專利名稱：彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vα6亞家族的MR基因序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個T細胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別涉及彌漫性大B 細胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCRVa6亞家族的MR基因序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，非霍奇金淋巴瘤(NHL)發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。據(jù)估計，21 世紀(jì)初，NHL將占侵襲性惡性腫瘤的4.4。/。，并占所有癌癥死亡數(shù)的4.8%。其 中彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)是最常見的NHL，約占30% 40%,其中 超過60歲的老年患者占70%。 20多年來主要采用以CHOP方案(環(huán)磷酰胺、 多柔比星、長春新堿、潑尼松)為主的化療。但對部分老人有毒性作用，長期 生存率低。近期開展的靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現(xiàn)雖然 取得了新的療效，但微小殘留病變的存在導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)仍然是目前臨床治療 的棘手問題。多年來，各國學(xué)者一直在努力尋求更有效的治療方法。臨床腫瘤 學(xué)家對特異性的細胞免疫治療寄予厚望。Xue等于報道利用從白血病患分離出 能夠特異識別HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，將CTL的TCR基因轉(zhuǎn) 染患者的T淋巴細胞，在小鼠試驗中顯示出轉(zhuǎn)染細胞的特異殺傷性。隨后Tsuji 等將從進一步證明了利用轉(zhuǎn)導(dǎo)WTl特異的TCR基因的Thl和Tcl顯示出HLA 限制的的殺傷作用，同時轉(zhuǎn)染的Thl細胞具有分泌大量IFN-y和IL-2的功能， 由于IFN-Y和IL-2在遏制腫瘤中發(fā)揮重要的作用，因而可以通過該轉(zhuǎn)染相應(yīng) 的TCR基因的方法對腫瘤的免疫治療發(fā)揮重要的作用。目前利用腫瘤細胞相關(guān)抗原特異的TCR基因修飾正常T細胞(自體的或 供者源T細胞)，從而獲得具有殺傷相應(yīng)腫瘤細胞的細胞毒T淋巴細胞(CTL)， 這是近年抗腫瘤特異性細胞免疫治療的一個重要發(fā)現(xiàn)。抗原特異TCR修飾正 常T細胞而獲得特異抗腫瘤T細胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展開，隨后 有多個研究擴展了該技術(shù)的應(yīng)用，如特異性抗EB病毒陽性細胞的CTL、抗 WT1的CTL，個別己形成了 TCL產(chǎn)品用于臨床治療。制備CTL產(chǎn)品的關(guān)鍵 是明確腫瘤/白血病細胞的相關(guān)抗原，從而獲得抗原特異的TCR，進而誘導(dǎo)產(chǎn)生特異抗白血病/腫瘤的T細胞克隆。目前國內(nèi)外對淋巴瘤的研究主要集中在 T細胞型淋巴瘤，而對B淋巴細胞淋巴瘤的研究資料較少，主要原因可能是對 B淋巴細胞型淋巴瘤的相關(guān)抗原了解得較少有關(guān)。發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Va 6亞家族的MR基因序列。本發(fā)明從DLBL患者外周血中存在T細胞受體(TCR) Vcx亞家族的克隆 性T細胞(TCRa和TCR卩鏈分別為TCRct卩+T細胞表面所表達的異源雙鏈TCR 的組成部分，兩者在T細胞免疫中具有同樣重要的地位)，經(jīng)序列分析顯示其 特異性TCR序列的高度可變區(qū)V-N-J區(qū)，即互補決定區(qū)3 (CDR3)，與抗原 特異性識別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細胞所表達的TCR為DLBL相關(guān)抗 原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR，獲得了 DLBL相關(guān)的TCR基因序列。本發(fā)明公開了針對DLBL相關(guān)抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是 TCR的高度可變區(qū)即CDR3，后者是T細胞表面受體識別抗原的特異區(qū)域， 針對于不同抗原，除了機體所選用的TCRVa亞家族T細胞不同，更為關(guān)鍵的 是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細胞所能識別的抗 原。本發(fā)明提供了一種識別DLBL相關(guān)抗原的TCR Va6基因序列，由于其 CDR3的特異性，僅來自于單一克隆的T細胞，是一高度特異的序列。同時， 根據(jù)CDR3的基因序列編碼的蛋白質(zhì)，可用來了解DLBL的相關(guān)抗原肽，為 了解DLBL的生物學(xué)特性提供資料。本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因序列的應(yīng)用。根據(jù)所獲得的DLBL相關(guān)抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用于(1 ) 了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR Va6亞家族T細胞的情況，用于評 價病人的免疫功能狀態(tài)，(2)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將DLBL相關(guān)抗原的特異性TCR 基因轉(zhuǎn)入正常T淋巴細胞中，使其強制表達這種特異性的TCR，改變T細胞 內(nèi)源性TCR識別抗原的原有模式，具備分泌細胞因子和(或)特異殺傷靶細 胞的功能，經(jīng)體外短期培養(yǎng)擴增即可產(chǎn)生足量的CTL，再回輸入患者體內(nèi)使 其對DLBL細胞行使耙向細胞免疫效應(yīng)。