專利名稱::一種蠟狀芽孢桿菌cpu0029菌株及用它制備石斛類生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,具體是涉及一種石斛內(nèi)生細(xì)菌(蠟狀芽孢桿菌CPU0029菌株),以及用該菌生產(chǎn)石斛類生物堿的方法。技術(shù)背景植物內(nèi)生菌OPto加幼cfo/7te)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物,而被感染的宿主植物(至少是暫時(shí))并不表現(xiàn)出外在病癥。既包括互惠共利的和中性的內(nèi)共生微生物,也包括那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物,這些微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌等。近些年來,植物內(nèi)生菌由于能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物,在自然界中具有重要的生態(tài)學(xué)作用,受到了全世界的廣泛關(guān)注并取得了極大進(jìn)展。植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì),殺蟲抗菌物質(zhì),抗腫瘤類物質(zhì),及其他類型的代謝產(chǎn)物,如一些內(nèi)生真菌能產(chǎn)生細(xì)胞壁分解酶,用以克服宿主防御異物的天然屏障,還能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶、酯酶等胞外酶。由于內(nèi)生菌和宿主植物的共生(或寄生),其次生代謝產(chǎn)物往往有特殊的生物活性。人們發(fā)現(xiàn)有的內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主(尤其是藥用植物)相同或類似的化合物,如從南方紅豆杉樹皮中分離到的能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌,從長(zhǎng)春花、桃兒七等植株中分離到產(chǎn)長(zhǎng)春新堿和鬼臼毒素類似物的內(nèi)生真菌,從華重樓中分離到能夠產(chǎn)生重樓甾體皂甙的內(nèi)生細(xì)菌,在德國(guó)鳶尾根狀莖中分離得到產(chǎn)鳶尾酮的絲狀真菌等。這就為植物藥物的生產(chǎn)提供了新的途徑,并且對(duì)珍貴稀有藥用植物的保護(hù)和開發(fā)有著積極作用。石斛(De"rfro&M附"oW/e""^)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥,應(yīng)用歷史悠久?,F(xiàn)代藥理研究表明,石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用,因此在臨床上及中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用。由于多年來的掠奪性采挖和無序開發(fā),野生石斛已經(jīng)瀕臨滅絕,尋找新的、可再生的石斛替代資源成為必然。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株從新鮮石斛外植體中篩選分離得到內(nèi)生菌,該菌能產(chǎn)生與石斛相同的有生物活性的次生代謝產(chǎn)物,本發(fā)明還提供了用該菌生產(chǎn)石斛生物堿的方》去。所說的石斛內(nèi)生細(xì)菌,是蠟狀芽孢桿菌(5ac說船^M泌)CPU0029,保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)CCTCCNO:M208020。所說的用蠟狀芽孢桿菌CCTCCM208020生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,包括以下步驟是(1)發(fā)酵培養(yǎng)以PDA培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基,改良PDA培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)蠟狀芽孢桿菌CPU0029CCTCCM208020進(jìn)行發(fā)酵;(2)分離純化將發(fā)酵液上清堿化后過濾,經(jīng)氯仿或乙酸乙酯萃取,回收有機(jī)溶劑得到浸膏。為了減少萃取時(shí)有機(jī)溶劑的用量,還可以在萃取前將濾液經(jīng)過大孔樹脂富集后,將洗脫液濃縮后再堿化。得到的浸膏產(chǎn)物還可再經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)一步純化。蠟狀芽孢桿菌CPU0029CCTCCM208020能夠利用多種有機(jī)碳源,如葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等,但不能利用枸櫞酸鹽;該菌也能夠利用多種有機(jī)氮源,如蛋白胨、酵母粉、玉米漿、牛肉膏等(除尿素外),也可以利用含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源的復(fù)合氮源,但不能利用單一的無機(jī)氮源,如硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸銨等。該菌的培養(yǎng)溫度范圍寬,在10—40'C均能生長(zhǎng),但在25—37'C生長(zhǎng)較好,生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的最佳溫度為28—3(TC。