C保存；(3)痰中APRIL mRNA含量測定將待測痰液用與步驟(2)相同 的標本收集及預處理、總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA;將其中 2ulcDNA模板加入18 iil PCR反應液，所述PCR反應液中含1XPCR buffer, 4. 0畫1/L MgCl2 , 0. 2腿ol/L dNTPs， APRIL上、下游引物各 0. 15 p mol/L， 20XSYBR Green I 0. 3 u 1 ， Taq DNA聚合酶1. 5U;混勻 后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì) 粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、 108、 107、 106、 105、 104copies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 APRIL PCR擴增，擴增參數(shù)為94。C預變性3min; 94°C 5s， 62°C 35s， 86°C ls讀取熒光度值，40個循環(huán)，測出待測樣本中APRIL準確含量； 另將2 ii lcDNA模板加入18 u 1 PCR反應液，所述PCR反應液中含1XPCR buffer, 4. O腿ol/L MgCl2 ， 0. 2畫1/L dNTPs， P 2M上、下游引物各 0. 15 ti mol/L， 20XSYBR Green I 0, 3 u 1 ， T叫DNA聚合酶1. 5U;混勻后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì)粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、 108、 107、 106、 105、 104COpies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 P2M PCR擴增，擴增參數(shù)為.94。C預變性3min; 94°C 5s， 60°C 35s， 81°C ls讀取熒光度值，40個循環(huán)；測出待測樣本中6^準確含量。本發(fā)明準確可靠，可作為肺癌發(fā)生的有效檢測指標。方法簡便、易 操作?？蔀榉伟┑呐R床診斷提供一種經(jīng)濟簡便而有效可行的輔助手段。 下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明作進一步說明。

圖1是APRIL標準品測序圖。圖2是APRIL標準品2%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3是PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。圖4是肺癌組肺炎組正常組APRIL mRNA表達水平圖。 圖5是痰脫落細胞檢查發(fā)現(xiàn)的鱗癌細胞圖。圖2中M:marker; 1 6:依次為3. 76X 109 3. 76X 104copies/ml APRIL標準品；B:空白對照。圖3中M:marker; 1、 2:肺癌APRIL擴增片段;3、 4:肺炎APRIL擴增 片段;5、 6:正常對照APRIL擴增片段7 9:p2M擴增片段；IO:空白對照。圖4中肺癌組分別與肺炎組和對照組比較P〈0.05， *肺炎組與對照組比較P〉0. 05。
具體實施例方式一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，包括下列步驟(1) 引物合成依據(jù)Genebank收錄人APRIL mRNA (注冊號AF 046888)和^微球蛋白(32 microgluobulin， M) mRNA (注冊號 NM004048)，用Primer Premier 5. 0軟件設計引物，其中APRIL禾np2M 引物跨內(nèi)含子，APRIL下游引物跨越327bp的第l個內(nèi)含子，^M上游 引物跨越3811bp的第1個內(nèi)含子。APRIL上游引物5， -ACT CTC AGT TGC CCTCTGGTTG-3， (819nt 840nt) ， APRIL下游引物5， -GGA ACT CTG CTC CGG GAG ACT C-3， (984nt 1005nt)，擴增片段長度187bp; P 2M 上游引物:5， -CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3， (119nt 136nt) ， P 2M 下游引物5， -GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3， (342 nt 360nt)，擴 增片段長度242bp，均由上海生物工程公司合成。(2) APRIL定量質(zhì)粒標準品及P2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建 a)標本收集及預處理收集對象晨起用清水漱口后，咳深部痰2 3 口于無菌痰盒內(nèi)，用力振蕩，混勻。痰內(nèi)加入適量0. 1%二硫蘇糖醇 (dithiothreitol， DTT Promega公司)解粘，振蕩液化10 20min至 痰中無粘稠痰塊呈均勻液相后，用70陶尼龍篩網(wǎng)過濾至10ml消毒玻 璃管內(nèi)，4"C1200rpm離心8min，棄上清，管底沉淀物用1 X磷酸鹽緩沖 液(PBS)液洗2遍，再用1XPBS液重懸，制成細胞懸液，鏡下計數(shù)細 胞，調(diào)細胞懸液濃度至1X107mL，分別取20W涂片2張，做蘇木素-伊紅染色(HE染色)，行常規(guī)細胞學檢查；余下細胞懸液-7(TC冰凍保存，留作RNA提取用。b) 總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄取預處理后痰標本細胞懸液0.8ml加 lmlTrizol提取總RNA，取總RNA 0. 