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn) 一種彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān) 抗原特異TCR Vcx6亞家族的MR基因序列，所述MR基因序列如下所示ACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。其中，所述基因序列為333個bp: l-65bp為V區(qū)；66-69bp為N區(qū)；70-133bp為J區(qū)；134-333bp為C區(qū)。上述彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vct6亞家族的MR基因序列 翻譯的蛋白質(zhì)(111氮基酸)如下SNSAVAWSN。其中CDR3區(qū)包括V區(qū)的下游端、N區(qū)和J區(qū)的上游端。上述彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V(x6亞家族的MR基因序 列的制備方法，包括如下步驟a. 收集DLBL患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個核細胞；b. 提取外周血單個核細胞的RNA， RT-PCR合成cDNA第一鏈；c. 在NCBI的Genebank中查找TCR a鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū) 及C區(qū)在基因組中的位置；d. 設(shè)計29個Va特異性上游引物及Qx下游引物；e. PCR擴增29個Va亞家族TCR重排時產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)；f. Ca-Fam標(biāo)記PCR產(chǎn)物，基因掃描分析T細胞亞家族的表達和克隆性；g. 將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產(chǎn)物進行切膠純化序列分析。 上述彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vot6亞家族的MR基因序列在制備彌漫性大B細胞淋巴瘤特異性分子靶向過繼性免疫藥物中的應(yīng) 用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明制備得到了一種獨特的DLBL抗原的相關(guān)TCRV(x6基因序歹U， 該序列可以作為一種新的抗原識別TCR基因(主要變化區(qū)在于CDR3序列)補充人類基因庫資料。(2)該TCR基因可用于研究DLBL的特異性免疫診斷和治療。 上述彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Va6亞家族的基因序列，一方面可用于進一步檢測病人體內(nèi)所存在的TCR Va6亞家族T細胞的情況，以評價其細胞免疫功能狀態(tài)，另一方面是應(yīng)用在制備彌漫性大B細胞淋巴瘤分子耙向過繼性免疫細胞治療研究方面。前者的檢測所采用技術(shù)與上述檢測TCR基因的技術(shù)相同，通過不同時間點的分析，可以了解病人所存在的TCRV(x6亞家族T細胞的情況，用于了解病人的免疫狀態(tài)。后者主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將DLBL相關(guān)抗原特異的TCR基因修飾自體或 異基因正常T細胞，這些經(jīng)過修飾的細胞就可提供對抗確定的腫瘤特異性抗 原的T細胞反應(yīng)性，從而具備了發(fā)揮相應(yīng)特異性識別殺傷DLBL細胞的細胞 毒活性，可以制備特異性抗DLBL細胞的CTL產(chǎn)品。國外有相關(guān)的動物實驗 研究提示這類技術(shù)有可能發(fā)揮特異性的免疫治療效果。本發(fā)明所提供的TCR 基因的應(yīng)用最終目的是通過對DLBL患者進行特異性免疫治療，從而提高療 效，清除微小殘留病變，減少疾病治療后復(fù)發(fā)提高長期生存率，改善病人的生 存質(zhì)量等，是具有很大的市場推廣應(yīng)用價值和和較大的社會經(jīng)濟效益。


圖1為DLBL相關(guān)抗原特異TCR V(x6亞家族的基因掃描圖。 其中，A為TCRVa6亞家族單克隆圖；B為TCRVa6亞家族雙克隆圖； C為TCR Va6亞家族多克隆圖；D為TCRVa6亞家族寡克隆圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方 式不限于此。實施例(一)抗原特異性TCR基因序列的分析 分析TCRVa基因譜的CDR3的長度和堿基序列的的方法是利用RT-PCR —基因掃描方法分析TCR Vet 29個亞家族的CDR3長度。首先收集DLBL患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個核細胞，留取P10"個PBMCs (外周 血單個核細胞)提取RNA， RT-PCR合成cDNA。同時，在NCBI的基因庫中 查找出TCRa鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位 置。根據(jù)Va 29個亞家族基因的cDNA設(shè)計相應(yīng)的29個Va特異性上游引物， 并在Ca區(qū)設(shè)一 Ca下游引物，利用PCR技術(shù)擴增患者29個Va亞家族TCR 重排時產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)。如圖1所示，熒光素Fam標(biāo)記各亞家族PCR產(chǎn)物 的C(x區(qū)，基因掃描分析T細胞各亞家族的表達，根據(jù)不同位置，高度和形態(tài) 的峰，表示產(chǎn)物的大小、量和均一性，從而確定T細胞克隆性(一般情況下， 正常轉(zhuǎn)錄的每個Va亞家族包含8 10個峰，即8 10個不同克隆的T細胞； 主峰的出現(xiàn)表明相同大小cDNA的過度擴增，單峰表明產(chǎn)物中DNA片斷大小 相同，均存在寡克隆或單克隆T細胞群，三者分別提示產(chǎn)物來自多克隆、寡 克隆和單克隆的T細胞)?