專利名稱：：起搏通道基因亞型hcn2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法。技術(shù)背景哺乳動(dòng)物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1HCN4。這四種異構(gòu)體在心臟中均已發(fā)現(xiàn)，但不同種屬、不同心臟組織和發(fā)育不同階段這些異構(gòu)體的表達(dá)存在差異不同種屬成年動(dòng)物竇房結(jié)均優(yōu)勢(shì)表達(dá)HCN4，約占竇房結(jié)總體HCN的80%。在四種異構(gòu)體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細(xì)胞中有低水平表達(dá)。起搏活性小的區(qū)域(如心室肌)，HCN2的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)；而起搏活性髙的區(qū)域HCN4的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。目前的研究大多使用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)來初步探討生物起搏的可行性；雖然此類研究也獲得了較大的成就，但由于腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有髙免疫原性，其病毒基因組游離于宿主基因組外，所以只能瞬時(shí)表達(dá)外源基因，國(guó)外體內(nèi)的研究?jī)H僅持續(xù)了3-10天，這就限制了它的發(fā)展。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，該病毒既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性，這是其最為突出的優(yōu)點(diǎn)。可見慢病毒可能是基因治療的最佳載體，以后的發(fā)展趨勢(shì)也許是利用慢病毒為載體，結(jié)合細(xì)胞治療和基因治療；把起搏基因HCNl-4轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒一起建立HCN2重組病毒載體，成為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒；所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質(zhì)粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2。所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒液。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，其既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性。構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。如果把帶有起搏基因HCN2的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，可以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。圖1為慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒圖譜圖2為轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后的熒光照片(放大倍數(shù)250x);圖3為Westernblot蛋白電泳圖，轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞；空未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；圖4為HCN2real-timeRT-PCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果曲線；圖5為HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染流程示意圖；圖6a為本發(fā)明陽性克隆質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告第一部分；圖6b為本發(fā)明續(xù)圖6a的陽性克隆質(zhì)粒測(cè)序報(bào)告的第二部分。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒將全長(zhǎng)約3.0kb的hHCN2目的序列從pCDNA3-hHCN2質(zhì)粒(我們實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建)卸載下來，最終裝載到帶有免疫熒光蛋白的質(zhì)粒pCDHl-MCS1-EF1-copGFP上，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2,所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質(zhì)粒Pncl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2。所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒液。具體實(shí)施例一、穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2的構(gòu)建hHCN2的目的序列插入于pcDNA3載體上，插入的位點(diǎn)為EcoRI和XbaI,首先用EcoRI和XbaI從pCDNA3-hHCN2質(zhì)粒切下目的片段連接到Pucl9載體中，再用EcoRI和HindIII從質(zhì)粒Pucl9切下目的片段連接到pcDNA3.1(A)載體中，再用XbaI單酶從質(zhì)粒pc隱3.1(A)雙切至ljpCDH卜MCSl-EFl-copGFP中。最終將陽性質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，觀察hHCN2基因是否插入穿梭質(zhì)粒。1.準(zhǔn)備工作pCDNA3-hHCN2、Pucl9、pcDNA3.1(A)pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒的抽提采用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒。首先配置以下溶液溶液I(P1)溶液II(P2)溶液III(P3)BufferPl(resuspensionbuffer)50mMTris-Cl，pH8.0:10mMEDTA;15-25。C。BufferP2(lysisbuffer)200mMNaOH,19GSDS(w/v)15-25。C。BufferP3(neutralizationbuffer)3.0M乙酸鉀(potassiumRNaseA(10mg/ml)用前煮沸IO分鐘滅活。a)抽質(zhì)粒的前一晚接菌于3邁1抗性LB中，240rpm,37T搖過夜。b)倒菌液于1.5mlEP管中，12，000rpm，30秒。去上清(可以倒置紙上敲，至沉淀散開，并可以用溶液I洗一次沉淀。)c)加200ul溶液I，同時(shí)加適量RNaseA(2ul)d)加200ul溶液n,緩慢倒置6-8次，至溶液澄清。e)加200ul溶液ni，緩慢倒置6-8次，產(chǎn)生白色沉淀。f)12,OOOrpm離心5min，取上清，加等體積氯仿，混勻。g)12,OOOrpm離心5min,取上清，加360(0.6V)異丙醇。h)12,OOOrpm離心10分鐘，lml70W乙醇洗沉淀。i)晾干5-IO分鐘。j)無菌水30ul溶解沉淀，-2(TC保存。所得質(zhì)粒于1%瓊脂糖凝膠電泳。2.