8 u g，以特異性抓尾引物Oligo (DT) 18 為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后-2(TC保存；c) APRIL定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA 2ul用APRIL上、 下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀(美國MJ公司)進行PCR擴增，反應條 件為94°C 3min， 94°C 30s、 62°C 40s、 72。C30s， 33個循環(huán)，72。C延 伸5min。 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pGEM-T easy載體 4。C連接12 16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布于經(jīng)2 O/a-gal和20%IPTG處理的含75 u g/ml氨節(jié)青霉素的LB平皿上，37°C 倒置培養(yǎng)12 16h，經(jīng)藍白斑篩選，白色菌落經(jīng)PCR初步鑒定后，陽性 克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質(zhì)粒，用核酸蛋白 分析儀準確定量，并進行10倍系列稀釋作為標準品，分裝后-2(TC保存；d) P2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA2ul，以上、 下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀擴增目的片段，其余步驟同APRIL定量 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建，得到10倍系列稀釋P2M定量質(zhì)粒標準品，分裝后 -20。C保存；(3)痰中APRIL mRNA含量測定將待測痰液用與步驟(2)相同 的標本收集及預處理、總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA;將其中 2ulcDNA模板加入18p1 PCR反應液，所述PCR反應液中含1XPCR buffer, 4. 0,1/L MgCL , 0. 2鵬ol/L dNTPs， APRIL上、下游引物各 0. 15umol/L， 20XSYBR Green I 0. 3u 1 , Taq DNA聚合酶1. 5U;混勻后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì)粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、 10H、 107、 10fi、 105、 104COpies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 APRIL PCR擴增，擴增參數(shù)為94。C預變性3min; 94°C 5s， 62°C 35s， 86°C ls讀取熒光度值，40個循環(huán)，測出待測樣本中APRIL準確含量； 另將2u lcDNA模板加入18 u 1 PCR反應液，所述PCR反應液中含1XPCR buffer, 4. 0腿ol/L MgCl2 , 0. 2腿ol/L dNTPs， P 2M上、下游引物各 0. 15u mol/L， 20XSYBR Green I 0. 3 u 1 ， Taq DNA聚合酶1. 5U;混勻 后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì) 粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、 108、 107、 106、 105、 10Vopies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 0 2MPCR擴增，擴增參數(shù)為94。C預變性3min; 94°C 5s， 60°C 35s， 81°C ls讀取熒光度值，40個循環(huán)；測出待測樣本中e2M準確含量?？筛鶕?jù)各自標準品建立標準曲線，計算待測樣本中APRIL或^ 2M準 確含量，以所測APRIL mRNA和3 2M mRNA含量的比值作為評價APRIL 表達水平的指標。熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析將實時熒光PCR反應產(chǎn)物同時進 行熔解曲線分析和2%瓊脂糖凝膠電泳。熔解曲線分析模式為溫度以 0. rC/s變化速度從70。C升至95。C，全程記錄熒光值，最后設置3(TC 20s， 由實時熒光定量PCR儀自動繪制熔解曲線。統(tǒng)計學處理:應用SPSS 11. 5統(tǒng)計分析軟件包，計量資料采用t檢驗， 并分別計算均數(shù)(；)、標準差(s)和變異系數(shù)，所得結(jié)果表示為均數(shù)土標準差G士S);計數(shù)資料采用X2檢驗，顯著性差異的概率均設為P〈0.05。 還取南通大學附屬醫(yī)院胸外科和呼吸內(nèi)科住院患者共42例。分為肺癌組22例，男19例，女3例，年齡35 78歲，平均66. 8歲，均經(jīng)本 院病理科病理確診；肺炎組20例，男16例，女4例，年齡28 72歲， 平均67.8歲，均經(jīng)本院呼吸內(nèi)科臨床確診。并收集12例健康成人痰標 本作為正常對照組，其中男8例，女4例，年齡25 63歲，平均55.2 歲。所有標本的收取均得到受試者的知情同意。采用上述方法進行APRIL 表達水平分析，見圖4。
權(quán)利要求
