專利名稱：蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取單糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程中的木質(zhì)纖維原料酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及經(jīng)蒸汽爆破 預(yù)處理后的木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制備單4t的方法。二、 背景技術(shù)纖維素和半纖維素可以水解生成葡萄糖和木糖，被稱為糖平臺(tái)化合物，是生 物化工的基礎(chǔ)原料。木質(zhì)纖維原料是自然界最豐富的生物質(zhì)原料，主要由纖維素、半纖維素和木 質(zhì)素構(gòu)成，分別約占干重的45%、 30%和25%左右。其中，纖維素是由^:千至上 萬(wàn)個(gè)(3 - D - (+)葡萄糖單元通過(guò)(3-1 ， 4糖戒鍵結(jié)合而成的線形葡聚糖鏈，具有緊 密的周期性晶格分子束結(jié)構(gòu)，分子大小為6000 ~ 12000個(gè)殘基；半纖維素是木質(zhì) 纖維中非纖維素的碳水化合物，是一種具有高度分枝結(jié)構(gòu)的不均一多聚糖，分子 大小為50~400個(gè)殘基，主鏈分別為p-D- (1,4)木聚糖苷鏈和葡甘聚糖鏈，主要 為木糖基，尤其在農(nóng)林廢棄木質(zhì)纖維資源中的含量十分豐富。在天然木質(zhì)纖維原料中，纖維素和半纖維素均不溶于水和一般有機(jī)溶劑，它 們和木質(zhì)素相互粘合形成緊密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維素和半纖維素難以生物降 解。因此，采用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理技術(shù)破壞木質(zhì)纖維原料的天然結(jié)構(gòu)，解除木質(zhì)素的 包裹作用和降低纖維素與半纖維素的聚合度是它們高效水解的前提。木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理技術(shù)主要有物理法(如機(jī)械研磨法、輻射法和蒸汽 法)化學(xué)法(如酸法、堿法、氧化法和有機(jī)溶劑法)、生物法(微生物腐朽法、 酶處理法)和聯(lián)合法(如高溫機(jī)械磨碎法、堿-機(jī)械磨碎法、直接蒸汽爆破法、 S02-蒸汽爆破法、NH3-蒸汽爆破法、H202 -蒸汽爆破法和C02-蒸汽爆破 法)。其中，蒸汽爆破法被公認(rèn)為是目前最為經(jīng)濟(jì)和清潔的木質(zhì)纖維原料預(yù)處理 技術(shù)。在蒸汽爆破的過(guò)程中，通過(guò)高溫、高壓蒸汽的作用纖維素和半纖維素發(fā)生 部分降解，導(dǎo)致結(jié)晶度和聚合度下降，同時(shí)木質(zhì)素橫向連結(jié)強(qiáng)度下降，甚至部分 軟化可塑；然后，當(dāng)物料驟然減壓噴放時(shí)，木質(zhì)纖維孔隙中的高壓蒸汽瞬間劇烈 膨脹，將原料撕裂成細(xì)小纖維，同時(shí)部分剝離木質(zhì)素，從而有效地^波壞細(xì)胞結(jié) 構(gòu)，暴露纖維素和半纖維素，提高它們的水解效率。經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理后，木 質(zhì)纖維原料中約30%的半纖維素、10%的纖維素和部分木質(zhì)素降解成為水溶性 的木低聚糖、纖維寡糖、少量的單糖和多種發(fā)酵抑制物，如甲酸、醋酸、糠醛、 羧曱基糠醛、乙酰丙酸、丁香醛和香草醛等木質(zhì)素衍生物，所以洗滌分離對(duì)于提 高固體原料在后續(xù)工序中的利用效率是十分必要的，同時(shí)充分利用洗滌液中水溶 性的糖組分，尤其是木低聚糖，是木質(zhì)纖維原料生物加工商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 之— 3可采用酸水解法或酶水解法將木低聚糖和纖維寡糖水解成木糖和葡萄糖而加 以生物利用，如CN 1629321《利用秸稈植物提取制乙醇用葡萄糖和/或木糖的方 法》等，但是酸水解法需要強(qiáng)烈的無(wú)機(jī)酸和高溫條件，不僅對(duì)設(shè)備和工藝操作條 件要求高，而且新生成大量的發(fā)酵抑制物，嚴(yán)重地影響后續(xù)的發(fā)酵和廢水處理工 序。與之相比，利用酶水解法，如添加纖維素酶和木聚糖酶等，反應(yīng)條件溫和， 也不生成新的抑制物，因而具有顯著的優(yōu)勢(shì)，是目前發(fā)展的方向。