同時(shí)各種金屬離子,如Mg2、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、K+、Na+等對(duì)該菌生長(zhǎng)沒有顯著影響。雖然上述碳源、氮源、金屬離子以及溫度對(duì)該菌的生長(zhǎng)沒有明顯影響,但是其碳氮源濃度、金屬離子和培養(yǎng)溫度對(duì)該菌發(fā)酵生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物有顯著影響。通過優(yōu)化,確定最佳培養(yǎng)條件為去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,硫酸銨0.25%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%,起始pH6.5,培養(yǎng)溫度28—30°C。在上述用蠟狀芽孢桿菌CCTCCM208020生產(chǎn)石斛類生物堿的方法中,其步驟(1)培養(yǎng)條件為以液體馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)為種子培養(yǎng)基,3CTC培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌CCTCCM20802012小時(shí)后;按照5—10%比例接種發(fā)酵液,在發(fā)酵培養(yǎng)基(改良PDA培養(yǎng)基)中28。C培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵;所說的發(fā)酵培養(yǎng)基是去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,硫酸銨0.25%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%;pH6.5-7.0,于115。C滅菌30分鐘。所說的步驟(2)具體是將發(fā)酵液離心后取上清液,用氨水堿化至pH7—ll后過濾除去沉淀,濾液經(jīng)過大孔樹脂吸附后,再用60—90%乙醇洗脫;將洗脫液減壓蒸餾濃縮后用氨水堿化,再用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸膏。所說的蠟狀芽孢桿菌CCTCCM208020通過以下方法得到A.對(duì)新鮮石斛假鱗莖或葉片進(jìn)行表面消毒后,進(jìn)行切片或研磨,再將植物組織或研磨液至于固體馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)2—5天。B.將長(zhǎng)出的菌落逐個(gè)分離、純化。C.對(duì)每個(gè)微生物進(jìn)行培養(yǎng),用氯仿對(duì)發(fā)酵液及破碎細(xì)胞中的生物堿進(jìn)行提取。D.用薄層層析法對(duì)各提取物進(jìn)行檢測(cè),并與石斛總生物堿進(jìn)行比較。'E.經(jīng)過分離、篩選和檢測(cè),得到CPU0029,其產(chǎn)生的生物堿與石斛總生物堿中的一個(gè)具有相同比移值。本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌CPU0029已經(jīng)于2008年1月26日提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)CCTCCNO:M208020。本發(fā)明以石斛內(nèi)生菌蠟狀芽孢桿菌CCTCCM208020發(fā)酵生產(chǎn)石斛類生物堿可以在相當(dāng)大的程度上緩解天然金釵石斛藥源不足的問題。圖l是發(fā)酵液粗提物與石斛總生物堿的TLC比較;其中1、空白液體馬鈴薯培養(yǎng)基;2、發(fā)酵液粗提物;3、石斛總生物堿。圖2是初始pH的影響圖3是培養(yǎng)溫度的影響圖4是接種量的影響圖5是發(fā)酵時(shí)間的影響具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語,除非有另外說明,一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例,并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明,而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中,未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物,均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明,其后所用相同引物,均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例一菌種的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化(l)菌種的篩選A.將新鮮石斛假鱗莖或葉片,用自來水洗凈,無菌水沖洗后用無菌濾紙吸干水分。常規(guī)無菌操作下,分別用75%乙醇和0.1%的升汞消毒;B.用無菌解剖刀將已表面消毒的石斛切塊后,放入內(nèi)置無菌玻璃珠的錐形瓶中,并加入少量無菌水,在無菌條件下珠磨30分鐘;C.吸取少許上述研磨液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上,在30'C培養(yǎng)2—5d。D.待平板有菌長(zhǎng)出后,平板劃線純化,直至得到單菌落,用斜面保存?zhèn)溆?。E.