；驋呙杞Y(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的Va6亞家族T細胞呈明 顯單克??；將Va6亞家族的PCR產(chǎn)物切膠純化，序列分析發(fā)現(xiàn)了 Va6亞家族 TCR的基因序列及其CDR3區(qū)(V-N-J區(qū))，即為與淋巴瘤相關(guān)抗原特異性結(jié) 合的部位。彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCR Va6亞家族的MR 基因序列的具體制備方法1、 分離外周血單個核細胞(1) 取淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077) 4mL加入離心管內(nèi)，將稀 釋后的抗凝外周血標(biāo)本混懸液平鋪于分離液之上，以水平離心機，2000 rpm， 離心15分鐘。(2) 吸取中間單個核細胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，再加入5mL 1640液， 輕輕吹打，以1500 rpm，離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL， 混勻后計數(shù)，并用同樣的方法洗滌兩次，按2xlOVmL調(diào)整細胞濃度備用。2、 RNA提取(TRIzoH式劑盒方法提取法)(1) 將已加入TRIzol試劑一2(TC凍存的細胞取出，置冰上解凍，混勻后 加入0.2mL氯仿，充分混勻，4°C， 14000 rpm離心30分鐘。(2) 吸取上層液至另一離心管，加入0.5 mL異丙醇并混勻，室溫靜置 10分鐘后4"C， 14000 rpm離心30分鐘。(3) 去上清，并用lmL75X乙醇(一20。C)洗兩次(2 8。C， 14000 rpm)， 每次混勻30秒后，離心10分鐘。(4) 去上清，再離心2 3分鐘，去除剩余的乙醇，置于超凈臺上自然干燥1 1.5小時。加入超凈水(20 50fiL)溶解。(5) 于紫外線分光光度儀中檢測樣品的純度和含量，0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量。(6) RNA保存RNA樣品加入其0.1倍容積的3mol/LNaAC (醋酸鈉) 和2倍容積的乙醇后，保存于一80。C備用。3、 cDNA合成(1 )應(yīng)用六聚體隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。l嗎RNA 加入16.5pL預(yù)先配制的混合液其中包括7pL H20、 2pL10xPCR-Buffer、 2jiL 0.lmmol/L DTT、 5(iL 2.5mmol/L dNTP和0.5|iL Rand.Hexmer。(2) 于73°C 3分鐘后，置于冰中30秒。低溫高速離心30秒置于冰中2 3分鐘。(3) 加入0.6(^L Rnasin (33U/pL)禾n 0.5jxL Superscript (200U/pL)后，低溫高速離心30秒。(4) 室溫靜置10分鐘；42°C， 40分鐘以上;83°C， 5分鐘，一20。C保存?zhèn)溆谩?、 cDNA合成質(zhì)量檢測將所有樣本的cDNA經(jīng)PCR檢測P2M基因(引物序列見表l)而確定其 合成質(zhì)量。總反應(yīng)體系20(iL,其中上下游引物0.5(imol/L， dNTP 0.1mmol/L， Taq聚合酶1.0U， MgCL2 1.5mmol/L， 10xPCR緩沖液2(xL， cDNA產(chǎn)物lpL 和dH20，同時設(shè)置陽性和陰性對照。在德國BiometraPCR擴增儀中進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94°C 1分鐘(首次3分鐘)，58°C 1分鐘，72°C 1分鐘(末次 6分鐘)，共35個循環(huán)，最后保存于4"中。取8iaLPCR產(chǎn)物以1.5% (w/v) 瓊脂糖凝膠進行電泳，(32M陽性者可進一步研究，陰性者視為無cDNA合成， 棄去不用。5、 PCR擴增TCRVa29個亞家族以29個TCR Va亞家族基因設(shè)計相應(yīng)的特異性上游引物，并在Ca區(qū)設(shè) 計一個下游引物(引物序列見表1)。 PCR按常規(guī)方法進行。總反應(yīng)體系20|iL， 其中含任一Va引物(24個VP亞家族之一)和Ca引物0.5jimol/L，余同上。反應(yīng)條件94°C、 1分鐘(首次3分鐘)，60°C、 1分鐘和72°C、 1分鐘(末次6分鐘)，共進行40個循環(huán)，最后PCR產(chǎn)物保存于4"C中。取8)iLPCR產(chǎn) 物電泳分析結(jié)果。6、 T細胞克隆性分析(1) 標(biāo)記PCR產(chǎn)物10|uL的反應(yīng)體系含2.5|iiL未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物、0.15)imol/L Ca-fam引物、 1.5mmol/LMgCl2， O.lmmol/L dNTP， 0.75UTaq聚合酶，ljiL 10xPCR緩沖液 和dH20。 PCR共進行35循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C、 1分鐘(首次3分鐘)， 66°C、 1分鐘和72'C、 l分鐘(末次6分鐘)，最后PCR產(chǎn)物保存于4'C中。(2) 基因掃描樣品配制熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(2pL)加入高質(zhì)量的去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)與Genescan-500 LIZ分子量標(biāo)準(zhǔn)品按20 : 1比例配好的10pL混合液中。(3) 基因掃描(按操作指南進行)1) 按操作指南準(zhǔn)備好儀器并更換水和緩沖液。2) 灌膠灌膠前2小時從4。C冰箱取出POP-4 (Performance Optimized Polymer-4)膠回溫1 2小時，把膠液抽進貯膠5mL針筒中(抽取的mL數(shù)約 為0.5+0.07 x做樣次數(shù))，倒置排出針筒內(nèi)氣泡，裝緊針筒。