CN 1884569《木糖的酶法制備方法》和CN 1952162A《蒸汽爆破與超孩i粉 碎協(xié)同預(yù)處理提高稻草酶解率的方法》等主要涉及利用單一的酶產(chǎn)品對(duì)單一木 聚糖或者固體原料部分的酶水解。由于在蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料的水溶物中同時(shí)含有木低聚糖和纖維寡糖，再 加上酶解過(guò)程中存在著木糖和葡萄糖等顯著的產(chǎn)物抑制作用，所以，如何解決蒸 汽爆破木質(zhì)纖維原料的高效酶解問(wèn)題，是產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的 一個(gè)重要課題。迄今為 止，未見(jiàn)此類專利技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。三、 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水溶物中糖類的組成特點(diǎn)，根據(jù) 木聚糖酶、纖維素酶和糖芬酶的協(xié)同作用機(jī)理，提供一種高效、清潔的蒸汽爆破 木質(zhì)纖維原料水溶性低聚糖類同步酶解制取單糖的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取單糖的方法，將木質(zhì) 纖維原料進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，經(jīng)常溫水洗后進(jìn)行同步酶解，其特征是a. 將水洗液濃縮、分離去除不溶物，取上清液并調(diào)節(jié)控制濃縮液中糖類物 質(zhì)的總濃度為1.0 3.0。/o和pH值為4.5 5.5后進(jìn)行同步酶解；b. 在濃縮液中添加3.0-6.0 U/mL木聚糖酶、0.05~0.5 FPU/mL纖維素酶和 0.4~1.0 U/mL (3 -葡萄糖苷酶后進(jìn)行同步酶解。如上所述，其特征是同步酶解在50 ± 1°。和80-150卬m的條件下進(jìn)4亍48~72h。如上所述，其特征是木聚糖酶和纖維素酶的生產(chǎn)菌抹為里氏木霉 (7h'c/zoi/er應(yīng)，， ) Rut C30;如上所述，其特征是P-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌林為黑曲霉(爿^wg/〃附 w/ger )。具體制取過(guò)程及工藝參數(shù)參見(jiàn)實(shí)施例。四

圖1為不同的酶組合方式酶解蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水溶性低聚糖的比較結(jié) 果，反應(yīng)條件是總糖濃度為6~8%,酶的用量分別為3.0-6.0 U/mL木聚糖酶， 用"X"表示；0.08 0,8 FPU/mL纖維素酶，用 "C，， 表示；1.0 1.6 U/mL P陽(yáng)葡 萄糖普酶，用"BG"表示。50°C ± 1和80 150rpm振蕩酶解48 72h;圖2為不同用量的組合酶酶解蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水溶性低聚糖的比較結(jié) 果，反應(yīng)條件是總糖類濃度為6~8%,組合酶的用量分別為2x、 lx、 0.5 x或 0.2 x ( 3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08-0.8 FPU/mL纖維素酶+ 1.0 1.6 U/mL P -葡 萄糖香酶)，50°C ± 1和80 150 rpm振蕩酶解48~72 h;圖3為組合酶水解不同濃度的蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水溶性低聚糖的比較結(jié) 果，反應(yīng)條件是糖類的總濃度在0.4~8.0%的范圍變化，酶的用量為3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08 0.8 FPU/mL纖維素酶+ 0.4~1.0U/mL P-葡萄糖苷酶， 50°C ± 1和80~150 rpm振蕩酶解48~72 h;圖4為蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水溶性低聚糖同步酶水解的典型反應(yīng)歷程，反 應(yīng)條件是糖類的總濃度為1.0-3.0%,酶的用量為3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08 0.8 FPU/mL纖維素酶+ 0.4~1.0 U/mLP-葡萄糖苷酶，50°C ± 1和80~150 rpm振蕩酶解96 h，間隔一定時(shí)間取樣0.5 mL進(jìn)行高效液相色譜分析。五具體實(shí)施方式