將菌株接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,待發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取,用薄層層析發(fā)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物(展開劑為正丁醇冰醋酸水=4:1:5的上層液,顯色劑為改良碘化鉍鉀)。F.將石斛假鱗莖陰干,取2g剪碎后置于錐形瓶中,用氨水浸潤(rùn)30min,加入氯仿20ml,超聲振蕩提取2次(各20min);將氯仿層合并后用脫脂棉濾過,回收氯仿;再用lml氯仿溶解浸膏,即得石斛總生物堿,備用。G.共分離得到16個(gè)菌株,其中真菌2株,細(xì)菌14株。經(jīng)TLC檢測(cè),有一株細(xì)菌的發(fā)酵液與石斛總生物堿有顯色相同、遷移率相當(dāng)?shù)膶游霭唿c(diǎn),掃描結(jié)果見圖1。石斛總生物堿有3個(gè)生物堿斑點(diǎn),相對(duì)遷移率Rf分別為0.403、0.474和0.579;菌株的發(fā)酵液有1個(gè)生物堿斑點(diǎn),相對(duì)遷移率Rf為0.474。該菌命名為CPU0029。(2)菌種的簽定CPU0029屬于革蘭氏陽(yáng)性大桿菌,寬度在lwm以上,呈鏈狀排列在肉湯中生長(zhǎng)混濁,有明顯菌膜或壁環(huán);在固體PDA培養(yǎng)基上生成的菌落不透明,灰白色,表面粗糙,微有褶皺,邊緣毛玻璃狀或融蠟狀。生理生化試驗(yàn)見表1,經(jīng)過形態(tài)觀察和生理生化反應(yīng),該菌鑒定為芽胞桿菌屬蠟狀芽胞桿菌(fe"7/wscere,us)o表l生理生化試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(3)CPU0029培養(yǎng)條件的優(yōu)化培養(yǎng)方法將斜面培養(yǎng)物接種到液體馬鈴薯培養(yǎng)基在30。C培養(yǎng)12小時(shí)作為種子液,按5%體積轉(zhuǎn)接30ml液體培養(yǎng)基后在3(TC空氣搖床培養(yǎng)2天,轉(zhuǎn)速180r/min;每個(gè)試驗(yàn)均做3個(gè)平行樣品,最后結(jié)果取均值;液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的確定選用蛋白胨、亞硝酸鈉、硫酸銨以及蛋白胨+硫酸銨(1:1),酵母粉+硫酸銨(1:1)為氮源,試驗(yàn)濃度為0.5%,其他組分同液體馬鈴薯培養(yǎng)基。從表2中可知,該菌以無機(jī)氮源為氮源不能生長(zhǎng);以復(fù)合氮源為氮源較有機(jī)氮源生物堿產(chǎn)量高,選擇蛋白胨+硫酸銨(1:1)為氮源最佳。表2氮源的優(yōu)化<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的確定選用葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源,試驗(yàn)濃度為2%,氮源選擇氮源優(yōu)化后的最佳者,其他組分同液體馬鈴薯培養(yǎng)基;從表3中可知,該菌對(duì)碳源的利用相當(dāng)廣泛,從生物堿產(chǎn)量的角度考慮選擇葡萄糖最佳。表3碳源的優(yōu)化碳源葡萄糖果糖蔗糖可溶性淀粉液體馬鈴薯培養(yǎng)基終點(diǎn)pH4.86.57.97.06.7^6200.7350.4520.3740.330.494液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮比的確定采用雙因素三水平的正交試驗(yàn),如表4,可知,氮源的濃度過高,不利于生物堿的產(chǎn)生,可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)豐富不利于次生代謝產(chǎn)物的積累,因此確定碳源、氮源的濃度分別為2%和0.5%。表4碳氮比的確定i1%碳源濃度2%3%氮源濃度0.5%0.3560.7420.6441%0.1210.2650.2942%0.0880.1380.167不同微量離子對(duì)生物堿產(chǎn)量的影響考慮到微量元素如Mg^、Mn2+、FeS+等的影響,經(jīng)篩選后,分別考察了0.5%硫酸鎂、0.1%氯化錳和0.1%氯化鐵對(duì)生物堿產(chǎn)量的影響。從表5中可知,Mg^和Mn"+對(duì)生物堿的產(chǎn)量有顯著影響,而Fe"影響不大,故確定添加MgS04和MnCl2,而不必添加Fe3、表5微量元素的影響微量元素?zé)oMg"Mg2+Mn2+Fe3+Mg2+Mn2+Fe3+液體馬鈴薯培養(yǎng)基(對(duì)照)終點(diǎn)pH7.134.854.964.624.716.810.4560.7480.8750.470.8970.496其他發(fā)酵條件的優(yōu)化培養(yǎng)基的初始pH初始pH分別選擇7.5,7.0,6.5,6.0,5.5進(jìn)行試驗(yàn)。從圖2可知,初始pH對(duì)發(fā)酵最終pH和生物堿產(chǎn)量影響不大;初始pH為6.5時(shí)最佳。溫度溫度分別設(shè)為25'C、28°C、30°C、32°C、35。C進(jìn)行試驗(yàn)。如圖3可知,培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵最終pH和生物堿產(chǎn)量均有顯著影響;隨著培養(yǎng)溫度的提高,發(fā)酵最終pH由弱酸性上升至弱堿行,而生物堿的產(chǎn)量顯著下降。因此培養(yǎng)溫度選擇28—3(TC為宜。接種量分別按2%、4%、6%、8%、10%的比例接種種子液后進(jìn)行培養(yǎng)。從圖4可知,隨著接種量的提高,生物堿產(chǎn)量亦上升;但達(dá)至1』6%以后,生物堿產(chǎn)量提高不顯著,故采用6%~8%的接種量。