3) 上樣將備好的樣品于94r變性4分鐘，然后立即放置冰上冷卻2分 鐘。變性后的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進行電泳。4) 運行自動進樣器會自動把樣品板移到要分析的4個樣品的位置，電 泳過程中CCD檢測器把熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號并把它傳送給安裝了3100數(shù)據(jù) 采集軟件的計算機工作站。5) 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理完成后就存貯在計算機的數(shù)據(jù)庫里并以電泳信號 圖的形式顯示出來。電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對熒光強度， 每個圖中同時畫出幾種用于標(biāo)記DNA片斷的熒光素信號，電泳信號圖中的每 個峰代表一個DNA片斷。完成處理的數(shù)據(jù)被自動地從數(shù)據(jù)庫中提取并進行分 析。6) 結(jié)果分析打開GeneMapper SoftwareTMv3.5，將保存于計算機硬盤 數(shù)據(jù)庫中的原始數(shù)據(jù)加進分析軟件，分析產(chǎn)物的長度和熒光素強度。7、 核苷酸序列分析(1) E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物1) 切膠將PCR產(chǎn)物全部加入l 2。/。的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當(dāng)電泳至 足以分離目的DNA時，于紫外燈下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，切下的凝膠塊置于1.5 mL離心管中。2) 按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進行PCR產(chǎn)物的純化，先加入500 pL Binding Buffer, 55 65"孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBind DNA spin-column中高速離心去廢液后，再依次加入300 Binding Buffer、 700 (iL SPW Buffer洗膜；高速離心甩干spin-column的濾膜后，加入30 jxL DNA Elution Buffer (加于濾膜上)，室溫靜置5 min，高速離心1 min后可得純化的PCR產(chǎn) 物。3) 取3 純化后的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果； 剩余的PCR純化產(chǎn)物真空冷凍干燥濃縮約20 min至10 左右。(2) BigDye標(biāo)記用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit標(biāo)記純化后的PCR產(chǎn)物， 反應(yīng)體系為BigDye Terminator 1 jiL、相應(yīng)單向引物(2 |imol/L) 1.6|iL、純 化后PCR產(chǎn)物2.4 pL，反應(yīng)條件96°C 1 min， (96°C 10 sec、 50°C 5 sec、 60°C 4 min) 25個循環(huán)。(3) 測序?qū)?biāo)記好BigDye的5 體系的測序產(chǎn)物補水至20 pL，轉(zhuǎn)入1.5 ml的離 心管，再依次加入2 |iL 3 M NaAc(pH 5.2)、2 [iL 125 mM EDTA-Na2、50 95% 乙醇，旋渦振蕩后室溫下避光放置15min; 5415型高速臺式離心機2800 g離 心20 min，沿離心沉淀物的對側(cè)小心吸取上清并棄去，加入250 70%冰凍 乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置于加熱板上，94 95°C 1 min 使其干燥。加入10 高質(zhì)量的去離子甲酰胺，反復(fù)吹打混勻，轉(zhuǎn)入0.2 的PCR管內(nèi)，在PCR儀上95。C變性4 min，然后迅速置冰中冷卻至少4 min 后，裝載到3100 DNA序列分析儀上進行毛細管電泳。_表1 RT-PCR實驗所涉及的引物序列引物 序列5' GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA3' Va2 5' CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGT3， Va3 5' CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA3 ， Va4 5' TTGGTATCGACAGCTTCACTCCCA3' Va5 5' CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA3' Va65' TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT3'Va75，GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC3'Va85，CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG3'Va95'CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA3'ValO5，CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC3'Vall5'CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG3'Val25，TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA3'Val35，-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3'Val45，-