開始穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2的構(gòu)建(1)將目的片段從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒Puc-19-訓(xùn)21)對(duì)帶有目的片段的pcDNA3-HCN2和Pucl9用EcoRI和XbaI進(jìn)行順序雙酶切(由于EcoRI和XbaI沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)XbaI酶切體系如下XbaI(20U/U1)1ii1NEBuffer2(10X)3u1pc畫3-HCN2/Pucl9(500ng/ixl)2u1dH20_24u1Total30u1反應(yīng)條件如下37"、6小時(shí)b)將單酶切產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(PH5.2),再加入70ul無水乙醇，—20TC沉淀30分鐘10000rpm離心IO分鐘，棄上清，沉淀進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/U1)1U1NEBufferEcoRI(10X)3u1pc纖3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_241Total30u1反應(yīng)條件如下37'C、6小時(shí)。2)對(duì)酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會(huì)造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法如下a)在紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀將目的片斷條帶切下，放于干凈的1.5ml離心管中，盡量不要切到多余的凝膠；b)稱童，加三倍體積的BufferQG到離心管中，即每lOOmg凝膠加300ulBufferQG;c)將離心管放于50X:水浴中，放置10分鐘，直至凝膠完全融解，期間每?jī)?、三分鐘晃?dòng)離心管一次；d)觀察凝膠溶液的顏色，如果為橙色或紫色，則添加5ul3M的NaAC(pH5.2);e)加100ul，即一倍凝膠體積的異丙醇于凝膠溶液中，將凝膠混合液加入到QIAquickspincolumn中，將回收柱插于2ml廢液收集管中，13,OOOrpm離心一分鐘；f)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.5mlBufferQG,13,OOOrpm離心一分鐘；g)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.75mlBufferPE，放置2—5分鐘，13，OOOrpm離心一分鐘；h)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，13，OOOrpm離心一分鐘；i)將回收柱取下插入干凈的1.5ml離心管中，柱中加入50ulBufferEBUOmMTris-Cl,pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2—5分鐘，13,000rpm離心一分鐘；若想獲得更多量的回收產(chǎn)物，可以重復(fù)該步驟一次1.5ml離心管中則為回收產(chǎn)物。3)將回收的雙酶切的Pucl9和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下:線性化Pucl92ul雙酶切目的基因4ul10Xbuffer1u1ATP1u1Ligase0.7ii1dH20_1.3ix1TotallOu1b)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘；4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37C過夜培養(yǎng)a)取一80C保存的DH5a感受態(tài)細(xì)菌，冰浴放置5-10分鐘，使之冰中融化；b)將5ul連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)菌，用移液槍緩慢混勻，冰浴放置30分鐘c)將混有連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)菌放入42X:水浴中，熱擊90秒，冰浴2分鐘；d)將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入900ul的S0C培養(yǎng)基中，37t、150rpm搖床培養(yǎng)1小時(shí)；e)3，000rpm離心2分鐘，棄上清，加入200ulLB培養(yǎng)基重懸細(xì)菌涂布Amp+LB平板。其中根據(jù)BIOSCIENCES試劑盒說明書制備感受態(tài)細(xì)菌，過程如下a)取DH5ci甘油菌種，在LB平板中劃線，37"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；b)挑取一個(gè)單克隆接種入0.5邁1LB培養(yǎng)基中，240rpm，37T搖床培養(yǎng)過夜c)將過夜培養(yǎng)的0.5ml菌液轉(zhuǎn)移到50mlSOB培養(yǎng)基中，240rpm,25t!搖床培養(yǎng)，直至0D600在0.4-0.6之間；d)將培養(yǎng)細(xì)菌的錐形瓶放于冰上冷卻IO分鐘；e)將菌液轉(zhuǎn)移到滅菌的50ml離心管中，2,500Xg，4'C離心6分鐘；f)棄上清，用5ml冰上預(yù)冷的1Xwashbuffer重懸沉淀，2,500Xg,4"C離心6分鐘；g)棄上清，用5ml預(yù)冷的1Xcompetentbuffer重懸沉淀；h)小量分裝，每管100ul，快速放入液氮中；i)—80"C保存，備用。5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37"C、250rpm搖床培養(yǎng)過夜；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，根據(jù)Axygen試劑盒說明書質(zhì)粒抽提步驟如下a)過夜培養(yǎng)的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分兩次于一個(gè)1.5ml離心管中12,000Xg離心1分鐘，徹底去除上清；b)加入250^1BefferSl，振蕩器充分重懸細(xì)菌；c)加入250^1BefferS2,顛倒混勻4一6次；注意不能劇烈混合，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA污染d)加入250ftlBefferS2五分鐘內(nèi)加入350^1SolutionIII，輕輕顛倒混勻6—8次；e)12,000Xg,離心10分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到Miniprep柱中，Miniprep柱插于廢液收集管中，12，000Xg離心1分鐘；注意不要吸到沉淀，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染；f)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱插于收集管中，加70(^1BufferW2到Miniprep柱中，12，000Xg離心1分鐘；重復(fù)該步驟一遍；g)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱放入同一支收集管中，12，000Xg離心1分鐘徹底去除BufferW2:h)將Minipre柱放入新的干凈的1.5ml離心管中，加50nlEluent,室溫放置1分鐘后，12,000Xg離心1分鐘；離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒，抽提后質(zhì)粒濃度統(tǒng)一調(diào)整為500ng/ul。