發(fā)酵時(shí)間在250ml的三角燒瓶中裝入已經(jīng)確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并接入菌種,進(jìn)行培養(yǎng),分別于不同生長(zhǎng)階段取樣測(cè)定,從圖5可知,延長(zhǎng)穩(wěn)定期有利于次生代謝產(chǎn)物的積累,進(jìn)入衰亡期后,生物堿產(chǎn)量提高不顯著,故培養(yǎng)時(shí)間確定為48小時(shí)左右。培養(yǎng)基的干擾將液體馬鈴薯培養(yǎng)基和改良液體馬鈴薯培養(yǎng)基分別按照上述相同方法提取后再用酸性染料法測(cè)得A62Q均小于0.002,可見培養(yǎng)基對(duì)生物堿含量的測(cè)定幾無干擾。實(shí)施例二用蠟狀芽孢桿菌CCTCCM208020生產(chǎn)石斛類生物堿(1)培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)基液體馬鈴薯培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基去皮土豆20%,葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸二氫銨0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%,起始pH7.0,培養(yǎng)溫度3(TC。種子液于3(TC培養(yǎng)12小時(shí)后,按照5—10%比例接種發(fā)酵液,在3(TC培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵。(2)次生代謝產(chǎn)物的分離純化方法將發(fā)酵液離心后取上清液,用氨水堿化至pH7—11后過濾除去沉淀,濾液經(jīng)過大孔樹脂吸附后,再用60—90%乙醇洗脫;將洗脫液減壓蒸餾濃縮后用氨水堿化,再用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸膏。用少量氯仿溶解后經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行純化。(3)次生代謝產(chǎn)物的特征簽別A、發(fā)酵液的氯仿提取物(浸膏)用稀鹽酸溶解,分別用碘化鉍鉀試劑、硅鴇酸試劑、輮酸試劑等生物堿試劑鑒別,結(jié)果如表6。表6化學(xué)鑒別生物堿試劑碘化鉍鉀試劑硅鎢酸試劑鞣酸試劑現(xiàn)象紅棕色沉淀白色沉淀灰白色沉淀B、發(fā)酵液的氯仿提取物(浸膏)經(jīng)薄層層析(展開劑為正丁醇冰醋酸水=4:1:5,顯色劑為改良碘化鉍鉀試劑),與石斛總生物堿有顯色相同、遷移率相當(dāng)?shù)膶游霭唿c(diǎn)。石斛總生物堿有3個(gè)生物堿斑點(diǎn),相對(duì)遷移率Rf分別為0.403、0.474和0.579;菌株的發(fā)酵液有1個(gè)生物堿斑點(diǎn),相對(duì)遷移率Rf為0.474??梢?,得到的產(chǎn)物為石斛類生物堿。實(shí)施例三-(1)培養(yǎng)方法.種子培養(yǎng)基液體馬鈴薯培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,硫酸銨0.25%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%,起始pH6.5,培養(yǎng)溫度28。C。種子液于3(TC培養(yǎng)12小時(shí)后,按照5—10%比例接種發(fā)酵液,在28。C培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵。(2)次生代謝產(chǎn)物的分離純化方法將發(fā)酵液離心后取上清液,用氨水堿化至pH7—ll后離心出去沉淀,用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸膏,再用少量氯仿溶解后經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離純化。(3)次生代謝產(chǎn)物的特征簽別與實(shí)施例二相同。實(shí)施例四(1)培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)基液體馬鈴薯培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基去皮土豆20%,葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸二氫銨0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%,起始pH7.0,培養(yǎng)溫度30。C。種子液于3(TC培養(yǎng)12小時(shí)后,按照5_10%比例接種發(fā)酵液,在30'C培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵。(2)次生代謝產(chǎn)物的分離純化方法將發(fā)酵液離心后取上清液,用氨水堿化至pH7—ll后過濾,濾液經(jīng)過大孔樹脂吸附后,再用60一90%乙醇洗脫;將洗脫液減壓蒸餾濃縮后用氨水堿化,再用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸膏。用少量氯仿溶解后經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行純化。(3)次生代謝產(chǎn)物的特征簽別與實(shí)施例二相同。實(shí)施例五(1)培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)基液體馬鈴蓽培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,硫酸銨0.25%,磷酸二氛鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%,起始pH6.5,培養(yǎng)溫度28X:。