將木質(zhì)纖維原料，如玉米秸稈等破碎至2 3 cm,控制含水率為30%,將原料 加入蒸汽爆破器，于1.40~1.70 MPa的高壓蒸汽壓力下保壓5~10 min,通過(guò)自控 系統(tǒng)自動(dòng)開(kāi)啟爆破閥快速噴放物料至旋轉(zhuǎn)分離器得蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料，總固 形物得率為初始原料的85 ~95%;常溫水洗滌所得到的蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料，總固液比為1 : 5,分三次洗滌 壓榨后合并水洗液，在絕對(duì)壓力為0.02 MPa和水浴溫度為67。C的條件下減壓蒸 發(fā)得到濃縮液。得到的水溶性木低聚糖和纖維寡糖的得率分別占原料中木聚糖和 纖維素的25~35%和5~10%。蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水洗液及其濃縮液的組成及變化如表1所示。表1蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料水洗液及其濃縮液的組成和變化測(cè)定項(xiàng)目水洗液 (g/L)典型的濃縮液" (g/L)在濃縮過(guò)程中的損 失率"(％)低聚糖 木低聚糖 纖維寡糖2.72 ± 0.06 0.64. 士 0.0146.20 ± 0.02 11.46 ±0.01單糖 木糖 阿拉伯糖 阿拉伯糖基 葡萄糖0.70 ± 0.00 0.18 ±0.00 0.13±0.01 0.17 ±0.0012.37 ±0.00 3.25 ±0.00 2.13 ±0.00 2.99 ± 0.00抑制物 甲酸 乙酸 乙酰丙酸 糠醛 羥甲基糠醛0.59 ±0.01 0.99 ±0.01 0.09 ± 0.00 0.30 ±0.01 0.02 ± 0.009.15 ±0.00 10.43 ±0.00 1.56 ±0.01 4.39 ±0.08 0.25 ± 0.0111.9±0.0 40.1 ±0.0 1.5 ±0.6 16.9 ± 1.5 29.0 ±2.8總固形物2)11.6 ±0,2204.6 ± 0. 61)根據(jù)水洗液濃縮前后的體積比計(jì)算得濃縮比為17.6，以此為基準(zhǔn)計(jì)算得各組分的損失率;2) 105 °C烘干至恒重。表1結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理后，木質(zhì)纖維原料水洗液中的糖類物質(zhì) 主要為低聚糖，木低聚糖和纖維寡糖分別約占總糖的60%和14%。在減壓蒸發(fā)條 件下濃縮蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料的水洗液，木低聚糖、纖維寡糖和單糖幾乎不損 失，但是可以有效地脫除部分抑制物。當(dāng)總糖濃度由0.4%增濃到7.8%時(shí)，可脫 除11.9 ~ 40.1%的揮發(fā)性抑制物。采用飽和的石灰乳中和濃縮液至pH值4.5 5.5, 4000rpm離心10min分離去 除不溶物，取上清液并調(diào)節(jié)糖類物質(zhì)的總濃度。由附圖1可知，同時(shí)加入3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08-0.8 FPU/mL纖維素 酶+ 1.0~1.6 U/mL (3 -葡萄糖苷酶三種酶的組合酶可以同步酶解木低聚糖和纖維寡 糖，并且采用上述三種酶的組合優(yōu)于它們單一或兩者組合的使用效果，其中對(duì)于 木低聚糖酶解的影響尤為顯著，可以由32.6 ~ 48.2 °/4是高到53.3%,增幅達(dá)到 10.6 ~ 63.4%;由附圖2可知，當(dāng)總糖濃度為7.6%時(shí)，在3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08-0.8 FPU/mL纖維素酶+ 1.0-1.6 U/mLp-葡萄糖苷酶的基礎(chǔ)上增加組合酶的用量和減 少纖維素酶和(3 -葡萄糖苷酶用量一倍對(duì)酶解的影響也不大，但是減少木聚糖酶的 用量會(huì)導(dǎo)致木低聚糖和阿拉伯糖基的酶解得率顯著下降，因此適宜的組合酶用量 為3.0~6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08~0.8 FPU/mL纖維素酶+ 0.4 1.0 U/mLp-葡萄 糖苷酶；由附圖3和附圖4可知，以3.0-6.0 U/mL木聚糖酶+ 0.08~0.8 FPU/mL纖維 素酶+ 0.4-1.0 U/mL (3 -葡萄糖苷酶的組合酶同步酶解蒸汽爆破木質(zhì)纖維可溶性低 糖的最適總糖濃度為1.0~3.0%，酶解時(shí)間為48~72 h,木低聚糖、纖維寡糖和阿 拉伯糖基的水解得率分別為99.2%、 100.0%和81.2%,其中木低聚糖和纖維寡糖 同步酶解的得率超過(guò)99.0%。