(2)將目的片段從質(zhì)粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.1A-HCN21)對(duì)帶有目的片段的Pucl9-HCN2和pcDNA3.1A用EcoRI和Hindm進(jìn)行雙酶切(由于EcoRI和Hindm沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)酶切體系如下Hindm(20U/w1)1u1國(guó)uffer2(10X)3u1Pucl9-HCN2/pCDNA3.1A(500ng/ii1)2u1dH20_23ix1Total30ii1反應(yīng)條件如下37"、6小時(shí)；b)將單酶切產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，—20'C沉淀30分鐘；10000rpm離心IO分鐘，棄上清，沉淀進(jìn)行下一步酶切反應(yīng);c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/u1)1u1隱ufferEcoRI(10X)3u1pc謹(jǐn)3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_24u1Total30u1反應(yīng)條件如下37°C、6小時(shí)。2)對(duì)酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會(huì)造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(1)中2)項(xiàng)所述；3)將回收的雙酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下線性化pCDNA3.1Alul雙酶切目的基因5ul10XbufferlulATP1U1Ligase0.7u1dH20_1.1TotallOii1b)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘。4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37匸過夜培養(yǎng)，方法同步驟(1)中4)項(xiàng)所述；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37"、250rpm搖床培養(yǎng)過夜；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，方法同步驟(1)中5)項(xiàng)所述；(3)將目的片段從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCS1-EF1-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN21)對(duì)帶有目的片段的pcDNA3.1A-HCN2和pCDHl-MCSl-EF1-c叩GFP(以下簡(jiǎn)寫為pCDHl-GFP)用Xbal進(jìn)行單酶切a)酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反應(yīng)條件如下37'C、6小時(shí)。2)對(duì)酶切載體和目的基因片段進(jìn)行凝膠電泳后回收，由于紫外線會(huì)造成堿基突變，因此在該步驟中不進(jìn)行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(1)中2)項(xiàng)所述；3)將回收的單酶切的pCDHl-GFP和目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Epicentre試劑盒說明書進(jìn)行如下操作a)連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反應(yīng)條件室溫連接8分鐘。4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37'C過夜培養(yǎng)，方法同步驟(1)中4)項(xiàng)所述；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養(yǎng)基中，37^C、250rpm搖床培養(yǎng)過夜使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，方法同步驟(1)中5)項(xiàng)所述6)將陽性克隆質(zhì)粒送上海生工測(cè)定基因序列。(4)使用Qiagen小抽試劑盒抽提pCDHl-GFP-HCN2穿梭質(zhì)粒用于后續(xù)的慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)1)吸取10ul陽性克隆的菌保接種于2—5mlAmp+LB培養(yǎng)基中，37"、300rp邁搖床培養(yǎng)8小時(shí)；2)將步驟1)中培養(yǎng)的菌液按1/500或1/1000接種到Amp+LB中，即3-6ul菌液接種于3mlAmp+LB中，37'C、300rpm搖床培養(yǎng)12—16小時(shí)；3)菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4"、6000Xg離心15分鐘；4)棄上清，加0.3ml含有RNaseA的BufferPl重懸細(xì)菌沉淀，振蕩、充分重懸；5)加入0.3mlBufferP2,顛倒混勻4一6次，不能振蕩混勻，以免出現(xiàn)基因組污染，室溫放置5分鐘；6)加入0.3ml預(yù)冷的BufferP3,顛倒混勻4一6次，冰上放置5分鐘；7)4C、20，000Xg離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；重復(fù)該步驟一次；8)將lmlBufferQBT加入QIAGEN-tip20中，Buffer靠重力作用流過QIAGEN-tip20以平衡QIAGEN-tip20;9)將步驟7)中的上清加入到QIAGEN-tip20中，溶液靠重力作用流出，質(zhì)粒DNA則結(jié)合在QIAGEN-tip20的膜上；10)用2mlBufferQC洗QIAGEN-tip20兩次；11)用500ulBufferQF將質(zhì)粒從QIAGEN-tip20的膜上洗脫下來。12)取1—2ul用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，用無菌水將質(zhì)粒濃度調(diào)整為0.5ug/ul，以備后續(xù)構(gòu)建病毒載體實(shí)驗(yàn)用。(5)將陽性克隆質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，與GENEBANK目的基因序列完全相同，表明成功構(gòu)建pCDHl-GFP-HCN2穿梭質(zhì)粒。測(cè)序報(bào)告如圖6a和圖6b所示。二、使用穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2包裝構(gòu)建起博通道基因亞型HCN2重組慢病毒實(shí)驗(yàn)過程參照SBI的LentivectorExpressionSystem的操作手冊(cè)進(jìn)行；慢病毒包裝系統(tǒng)pPACKHl-LentivectorPackagingKit(SBI)三個(gè)包裝質(zhì)粒圖譜見圖l;操作流程圖如圖5所示，具體操作過程如下1.假病毒顆粒的包裝(包裝產(chǎn)生的假病毒顆粒中含有攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒)1)轉(zhuǎn)染前2-3天，D-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染前一天，接種293T細(xì)胞到新的lOcm培養(yǎng)皿，接種量約為5X106,完全吹散細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞均勻分布。