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3'Val55，-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3'Val65，-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3'Val75，-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3'Val85，-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3'Val95'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'Va205，-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3'Va215'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3'Va225，-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va235，-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3'Va245'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3'Va255，-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3Va265，-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3'Va275，-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3'Va285，-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3'Va295'-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3'Cal5，-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'Ca-Fam5，-Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3'p2-M5'5'-.TACACTGAATTCACCCCCAC(32-M3'5'--CATCCAATCCAAATGCGGCA(二)抗原特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 1、重組質(zhì)粒TCRVa6 (MR) -pIRES的構(gòu)建*(1)目的基因的擴增 根據(jù)DLBL相關(guān)TCRVa6亞家族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設(shè)計 引物，擴增病人樣本中的TCR Va6基因序列的上游引物上帶有Xho I酶切位 點、下游引物上帶有EcoRl酶切位點(與真核表達載體pIRES中的插入位點 A的酶切位點相對應(yīng))。按BD Advantage 2 PCR試劑盒說明書進行PCR反 應(yīng)PCR總反應(yīng)體系50 pL，其中含10XBD Advantage 2 PCRBuffer、上下游 引物各0,5 pmol/L、 dNTP Mix 0.2 mmol/L、 50XBD Advantage 2 Polymerase Mix、超純水和1 pLcDNA模板，同時設(shè)置陽性和陰性對照。反應(yīng)條件94澄清，精濾去渣，裝瓶，即得成品。精濾去渣后，還可加入適量甜味劑或/和酸味劑調(diào)味。所述釀酒酵母(&cc力aro/^ces cerew'siae)可為各種釀酒酵母，其中優(yōu)選以下菌株 As2. 162.或/和As2. 470.(參見《中國工業(yè)微生物菌種目錄》，機械工業(yè)出版社1992年版)。所述大蒜果實可為各類大蒜的成熟果、殘次果。大蒜果實既不像糧食類食品含有豐富的淀粉類物質(zhì)，也不像葡萄、蘋果等水果自身含有 可溶性糖等可轉(zhuǎn)化為乙醇的物質(zhì)，因而如果利用大蒜全汁發(fā)酵釀制果酒，必須加入大量的糖， 這一方面會導(dǎo)致釀成的果酒口味單調(diào)；另一方面，由于大蒜含有抗菌類物質(zhì)，對酵母菌活性具 有一定抑制作用，因而還會影響發(fā)酵過程的順利進行。本發(fā)明采用將大蒜果肉先用酒精浸泡，再將浸泡好的大蒜果肉進行發(fā)酵處理，其作用主要體現(xiàn)在(1)發(fā)酵前殺滅附著在果肉中的微生物，提高發(fā)酵釀造的安全性；(2)鈍化果肉中存在的多種氧化酶的活性，抑制果肉的各種酶促變化和大蒜果肉的綠變，有利于保持大蒜風(fēng)味成分和產(chǎn)品的色澤；(3)可提取大蒜果肉中大蒜素等活性成分；(4)大蒜果肉含氮物質(zhì) 豐富，通過酒精的作用，可使部分蛋白質(zhì)變性沉淀，消除蛋白質(zhì)過多的不利影響；(5)分離 所得的浸提液裝于密閉容器中保存，待發(fā)酵完成后，再兌入發(fā)酵酒液中，可避免大蒜香氣成 分在發(fā)酵過程中揮發(fā)損失；(6)讓大蒜果肉參與發(fā)酵，提升果酒風(fēng)味，克服口味單調(diào)等缺陷。 本發(fā)明之酒精浸提半發(fā)酵法釀制的蒜素果酒，具有低酒度、獨特的果香和開胃健脾、補 虛益智，酒體豐滿協(xié)調(diào)等特點，特別適宜于有嗜酒愛好而又有高血壓和心血管疾病的"亞健 康"人群飲用。飲用該酒，入口舒適醇香具有抗菌,促進人體血液循環(huán)，預(yù)防心腦血管、高 血壓疾患的發(fā)生，補充體力，消除疲勞，增強機體耐久力，增進食欲，使人入睡安穩(wěn)，美容 美顏，提高機體免疫力等功效。生產(chǎn)成本低。
具體實施方式