種子液于3(TC培養(yǎng)12小時(shí)后,按照5—10%比例接種發(fā)酵液,在2S"C培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵。(2)次生代謝產(chǎn)物的分離純化方法將發(fā)酵液離心后去菌體,取上清液用氨水堿化至pH8—ll離心去沉淀,上清液用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸裔。用少量氯仿溶解后經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行純化。(3)次生代謝產(chǎn)物的特征簽別與實(shí)施例二相同。本發(fā)明所說的蠟狀芽胞桿菌(5s""uscereus)CPU0029,已于2008年1月26日,提交位于中國(guó)武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)CCTCCNO:M208020。權(quán)利要求1、一種蠟狀芽孢桿菌CPU0029(CCTCCM208020),其具有產(chǎn)生石斛類生物堿的能力。2、一種發(fā)酵生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,其特征在于,包括以下步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)以PDA培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基,改良PDA培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)蠟狀芽孢桿菌CPU0029CCTCCM208020進(jìn)行發(fā)酵;(2)分離純化將發(fā)酵液上清堿化后過濾,經(jīng)氯仿或乙酸乙酯萃取,回收有機(jī)溶劑得到浸膏。3、根據(jù)權(quán)利要求2所說的生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,其特征在于,步驟(1)中所說的改良PDA培養(yǎng)基是去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,硫酸銨0.25%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,氯化錳0.01%。4、根據(jù)權(quán)利要求3所說的生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,其特征在于,步驟(1)的培養(yǎng)條件為以液體馬鈴薯培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基,30'C培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌CPU0029CCTCCM20802012小時(shí)后;按照5_10%比例接種發(fā)酵液,在發(fā)酵培養(yǎng)基中,起始pH6.5-7.0,28-30'C培養(yǎng)48—60小時(shí)后終止發(fā)酵。5、根據(jù)權(quán)利要求2所說的生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,其特征在于,步驟(2)是將發(fā)酵液上清堿化后過濾,濾液經(jīng)過大孔樹脂富集后,將洗脫液濃縮后再堿化,經(jīng)氯仿或乙酸乙酯萃取,回收有機(jī)溶劑得到浸膏。6、根據(jù)權(quán)利要求5所說的生產(chǎn)石斛類生物堿的方法,其特征在于,步驟(2)具體是將發(fā)酵液離心后取上清液,用氨水堿化至pH7—ll后過濾除去沉淀,濾液經(jīng)過大孔樹脂吸附后,再用60—90%乙醇洗脫;將洗脫液減壓蒸餾濃縮后用氨水堿化,再用氯仿或乙酸乙酯萃取,回收氯仿或乙醚后得到浸膏。全文摘要本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,具體是涉及一種石斛內(nèi)生細(xì)菌,以及用該菌生產(chǎn)石斛類生物堿的方法。所說的石斛內(nèi)生細(xì)菌為蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)CPU0029(CCTCCM208020),其具有產(chǎn)生石斛類生物堿的能力。將新鮮石斛進(jìn)行表面消毒后經(jīng)過研磨或切片接種平面,待長(zhǎng)出菌落后挑出純化,分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并對(duì)發(fā)酵液提取物進(jìn)行薄層檢測(cè),該菌的次生代謝產(chǎn)物與石斛總生物堿中的一個(gè)具有相同比移值。利用該菌進(jìn)行液體發(fā)酵,并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取和分離純化從而獲得其次生代謝產(chǎn)物。本發(fā)明可望成為新的、可再生的石斛替代資源,避免了石斛資源匱乏,植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng),受環(huán)境影響大等限制。文檔編號(hào)C12P17/10GK101265459SQ20081002450公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日發(fā)明者呂煒鋒,姚文兵,廖晨陽(yáng),王紅蘭申請(qǐng)人:呂煒鋒;王紅蘭