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的50-70%:2)將2ng(濃度為500ng/ixl)攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFT-HCN2同10ug(濃度為500ng/ul)慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌希瑢⒒旌系馁|(zhì)粒稀釋到750ii1Opti-MEM培養(yǎng)基中，充分混勻，室溫孵育5分鐘；3)將60w1Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑稀釋到750u1Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘；4)將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到質(zhì)粒-Opti-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育20分鐘；5)在第4步孵育形成轉(zhuǎn)染混合物的同時(shí)，用10mlOpti-MEM洗293T細(xì)胞一次，然后加入8.5ml含2%血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基；6)將第4步中產(chǎn)生的質(zhì)粒-Lipofectamine2000TM混合物加入第5步處理后的培養(yǎng)皿中，輕輕地混勻使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在培養(yǎng)基中，37'C、59tC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7)6小時(shí)后，用新鮮的含抗生素和2%血清的D-MEM培養(yǎng)基替換掉含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；8)收集轉(zhuǎn)染后24和48小時(shí)的上清液；用含2%血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基替換掉上清液注意觀察培養(yǎng)基的顏色，培養(yǎng)24小時(shí)后和48小時(shí)后，由于293T細(xì)胞的代謝活性，會(huì)引起培養(yǎng)基顏色變黃(呈酸性)；9)將含有假病毒顆粒的培養(yǎng)基3000rpm室溫離心5分鐘，去除細(xì)胞碎片，然后將上清用Millex-HV0.45Um的PVDF濾膜過濾過濾后的病毒液用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染基質(zhì)干細(xì)胞研究。2.將構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，并將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到足夠量時(shí)，收集細(xì)胞RNA和蛋白用于實(shí)時(shí)定量PCR鑒定和WesternBlot鑒定。3.原代細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周后行Westernblot鑒定蛋白的表達(dá)蛋白抽提方法1)從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。2)預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞2次，小心傾去PBS。3)配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1ml抽提試劑中加入5Pi蛋白酶抑制劑混合液，5PlPMSF和5Jil磷酸酶混合液)。4)細(xì)胞瓶中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(107個(gè)細(xì)胞中加入lml抽提試劑；5X10e個(gè)細(xì)胞中加入0.5ml抽提試劑)，輕輕搖動(dòng)5分鐘。5)用一預(yù)冷的橡膠和塑料細(xì)胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細(xì)胞刮下來，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動(dòng)15分鐘進(jìn)行裂解。6)裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14,000Xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。使用上清液5ul上樣，凝膠蛋白電泳。4.原代細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周行real-timeRT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)1)RNA抽提TrizolRNA抽提及質(zhì)量檢測(cè)方法和步驟a)勻漿轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)兩周后，離心沉淀細(xì)胞。加入lmlTRIZ0L試劑，使用勻漿器破碎細(xì)胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL試劑進(jìn)行裂解前清洗細(xì)胞，因?yàn)榍逑磿?huì)很可能導(dǎo)致mRM的降解。b)兩相分離勻漿后樣品于15~30°C孵育5分鐘，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。每lml的TRIZ0L試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15~30°C孵育2到3分鐘。4°C下12,000Xg離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時(shí)加入的TRIZ0L試劑的60先。c)RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入lmlTRIZOL試劑的此時(shí)加O.5ml的異丙醇?；靹蚝?5~30。C孵育10分鐘后，于4°C12,000Xg離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。d)RNA清洗移去上清液，每lmlTRIZ0L試劑勾漿的樣品中加入至少1ml的7596乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4°C7,500Xg離心5分鐘。e)重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5~10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RM樣品A260/280比值將小于1.6。f)變性瓊脂糖凝膠電泳i)制膠1g瓊脂糖溶于72邁l水中，冷卻至60°C,10ml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10XMOPS電泳緩沖液濃度_成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25H1溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的lXMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。ii)準(zhǔn)備RNA樣品取3PgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10Pg/ml。加熱至70°C孵育15分鐘使樣品變性。