加入75 pL預(yù)熱65。C的TE Buffer,室溫下放置3 min， 11400 rpm離心2 min，所收集的溶液即為富含質(zhì)粒溶液；H、提取質(zhì)粒DNA后用Xho I和EcoR I雙酶切鑒定，同時在pIRES載體的 IRES區(qū)設(shè)計一下游引物IRES-R (5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結(jié) 合pIRES載體上游的T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3，)進行 PCR鑒定，PCR反應(yīng)體積為25 pL，包括O.l mmol/LdNTP、 1.5UTaq聚合酶、 10XPCR緩沖液、1.5mmol/LMgCl2和超純水，引物濃度均為0.4pmol/L，以l : 500稀釋的質(zhì)粒DNA 1 jaL作為模板。PCR擴增條件為94。C 3 min， (94°C 30 s， 60°C lmin， 72°C 2min， 35個循環(huán))，72°C 5 min;酶切產(chǎn)物及PCR擴增產(chǎn) 物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。篩選出陽性克隆，再對其進行雙向測序鑒 定，證實為本發(fā)明特異基因序列后擴增陽性克隆并提取質(zhì)粒，從而獲得特異性 CTL相關(guān)的TCRVa6-pIRES質(zhì)粒。用紫外分光光度計測定重組質(zhì)粒的濃度。2、 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒TCRVa6-pIRES轉(zhuǎn)染(1)脂質(zhì)體Lipofectamine tm2000轉(zhuǎn)染A549細胞株、Molt4細胞株 轉(zhuǎn)染A549細胞株①將處于對數(shù)生長期的A549細胞株以4X1()s個細胞 /孔的密度，加入2 mL無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基，接種6孔培養(yǎng)板； ②取TCR Va6-pIRES重組質(zhì)粒(4 )ig)置于1.5 mL離心管中，加入無血清 無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250 pL，輕輕混勻；③取15 脂質(zhì)體 Lipofectamine TM 2000置于1.5 mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM 培養(yǎng)基至250 mL，輕輕混勻后室溫下孵育5 min; 將②和③混勻后，室溫 下孵育20 min; 將④加入①的A549細胞培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)染平行2孔)，另 設(shè)1孔轉(zhuǎn)染pIRES空載體作為陰性對照，具體操作方法同轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒；置 于37。C、 5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2411后全量換液為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后加 G418進行篩選(終濃度600 (ig/mL)，每4天換一次培養(yǎng)基，同時加入相同 濃度的G418，在此篩選條件下培養(yǎng)20 d可得到穩(wěn)定表達細胞系。轉(zhuǎn)染Molt4細胞株將處于對數(shù)生長期的Molt4細胞株以2X 106個細胞/ 孔的密度接種6孔板，取4 Hg TCR Va6-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合后轉(zhuǎn)染Molt4細胞株，方法同轉(zhuǎn)染A549細胞株。3、 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TCR Va6基因表達的鑒定(1) RT-PCR和實時定量PCR檢測TCR Va6 mRNA的表達 轉(zhuǎn)染7天后，各孔收集3X10嘲胞(A549細胞株需胰酶消化)，用TRIZol試劑盒和SurperScriptII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經(jīng)PCR擴 增管家基因P2M檢測cDNA的合成質(zhì)量(同第一部分，步驟7);用相應(yīng)的TCR Va6引物以及相應(yīng)的Ox引物進行PCR擴增，轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對照，PCR 擴增體系和擴增條件同前所述。(2) 間接免疫熒光法和流式細胞儀檢測重組質(zhì)粒的表達 轉(zhuǎn)染10天后，收集1乂106細胞(A549細胞株需胰酶消化)，用0.1mol/L的PBS洗滌細胞兩次后，標(biāo)記大鼠抗人TCRVa單抗(一抗，1 : 100稀釋)， 37。C孵育lh; PBS洗滌細胞三次后，標(biāo)記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1: 50稀釋)，37。C孵育lh; PBS洗滌細胞三次后，在熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒 在轉(zhuǎn)染后細胞株中的表達情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRV(x6單抗標(biāo)記， 37"C孵育30 min， PBS洗漆細胞一次后用流式細胞儀進行流式檢測重組質(zhì)粒的 表達。(3) 點印記雜交和Western Blot檢測TCR Va6蛋白的表達 轉(zhuǎn)染20天后，收集2乂106穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒的細胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍干燥濃縮后考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細胞 (TCR Va6亞家族表達均陽性)的蛋白作為陽性對照，轉(zhuǎn)染空載體的細胞的 蛋白為陰性對照。 