專利名稱：：新構建的高產蘋果酸基因工程菌及其生產蘋果酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一抹高產蘋果酸重組菌抹的構建，還涉及利用該菌林發(fā)酵生產蘋果酸的方法。
背景技術：
：蘋果酸是人體內部循環(huán)的重要中間產物，易被人體吸收，因此作為優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應用于食品、醫(yī)療和保健等領域。目前蘋果酸生產以富馬酸或馬來酸為原料，加壓與水蒸汽共熱形成DL-蘋果酸，也可以糠醛為原料，經雙氧水處理，在超聲波作用下轉變而成?；瘜W法由于生產工藝比較復雜，工藝條件要求高，分離精制技術難度大，加之原料為化工產品，成本高和環(huán)境污染等原因使得蘋果酸的應用受到限制。蘋果酸的生物合成法包括Sim化轉化法和微生物發(fā)酵法。20世紀卯年代中期出現(xiàn)的酶催化轉化法一般都是以富馬酸為底物，利用具有高活性富馬酸酶的微生物細胞或富馬酸酶，采用細胞反應器或固定化酶，將富馬酸轉化成L-蘋果酸。但原料富馬酸供應不足，且價格昂貴，限制了該方法的應用前景。隨著石油危機的出現(xiàn)，使得人們加大了對微生物發(fā)酵法制備蘋果酸的研究力度，這一時期人們用來發(fā)酵制備蘋果酸的微生物主要是霉菌，其中黃曲霉^a/^v"為重點研究的對象，具體包括黃曲霉^yA/7flvw,末曲霉爿平oo^"e,寄生曲霉y^.戸m礎dTakao等報道先用少糾艮霉(///邵"5fl/h'/r/認)或華根霉(及Wzo/7mc/u'"e"j&)把糖質原料轉化成富馬酸，然后利用膜醭畢赤酵母(i^c/ia附e附6roweflcybc/giw々c/ew力、普通變形軒菌(pro&"j1vw/gar/5)及宛氏4以青審(pacc/o附y(tǒng)cesvan'o")之一，把富馬酸轉化成L-蘋果酸的研究，但轉化率不高(J.Ferment.Techno,1983，61:643-645)。山東食品發(fā)酵工程實驗室等人多年來致力于直接發(fā)酵法生產L-蘋果酸的研究，并且從土壤中分離篩選、誘變獲得一林直接利用淀粉質原料生產L-蘋果酸的高產菌林^perg/〃^y7aviwHA5800,經條件優(yōu)化，7000升發(fā)酵罐產酸達8.68%,糖酸轉化率達83.5%，發(fā)酵周期112小時，為L-蘋果酸產業(yè)化奠定了基礎。(中國食品添加劑，2003，3:52-56)。發(fā)酵法生產蘋果酸可以利用可再生資源(葡萄糖，淀粉等)和二氧化碳，不僅擺脫了對石化原料的依賴，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑。因此，以微生物發(fā)酵法生產蘋果酸的研究與開發(fā)正在美國、日本等國家深入地進行著。但霉菌生長速度慢，產品生產強度偏低，開發(fā)對營養(yǎng)條件需求簡單、生長迅速、收率高的蘋果酸酸生產菌抹是加速生物法替代石化法生產的關鍵。利用大腸桿菌來發(fā)酵生產蘋果酸，是利用了大腸桿菌生長快速、培養(yǎng)條件簡單、安全性好、易操作易改造等諸多優(yōu)點，實現(xiàn)蘋果酸優(yōu)質高產工業(yè)化生產的方向。而提高大腸桿菌的發(fā)酵產酸能力，可以用多種方法，包括重新篩選優(yōu)良菌^f朱、通過傳統(tǒng)的物理化學方法進行菌種誘變以及用現(xiàn)代遺傳育種技術、基因工程方法來提高菌種的產酸能力等。SoonHoHong等人報道了構建產琥珀脧基因工程菌的方法，原理是敲除野生大腸桿菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)和乳酸脫氫酶基因(LDH)，減少甚至不產副產物曱酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代謝流流向琥珀酸(BiotechnolBioeng，2001，74:89-95)。在此基礎下，如果能夠敲除FUM,則可以阻斷蘋果酸到富馬酸的反應，使產物以蘋果酸的形式積累。采用基因工程手段構建高產蘋果酸的大腸桿菌以及利用該基因工程菌用于厭氧發(fā)酵生產蘋果酸的方法未見公開，而這種應用將大大推進蘋果酸產業(yè)的進步和發(fā)展。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種能高產蘋果酸的基因工程菌抹及其構建方法，并利用該菌抹厭氧發(fā)酵生產蘋果酸，達到菌林的構建方法簡單方便，構建得到的菌林發(fā)酵方法簡單可行，易于工業(yè)化，產酸能力強的目的，從而大大降低生產成本，提高經濟效益。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案1、高產蘋果酸基因工程菌抹Esc/ze/7'cWaco/ZJM127的構建本發(fā)明構建到的基因工程菌林，分類命名為埃希氏菌屬大腸埃希氏菌EscAm'c/^co//JM127，其保藏號登記號為CGMCCNo.2300。本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll為出發(fā)菌抹，利用同源重組技術敲除富馬酸酶FUM基因，并過量表達蘋果酸酶后，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得￡sc;lmcWflco//JM127,重組菌林的代謝途徑如圖1所示。