組合酶中各成分的制取方法木聚糖酶和纖維素酶的生產(chǎn)菌沖朱為里氏木霉(7Wc/20tfera^ ree^/) Rut C30, 采用液體發(fā)酵方法制取獲得；P-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌林為黑曲霉(A^"g///^ "/gw),采用液體或固體發(fā) 酵方法制取獲得。木聚糖酶、纖維素酶和p -葡萄糖香酶的酶活力測(cè)定方法采用國(guó)際純化學(xué)與應(yīng) 用化學(xué)聯(lián)合會(huì)的測(cè)定方法(GHOSE, T. K. and BISARIA V. S., (1987) Pure & Appl. Chem., 59(12), 1739-1752; GHOSE, T. K. and BISARIA V. S., (1987) Pure & Appl. Chem" 59(2), 257-268 );所述的低聚糖、單糖和抑制物的測(cè)定均采用高效液相色語(yǔ)(HPLC)分析， 色鐠儀的系統(tǒng)和操作條件為Agilent 1100色譜儀及工作站，糖柱Bio-Rad Aminex HPX-87H,柱溫55°C，流動(dòng)相為0.5 mmol/L H2S04，流速0.6 mL/min, 檢測(cè)器為差示折光檢測(cè)器(RID)。所述的糖酶水解得率計(jì)算公式如下酶解得率(％) =_單鵬i (g)_x勵(lì)單糖的量(g) + ux低聚糖的量(g)有益效果由于采用了水洗濃縮、控制濃度和添加合適的組合酶及用量進(jìn)行 同步酶解的新方法，木低聚糖、纖維寡糖和阿拉伯糖基的水解得率分別為 99.2%、 100.0%和81.2%,其中木低聚糖和纖維寡糖同步酶解的得率超過(guò)99.0%, 滿足了將纖維素和半纖維素水解生成葡萄糖和木糖的工業(yè)化生產(chǎn)要求。
權(quán)利要求
1.一種蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取單糖的方法，將木質(zhì)纖維原料進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，經(jīng)常溫水洗后進(jìn)行同步酶解，其特征是a.將水洗液濃縮、分離去除不溶物，取上清液并調(diào)節(jié)控制濃縮液中糖類物質(zhì)的總濃度為1.0～3.0％和pH值為4.5～5.5后進(jìn)行同步酶解；b.在濃縮液中添加3.0～6.0U/mL木聚糖酶+0.08～0.8FPU/mL纖維素酶+0.4～1.0U/mLβ-葡萄糖苷酶后進(jìn)行同步酶解。
2. 如權(quán)利要求1所迷的蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取 單糖的方法，其特征是同步酶解在50士1。C和80~150 rpm的條件下進(jìn)行48~72 h。
3. 如權(quán)利要求1所述的蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取 單糖的方法，其特征是木聚糖酶和纖維素酶的生產(chǎn)菌林為里氏木霉(7Wc/2oAmw reese/) Rut C30;
4. 如權(quán)利要求1所述的蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取 單糖的方法，其特征是(3-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌抹為黑曲霉(A^wgz7/iwm'ger)。
全文摘要
將木質(zhì)纖維原料進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，經(jīng)常溫水洗、濃縮、分離去除不溶物，取上清液并調(diào)節(jié)控制濃縮液中糖類物質(zhì)的總濃度和pH值后，再在濃縮液中添加木聚糖酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶后進(jìn)行同步酶解。由于采用水洗濃縮、控制濃度和添加組合酶后同步酶解的新方法，木低聚糖、纖維寡糖和阿拉伯糖基的水解得率分別為99.2％、100.0％和81.2％，大大提高了將纖維素和半纖維素水解生成葡萄糖和木糖的效率。
文檔編號(hào)C12R1/685GK101250567SQ200810023479
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者余世袁, 強(qiáng) 勇, 勇 徐 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司