1)點印記雜交A、 取NC膜2cmX4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點膜，重組質(zhì)粒組、 陽性對照組、陰性對照組的蛋白樣品分別點3次，每次l jiL;進行2個平行反應(yīng)；B、 用blocking Reagent封膜4 h后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;C、 加入l : 500的大鼠抗人TCRVa6單抗(用blocking Reagent稀釋)，4 °C孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;D、 加入l : 500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫 孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5 min;E、 將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。 2) Western BlotA、 SDS-PAGE電泳將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰 性對照分別加樣于15。/。SDS-PAGE膠(每孔上樣約100嗎)，以PageRuler Prestained Protein Ladder為預(yù)染marker，進行3個平行反應(yīng)；用恒壓60V電泳30 min后，改恒壓100Vlh;B、 分離其中1個平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色后，用冰乙酸甲醇洗脫液反復(fù)漂洗直至有清晰條帶顯出；C、 轉(zhuǎn)膜PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到轉(zhuǎn)膜液中備用；切好 的濾紙和海綿也浸泡到轉(zhuǎn)膜液中10min;將切下的另2個平行反應(yīng)的SDS-PAGE 膠與相應(yīng)的PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡片刻；將海綿一濾紙一PVDF膜一 SDS-PAGE膠一濾紙一海綿依次放到陽極板上，膠大小=膜〉濾紙；用4。C預(yù)冷 的轉(zhuǎn)膜液，恒壓40V， 90min (濕轉(zhuǎn));D、 封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗滌2次，每次5 min;E、 檢測人(3-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達將其中1個平行反應(yīng)的PVDF膜 加入l : 800的小鼠抗人(3-actin單抗(用blocking Reagent稀釋)，4t孵育過夜 后用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l : 1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用 blocking Reagent稀釋)室溫孵育2 h，用wash buffer洗滌3次，每次5 min;F、 檢測目的蛋白TCRVa6的表達:將另l個平行反應(yīng)的PVDF膜加入l : 800 的大鼠抗人TCRVa6單抗(用blockingReagent稀釋)，4"孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;加入l : 1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5 min;G、 化學(xué)發(fā)光法顯影在暗室中將PVDF膜轉(zhuǎn)入LumiGLO Working Reagent 中，室溫孵育3min;用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多余的試劑；將PVDF膜放 入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的 塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規(guī)顯影、定影后 得到顯影的X線膠片。4、重組質(zhì)粒TCRVcx6-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細胞，構(gòu)建特異性CTL(1) 重組質(zhì)粒TCR Va6-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細胞 將處于對數(shù)生長期的正常人T細胞以2X 106個細胞/孔的密度接種6孔板，取4 )ig TCR Va6-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合后轉(zhuǎn)染 正常人T細胞，操作方法同前所述，培養(yǎng)擴增后得到表達抗原特異性CTL相 關(guān)TCRVot6基因的T細胞，并檢測驗證重組質(zhì)粒的表達(方法同前)。(2) 細胞毒活性實驗以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測試劑盒分別在轉(zhuǎn)染后 第1周、第3周進行細胞毒性試驗，操作按說明進行。分別以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的 正常T細胞、轉(zhuǎn)染空載體的正常T細胞為效應(yīng)細胞，以DLBL細胞株、Raji細胞、Molt4細胞(陰性對照)為靶細胞，另設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常T細胞為空 白組。效靶比為10 : 1，靶細胞濃度1乂104個細胞/孔，每組3個復(fù)孔；置U型96孔培養(yǎng)板內(nèi)，稍離心2500rpm30s，以促進效、靶細胞之間接觸，于37 。C、 5。/。C02飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4h;用1000rpm離心5min，吸取上清100 加入平底酶標(biāo)板中，加入100 )iL LDH底物反應(yīng)液，室溫下避光作用30 min， 每孔加50 (iL 1 mol/L鹽酸終止酶促反應(yīng)；Elx-800酶標(biāo)儀測定光密(optical density, OD)值，測定波長490nm，參考波長670nm。