1. 一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，其特征是包括下列步驟(1)引物合成依據(jù)Genebank收錄人APRIL mRNA和β2微球蛋白mRNA，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，其中APRIL和β2M引物跨內(nèi)含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1個內(nèi)含子，β2M上游引物跨越3811bp的第1個內(nèi)含子；APRIL上游引物5’-ACT CTC AGT TGCCCT CTG GTT G-3’(819nt～840nt)，APRIL下游引物5’-GGA ACT CTGCTC CGG GAG ACT C-3’(984nt～1005nt)，擴增片段長度187bp；β2M上游引物5’-CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3’(119nt～136nt)，β2M下游引物5’-GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3’(342nt～360nt)，擴增片段長度242bp；(2)APRIL定量質(zhì)粒標準品及β2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建a)標本收集及預處理收集對象晨起用清水漱口后，咳深部痰2～3口于無菌痰盒內(nèi)，用力振蕩，混勻。痰內(nèi)加入適量0.1％二硫蘇糖醇解粘，振蕩液化10～20min至痰中無粘稠痰塊呈均勻液相后，用70μm尼龍篩網(wǎng)過濾至10ml消毒玻璃管內(nèi)，4℃1200rpm離心8min，棄上清，管底沉淀物用1×磷酸鹽緩沖液(PBS液)洗2遍，再用1×PBS液重懸，制成細胞懸液，鏡下計數(shù)細胞，調(diào)細胞懸液濃度至1×106/mL，-70℃冰凍保存，留作RNA提取用；b)總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄取預處理后痰標本細胞懸液0.8mL加1mLTrizol提取總RNA，取總RNA 0.8μg，以特異性抓尾引物Oligo(DT)18為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后-20℃保存；c)APRIL定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA 2μl用APRIL上、下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀進行PCR擴增，反應條件為94℃ 3min，94℃30s、62℃40s、72℃30s，33個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pGEM-T easy載體4℃連接12～16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于經(jīng)2％X-gal和20％IPTG處理的含75μg/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12～16h，經(jīng)藍白斑篩選，白色菌落經(jīng)PCR初步鑒定后，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀準確定量，并進行10倍系列稀釋作為標準品，分裝后-20℃保存；d)β2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建取上述cDNA 2μl，以β2M上、下游引物于PTC-200 PCR循環(huán)儀擴增目的片段，其余步驟同APRIL定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建，得到10倍系列稀釋β2M定量質(zhì)粒標準品，分裝后-20℃保存；(3)痰中APRIL mRNA含量測定將待測痰液用與步驟(2)相同的標本收集及預處理、總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA；將其中2μlcDNA模板加入18μl PCR反應液，所述PCR反應液中含1×PCRbuffer，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，APRIL上、下游引物各0.15μmol/L，20×SYBR Green I 0.3μl，Taq DNA聚合酶1.5U；混勻后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì)粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、108、107、106、105、104copies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行APRIL PCR擴增，擴增參數(shù)為94℃預變性3min；94℃ 5s，62℃ 35s，86℃ 1s讀取熒光度值，40個循環(huán)，測出待測樣本中APRIL準確含量；另將2μlcDNA模板加入18μl PCR反應液，所述PCR反應液中含1×PCRbuffer，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，β2M上、下游引物各0.15μmol/L，20×SYBR Green I 0.3μl，Taq DNA聚合酶1.5U；混勻后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質(zhì)粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為109、108、107、106、105、104copies/ml的質(zhì)粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行β2M PCR擴增，擴增參數(shù)為94℃預變性3min；94℃ 5s，60℃ 35s，81℃ 1s讀取熒光度值，40個循環(huán)；測出待測樣本中β2M準確含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，包括引物合成、APRIL定量質(zhì)粒標準品及β₂M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建、痰中APRILmRNA含量測定等步驟。本發(fā)明準確可靠，可作為肺癌發(fā)生的有效檢測指標。方法簡便、易操作?？蔀榉伟┑呐R床診斷提供一種經(jīng)濟簡便而有效可行的輔助手段。
文檔編號C12Q1/68GK101265498SQ20081002328
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者丁偉峰, 孫寶蘭, 景蓉蓉, 俐 朱, 王惠民, 褚少朋 申請人:南通大學附屬醫(yī)院