具體步驟如下(1)利用同源重組技術敲除富馬酸酶FUM基因本發(fā)明以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統(tǒng)，并設計兩端帶有FUM同源片段的擴增引物，成功擴增出線性DNA同源片段；同時，在出發(fā)菌林中導入能夠誘導表達X重組酶的質粒，使在電轉入線性DNA片段后，可以抑制菌體內部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時進行同源重組，通過抗性篩選獲得陽性重組子；然后，利用FRT位點的存在，敲除抗性基因。本發(fā)明利用諸導表達FLP重組酶后成功將抗性基因敲除，達到無痕敲除的目的，其中實現(xiàn)過程如下導入能夠誘導產生FLP重組酶的質粒，在誘導后，利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經敲除抗性的菌抹；(2)過量表達蘋果酸酶，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得Ey^e/7'c;^co//JM127:合成一對5，端帶有酶切位點的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴增出的#」基因后，表達質粒pTrc99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-s/";將質粒pTrc99a"/d導入之前消除安普霉素抗性菌抹的感受態(tài)，獲得的陽性轉化子即為Esr/jer/c/j/aco/z'JM127;在成功敲除FUM基因后，超量表達蘋果酸酶，恢復在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。2、基因工程菌林^c/ier/c/n'aco//JM127的發(fā)酵生產蘋果酸厭氧發(fā)酵過程中產生大量諸如乙酸等對菌林有毒害作用的副產物，因此考慮采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進行產酸發(fā)酵。也可選擇性地采用膜分離技術，達到分離菌體的目的，再進而用于厭氧發(fā)酵。具體步驟為采用兩階段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD6(M)=3左右時，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵?；蛘撸捎脙呻A段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD600=3左右時，經膜處理后，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。發(fā)酵結果表明新構建的重組大腸桿菌Esc/^WcWaco/z'JM127能大量積累蘋果酸，富馬酸、丁二酸積累較少，相比出發(fā)菌林的終產物為丁二酸，且無蘋果酸積累的特征，新構建的重組大腸桿菌Esc/er/c/H'flJM127產酸特征變化巨大。而采用膜過濾后轉接厭氧發(fā)酵48h,17.5g/L初始葡萄糖可產9.7g/L蘋果酸。未經膜處理的也能達到8.1g/L的蘋果酸，得率46%，生產強度0.17g/(L'h)。當以80g/L葡萄糖為初始糖濃度時，蘋果酸產量最高，為29.5g/L。本發(fā)明的有益效果在于利用代謝工程手段，對大腸桿菌進行目標產物途徑的強化，以及切斷副產物的生成途徑，使代謝流更多地流向蘋果酸。并利用該菌林進行兩階IL^酵實驗，結果顯示可生產較高濃度的蘋果酸，為利用大腸桿菌工業(yè)化生產蘋果酸打下基礎0圖1￡^m-c/.flco//JM127的代謝途徑圖2線性DNA片段的電泳鑒定圖圖3同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖圖4NZN111(pTrc99a-s/d)敲除富馬酸酶前后的有沖幾酸產物比較本發(fā)明的微生物保藏日期為2007年12月25日，保藏單位全稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.2300。具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例1本實施例說明利用同源重組技術敲除親本大腸桿菌NZN111中富馬酸酶/ww基因，得到消除安普霉素抗性菌林的過程。1、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZN111至OD60o=0.4~0.6，制備成電轉感受態(tài)。2、將重組質粒電轉入感受態(tài)的大腸桿菌NZNlll。電擊條件為200Q,25jiF，電擊電壓2.3kV，電擊時間4~5ms。電擊后迅速將菌體加入預冷1mL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30'C培養(yǎng)1h之后涂布于帶氨節(jié)青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉化子NZNlll(pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30'C下誘導質粒pKD46表達出X重組酶，制成電轉感受態(tài)。4、以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為4莫板，利用高保真PCR擴增系統(tǒng)，以質粒pIJ773為模板，并設計兩端帶有FUM同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片^殳，引物序列如下上游帶同源臂引物Hl-Pl,下劃線為同源片段5'-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5，-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'反應體系帶同源臂的上下游引物(100pmol4iL)各0.5^L;模板DNA(100ng4iL)0.5nL;10xbuffer5dNTPs(10mM)各1DMSO(100%)2.5^L;PyrobestDNA聚合酶(2.5U/pL)1ddH2036/35.5總體積50^L。