CTL細胞毒活性計算公式 CTL活性(％) 二(實驗組OD值一效應(yīng)細胞自然釋放組OD值—靶細胞自然 釋放組OD值)/ (最大釋放組OD值一靶細胞自然釋放組OD值)上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 <120>彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V a 6亞家族的MR基因序列及應(yīng)用 <130〉 42 <160〉 2< 170> Patentln version 3.2<210〉 1<211> 333<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223>彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V a 6亞家族的MR基因序列 <400> 1tccgccaacc ttgtcatctc cgcttcacaa ctgggggact cagcaatgta tttctgtgca 60 atg鄉(xiāng)gatt actctggggc tgggagttec caactcactt tcggga鄉(xiāng)g gaccaaactc 120 tcggtcatac caaatatcca gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag agactctaaa 180 tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa 240 agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac 300 ttcaagagca acagtgccgc ggcctggagc aac 333 <210> 2 <211> 111 <212> PRT<213> Artificial sequence<220><223>彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V a 6亞家族的MR基因序列翻譯的蛋白質(zhì)<400> 2Ser Ala Asn Leu Val lie Ser Ala Ser Gin Leu Gly Asp Ser Ala Met15 10 15Tyr Phe Cys Ala Met Arg Asp Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gin Leu20 25 30Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val He Pro Asn He Gin Asn35 40 45Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys50 55 60Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr Asn Val Ser Gin 65 70 75 80Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr lie Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met85 90 95Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn 100 105 110
權(quán)利要求
1、一種彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vα6亞家族的MR基因序列，其特征在于所述MR基因序列如下TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTATTTCTGTGCAATGAGGGATTACTCTGGGGCTGGGAGTTACCAACTCACTTTCGGGAAGGGGACCAAACTCTCGGTCATACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Va6 亞家族的MR基因序列，其特征在于所述述彌漫大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特 異TCRVa6亞家族的MR基因序列翻譯的蛋白質(zhì)如下AVAWSN。
3、權(quán)利要求1所述的彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V(x6亞家 族的MR基因序列在制備彌漫性大B細胞淋巴瘤特異性分子靶向過繼性免疫 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個針對彌漫性大B細胞淋巴瘤相關(guān)抗原的特異性T細胞受體的核苷酸序列及應(yīng)用。通過RT-PCR基因掃描分析DLBL患者外周血中TCRVα6亞家族呈明顯單克隆，其PCR產(chǎn)物進行序列分析特異性TCR序列的V-N-J區(qū)，即互補決定區(qū)3，是和抗原特異性識別結(jié)合的部位；表明該克隆性T細胞的TCR為DLBL相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR。它是通過TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行DLBL分子靶向的過繼性免疫治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進一步開展針對淋巴瘤的特異性細胞免疫治療的一個重要基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/12GK101225388SQ20081002599
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者葉靜梅, 吳秀麗, 尹青松, 李揚秋, 楊力建, 獲 譚, 陳少華 申請人:暨南大學(xué);廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院