iii)電泳上樣于膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。2)以提取的RNA為模板合成cDNA:a)配制退火混合物RNA3[ig0.5ug/ulOligo(dT)18lPl加無RNA酶的&0至總體積10Jil混合液在70t:水浴3分鐘，降到37'C放置IO分鐘。b)RT反應(yīng)液5XRT緩沖液4Jil2.5mMdNTP混合液4mRNA酶抑制劑1JilMMLV反轉(zhuǎn)錄酶1fil混合后37"恒溫1分鐘c)加10W的RT反應(yīng)液到10jxl退火混合物中，37C水浴60分鐘，加熱到95X:維持5min。得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。3)合成的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCRa)制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板i)針對(duì)每一需要測(cè)量的基因和管家基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)d證(2.5mMeach)2.10XPCR緩沖液2.5PiMgCl2溶液1.5MllimitslOuM的PCR特異引物F1H1lOuM的PCR特異引物Rlnic函1Ml加水至總體積為25JU輕彈管底將溶液混合，40個(gè)PCR循環(huán)(94'C，20秒；退火溫度，20秒；721C,30秒)；72°C延伸5分鐘。ii)PCR產(chǎn)物與100bpDNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。iii)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行IO倍梯度稀釋設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1,分別稀釋為1Xl(T1，1Xl(T2，1X10—3,1X10",1X10—5,1X10—6，1X10—7這幾個(gè)梯度濃度的DNA。4)進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)a)幾個(gè)梯度稀釋的DM模板以及所有cDNA樣品分別配置RealtimePCR反應(yīng)體系。體系配置如下dNTP(2.5mMeach)2.5^110XPCR緩沖液2.5HiMgCl2溶液1.5M1rag聚合酶lunitsSybergreenI終濃度O.25XlOuM的PCR特異引物FlUllOuM的PCR特異引物R1^1cDNAorDNA1Ml加水至總體積為25PI輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心。b)步驟1配置的PCR反應(yīng)溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH:95C5min;35個(gè)PCR循環(huán)(95'C,10秒；58^C，15秒；20秒；85"C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72"C緩慢加熱到99^C(每5秒升高ir);HCN2:95'C，5min:35個(gè)PCR循環(huán)(95t!，10秒；58'C，15秒；72t!,20秒；85'C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72C緩慢加熱到99^(每5秒升高1X:)。表l實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>5.結(jié)果(1)將帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2同慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾蟾腥?93T細(xì)胞后，培養(yǎng)24小時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)大量的熒光出現(xiàn)，如圖2所示。(2)提取蛋白后進(jìn)行Westernblot的蛋白鑒定結(jié)果如圖3所示。(3)各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量(見圖4)此方法中量的表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言的，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對(duì)稀釋度即可。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中樣本的耙序列的量來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物(對(duì)照組)的量，即參照物(對(duì)照組)是1倍的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)各樣品加樣量均為1然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個(gè)樣品的1W體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測(cè)基因得值除以此樣品內(nèi)參得值，最終得到的比值為樣品的待測(cè)基因相對(duì)含量。待測(cè)基因以內(nèi)參校正。結(jié)果顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的RNA是原代細(xì)胞的123倍。表2內(nèi)參校正列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>HCN2real-timePCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)如圖4所示。以上結(jié)果表明已成功構(gòu)建起博通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，其既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性。構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。如果把帶有起搏基因HCN2的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，可以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。權(quán)利要求1.一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，其特征在于所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質(zhì)粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒液。全文摘要本發(fā)明公開了一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。本發(fā)明將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN2與慢病毒一起建立HCN2重組病毒載體，成為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/12GK101265484SQ20081002378公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者周亞峰,李紅霞,楊向軍,蔣文平,韓蓮花申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院