反應條件94°C,2min;(94°C，45sec;50°C，45sec;72°C，90sec;IO個循環(huán))；(94°C,45sec;55°C,45sec;72。C,卯sec;15個循環(huán))；72X:,5min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉線性DNA片段至已誘導表達X重組酶的NZNUl(pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制備成感受態(tài)后倒入能誘導表達FLP重組酶的質粒pCP20,于42'C熱激表達FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經敲除抗性的菌株。敲除了富馬酸酶后的有>^酸產物比4交如圖4所示。實施例2本實施例說明構建超量表達蘋果酸酶的表達質粒，恢復重組菌林在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到菌林^c/er/cWaco//JM127的過程。1、構建超量表達蘋果酸酶的表達質粒，其過程包括(i)合成帶有ivcoi和/z/mnn酶切位點的引物，上游引物5'-CATGCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGTG誦3，下游引物5，-CCCAAGCTTTTAGATGGAGGTACGGC-3，(2)以大腸桿菌K12為模板，菌落PCR，反應條件為95。C，1.5min，63。C，l.Omin,72°C，1.5min，共35個循環(huán)。純化擴增出的s/"基因后，表達質粒pTrc99a分別用iVcoI和歷m/HI雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-s/c丄2、將質粒pTrc99a-s/d導入實施例1中消除安普霉素抗性菌抹的感受態(tài)。獲得的陽性轉化子即為本發(fā)明的新構建菌抹EscAen'cWaco//JM127。實施例3本實施例說明新構建的重組大腸桿菌JM127與NZN111(pTrc99a-s/d)發(fā)酵產酸能力的對比。大腸桿菌NZN111(CGSC7726)當導入質粒pTrc99a-s/d，過量表達蘋果酸酶基因，恢復了NZN111在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，且有高產量的琥珀酸積累。構建的重組大腸桿菌￡^^/^/00)//1^127，在無氧條件下生長時，它產蘋果酸，富馬酸，琥珀酸，乙酸的混合酸，其中蘋果酸是主要產物。為了考察富馬酸酶活性降低后對產酸的影響，采用兩階段發(fā)酵模式，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD600=3左右時，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(卡那霉素30pg/mL)+amp(氨節(jié)青霉素100ng/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100ng/mL)發(fā)酵結果見表l。表l敲除富馬酸酶對NZNlll(pTrc99a-sfcA)發(fā)酵產酸的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注ND表示未檢測到實施例4本實施例說明將膜處理方法應用到新構建的重組大腸桿菌Esd^/"/cWaco//JM127發(fā)酵生產蘋果酸的產酸能力比較。大腸桿菌￡^^/￡^"0/〃1^127,在有M酵階段產生一定量乙酸，會影響第二階段厭氧發(fā)酵過程菌體的生長，因此采用膜過濾處理，截流下菌體后，經洗脫后作為接種物進行厭氧發(fā)酵。為了考察其對菌體生物量及產物的影響，采用兩階段發(fā)酵模式，按l。/。(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD柳至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD6(wr3左右時，經膜處理后，轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h，并以不經膜處理的接種物作為對照。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)發(fā)酵結果見表2。表2膜處理后對JM127發(fā)酵產酸及菌體生物量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注ND表示未檢測到實施例5本實施例中考察了大腸桿菌Eyc/ieWcWaco//JM127對葡萄糖耐受性。隨著起始葡萄糖濃度的提高，80g/L葡萄糖下，單位體積的菌體量基本不變，進一步提高葡萄糖濃度，菌體生長受到抑制，見表3。同時對不同濃度下蘋果酸的產量進行了考察。采用兩階段發(fā)酵模式，按l。/o(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD6oo至0.8-1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD600=3左右時，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+kan(30ng/mL)+amp(100pg/mL)厭氧階段培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸鎂(15g/L)十kan(30pg/mL)+amp(100pg/mL)發(fā)酵結果見表3。表3不同葡萄糖濃度下JM127的產蘋果酸能力<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種高產蘋果酸的基因工程菌，其分類命名為埃希氏菌屬大腸埃希氏菌EscherichiacoliJM127，其保藏號登記號為CGMCCNo.2300。2、一種構建權利要求1所述高產蘋果酸的基因工程菌的方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因(LDH),丙酮酸曱酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll為出發(fā)菌林，利用同源重組技術敲除蘋果酸酶(FUM)基因，并過量表達蘋果酸酶后，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得大腸桿菌五jc/m'c//"co//JM127。3、根據(jù)權利要求2所述的構建大腸桿菌￡^/jer/c//aco//JM127的方法，其特征包括以下構建步驟1)利用同源重組技術敲除蘋果酸酶(FUM)基因以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統(tǒng)，并設計兩端帶有FUM同源片段的擴增引物，成功擴增出線性DNA同源片段；在出發(fā)菌抹中導入能夠誘導表達X重組酶的質粒,使在電轉入線性DNA片段后，可以抑制菌體內部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時進行同源重組，通過抗性篩選獲得陽性重組子；導入能夠誘導產生FLP重組酶的質粒，在誘導后，利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經敲除抗性的菌林。2)過量表達蘋果酸酶，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得大腸桿菌■Esc/zm'c/j/aco//JM127。合成一對5'端帶有酶切位點的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴增出的基因后，表達質粒pTrc99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-s/cA將質粒pTrc99a"/"導入之前消除安普霉素抗性菌林的感受態(tài)，獲得的陽性轉化子即為Esc/eWc/z/flco//JM127;在成功敲除FUM基因后，超量表達蘋果酸酶，恢復在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。4、一種利用權利要求1所述的高產蘋果酸的基因工程菌五sc^n'c/n'aco"JM127發(fā)酵生產蘋果酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產酸。5、根據(jù)權利要求4所述的采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD6oo至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG談導至OD60o=3左右時，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。6、一種利用如權利要求4所述的高產蘋果酸的基因工程菌J^c/zen'c//aco//JM127發(fā)酵生產蘋果酸的方法，其特征在于發(fā)酵在經歷有氧發(fā)酵階段后采用膜分離過程，再進而用于厭氧發(fā)酵。7、根據(jù)權利要求6所述的采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當有氧培養(yǎng)菌體OD600至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG誘導至OD6o。-3左右時，經膜處理后，按接種量10%轉接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。8、根據(jù)權利要求6和7所述的膜分離過程，其特征在于采用的膜為微濾膜。全文摘要本發(fā)明公開了一種構建高產蘋果酸基因工程菌株EscherichiacoliJM127的方法及其產酸的方法，其構建過程主要包括失活或敲除兼性微生物中具有使蘋果酸脫水反應和降解丙酮酸能力的酶，并超量表達NAD再生的酶。利用已構建的一株大腸桿菌進行兩階段發(fā)酵實驗，其步驟如下(1)將活化的大腸桿菌接種于富集培養(yǎng)基，好氣培養(yǎng)，提高生物量；(2)將有氧培養(yǎng)得到的菌液膜處理后，轉接于含有20～100g/L葡萄糖，一定濃度碳酸鹽的LB培養(yǎng)基中，厭氧發(fā)酵生產蘋果酸。文檔編號C12N9/04GK101255405SQ200810023410公開日2008年9月3日申請日期2008年4月11日優(yōu)先權日2008年4月11日發(fā)明者麗于,岷姜,歐陽平凱,王益娜,陳可泉,萍韋,馬江鋒,黃秀梅申請人:南京工業(yè)大學